生物技术制药课后思考题

第一篇：生物技术制药课后思考题

生物技术制药思考题

第一章：绪论

思考题

1.什么是生物技术？生物技术所包含的内容及定义。

答：1）生物技术又称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。2）包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术及生物转化等。（具体定义见P1）。

2.生物技术药物的概念及分类。

答：1）指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。2）a.按照用途：预防、诊断、治疗；b.按作用类型：细胞因子类、激素类、酶类、疫苗、单克隆抗体类、反义核酸、RNA干扰类、基因治疗药物；c.按照生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚乙二醇化多肽或蛋白质。3.生物技术药物在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面的特性。答：1）理化性质（从药物多是蛋白质或核酸出发）：a.相对分子质量大；b.结构复杂；c.稳定性差；2）药理学作用：a.活性与作用机制明确；b.作用针对性强；c.毒性低；d.体内半衰期短；e.有种属特异性；f.可产生免疫原性；3）生产制备特性：a.药物分子在原料中含量低；b.原料中常存在降解目标产物的杂质；c.制备工艺条件温和；d.分离纯化困难；e.产品易受有害物质污染；4）质量控制特性：a.质量标准内容的特殊性；b.制造项下的特殊规定；c.检定项下的特殊规定。4.生物技术制药的概念和主要研究内容与任务。

答：1）指利用基因工程、细胞工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。2）主要研究内容与任务：a.生物制药技术的研究、开发与应用；b.利用生物技术研究、开发和生产药物。

第二章：基因工程制药

思考题

1.简述基因工程制药的基本原理和基本流程。

答：1）利用重组DNA技术将外源基因导入到宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获取蛋白质药物的过程称为基因工程制药。2）目的基因的获得、表达载体的选择、目的基因与载体的连接、重组DNA转入到宿主细胞、重组子的筛选与鉴定、工

生物技术制药思考题

程菌的发酵表达重组蛋白、表达产物的分离纯化、重组蛋白制剂的生产。2.与化学药物相比较，基因工程药物有什么特点？

答：a.基因工程药物是由活细胞代谢产生的；b.基因工程药物的相对分子质量要远远大于一般的小分子化学药物；c.在制备基因工程药物时，需要除去宿主蛋白和核酸残留，同时还要防止其他物质的污染，而化学药物大多是通过组合合成的，杂质是原料残留及反应副产物等。

3.原核与真核表达体系各有什么优缺点？哪些蛋白质需要用真核表达体系？ 答：1）原核表达体系优点：宿主遗传背景清楚，商品化菌种齐全，方便购买；原核细胞操作简便、繁殖快、周期短；大规模生产成本低，产量较高；下游纯化工艺简单，易于控制，生产效率高；缺点：缺乏蛋白质折叠和翻译后加工系统；分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性、复性才恢复活性；有的表达系统，如大肠杆菌有内毒素，很难除去；大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。

2）真核表达系统：优点：具有转录后加工能力，外源基因可以是DNA也可以是cDNA；具有蛋白质折叠和翻译后加工系统，可形成正确折叠、装配和糖基化等修饰的蛋白质；可是重组蛋白分泌表达，有利于纯化；缺点：生长缓慢、操作复杂、产量较低、生产成本较高等。

3）某些需要修饰的蛋白质需要采用真核表达体系。4.重组蛋白类药物的质量控制要考虑哪几个方面? 答：蛋白质含量测定、纯度检查、理化性质的鉴定（分子量、等电点、序列、肽图、二硫键、氨基酸组成）、生物学活性鉴定、内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析。5.基因工程药物如何提高其疗效？今后的发展趋势有哪些？

答：1）提高蛋白质药物的稳定性；减少蛋白质药物的免疫原性；延长半衰期；提高组织的特异性。

2）提高基因工程药物的产量；一些现在还没有使用基因工程的手段的药物，实现基因工程化生产；构建突变体，改造已知的药物，增强疗效，减少临床上疗效弱、易产生抗性等不足。

第三章：动物细胞工程制药

思考题

1.离体培养的动物细胞有哪些类型？答：贴壁细胞、悬浮细胞和兼性贴壁细胞。

生物技术制药思考题

2.生产用动物细胞有哪些种类？各有何特点？

答：1）原代细胞：直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液。需要大量动物，费钱、费劳力。2）传代细胞系：染色体组型是2n核型；贴壁依赖，接触抑制；可传代培养50代；无致癌性。3）转化细胞系：转化过程可以是自发的和人工的，也可从肿瘤组织中获得；具备无限的生命力；较短的倍增时间；较低的培养条件要求；适合于大规模工业化生产的要求；基因工程药物表达的宿主细胞，主要是转化细胞。4）工程细胞系：利用细胞融合技术或基因工程技术对转化细胞系的遗传物质进行修饰改造或重组，获得的具有稳定遗传特性的细胞系。

3.常用的动物细胞培养基有哪几类？答：天然培养基、合成培养基及无血清培养基。4.动能细胞大规模培养有哪几种方式？

答：悬浮培养法、微载体培养法、多孔载体培养法、微囊化培养法、中空纤维培养法。5.利用动物细胞生产的药物主要有哪些？

答：疫苗、单克隆抗体、激素、淋巴因子、多肽生长因子、酶类等。

第四章：抗体工程制药

思考题

1.传统的鼠抗体在治疗应用上有哪些局限？

答：传统的鼠抗体在人体中反复使用会出现人抗鼠抗体反应（HAMA），导致抗体在人体内会迅速被清除，半衰期缩短，甚至出现出现严重的不良反应。2.如何对鼠源性单抗进行改造？

答：将抗体的Fc段用人源替换，仅保留CDR区（超可变区）是鼠源的，即为构造成嵌合抗体；或者生产全人源化抗体。3.如何制备杂交瘤细胞？

答：用免疫原与免疫小鼠，从小鼠体内获得淋巴B细胞，制成细胞悬液，然后与骨髓瘤细胞一起混合，使用聚乙二醇诱导细胞融合，将融合后的细胞混合液在HAT选择性培养基上生长，在培养基上生长的即为杂交瘤细胞，进行抗体检测和克隆化培养，可以获得既能够产生单一性抗体，又能够无限增殖的杂交瘤细胞。4.在制备单抗时为什么要进行两次筛选？

答：第一次筛选：获得淋巴B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞；第二次筛选：获得能够产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。

5.制备单抗时为什么要选用B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交细胞？

生物技术制药思考题

答：能够产生抗体的淋巴B细胞不能够无限增殖，而骨髓瘤在体外培养具有无限增殖的特性，但是不能产生抗体，将二者融合，融合细胞继承了两个亲代细胞的特性，形成了能够产生抗体又能够无限增殖。

第五章：疫苗及其制备技术

思考题

1.简述疫苗的概念、组成及其作用原理。

答：1）是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。2）组成：具有免疫保护性的抗原，如蛋白质、多肽、多糖及核酸等，与免疫佐剂混合制成。3）当机体通过注射或口服等途径接种疫苗后，疫苗中的抗原分子就会发生免疫原性作用，刺激机体免疫系统产生高效价特异性的免疫保护物质，如特异性抗体、免疫细胞及细胞因子等，当机体再次接触到相同的抗原时候，机体的免疫系统便会依循免疫记忆，迅速制造出更多的保护物质来阻断病原菌的入侵，从而使机体获得针对病原体特异性的免疫力，使其免受侵害而得到保护。

2.传统的灭活疫苗和减毒活疫苗在实际应用中存在哪些局限？

答：传统的减毒活疫苗，如果减毒程度不够，在使用时有致病的可能性，过分减毒又会使得免疫原性不足或丧失，失去活疫苗的效力。灭活疫苗常常需要多次接种，抗体滴度随时间而下降。

