第一篇：生物技术制药考试题复习
一：选择题
1、酶的主要来源是（C）
A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/植物细胞与组织培养
2、所谓“第三代生物技术”是指(A)A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术
3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A)A、大于 B、等于 C、小于 D、无关
4、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：（E）
A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用
B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定
C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化
5、目前基因治疗最常用的载体是：(B)A、腺病毒 B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒
6、cDNA第一链合成所需的引物是：（D）
A、Poly A B、Poly C C、Poly G D、Poly T E、发夹结构
7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A)A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段
B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达
C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达
D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制
8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A)A、表达产物的功能 B、表达产物的产量 C.表达产物的稳定性
D.表达产物分离纯化的难易
9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和（安全性鉴定）。
10、基因工程药物的化学本质属于：(C)A.糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类
11、用聚二乙醇（PEG）诱导细胞融合时，下列错误的是：(C)A、PEG的相对分子量大，促进融合率高 B、PEG的浓度高，促进融合率高
C、PEG的相对分子量小，促进融合率高 D、PEG的最佳相对分子量为4000
12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C)
A、表达产物为糖基化蛋白质 B、表达产物存在的部位是在菌体内
C、容易培养，产物提纯简单D、表达产物为天然产物
13、人类第一个基因工程药物是：(A)
A、人胰岛素 B、重组链激酶 C、促红细胞生成素 D、乙型肝炎疫苗
14、下列不属于加工改造后的抗体是：(C)A、人-鼠嵌合抗体 B、单链抗体C、鼠源性单克隆抗体 D、单域抗体
15、动物细胞培养的条件中，不正确的是：(D)A.最适pH为7.2-7.4 B.最适温度为37±0.5C C.最理想的渗透压为290-300mOsm/kg D.氧浓度为100%
16、第三代抗体是指：(D)A、B淋巴细胞合成和分泌的球蛋白 B、多发性骨髓瘤细胞产生的免疫球蛋白
C、融合细胞产生的单克隆抗体D、利用基因工程技术制备的基因工程抗体
17、现代生物技术的标志是：(C)A、DNA互补双螺旋结构模型的提出 B、DNA测序技术的诞生 C、第一只克隆羊“多莉”的诞生 D、人类基因组草图的完成18、获得目的基因最常用的方法是：(B)A、化学合成法 B、PCR技术 C、逆转录法 D、DNA探针技术
19、疫苗组成是由抗原和（佐剂）组成
20、鸟枪法克隆目的基因的战略适用于（A）
A、原核细菌B、酵母菌C、丝状真菌D、植物E、人类
21、cDNA法获得目的基因的优点是：（B）A.成功率高 B.不含内含子 C.操作简便
D.表达产物可以分泌 E.能纠正密码子的偏爱性
22、有机相酶反应的优点：
1．有利于疏水性底物的反应；2．可提高酶的热稳定性；3．从低沸点的溶剂中易分离纯化产物；4．热力学平衡向产物方向移动如脂合成和肽合成；5．减少由水引起的副反应，如水解反应；6．酶易于实现固定化；7．酶和产物易于回收；8．可避免微生物污染。
23、抗体发展阶段：抗血清、单克隆抗体、基因工程抗体。24、25、凝胶过滤层析进行分离的依据是：分子大小
26、质粒载体必备三要素：复制子、选择标记、多克隆位点。
27、体外培养动物细胞三类型：贴壁依赖性细胞、非贴壁依赖性细胞、兼性贴壁细胞。
28、下列关于细胞冻存及复苏过程的描述不正确的是（B）。A.冻存的细胞提前一天更换全部培养液 B.细胞冻存的原则为快速冻存
C.每只冻存管中以冻存（1～1.5）×106个细胞为宜 D.冻存液中含有8％二甲基亚砜
E.复苏时将冻存细胞从液氮中取出迅速投入42℃温水中速溶