3.简述基因工程亚单位疫苗的主要特点及制备方法。

答：1）优点：产量高、纯度高、安全性好，用于难以培养或具有潜在致癌性病毒的疫苗制备。缺点：生产成本比较高（纯化），产品研发成本高，免疫接种成本高（多次注射），与传统疫苗相比，免疫效果较差。

2）制备方法：在分离出病原体特异抗原编码基因的基础上，将外源基因转入另外一个非致病微生物或细胞中表达，然后通过分离纯化而获得特异的蛋白质。表达系统有大肠杆菌、酵母菌和高等植物。

4.何为治疗性疫苗？请比较治疗性疫苗与预防性疫苗的主要区别？

答：1）治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品。

2）治疗性疫苗兼有治疗和预防的作用，当机体已经处于感染或患病状态时，治疗性疫苗

生物技术制药思考题

会诱导免疫应答，治疗疾病。预防性疫苗是使机体处于免疫保护状态，当病原菌再次入侵时候，依循免疫记忆，会迅速做出免疫应答，阻止病原菌的入侵。5.设计并简述禽流感H5N1灭活疫苗的主要制备流程。答：P122

第二篇：生物技术制药 第二版 课后思考题及答案(全)

1.生物技术制药分为哪些类型？ 生物技术制药分为四大类：

（1）应用重组DNA技术(包 括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。

（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物 2．生物技术制药具有什么特征？

（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性

（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性

3.生物技术制药中有哪些应用？ 应用主要有：

（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物

（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢 产物

（3）酶工程制药（4）发酵工程制药 4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？

基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？

（1）外源基因的计量

（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱 b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件

6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？ 质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌2）选择合适的载体（3）选择压力

（4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化

7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？

影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7）PH值

8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？

高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH(4)温度（5）代谢副产物 实现高密度发酵的方法：

（1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力

（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流 进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流 d、引入血红蛋白基因（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 9.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么? 方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。（1）离子交换色谱IEC：是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂 上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

（2）疏水层析HIC：是利用蛋白质表面的疏水区与固定相上疏水性基团相互作用力的差 异，对蛋白质组进行分离的层析方法。

（3）亲和层析AC：是利用固定化配体与目的蛋白质之间的非常特异的生物亲和力进行 吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。

（4）凝胶过滤层析：以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离 的液相层析方法。

10.对由基因重组技术所获得的蛋白质药物进行鉴定时，常做哪些项目分析？

基因工程药物质量控制主要包括以下几点：产品的鉴别，纯度，活性，安全性，稳定性和一致性

项目分析主要有：（1）生物活性测定（2）理化性质鉴定（3）蛋白质含量鉴定（4）蛋白质纯度分析（5）杂志检测（6）稳定性考察（7）产品一致性的保证 11.离体培养的动物细胞分为哪些类型? 分为三类：

（1）贴壁细胞：细胞生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的培养基中 提供的贴附因子才能在该表面上生长增殖。

（2）悬浮细胞：细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中悬浮状态生长（3）兼性贴壁细胞：既可 贴附于支持物表面生长，又在悬浮生长。12.生产用的动物细胞有哪些种类？它们各有什么特点？

（1）生产用的动物细胞的种类：原代细胞系、二倍体细胞系、转化细胞、融合细胞系、重组工程细胞系

（2）它们各自的特点：

（A）二倍体细胞系的特点：

①染色体组型仍然是2n的核型

②具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性

③只有有限的增值能力，一般可连续传代培养50代 ④物致瘤性

（B）转化细胞系的特点：

①具有无限生命力 ②倍增时间较短

③对培养条件和生长因子等要求较低

（C）融合细胞系的特点：

①可使不同的动物和动物细胞融合 ②可是动物和植物细胞融合

13.常用的培养动物细胞的培养基的种类有哪些？

（1）天然培养基（2）合成培养基（3）无血清培养基 14.如何进行动物细胞大规模培养？

大规模培养的方法：（1）悬浮细胞（2）贴壁细胞

（3）贴壁—悬浮细胞：a、微载体培养 b、包埋和微囊培养 c、结团培养 大规模培养的操作方式：（1）分批式操作（2）半连续式操作（3）灌流式操作 15.动物细胞生物反应器必须具备哪些基本要求？有哪些类型？特定是什么？

动物细胞反应器具备的基本要求：

（1）制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基，细胞直接接触的材料，对细 胞必须是无毒性的。

（2）生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能（3）密封性良好，可避免一切外采的不需要的微生物污染。

（4）对培养基环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精度高，而且能 保持环境质量的均一。

（5）可长期连续运转，这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤其重要。（6）容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积。（7）拆装，连结和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修（8）设备成本尽可能低。

反应器类型及特点：

（1）搅拌罐式生物反应器：主要用于是悬浮细胞培养，微载体培养，微囊和巨载体培养 以及结团培养

（2）气升式生物反应器：气体通过装在罐底的喷管进入 反应器的导流管，致使该部液体 的密度小于导流管外部的液体形成循环流。

（3）中空纤维式生物反应器：占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低，不能重复 使用，不能耐高压蒸汽灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌，难以取样检测。

（4）透析袋或膜式生物反应器：可使细胞达到高密度，又可随意组合进行操作，对产品 进行浓缩纯化。

（5）固定床或流化床生物反应器：结构简单，装填材料易得。16.动物细胞制药有哪些新进展？

①改进表达载体，提高表达水平和产量

②利用代谢工程改进培养工艺 ③抑制细胞凋亡，延长培养周期 ④采用糖基化工程，提高产品质量 ⑤转基因动物的研究 ⑥组织工程研究

17.什么是单克隆抗体？单克隆抗体有哪些不足？

单克隆抗体：是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的抗体。不足：

（1）单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，在人体内半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间。

（2）完整的抗体分子，即Ig的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有 效治疗浓度。

18如何制备杂交瘤细胞？

将两个细胞（例如 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞）通过诱导融合形成杂交细胞，具体操作时为了提高成功率会用多个细胞同时杂交，然后筛选出目的细胞，再进行细胞培养使其有丝分裂而增值，得到大量目的细胞（杂交瘤细胞）。

19．基因工程抗体有哪些类型？其特性和制备方法有什么不同？

基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。（1）嵌合抗体 嵌合抗体（chimeric atibody）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。

（2）人源性抗体 是将人抗体的 CDR 代之以鼠源性单克隆抗体的 CDR，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。

（3）完全人源化抗体 采用基因敲除术将小鼠 Ig 基因敲除，代之以人 Ig 基因，然后用 Ag 免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。

（4）单链抗体 是将 Ig 的 H 链和 L 链的 V 区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链 FV（single chain fragment of variable region,sFv）。SFv 穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。

（5）双特异性抗体 将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL 细胞、NK 细胞、LAK 细胞）表面分子的抗体（CD3 抗体或 CD16 抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。20.抗体治疗药物有哪些？

（1）放射性同位素标记的抗体治疗药物（2）抗癌药物偶联的抗体药物（3）毒素偶联的抗体药物

21.抗体诊断试剂有哪些类型？（1）血清学鉴定用的抗体试剂（2）免疫标记用的抗体试剂（3）导向诊断药物

（4）CD单克隆抗体系列

22.单克隆抗体制备的基本原理与过程？有什么意义？ 原理：

B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细 胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。过程

1）免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。

2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。5）克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。

（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。

（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。6）细胞的冻存与复苏7）大规模单克隆抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。意义：

用于以下各种生命科学实验并具有医用价值（1）沉淀反应：Precipitation reaction（2）凝集实验：haemaglutination（3）放射免疫学方法检测免疫复合物

（4）流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离。（5）ELISA 等免疫学检测（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的 亲和力。(7)免疫印记（western blotting)（8）免疫沉淀：（9）亲和层析：分离蛋白质（10）磁珠分离细胞（11）临床疾病的诊断和治疗；

23.植物细胞培养的培养基由哪些主要成分组成？（1）无机盐（2）碳源（3）植物生长调节剂（4）有机氮源（5）维生素 24.植物细胞大规模培养的主要方法及其特点是什么？

（1）成批培养法：将培养基一次性地加入反应器中，接种，培养一定时间后收获细胞的操作方式。

特点：操作强度低，设备简单，容易发生污染，通气受限制。

（2）半连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和 新鲜培养 液进行交换的培养方法。

（3）连续培养法：是利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度 采集细胞和培养液，并以同样速度供给诶新鲜培养基以使细胞生长环境长期恒定的方法。（4）固定化培养法：将细胞固定于尼龙网套内，或固定于中空纤维有网状多孔板，尼龙 套和中空纤维膜上，放入培养液中进行培养，或连续流入新鲜培养液，进行连续培养及连续收集培养产物，也可通入净化空气以代替搅拌。

25.影响植物细胞积累次级代谢产物的因素有哪些？（1）生物条件（2）物理条件（3）化学条件（4）工业培养条件

26.各种植物细胞培养的生物反应器的特点是什么？

（1）机械搅拌式生物反应器：有较大的操作范围，混合程度高，适应性广，剪切力大，容易损伤细胞。

（2）鼓泡式生物反应器：优于机械搅拌式反应器。但由于鼓泡式反应器对氧的利用率较低，如果用较大通气量，则产生的剪切力会损伤细胞。

（3）气升式生物反应器：广泛应用于植物细胞培养的研究和生产，最高细胞浓度和最短倍增时间可从气升罐中得到。

（4）转鼓式生物反应器：生长速率高，其氧的传递及剪切力对细胞的伤害水平方面均优于气升式反应器。

（5）固定化细胞反应器：可保护细胞免受剪切，可长时间重复使用，易于实现 细胞的高密度培养，细胞接触良好，易于分化，有利于次级代谢产物的合成，减少细胞的遗传不稳定 性，易于实现连续化操作。

27.植物细胞培养有哪些新进展？

（1）诱导了在植物细胞工程研究中的应用（2）前体饲喂（3）两相法培养

（4）转基因技术在次级代谢产物生产中的应用（5）植物身为转化技术与生物制药 28.酶工程主要研究内容是什么？

（1）酶的分离、纯化、大批量生产及应用。（2）酶和细胞的固定化及酶反应器的研究。（3）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶研究。

（4）酶的分子改造与化学修饰以及酶的结构与功能之间关系的研究。（5）有机相中酶反应的研究。

（6）酶的抑制剂，激活剂的开发及应用与研究。（7）抗体酶，核酸酶的研究。（8）模拟酶，合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。

29.固定化酶回合固定化细胞的特点和优点各是什么？怎样制备？ 固定化酶的特点和优点:（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处 理使酶失活的步骤；

（3）稳定性显著提高；

（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；（5）提供了研究酶动力学的良好模型。

固定化细胞的特点和优点：

1.使用固定化细胞省去了酶的分离过程，显著降低了成本。2.2.固定化细胞为多酶系统，不需要辅助因子

3.增加了细胞对不利环境的耐逆性，可重复使用。4.增加了酶的稳定性。固定化酶制备：（1）吸附法：

过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。（2）包埋发：

将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。（3）共价键结合法：

将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。（4）交联法

使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。固定化细胞的制备： 一种固定化细胞的制备方法，包括以下步骤： a．选用甲烷利用细菌

Methylomonas sp．GYJ3，在可供给微生物能量的甲烷和空气的混合气体中，辅以无机培养基进行培养； b．培养好的菌体细胞离心后用无机培养基悬浮，加入到硅酸钠溶液和盐酸溶液制成的溶胶中，待溶胶凝固变成凝胶后，就制得了包埋的细胞，将包埋细胞置于低温环境中以增加包埋强度； c．用磷酸盐缓冲液洗去包埋细胞的杂质，充入可给微生物提供能量的相应的甲烷与空气的混合气体，在摇床上培养48－120小时。

30.为什么要对酶进行化学修饰？

（1）.更好的热稳定性以及抗核酸酶性对于临床应用很重要；（2）提高酶蛋白在体内的半衰期；（3）提高酶蛋白的靶向性；（4）提高酶蛋白效力。31.何谓分子印迹？分子印迹的应用范围有哪些？

分子印迹：是指制备对某一特定化合物具有选择性的聚合物的过程。应用范围：

（1）用于化学仿生传感器（2）色谱分离（3）固相萃取（4）天然杭体模拟（5）模拟酶催化（6）控缓释药物

32.有机相酶反应的定义及其优点是什么？

有机相酶反应：是指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行对的催化反应。优点是：（1）增加疏水性底物或产物的溶解度。（2）热力学平衡向合成方向移动。（3）可抑制有水剂中分离纯化产物。

（4）酶不溶于有机介质，易于回收再利用。（5）容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。（6）酶的热稳定性提高，PH的适应性扩大。（7）无微生物污染。（8）

能测定某介质中反应时，通过改变溶剂，能够控制底物的特异性、区域选择性和立体选择性，并可以催化某些在水中不能进行的反应。33.何谓人工模拟酶？

人工模拟酶：是指根据酶的作用机理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂。34.发酵工程的研究内容包括哪些？

发酵工程研究内容涉及：菌种的培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、溶氧、发酵条件的优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的分离纯化和精制等。

35.微生物菌种诱变使用的主要诱变剂有哪些？它们的诱变机制是什么？(1)物理诱变剂：主要有紫外线、X射线、γ射线、快中子、α射线、β射线和超声波等。（2）化学诱变剂：金属离子、一般化学试剂、生物碱、抗代谢物、生长刺激素、抗生素及高分子化合物、杀菌剂、染料等。

诱变机制：

1、碱基的类似物诱发突变

2、改变DNA的化学结构

3、结合到DNA分子上诱发移码突变

4、紫外线及其他射线引起的DNA分子的变化

36.微生物发酵主要有哪些方式？各具有什么特点？

（一）分批发酵：是将全部物料一次投入到反应器中，经灭菌，接种，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的操作方式。特点：（1）对温度的要求低，工艺操作简单；

（2）比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；

（3）对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高（4）人力、物力、动力消耗较大；（5）生产周期较长（6）生产效率低

（二）补料分批发酵：指在微生物分批发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。特点：(1)可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物阻遏作用。(2)可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率；(3)菌种的变异及杂菌污染问题易控制；(4)便于自动化控制(三)连续发酵：是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。特点：

（1）设备的体积可以减小；v（2）操作时间短，总的操作管理方便，便于自动化控制；（3）产物稳定，人力物力节省，生产费用低

（4）对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高；

（5）营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低（6）杂菌污染的机会较多，菌种易因变异而发生退化。

37.影响发酵的主要因素有哪些？如何对发酵过程进行控制？

（1）温度 温度对微生物的影响是多方面的。首先，温度影响酶的活性。在最适温度范围内，随着温度的升高，菌体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。当超过最适温度范围以后，随着温度的升高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期缩短，产量降低。温度也能影响生物合成的途径。例如，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强，但当温度超过35℃时，则只合成四环素而不合成金霉素。此外，温度还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收等。因此，要保证正常的发酵过程，就需维持最适温度。但菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同。如灰色链霉菌的最适生长温度是37℃，但产生抗生素的最适温度是28℃。通常，必须通过实验来确定不同菌种各发酵阶段的最适温度，采取分段控制。