29、能将IgG水解成两个抗原片段和一个可结晶片段的是：（木瓜蛋白酶）。30、单克隆技术抗体是B细胞和（杂交瘤细胞）的结合。
31、所谓“第二代基因工程”是指(A)A、蛋白质工程 B、细胞工程 C、酶工程 D、抗体工程
32、酶和细胞固定化最常用、最有效的方法是：(A)A、载体结合法 B、交联法 C、包埋法 D、选择性热变性法
33、真核基因在大肠杆菌中以融合蛋白形式表达，下列错误的是：(D)A、基因操作简便 B、只能作抗原用
C、容易实现高效表达 D、易被细菌酶类水解
34、目前应用最广泛的产酶菌是：(A)A.大肠杆菌 B.枯草杆菌 C.青霉菌 D.链霉菌
35、大肠杆菌的基因表达系统为(A)A、pBV220/pET B、YEp/YRp C、pUC/λgt11 D、pBR322/λgt10
36、用于生产α-干扰素的动物细胞是(A)A、Namalum Namalwa B、Vero C、WI-38 D、MIRC-5
37、外源基因在动物细胞与大肠杆菌中表达产物的主要区别是(A)A.糖基化 B.产量高 C.性质稳定 D.疗效可靠
38、基因表达最常用的宿主菌是(A)A.大肠杆菌 B.枯草芽孢杆菌 C.链霉菌 D.酵母
39、筛选杂交瘤细胞（脾-瘤融合细胞）选用的培养基是(B)A、HT B、HAT C、RMP1640 D、BME
40、采用凝胶过滤法分离单克隆抗体，最高峰属于(A)A、IgG B、IgM C、IgA D、IgE
41、改造鼠源性单克隆抗体的首要目的是(C)
A、降低相对分子量 B、增加组织通透性 C、降低免疫源性 D、延长半衰期
42、鼠源性单克隆抗体改造后得到小分子抗体，常用的是(B)A、单域抗体 B、单链抗体 C、Fab片段抗体 D、最小识别单位
43、最具有抗原活性的蛋白是：（丙种球蛋白）。
44、基因工程的单元操作顺序是（A）
A．酶切，连接，转化，筛选，验证 B.酶切，转化，连接，筛选，验证 C．连接，转化，筛选，验证，酶切 D.验证，酶切，连接，筛选，转化 E.酶切，连接，筛选，转化，验证
45、CHO-K1细胞来源于：答案：中国仓鼠卵巢。
46、下列五个DNA片段含有回文结构的是（D）
A．GAAACTGCTTTGAC B.GAAACTGGAAACTG C.GAAACTGGTCAAAG D.GAAACTGCAGTTTC E.GAAACTGCAGAAAG47、48、T4-DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起，其底物的关键基团是（D）
A．2’-OH和5’-P B.2’-OH和3’-P C.3’-OH和2’-P D.3’-OH和5’-P E.5’-OH和3’-P
49、目前工业上生产酶的方法大多数是（微生物发酵）。
50、若某质粒带有lacZ标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入（D）
A、半乳糖B、葡萄糖C、蔗糖
D、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷（X-gal）E、异丙基巯基-b-半乳糖苷（IPTG）
51、对酶活性有影响的物理化学方法是（温度，pH值，酶的浓度，底物浓度，激活剂，抑制剂）
52、分子杂交的化学原理是形成（E）
A.共价键 B.离子键 C.疏水键 D.配位键 E.氢键
二、填空题
1、人工化学合成DNA新形成的核苷酸的合成方向是(3’→5'),合成的DNA5’末端是（-P），3’末端是（-OH）。
2、理想载体应具备的条件：（至少有一个复制起点，有多克隆位点，具备转化的功能，遗传标记基因，具有较高的载装能力）。
3、进行PCR扩增DNA时，反映体系应加入（DNA模板，DNA聚合酶，引物，dNTP的缓冲液）。
4、细胞培养基三大类：（天然培养基，合成培养基，无血清培养基）。
5、质粒DNA三种构型：（共价闭合环状DNA（cccDNA),开环DNA(ocDNA),线状DNA(1DNA)）。
6、微生物转化中常用的微生物有：（细菌，真菌，放线菌）。
7、生物技术的核心与关键是（基因工程），生物技术的基础是(生化工程)，生物技术的条件是(细胞工程)，生物技术获得最终产物的手段是(发酵工程)。
8、PCR全称是（聚合酶链反应），以（mRNA)为引物，基本反应步骤是（变性，退火，延伸）。
9、在翻译过程中mRNA与核糖体的结合位点：（SD序列，SD序列与起始密码子AUG之间的距离）。
10、克隆真核基因常用的方法：（逆转录法，化学合成法）。
11、将抗体转变为酶的四种途径：（诱导，拷贝，引入，化学修饰）。
12、酶固定法中包埋法有（网格型和微囊型）两种。
13、噬菌体表达载体有（穿梭，插入，置换）三种。
14、鼠源性单克隆抗体改造后的小分子抗体类型（人-鼠联合抗体，改形抗体，Fab抗体，单链抗体，单域抗体，分子识别单位）。
15、抗体药物的特点：（多样性，定向性，特异性）。
16、质粒载体结构包括：（复制子，选择标记，多克隆位点）。
17、蛋白质药物按分子大小提取方法：（透析，层析，离心，超滤）。
18、核酸类药物分为：（反义核酸，核酶，脱氢核酶，抗基因寡核苷酸，裸DNA疫苗，基因药物）。
19、动物细胞的培养条件：（培养温度，pH值，通氧量，防止污染，基本营养物质，渗透压）。
20、根据动物细胞对生长基质的依赖性可分为：（贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞）。