（2）pH pH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。细胞膜的带电荷状况如果发生变化，膜的透性也会改变，从而有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌。此外，pH还会影响培养基中营养物质的分解等。因此，应控制发酵液的pH。但不同菌种生长阶段和合成产物阶段的最适pH往往不同，需要分别加以控制。在发酵过程中，随着菌体对营养物质的利用和代谢产物的积累，发酵液的pH必然发生变化。如当尿素被分解时，发酵液中的NH+4浓度就会上升，pH也随之上升。在工业生产上，常采用在发酵液中添加维持pH的缓冲系统，或通过中间补加氨水、尿素、碳酸铵或碳酸钙来控制pH。目前，国内已研制出检测发酵过程的pH电极，用于连续测定和记录pH变化，并由pH控制器调节酸、碱的加入量。（3）溶解氧 氧的供应对需氧发酵来说，是一个关键因素。从葡萄糖氧化的需氧量来看，1 mol的葡萄糖彻底氧化分解，需6 mol的氧；当糖用于合成代谢产物时，1 mol葡萄糖约需1.9 mol的氧。因此，好氧型微生物对氧的需要量是很大的，但在发酵过程中菌种只能利用发酵液中的溶解氧，然而氧很难溶于水。在101.32 kPa、25℃时，氧在水中的溶解度为0.26 mmol/L。在同样条件下，氧在发酵液中的溶解度仅为0.20 mmol/L。而且随着温度的升高，溶解度还会下降。因此，必须向发酵液中连续补充大量的氧，经搅拌，可以提高氧在发酵液中的溶解度。

（4）泡沫 在发酵过程中，通气搅拌、微生物的代谢过程及培养基中某些成分的分解等，都有可能产生泡沫。发酵过程中产生一定数量的泡沫是正常现象，但过多的持久性泡沫对发酵是不利的。因为泡沫会占据发酵罐的容积，影响通气和搅拌的正常进行，甚至导致代谢异常，因而必须消除泡沫。常用的消泡沫措施有两类：一类是安装消泡沫挡板，通过强烈的机械振荡，促使泡沫破裂；另一类是使用消泡沫剂。

（5）营养物质的浓度 发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢产物的积累。如在谷氨酸发酵中，NH+4浓度的变化，会影响代谢途径(见谷氨酸发酵)。因此，在发酵过程中，也应根据具体情况进行控制。38.如何克隆抗生素生物合成基因？

在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。39．基因工程在抗生素生产中有哪些应用？ 基因工程技术在抗生素生产过程中的几类应用 4.1 提高抗生素的产量

4.1.1 增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数

增加生物合成中限速阶段酶系基因剂量有可能提高抗生素的产量。抗生素的生物合成基因成簇存在于菌体内，包括抗性基因、结构基因、调节基因，各基因之间以种种机制相互制约，相互调控，配对同步翻译，通过基因重组修饰可以提高产量。现已知晓，抗生素的产量与产生对该抗生素的抗性基因密切相关，因此可以通过外源抗性基因的拷贝数来提高菌种的抗性水平，达到提高产量的目的，如卡那霉素的抗性基因—6’-N-乙酞转移酶基因克隆到多拷贝数质粒pIJ702，然后转人卡那霉素产生菌—卡那链霉菌ATCC12853中，得到的转化子产卡那霉素能力提高6倍，转人新霉素产生菌—弗氏链霉菌ATCC10745，含重组质粒的转化子，产生抗生素能力亦有显著提高[9]。4.1.2 通过调节基因的作用

调节基因的作用可以增加或降低抗生素的产量，在许多链霉菌中关键的调节基因嵌在控制抗生素产生的基因簇中，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因簇的组成部分。正调节基因可能通过一些正调控机制对结构基因进行正向调节，加速抗生素的产生。负调节则反之。因此，增加正调节基因或降低负调节基因的作用也是一种增加抗生素产量的可行方法。4.2 改善抗生素组分

Hoopwood在1981年提出链霉菌之间生物合成基因重组可以产生新抗生素，其后率先利用基因克隆技术成功地将放线紫红素产生菌羟化酶基因转人Medennycin产生菌中并使之表达获得杂合抗生素Medennycin，将放线紫红素生物合成途径基因转移到Granatin产生菌内，通过两个不同链霉菌相互作用产生地杂合抗生素Dihydrogranatiylhodin(二氢榴菌紫素)[10]。β-内酞胺抗生素是临床应用最广泛的抗生素，其生物合成途径研究最彻底，合成基因已被克隆和测序表达。其中编码异青霉素N合成酶（IPNS）即环化酶的研究倍受重视。因为，它是前体氨基酸L—α—氨基己二酸(A)、L—撷氨酸(V)、L—半胺氨酸(C)转化为LLD-ACV三肤进而环化为青霉素，头孢霉素母核的关键酶。由于IPNS的专一性不强，可利用A、V及发生修饰的ACV类似物进行三肤合成并环化，研究证明采用150种人工合成的三肤底物进行体外酶促反应，发现有80种不同程度地转化产生β-内酞胺衍生物，其中1/4有抗菌活性，意味着利用IPNS酶的催化特性，应用适当三肤底物可以合成全新的件内酞胺类抗生素。4.3 改进抗生素生产工艺

半合成头抱菌素7ACA制造法，目前国内外仍以化学裂解法生产。最近国外报道二步酶法生产7ACA。头孢霉素酞基转移酶不能直接水解头抱菌素生产7ACA，必须先将头孢霉素C侧链氨基氧化为酮基才能进行水解，现已实现D一氨基酸氧化酶(DAO)编码基因和头孢霉素酞基转移酶编码基因直接转人头孢霉素C工程菌的构建工作，可直接制备7ACA。虽然，目前收率不高，但展现了基因工程的美好前景.

第三篇：生物技术制药课后习题

1.生物技术制药分为哪些类型？ 生物技术制药分为四大类：

（1）应用重组DNA技术(包 括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。

（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物 2．生物技术制药具有什么特征？（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性

3.生物技术制药中有哪些应用？ 应用主要有：

（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技

术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物

（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3）酶工程制药（4）发酵工程制药

4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？

基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验

5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？（1）外源基因的计量

（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱

b、核糖体的结合位点

c、SD序列和起始密码的间距

d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件

6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？

质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能 的改变。

提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌（2）选择合适的载体（3）选择压力（4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化

7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？ 影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7）PH值

8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？

高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基

（2）溶氧浓度

（3）PH(4)温度

（5）

代谢副产物

实现高密度发酵的方法：

（1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力

（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流 d、引入血红蛋白基因

（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌

9.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么? 方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。

（1）离子交换色谱IEC：是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

（2）疏水层析HIC：是利用蛋白质表面的疏水区与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组进行分离的层析方法。（3）亲和层析AC：是利用固定化配体与目的蛋白质之间的非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。

（4）凝胶过滤层析：以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。

10.对由基因重组技术所获得的蛋白质药物进行鉴定时，常做哪些项

目分析？

基因工程药物质量控制主要包括以下几点：产品的鉴别，纯度，活性，安全性，稳定性和一致性 项目分析主要有：（1）生物活性测定（2）理化性质鉴定（3）蛋白质含量鉴定（4）蛋白质纯度分析（5）杂志检测（6）稳定性考察（7）产品一致性的保证

11.离体培养的动物细胞分为哪些类型? 分为三类：

（1）贴壁细胞：细胞生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长增殖。

（2）悬浮细胞：细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中悬浮状态生长

（3）兼性贴壁细胞：既可 贴附于支持物表面生长，又在悬浮生长。12.生产用的动物细胞有哪些种类？它们各有什么特点？ 13.常用的培养动物细胞的培养基的种类有哪些？（1）天然培养基

（2）合成培养基（3）无血清培养基

14.如何进行动物细胞大规模培养？ 大规模培养的方法：（1）悬浮细胞（2）贴壁细胞

（3）贴壁—悬浮细胞：a、微载体培养 b、包埋和微囊培养 c、结团培养

大规模培养的操作方式：（1）分批式操作（2）半连续式操作（3）灌流式操作

15.动物细胞生物反应器必须具备哪些基本要求？有哪些类型？特定是什么？

动物细胞反应器具备的基本要求：

（1）制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基，细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的。