21、答案：感受态细胞。
22、三、简答题
五、问答题
1、简述生物药物与生物技术药物的内涵。
答：生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。生物药物，包括生物技术药物和原生物制药。生物技术药物：是指采用DNA重组技术或其他创新生物技术生产的治疗药物。细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物。
2、简述生物技术药物和生物技术制药的概念。
答：生物技术药物是指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物；生物技术制药是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物。
3、比较基因工程疫苗与传统疫苗？ 答：传统疫苗是用人工变异或从自然界筛选获得的减毒或无毒的活的病原微生物制成的制剂或用理化方法将病原微生物杀死制备的生物制剂。传统疫苗受制作工艺的限制，其保存、使用和接种副反应等方面都容易出现一些问题。
基因工程疫苗指使用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物，或重组体本身制成的疫苗。
基因工程亚单位疫苗优点： ①纯度高；产量高。②易制备。③安全性好。④这种疫苗稳定性好，免疫期长，便于保存和运输。
4、如何控制基因工程药物的质量？
答：①原材料：主要检查目的基因、表达载体及宿主细胞（如细菌、酵母、人和动物的细胞），防止其产生我们不想要的遗传变异。
②培养过程：无论是发酵还是细胞生产，关键是保证基因的稳定性和不被污染。主要控制生产用的细胞库、有限代次的生产、连续培养过程。
③纯化工艺过程：要求能保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带入的有害化学物质、致热原，或者将这类杂质减少至允许量。
④最终产品：主要表现在生物学效价测定、蛋白质纯度检查、蛋白质的比活性、蛋白质的性质鉴定几个方面。
⑤杂质检测：蛋白类，由于降解、聚合或者错误折叠而造成的目的蛋白变构体在体内往往会导致抗体的产生；非蛋白类，主要有细菌、病毒、热原质和DNA几种类型，往往在极低的水平就可产生严重的危害作用。
⑥安全性试验：其中的无菌试验、热原试验、安全性和毒性试验按我国新颁布的《中国生物制品规程》进行。
5、简述单克隆抗体的制备。
答：（1）．对动物注射特定的抗原蛋白，使其产生免疫反应；提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。
（2）．应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性。
（3）．对杂交瘤细胞进行细胞培养，用特定的选择培养基选出所需要的细胞群，体外或体内培养，从培养液或动物腹水中提取单克隆抗体。
6、简述基因工程操作流程。答：1目的基因的获取
2构建表达载体
3将重组DNA导入受体细胞 4重组DNA筛选与鉴定
4目的基因的检测与表达。
7、动物大规模培养有哪些方式？
答：（1）悬浮培养法、（2）微载体培养法、（3）多孔载体培养法、（4）微囊化培养法、（5）中空纤维培养法。
8、生产用动物细胞的种类有哪些？各有什么特点？
答：（1）原代细胞,特点：不能直接获得，需临时制备，生长不旺盛；（2）传代细胞系，特点：接触抑制和贴壁依赖性，增值能力有限，无致瘤性；
（3）转化细胞系，特点：无限增殖，倍增时间短，较低的营养条件要求，适用于大规模生产；
（4）工程细胞系（包括融合细胞系和基因工程细胞系），特点：稳定遗传
9、获得部分或全部人员化的质量抗体采用何种方法？
10、何为治疗性疫苗？比较治疗性疫苗和预防性疫苗的主要区别。（p129）.答：治疗性疫苗：指在已感染病原生物或患某些疾病的机体中，通过诱生机体的特异性或非特异性免疫应答，以达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工修饰合成或用基因重组技术表达的产品或生物制品。
区别：a.使用对象不同：治疗性疫苗的使用对象为已病者，而预防性疫苗的使用对象为未病者。
b.使用目的不同：治疗性疫苗的目的是治疗疾病，预防性疫苗的目的是预防疾病。
c.监测手段不同：预防性疫苗接种后产生保护性抗体，可通过实验室进行监测，结果准确，可靠。而治疗性疫苗接种后疾病是否改善，则需要结合临床症状、体征、疾病相关的实验指标进行综合测试，较为复杂，且其准确性尚有争议。
d.期望激发的免疫应答类型不同：预防性疫苗接种后，期望产生的是保护性抗体，即激发体液免疫反应；而治疗性疫苗主要用于病毒感染和肿瘤疾病，病毒一旦进入宿主细胞内，抗体即失去作用，肿瘤细胞的杀灭也主要依赖细胞免疫效应，因此，治疗性疫苗应以激发细胞免疫反应为主要目的，这是与预防性疫苗最大的区别。
第二篇：生物技术制药复习要点与重点
复习要点
第一章 绪论
1．生物药物的概念及21世纪生物药物的分类
2．生物技术(Biotechnology)概念及现代生物技术的组成和特点
3．基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术、发酵工程技术定义
4．基因诊断、基因治疗概念
5．生物技术在药学应用中的两类方式
6．生物药物的两大来源及生物药物的特点
7.生物制药的特点、生物制药基本过程及生物制药基本方法
第五章 发酵工程制药
1．发酵定义及发酵类型
2．菌种的选育方法
3．培养基概念和培养基的配制原则
4．发酵的基本过程
5．微生物发酵方式
6．发酵过程影响因素及控制
7．代谢工程定义
8．简述发酵工程下游加工过程的的特点和一般程序
第二章 基因工程制药
1．基因的概念及基因的一般特性
2．基因工程药物的概念
3．基因工程药物制药的主要流程
4．基因工程药物建立分离纯化工艺的根据
5．基因工程药物分离纯化的一般流程
6．基因工程产品的质量控制内容
7．基因工程药物临床前安全性评价的特殊性
8．蛋白质工程的概念
第三章动物细胞工程制药
1．细胞定义、细胞的特征和细胞的化学组成2．细胞培养定义、细胞培养基本条件和基本过程
3．细胞融合技术定义和基本过程
4．细胞工程技术概念和动物细胞工程制药的基本概念
5．动物细胞培养的基本技术和动物细胞培养特点
6．细胞株、细胞系、原代培养和传代培养的概念
7．动物细胞的大规模培养方法
8．转基因动物概念(transgenic animal)及转基因的技术方法
9．转基因动物在医药行业中的应用
10．动物乳腺生物反应器（mammary gland bioreactor）概念
第四章植物细胞工程制药
1．植物细胞工程制药的两大内容
2．植物细胞的全能性定义和原理
3．植物细胞特点——外植体(explant)、脱分化（dedifferentiation）、再分化（redifferentiation）、愈伤组织（callus culture）概念
4．植物细胞的培养方法
5．转基因植物概念及主要方法
6．植物细胞工程制药应用于哪些方面
第六章 酶工程制药
1．酶工程概念和现代酶工程研究的主要内容
2．酶固定化概念、方法和固定化酶的特点
3．细胞固定化概念和固定化细胞的特点
4．酶反应器(Enzyme reactor)的概念
第七 章 新型生物制药技术
抗体工程制药
1．概念——抗体(antibody)、多克隆抗体(Polyclonal antibody,PcAb)、单克隆抗体(monoclonal
antibody)、杂交瘤细胞(hybridoma)技术、抗体工程
2．单抗制备的基本流程
3．HAT培养基的选择培养杂交瘤细胞的原理
4．单克隆抗体的鉴定与检测项目
5．基因工程抗体概念和基因工程抗体的类型———嵌合抗体(Chimeric Antibodies)，改形抗
体(reshaped Antibodies),单链抗体(single chain antigen binding protein,ScFv)等
6．噬菌体抗体工程和转基因动物表达抗体的优点
7．反义核酸(ribozyme)、核酶（antisense nucleic acide）、RNA干扰（RNA interference，RNAi）
概念
8．核酸疫苗（nucleic acid vaccine)又称基因疫苗（gene caccine)或DNA疫苗（DNA vaccine）
概念和核酸疫苗的优点
9．基因治疗概念、基因治疗的必要条件和主要方式
10．干细胞、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）的概念及应用生物芯片基因芯片，蛋白芯片
12．。。。
复习重点
基本概念
1．Biotechnology 以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科
学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所
需产品或达到某种目的2．Fermentation Engineering 微生物工程是利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服
务的技术.其特点: 发酵工程是以某种特定的产物为工艺的目
标,这就要求微生物细胞既能正常生长又能过量积累目的产物
3．Enzyme Engineering是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是
从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程
化将相应原料转化成有用物质的技术。
4.Gene Engineering 是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建
成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程
菌内进行复制和表达的技术。
5．蛋白质工程 以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基
因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。
6.抗体工程利用单克隆抗体技术和基因工程技术进行天然抗体的生产和抗体改造以及研
制新型抗体.7．Metabolic engineering 利用多基因重组技术有目的的对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。