（2）生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能

（3）密封性良好，可避免一切外采的不需要的微生物污染。（4）对培养基环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精度高，而且能保持环境质量的均一。

（5）可长期连续运转，这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤其重要。

（6）容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积。

（7）拆装，连结和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修（8）设备成本尽可能低。反应器类型及特点：

（1）搅拌罐式生物反应器：主要用于是悬浮细胞培养，微载体培养，微囊和巨载体培养以及结团培养

（2）气升式生物反应器：气体通过装在罐底的喷管进入 反应器的导流管，致使该部液体的密度小于导流管外部的液体形成循环流。（3）中空纤维式生物反应器：占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低，不能重复使用，不能耐高压蒸汽灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌，难以取样检测。

（4）透析袋或膜式生物反应器：可使细胞达到高密度，又可随意组合进行操作，对产品进行浓缩纯化。

（5）固定床或流化床生物反应器：结构简单，装填材料易得。16.动物细胞制药有哪些新进展？

17.什么是单克隆抗体？单克隆抗体有哪些不足？

单克隆抗体：是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的抗体。不足：

（1）单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，在人体内半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间。

（2）完整的抗体分子，即Ig的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效治疗浓度。

18如何制备杂交瘤细胞？

将两个细胞（例如 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞）通过诱导融合形成杂交细胞，具体操作时为了提高成功率会用多个细胞同时杂交，然后筛选出目的细胞，再进行细胞培养使其有丝分裂而增值，得到大量目的细胞（杂交瘤细胞）。

19．基因工程抗体有哪些类型？其特性和制备方法有什么不同？ 基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。

（1）嵌合抗体 嵌合抗体（chimeric atibody）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。

（2）人源性抗体 是将人抗体的 CDR 代之以鼠源性单克隆抗体的 CDR，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。

（3）完全人源化抗体 采用基因敲除术将小鼠 Ig 基因敲除，代之以人 Ig 基因，然后用 Ag 免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。

（4）单链抗体 是将 Ig 的 H 链和 L 链的 V 区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链 FV（single chain fragment of variable region,sFv）。SFv 穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。

（5）双特异性抗体 将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL 细胞、NK 细胞、LAK 细胞）表面分子的抗体（CD3 抗体或 CD16 抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。20.抗体治疗药物有哪些？

（1）放射性同位素标记的抗体治疗药物（2）抗癌药物偶联的抗体药物（3）毒素偶联的抗体药物 21.抗体诊断试剂有哪些类型？（1）血清学鉴定用的抗体试剂（2）免疫标记用的抗体试剂（3）导向诊断药物（4）CD单克隆抗体系列

22.单克隆抗体制备的基本原理与过程？有什么意义？

原理：

B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。过程

1）免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。

2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。

4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。

5）克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。

（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。

（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。

（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。

（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。

6）细胞的冻存与复苏

7）大规模单克隆抗体的制备

选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。意义：

用于以下各种生命科学实验并具有医用价值（1）沉淀反应：Precipitation reaction

（2）凝集实验：haemaglutination（3）放射免疫学方法检测免疫复合物

（4）流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离。（5）ELISA 等免疫学检测

（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的亲和力。

(7)免疫印记（western blotting)（8）免疫沉淀：

（9）亲和层析：分离蛋白质（10）磁珠分离细胞

（11）临床疾病的诊断和治疗；

23.植物细胞培养的培养基由哪些主要成分组成？（1）无机盐（2）碳源

（3）植物生长调节剂（4）有机氮源（5）维生素

24.植物细胞大规模培养的主要方法及其特点是什么？

（1）成批培养法：将培养基一次性地加入反应器中，接种，培养一定时间后收获细胞的操作方式。

特点：操作强度低，设备简单，容易发生污染，通气受限制。（2）半连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部

分培养液和 新鲜培养液进行交换的培养方法。

（3）连续培养法：是利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度采集细胞和培养液，并以同样速度供给诶新鲜培养基以使细胞生长环境长期恒定的方法。

（4）固定化培养法：将细胞固定于尼龙网套内，或固定于中空纤维有网状多孔板，尼龙套和中空纤维膜上，放入培养液中进行培养，或连续流入新鲜培养液，进行连续培养及连续收集培养产物，也可通入净化空气以代替搅拌。25.影响植物细胞积累次级代谢产物的因素有哪些？（1）生物条件

（2）物理条件（3）化学条件（4）工业培养条件

26.各种植物细胞培养的生物反应器的特点是什么？

（1）机械搅拌式生物反应器：有较大的操作范围，混合程度高，适应性广，剪切力大，容易损伤细胞。

（2）鼓泡式生物反应器：优于机械搅拌式反应器。但由于鼓泡式反应器对氧的利用率较低，如果用较大通气量，则产生的剪切力会损伤细胞。

（3）气升式生物反应器：广泛应用于植物细胞培养的研究和生产，最高细胞浓度和最短倍增时间可从气升罐中得到。

（4）转鼓式生物反应器：生长速率高，其氧的传递及剪切力对细胞 的伤害水平方面均优于气升式反应器。

（5）固定化细胞反应器：可保护细胞免受剪切，可长时间重复使用，易于实现 细胞的高密度培养，细胞接触良好，易于分化，有利于次级代谢产物的合成，减少细胞的遗传不稳定 性，易于实现连续化操作。

27.植物细胞培养有哪些新进展？

（1）诱导了在植物细胞工程研究中的应用（2）前体饲喂（3）两相法培养

（4）转基因技术在次级代谢产物生产中的应用（5）植物身为转化技术与生物制药 28.酶工程主要研究内容是什么？

（1）酶的分离、纯化、大批量生产及应用。（2）酶和细胞的固定化及酶反应器的研究。

（3）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶研究。

（4）酶的分子改造与化学修饰以及酶的结构与功能之间关系的研究。（5）有机相中酶反应的研究。

（6）酶的抑制剂，激活剂的开发及应用与研究。（7）抗体酶，核酸酶的研究。

（8）模拟酶，合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。29.固定化酶回合固定化细胞的特点和优点各是什么？怎样制备？ 固定化酶的特点和优点:

（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；

（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处

理使酶失活的步骤；

（3）稳定性显著提高；

（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；

（5）提供了研究酶动力学的良好模型。

固定化细胞的特点和优点：

1.使用固定化细胞省去了酶的分离过程，显著降低了成本。

2.固定化细胞为多酶系统，不需要辅助因子

3.增加了细胞对不利环境的耐逆性，可重复使用。

4.增加了酶的稳定性。

固定化酶制备：

（1）吸附法：

过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。（2）包埋发：

将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。（3）共价键结合法：

将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。

（4）交联法

使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。

固定化细胞的制备：

一种固定化细胞的制备方法，包括以下步骤： a．选用甲烷利用细菌Methylomonas sp．GYJ3，在可供给微生物能量的甲烷和空气的混合气体中，辅以无机培养基进行培养； b．培养好的菌体细胞离心后用无机培养基悬浮，加入到硅酸钠溶液和盐酸溶液制成的溶胶中，待溶胶凝固变成凝胶后，就制得了包埋的细胞，将包埋细胞置于低温环境中以增加包埋强度； c．用磷酸盐缓冲液洗去包埋细胞的杂质，充入可给微生物提供能量的相应的甲烷与空气的混合气体，在摇床上培养48－120小时。

30.为什么要对酶进行化学修饰？

（1）.更好的热稳定性以及抗核酸酶性对于临床应用很重要；（2）提高酶蛋白在体内的半衰期；（3）提高酶蛋白的靶向性；（4）提高酶蛋白效力。

31.何谓分子印迹？分子印迹的应用范围有哪些？

分子印迹：是指制备对某一特定化合物具有选择性的聚合物的过程。

应用范围：

（1）用于化学仿生传感器（2）色谱分离（3）固相萃取（4）天然杭体模拟（5）模拟酶催化（6）控缓释药物

32.有机相酶反应的定义及其优点是什么？

有机相酶反应：是指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行对的催化反应。优点是：

（1）增加疏水性底物或产物的溶解度。（2）热力学平衡向合成方向移动。（3）可抑制有水剂中分离纯化产物。（4）酶不溶于有机介质，易于回收再利用。（5）容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。（6）酶的热稳定性提高，PH的适应性扩大。（7）无微生物污染。

（8）能测定某介质中反应时，通过改变溶剂，能够控制底物的特异性、区域选择性和立体选择性，并可以催化某些在水中不能进行的反应。33.何谓人工模拟酶？

人工模拟酶：是指根据酶的作用机理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂。

34.发酵工程的研究内容包括哪些？

发酵工程研究内容涉及：菌种的培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、溶氧、发酵条件的优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的分离纯化和精制等。35.微生物菌种诱变使用的主要诱变剂有哪些？它们的诱变机制是什么？

(1)物理诱变剂：主要有紫外线、X射线、γ射线、快中子、α射线、β射线和超声波等。

（2）化学诱变剂：金属离子、一般化学试剂、生物碱、抗代谢物、生长刺激素、抗生素及高分子化合物、杀菌剂、染料等。诱变机制：

1、碱基的类似物诱发突变

2、改变DNA的化学结构

3、结合到DNA分子上诱发移码突变

4、紫外线及其他射线引起的DNA分子的变化 36.微生物发酵主要有哪些方式？各具有什么特点？

（一）分批发酵：是将全部物料一次投入到反应器中，经灭菌，接种，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的操作方式。特点：

（1）对温度的要求低，工艺操作简单；（2）比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；

（3）对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高（4）人力、物力、动力消耗较大；（5）生产周期较长（6）生产效率低

（二）补料分批发酵：指在微生物分批发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。特点：

(1)可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物阻遏作用。

(2)可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率；(3)菌种的变异及杂菌污染问题易控制；(4)便于自动化控制

(三)连续发酵：是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。

特点：

（1）设备的体积可以减小；v（2）操作时间短，总的操作管理方便，便于自动化控制；（3）产物稳定，人力物力节省，生产费用低（4）对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高；（5）营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低

（6）杂菌污染的机会较多，菌种易因变异而发生退化。37.影响发酵的主要因素有哪些？如何对发酵过程进行控制？（1）温度 温度对微生物的影响是多方面的。首先，温度影响酶的活性。在最适温度范围内，随着温度的升高，菌体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。当超过最适温度范围以后，随着温度的升高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期缩短，产量降低。温度也能影响生物合成的途径。例如，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强，但当温度超过35℃时，则只合成四环素而不合成金霉素。此外，温度还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收等。因此，要保证正常的发酵过程，就需维持最适温度。但菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同。如灰色链霉菌的最适生长温度是37℃，但产生抗生素的最适温度是28℃。通常，必须通过实验来确定不同菌种各发酵阶段的最适温度，采取分段控制。（2）pH pH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。细胞膜的带电荷状况如果发生变化，膜的透性也会改变，从而有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌。此外，pH还会影响培养基中营养物质的分解等。因此，应控制发酵液的pH。但不同菌种生长阶段和合成产物阶段的最适pH往往不同，需要分别加以控制。在发酵过程中，随着菌体对营养物质的利用和代谢产物的积累，发酵液的pH必然发生变化。如当尿素被分解时，发酵液中的NH+4浓度就会上升，pH也随之上升。在工业生产上，常采用在发酵液中添加维持pH的缓冲系统，或通过中间补加氨水、尿素、碳酸铵或碳酸

钙来控制pH。目前，国内已研制出检测发酵过程的pH电极，用于连续测定和记录pH变化，并由pH控制器调节酸、碱的加入量。（3）溶解氧 氧的供应对需氧发酵来说，是一个关键因素。从葡萄糖氧化的需氧量来看，1 mol的葡萄糖彻底氧化分解，需6 mol的氧；当糖用于合成代谢产物时，1 mol葡萄糖约需1.9 mol的氧。因此，好氧型微生物对氧的需要量是很大的，但在发酵过程中菌种只能利用发酵液中的溶解氧，然而氧很难溶于水。在101.32 kPa、25℃时，氧在水中的溶解度为0.26 mmol/L。在同样条件下，氧在发酵液中的溶解度仅为0.20 mmol/L。而且随着温度的升高，溶解度还会下降。因此，必须向发酵液中连续补充大量的氧，经搅拌，可以提高氧在发酵液中的溶解度。

（4）泡沫 在发酵过程中，通气搅拌、微生物的代谢过程及培养基中某些成分的分解等，都有可能产生泡沫。发酵过程中产生一定数量的泡沫是正常现象，但过多的持久性泡沫对发酵是不利的。因为泡沫会占据发酵罐的容积，影响通气和搅拌的正常进行，甚至导致代谢异常，因而必须消除泡沫。常用的消泡沫措施有两类：一类是安装消泡沫挡板，通过强烈的机械振荡，促使泡沫破裂；另一类是使用消泡沫剂。（5）营养物质的浓度 发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢产物的积累。如在谷氨酸发酵中，NH+4浓度的变化，会影响代谢途径(见谷氨酸发酵)。因此，在发酵过程中，也应根据具体情况进行控制。38.如何克隆抗生素生物合成基因？

在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。39．基因工程在抗生素生产中有哪些应用？

第四篇：生物技术制药总结

生物技术：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术

1基因工程制药：利用基因重组技术将外援基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。

2.载体：是携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外援基因或DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

细胞传代passage：将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作。细胞克隆培养（clonal culture）：即单细胞分离培养，是将动物组织分散后，将一个细胞从群体细胞中分离出来，由单个细胞培养成纯系细胞集群。

动物细胞的复苏：其原则是快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

细胞融合（cell fusion）：是指在外力（诱导剂或促融剂）作用下，两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象，或称细胞杂交。

转基因动物（transgenic animal）：采用基因工程技术将外源目的基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，在经过发育途径将外源目的基因稳定地传给子代，通过这项技术所获得的动物即为转基因动物。

胚胎干细胞（embryo stem cell）：简称ES细胞，是从早期胚胎细胞团分离出来并能在体外培养的一种高度未分化的、具有形成所有成年细胞类型能力的全能干细胞。它是正常二倍体型，像早期胚胎细胞一样具有发育上的全能性。

抗体工程制药（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、细胞工程（包括动物细胞工程和植物细胞工程）和转基因动物及转基因植物技术生产抗体药物的过程。

单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）：简称单抗，将能大量扩增和永生的骨髓瘤细胞和能合成分泌特异性抗体的B细胞（仅识别一种抗原表位）进行融合得到杂交瘤细胞，经筛选和克隆化的杂交瘤细胞仅能合成及分泌抗单一抗原表位的特异性抗体。

杂交瘤细胞克隆化（cloning）：是指将阳性孔中分泌抗体的单个细胞分离出来。融合后的杂交瘤细胞一般要经过3次克隆化才能达到100%的阳性克隆。

双特异性抗体（bispecific antibody，bsAb）：亦称双功能抗体，是含有两个不同配体结合位点的抗体分子，它有两个不同的抗原结合部位（两个臂），可分别结合两种不同的抗原表位。嵌合抗体（chimeric antibody）：是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达的抗体，表达的抗体分子中轻、重链的V区是异源的，而C区是人源的，即整个抗体分子的60%~70%是人源的。