8．biopharmaceutics是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组
织、细胞、体液等中，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术
和药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品
9．基因工程药物 是指以DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗
体和细胞生长因子类药物。
10．GeneDNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。
11．Cell 细胞是一切生物体进行生命活动的基本结构和功能单位.细胞是有膜包围的能独立
进行繁殖的原生质。
12．Culture medium 是人工配制的适合于不同细胞生长繁殖或积累代谢产物的营养基质.其主要成份碳源、氮源、无机盐、生长因子、前体和水等几大类.13．hybridoma技术：将含有特异免疫信息的淋巴细胞与具有无限增殖的肿瘤细胞在诱导
剂作用下使其融合,产生一个具有特异活性细胞及其产物技术.14.monoclonal antibody由一个克隆产生只针对一种抗原决定簇的结构与功能完全相同的抗体.15.Chimeric Antibodies将人抗体的恒定区(C区)替代鼠源单抗的可变区(C区)而得到的抗体
16．immobilized enzyme固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经
物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而
又能发挥催化作用的酶制剂。
17．Biosensors由生物识别物质(酶,微生物 动植物组织 抗体等)与换能器组成的分析系统,其基于酶(细胞)固定化技术
18．transgenic animal 采用基因工程技术把外源基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早
期胚胎,并在受体动物染色体上稳定整合,又经过各种发育途径能把外
源基因稳定传给子代的这种动物
19.gene knockout 用基因打靶技术定点灭活一个内源基因。
20．RNA interference（RNAi）是指对应于某种Mrna的正义RNA和反义RNA组成的双链
RNA（ds RNA）分子使mRNA发生特异性降解，导致其不能表达的转录后基因沉默现象
21．酶联免疫法（ELISA）以酶代替放射同位素对抗原或抗体进行标记，使酶与抗原抗体共
价连接，称之为酶联免疫吸附法。
22基因治疗 是指将正常的外基因导入生物体的靶细胞内，以弥补或纠正基因缺陷或异常表
达，从而达到治疗目的。
23.原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。
24传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养
25细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存
活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。
26细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
27细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
基本方法：
1.生物大分子的分离纯化主要方法 超滤和凝胶过滤、离子交换法、电泳和等电聚焦法，等电点沉淀法和有机溶媒分级沉淀法、亲和色谱法等
2.生物制药基本方法有提取法 发酵法 化学合成法 组织培养法 现代生物技术方法
3.测定蛋白质类药物分子量方法超速离心、凝胶色谱法、SDS_PAGE 生物质谱法等
4.酶和细胞固定化方法有载体偶联法、交联法、包埋法、新型固定法。
5.常用的菌种保藏方法① 斜面低温保藏法 ②石蜡油封存法 ③砂土管保藏法 ④ 麸皮保
藏法 ⑤甘油悬液保藏法 ⑥冷冻真空干燥保藏法 ⑦液氮超低温保藏法 ⑧宿主保藏法
等
6.基因工程操作中获得目的基因的方法 逆转录法、化学合成法、PCR等
7.基因诊断主要技术包括基因探针技术、PCR技术、单抗试剂等。
8.发酵工程制药中微生物发酵方式固体发酵、液体发酵
9.基因治疗中外源基因导入的方式。。
10.基本过程：
1．基因工程制药的基本流程 获得目的基因、组建重组质粒、构建工程菌（或细胞）、培养工程菌、产物分离纯化、除菌过滤、半成品检定、成品检
定、包装。
2．发酵的基本过程 菌种、种子制备、发酵、发酵液处理、提取精制。
3．单抗制备的基本流程抗原的制备、动物的免疫、抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂
交瘤细胞、杂交瘤细胞的选择性培养、筛选能产生某一特异抗体的阳性克隆和克隆化、体外培养(动物腹腔接种培养)、大量制备单克隆抗体。
4．动物细胞培养的基本过程：取动物器官、和组织、剪碎组织、胰蛋白酶处理、单个细胞、细胞培养。
5．生物制药的基本过程1.原料的选择、预处理和保存 2.原料的粉碎3.提取4.分离纯化5.浓缩6.结晶7.干燥
6． PCR三个基本步骤 变性--退火--延伸
基本原理、组成、分类和特点
1.单抗制备的基本原理 制备单克隆抗体通过B淋巴细胞杂交瘤技术把能产生单一抗体的淋
巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合形成杂交瘤细胞，通过
有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产
生的只针对一个抗原决定簇、结构和特异性完全相同的高纯度抗体
2．植物细胞培养技术的理论基础 植物细胞的全能性。
3现代生物药物类型基因药物 , 重组药物，天然药物，合成、半合成药物。
4．现代生物技术主要组成基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程。
5．现代生物技术特点: 高效益、高智力、高投入、高竞争、高风险、高势能。
6．生物药物来源主要有两大类 ①以天然生物材料为主,②有目的的人工制备生物原料。7 基因工程抗体的类型有嵌合抗体、改型抗体、小分子抗体、多功能化抗体。
8.生物药物特点化学结构和组成比较复杂；相对分子量较大，一般不易化学合成；药理作
用针对性强，不良反应小；疗效确切，营养价值高；有的生物原料和生物
药物不能代替.9.固定化酶的特点具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。①可多次使用 ②反
应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。③
反应条件易控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更适合于多酶反应
10固定化细胞的特点有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点： ①无须进行
酶的分离纯化 ②保持酶的原始状态，酶回收率高③比固定化酶稳定性
高④细胞内酶附助因子可再生⑤细胞本身含多酶体系⑥抗污染能力强
11.影响大肠杆菌中外源蛋白表达的主要因素①外源基因密码子的使用,②mRNA结构,③表
达载体的构建,④培养条件
如何实现高表达…
12发酵工程制药特点 是以某种特定的产物为工艺的目标,这就要求微生物细胞既能正常生
长又能过量积累目的产物。
13．生物制药的特点（特殊性）1.生物原料组成成分非常复杂2.有效成分含量低3.易变性
及被破坏4.分离制备过程影响因素多相对“均一性”
13．发酵过程影响因素：温度、pH、溶解氧、菌体浓度、泡沫、营养浓度。如何控制…
14．微生物发酵生产药物主要种类抗生素类;氨基酸类;核苷酸类维生素类;甾体类激素;治
疗酶及酶抑制剂等。
15．细胞的特征：在结构上具有自我装配的能力, 在生理活动中具有自我调节的能力, 在增
殖上自我复制的能力。
16．生物技术在药学研究中两种基本作用方式 1作为生产工具----生物技术药物
2.作为研究手段----合理药物设计
17．单抗优点和局限性优点单克隆抗体的特性高度特异性高度的均一性和可重复性 高
度专一性：大量产生及稳定性：
局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应
强度不如多克隆抗体、制备技术复杂、费时费工、价格较高
18生产用动物细胞类型贴壁依赖性细胞、非贴壁依赖性细胞、兼性贴壁细胞
19．动物细胞培养特点 无细胞壁,抗机械强度低,对剪切力敏感,适应环境差；倍增时间长,生
长缓慢,易污染,培养时必须加抗生素；培养过程需氧量少,有的需要
一定CO2；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在20．基因工程药物制备全程质量控制理念包括
一、原材料的质量控制(1.目的基因2.表达载体3.宿主细胞),二、培养过程的质量控制(1.生产用细胞库2.培养过程)
三、纯化工艺中的质量控制;四.目标产品的质量控制
21.选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料的原理（目的）这些组织或
器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强
22．基因治疗的必要条件1发病机制在DNA水平上已经清楚2要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解 3该基因正常表达的组织可在体外进行
遗传操作
23．PCR原理 是体外酶促合成特异DNA片段的方法 反应特点1.特异性强2.灵敏度高 3.简便、快速。确保PCR获得目的基因序列正确应注意:1.使用高保真的DNA
聚合酶,和相对保守的PCR扩增条件.2.凡经PCR扩真制备的目的基因片段,克隆后必须要测序.24基因工程产品的质量控制内容：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性。利用多学科的技术生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学。
25.基因工程药物包含上游下游过程
上游技术主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。主要技术涉及