人源化抗体（humanized antibody，hAb）：通过CDR移植即把鼠抗体的CDR（互补决定区）序列移植到人抗体的可变区内所得到的抗体，也称CDR移植抗体或改型抗体。该抗体既具有鼠源性单抗的特异性又保持了人抗体的功能（C区的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激机体特异性免疫细胞，使其活化、增值、分化，最终产生免疫效应物质（抗体或致敏淋巴细胞）的特性。

免疫反应性（immunoreactivity）：抗原与相应免疫效应物质在体内或体外相遇时，可发生

特异性结合而产生免疫反应的特性。

减毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通过不同的方式手段使病原体的毒性即致病

性减弱或丧失后获得的一种由完整的微生物组成的疫苗制品。

灭活疫苗（inactivated）：是将病原体经培养增殖、灭活纯化处理，使其完全丧失感染性，但保留了病原体的几乎全部组分因此灭活疫苗具有较好的免疫原性和安全性。

亚单位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某种表面结构成分（抗原）制成、能诱发

机体产生抗体的疫苗。

分解代谢阻遏（catabolite repression）：在菌体的生长阶段被菌体快速利用的碳源会产

生大量的分解产物，这些代谢产物阻遏次级代谢酶系的合成，只有当这类碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌体才由生长阶段转入次级代谢产物合成阶段，这种发酵过程中的次级代

谢产物在碳源被消耗尽时才产生和积累的现象称为分解代谢阻遏。

生物技术：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原

理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。

种龄（inoculumage）：种子罐中培养的菌丝转入下一级种子罐或发酵罐时得培养时间

生物技术药物的特性？

（1）理化性质特性（1）相对分子量大（2）结构复杂：蛋白质和核酸均为生物大分子，蛋

白质含有四级结构（3）稳定性差（2）药理学作用特性（1）活性与作用机制明确：活性物

质对生理功能的调节机制比较清楚（2）作用针对性强：有特定的靶分子、靶细胞或靶器官

（3）毒性低：生物技术药物本身是体内天然存在的物质或它们的衍生物（4）体内半衰期短

（5）有种属特异性（6）可产生免疫原抑制（3）生产制备特性（1）药物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目标产物的杂质：应采取快速分离纯化的方法以除去影响

目标产物稳定性的物质（3）制备工艺条件温和：目的产物不稳定（4）分离纯化困难：需要

多种不同原理的层析单元操作才能达到要用的纯度（5）产品易受有害物质（4）质量控制特

性

质粒的特点：（1）是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。（2）质粒

具有遗传传递和遗传交换的能力（3）质粒具有不相容性：两种亲缘关系密切的不同质粒不

能在同一宿主细胞中稳定共存。4..共价闭合环状DNA(ccDNA)，开环DNA(ocDNA)，线状

DNA(lDNA)在琼脂糖凝胶电泳中

5.复制子松弛型复制子的复制和宿主蛋白的合成功能

无关，宿主染色体DNA复制受阻时，质粒仍可复制；严谨型复制子的复制与宿主蛋白质的合成相关，因此在每个宿主细胞中为低拷贝数，仅1~3个。

6.克隆表达的质粒载体涉及三个要素：

（1）复制子（2）选择标记：由质粒携带的赋予宿主细胞新的表型的基因，用于鉴定和筛选

转化有质粒的宿主细胞。常见的标记：氨苄西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位点

（MCS）：质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制备方法

(1)化学合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通

过下列步骤扩增DNA：a）变性：双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；b）退火：降

低温度，引物与单链模板结合；c）延伸：温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，最终与单链

模板形成双链，并开始下一个变性、退火、延伸循环。（3）基因文库法（4）cDNA文库法

8.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之间的连接方式：粘性末端的连接效率高于平头末端。（2）目的基因与载

体的浓度和比例：增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因与载体DNA的摩尔数比应大

于1.（3）连接温度、时间、连接酶的活性及缓冲液。

9.重组DNA导入大肠杆菌，常用的感受态细胞制备方法：氯化钙法

10.重组子的筛选与鉴定：

（1）载体遗传标记法：a)抗生素抗性筛选法

b)互补筛选法：重组子转化成宿主细胞，载体的表达产物与宿主细胞中营养缺陷性突变发生

互补作用，从而实现重组子的筛选。蓝白斑筛选：lacZα基因可编码β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互补肽段，与宿主细胞编码的缺陷型β—半乳糖苷酶α实现互补，可分解底物5-溴-4-

氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成蓝色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空载体的宿主细胞呈蓝色。c)营养缺陷筛选法d噬菌斑筛选法(2)核酸分子杂交法

(3)限制性内切酶图谱法(4)DNA序列测定法：双脱氧终止法(5)目的基因表达产物测定法

12.外源基因在大肠杆菌中的表达形式：

(1)胞内表达：(a)非融合蛋白的胞内表达：形成包涵体（B）融合蛋白的胞内表达：在大肠杆

菌内较稳定（2）分泌表达：（a)分泌至周质（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表达的重要调控元件

(1)启动子：是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列，是决定外源基

因在原核生物中表达效率的关键因素。(2)核糖体结合位点：SD序列(3)终止子

13.大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素：(1)外源基因密码子：偏好密码子（蛋白质合成迅速，错配率低）和稀有密码子(2)mRNA结构：减少G、C含量，增加A、T含量(3)表达

载体：高拷贝数、适用范围广、稳定性高、表达产物容易纯化(4)外源蛋白稳定性

14.分离纯化技术应满足下列要求：(1)技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；(2)选

择性要好(3)回收率要高(4)两个技术之间要能直接衔接(5)整个分离纯化过程要快

15.基因重组蛋白的主要分离技术

(1)离心(2)沉淀(3)膜分离(4)双水相萃取

16基因重组蛋白的主要纯化技术:

(1)离子交换层析(2)亲和层析(3)凝胶过滤层析(4)反相层析和疏水层析

17.选择分离纯化方法的依据：

（元，层析分离次序的选择也同样重要。(3)根据分离纯化工艺的要求来选择(a)具有良好的稳

定性、重复性和较高的安全性(b)尽可能减少组成工艺的步骤(c)分离纯化工艺所用的时间要

尽可能的短(d)工艺和技术必须高效

18．基因工程药物的质量控制要点

(1)蛋白质含量的测定(2)蛋白质纯度检测(3)蛋白质分子质量测定(4)蛋白质等电点测定(5)蛋

白质序列分析(6)内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析

19.蛋白质含量的测定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考马斯亮蓝法(5)SDS-PAGE扫描分析法

20.蛋白质纯度的检测：电泳法、层析法、质谱法、末端氨基酸残基分析法

21.蛋白质Mr测定有SDS-PAGE法、凝胶层析法、质谱法

22.蛋白质等电点测定的常用方法：等电聚焦法。

23.蛋白质序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根据体外培养时动物细胞对生长基质的依赖性，可将动物细胞分为

(1)贴壁依赖性细胞(2)非贴壁依赖性细胞(3)兼性贴壁细胞

1.动物细胞培养的环境条件

(1)培养温度（哺乳类37℃，昆虫25~28℃）(2)pH值（大多数7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本营养物质(6)渗透压

3.动物细胞的培养特性

(1)比微生物细胞大得多，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；(2)

倍增时间长，生长缓慢，正常二倍体细胞的生长寿命是有限的；(3)对培养基要求高，易受

微生物污染，培养时需要添加抗生素；(4)生长大多需贴附于基质，相互粘连以集群形式存

在，并有接触抑制现象；(5)多半将产物分泌在细胞外，便于收集和纯化；(6)对蛋白质的合成条件和修饰功能与细菌不同，动物细胞可对蛋白质进行完善的翻译后修饰，特别是糖基化，与天然产品更一致，更适合于临床应用。

4.原代培养的主要步骤

(1)从健康动物体内无菌条件下取出适量组织，剪切成小薄片；(2)加入适宜浓度的胰蛋白酶

或胶原酶和EDTA等进行消化作用使细胞分散；(3)将分散的细胞进行洗涤并纯化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的浓度加到培养基中，37℃下进行原代培养，并适时进行传代培养。分为

组织块培养和单层细胞培养两种方法。

5.动物细胞深低温保存的基本原理

在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停滞状态，故可以长期保存。

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发

生机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等，能引起细胞

死亡。目前为了保存细胞，都采用液氮低温（-196℃）冻存的方法。

6.动物细胞的复苏

其原则是快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻

存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

7.动物细胞营养要求特点

(1)碳源不能为无机物，大多为葡萄糖；(2)氮源不能为无机物，主要为各种氨基酸；(3)在很

多情况下尚需添加5%~20%的小牛血清或适量的动物胚胎浸出液。

8.动物细胞的大规模培养方法

(1)悬浮培养法(2)微载体培养法(3)多孔载体培养法(4)微囊化培养法(5)中空纤维培养法

9.诱导动物细胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)电击法(4)激光法

10.转基因动物生物反应器（整体掌握？）

(1)转基因动物乳腺生物反应器（药用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)转基因动物血液生物反应器（人血红蛋白、抗体或非活性状态的融合蛋白）(3)转基因动

物尿液生物反应器（促性腺激素）(4)转基因鸡（蛋）生物反应器（人干扰素）

1.单克隆抗体技术的基本原理

基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞和B细胞的融合。骨髓瘤细胞在体外

培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫B细胞和骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代

细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗

体的能力。通常使用HAT（H为次黄嘌呤、A为氨基蝶呤、T为胸腺嘧啶核苷）选择培养基

对杂交瘤细胞进行筛选。未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡，未融合的骨髓瘤细

胞合成DNA的从头合成途径被培养基中的A阻断，又因缺乏HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸

核糖转移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培养基中的H和T完成DNA的合成过

程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT和TK，因此能在HAT培养基

中长期存活与繁殖并分泌抗体。

2.单克隆抗体的大量制备主要方法:（1）体内培养法（2）体外培养法

6.重组ScFv的应用:(1)用于构建和生产免疫毒素(2)用于肿瘤的影像分析和治疗

7.噬菌体抗体库技术的基本原理:用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗

体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，可以方便地利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。

7.噬菌体抗体库构建过程

(1)从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B细胞，提取mRNA并反转录为cDNA；

(2)应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的抗体基因片段；

(3)构建噬菌体载体；(4)用表达载体转化细菌，构建全套抗体库。

通过多轮的抗原亲和吸附（结合）-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。其中，噬

菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤。

减毒活疫苗的优缺点：

优点：

（1）通过自然感染途径接种，可以诱导包括体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫在内的更全面的免疫应答，使机体获得更广泛的免疫保护；（2）由于使用的是活的微生物他们可以在体内

长时间起作用而诱导较强的免疫反应，且由于活的微生物有增殖的特性，理论上只需要接

种一次，即可达到满意的免疫效果；（3）可能引起水平传播扩大免疫效果，增强群体免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐剂，生产工艺一般不需要浓缩纯化，价格低廉。

缺点：

(1)一般减毒活疫苗均保留一定残余毒力，对一些个体如免疫缺陷者可能诱发严重疾病，并

且由于种种原因如基因修饰等，减毒活疫苗可能出现毒力回复即“返祖”现象；(2)减毒活

疫苗是活的微生物制剂，可能造成环境污染而引发交叉感染等，并可能滞留在环境中形成传

染源；(3)缺损颗粒可能干扰免疫效果，因此产品分析评估较为困难；(4)保存运输等条件要

求较高，如需冷藏等。

1.灭活疫苗的特点：(1)灭活疫苗常需多次接种；(2)接种灭活疫苗产生的抗体滴度随着时

间而下降；(3)灭活疫苗需要量大。

第七章 发酵工程制药

1.发酵类型：(1)微生物菌体发酵(2)微生物的酶(3)微生物的代谢产物发酵(4)微生物转化发

酵(5)生物工程菌发酵

2.微生物发酵生产药物的分类：(1)抗生素类(2)氨基酸类(3)核苷酸类(4)维生素类(5)甾体类

激素(6)多糖类(6)治疗酶及酶抑制剂

3.菌种保藏方法：(1)斜面低温保藏法(2)石蜡油封存法(3)沙土管保藏法(4)麸皮保藏法(5)甘

油悬液保藏法(6)冷东真空干燥保藏法(7)液氮超低温保藏法(8)宿主保藏法

4.种子液具备的条件：(1)菌种的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；(2)

生理状态稳定；(3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；(4)无杂菌污染，保证纯种培养；()保持稳定的生产能力

5.微生物的发酵方式：（1）分批发酵（2）补料—分批发酵（3）半连续发酵（4）连续发酵

5.发酵过程的中间分析项目：（1）产物产量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌丝形

态

6.发酵过程的影响因素及控制：（1）菌体浓度的影响及控制（2）营养物质对发酵的影响

及控制（3）温度的影响及控制（4）PH的影响及控制（5）溶氧的影响及控制（6）二氧化碳的影响及控制（7）泡沫的影响及控制（8）染菌对发酵的影响

第五篇：生物技术制药教学大纲

第一章 绪论（2学时）第一节 生物技术概述 1 生物技术的概念 2 生物技术发展史 第二节 生物技术制药 1 生物技术制药的概念 2 生物技术在制药中的应用 我国生物技术制药现状和发展前景 4 医药生物技术发展展望

第二章 生物药物（10学时）

1．生物药物的来源、特性、分类与制备。（2学时）

2．氨基酸类药物：氨基酸类药物研究概况；在医药中的应用；氨基酸生产。（2学时）3．多肽、蛋白质类药物：多肽、蛋白质类药物的特点、分离纯化方法、工业生产制备过程。（2学时）

4．核酸类药物：概述（分类、应用）；生产方法；核酸类药物的制备。（2学时）5．糖类药物：制备；纯化。（2学时）

第三章 基因工程制药（8学时）

通过本章学习，了解基因工程药物研制的意义，掌握基因工程药物的研制过程、研制方法。1概述。

2基因工程药物生产的基本过程。(2)3目的基因的获得：直接分离法；从基因文库中筛选；逆转录法；人工合成法。4目的基因与运载体的体外重组：常用载体；目的基因与运载体的体外重组。5重组分子导入受体细胞；导入方法；影响转化的因素；阳性重组体的筛选。(2)6基因表达：大肠杆菌中的基因表达；真核基因在原核生物中的表达方式；真核基因在真核生物中的表达；真核基因在动物细胞中的表达。(2)7基因工程下游技术；下游技术的要求；基因工程菌的稳定性；基因工程菌发酵。8基因工程药物的分离、纯化：分离纯化的基本过程；分离纯化的技术。

9基因工程药物的质量控制:材料的质量控制;培养过程的质量控制;纯化工艺工程的质量控制。(2)第四章 动物细胞工程制药（8学时）1 概述： 形态及生理特性。（2）生产用的动物细胞：生产用动物细胞的要求；生产用动物细胞的获取。4 基因工程细胞的构建和筛选；真核细胞基因表达载体的构建；基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选。（2）动物细胞的培养条件和培养基 6 动物细胞培养的基本方法（2）7 动物细胞大量培养的方法和操作方式 动物细胞生物反应器及检测控制系统：搅拌式生物反应器；气升式生物反应器；流化床生物反应器。（2）

第五章 抗体制药（4学时）1概述

2单克隆抗体：制备；细胞融合；杂交瘤的培养、筛选及克隆化。（2）

3鼠源性单克隆抗体的改造：Ig分子的结构模式图；结构改造；基因工程抗体。4抗体的应用：临床检验；层析介质；导向药物。（2）