1、基因克隆载体:质粒载体，2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用
3、核酸制备技术； 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等.26.基因工程中影响外源蛋白表达的主要因素
①外源基因密码子的使用,②mRNA结构,③表达载体的构建,④培养条件
如何实现高表达…
第三篇：生物技术制药总结
生物技术：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术
1基因工程制药：利用基因重组技术将外援基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。
2.载体：是携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外援基因或DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
细胞传代passage：将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作。细胞克隆培养（clonal culture）：即单细胞分离培养，是将动物组织分散后，将一个细胞从群体细胞中分离出来，由单个细胞培养成纯系细胞集群。
动物细胞的复苏：其原则是快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
细胞融合（cell fusion）：是指在外力（诱导剂或促融剂）作用下，两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象，或称细胞杂交。
转基因动物（transgenic animal）：采用基因工程技术将外源目的基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，在经过发育途径将外源目的基因稳定地传给子代，通过这项技术所获得的动物即为转基因动物。
胚胎干细胞（embryo stem cell）：简称ES细胞，是从早期胚胎细胞团分离出来并能在体外培养的一种高度未分化的、具有形成所有成年细胞类型能力的全能干细胞。它是正常二倍体型，像早期胚胎细胞一样具有发育上的全能性。
抗体工程制药（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、细胞工程（包括动物细胞工程和植物细胞工程）和转基因动物及转基因植物技术生产抗体药物的过程。
单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）：简称单抗，将能大量扩增和永生的骨髓瘤细胞和能合成分泌特异性抗体的B细胞（仅识别一种抗原表位）进行融合得到杂交瘤细胞，经筛选和克隆化的杂交瘤细胞仅能合成及分泌抗单一抗原表位的特异性抗体。
杂交瘤细胞克隆化（cloning）：是指将阳性孔中分泌抗体的单个细胞分离出来。融合后的杂交瘤细胞一般要经过3次克隆化才能达到100%的阳性克隆。
双特异性抗体（bispecific antibody，bsAb）：亦称双功能抗体，是含有两个不同配体结合位点的抗体分子，它有两个不同的抗原结合部位（两个臂），可分别结合两种不同的抗原表位。嵌合抗体（chimeric antibody）：是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达的抗体，表达的抗体分子中轻、重链的V区是异源的，而C区是人源的，即整个抗体分子的60%~70%是人源的。
人源化抗体（humanized antibody，hAb）：通过CDR移植即把鼠抗体的CDR（互补决定区）序列移植到人抗体的可变区内所得到的抗体，也称CDR移植抗体或改型抗体。该抗体既具有鼠源性单抗的特异性又保持了人抗体的功能（C区的功能）。
免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激机体特异性免疫细胞，使其活化、增值、分化，最终产生免疫效应物质（抗体或致敏淋巴细胞）的特性。
免疫反应性（immunoreactivity）：抗原与相应免疫效应物质在体内或体外相遇时，可发生
特异性结合而产生免疫反应的特性。
减毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通过不同的方式手段使病原体的毒性即致病
性减弱或丧失后获得的一种由完整的微生物组成的疫苗制品。
灭活疫苗（inactivated）：是将病原体经培养增殖、灭活纯化处理，使其完全丧失感染性，但保留了病原体的几乎全部组分因此灭活疫苗具有较好的免疫原性和安全性。
亚单位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某种表面结构成分（抗原）制成、能诱发
机体产生抗体的疫苗。
分解代谢阻遏（catabolite repression）：在菌体的生长阶段被菌体快速利用的碳源会产
生大量的分解产物，这些代谢产物阻遏次级代谢酶系的合成，只有当这类碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌体才由生长阶段转入次级代谢产物合成阶段，这种发酵过程中的次级代
谢产物在碳源被消耗尽时才产生和积累的现象称为分解代谢阻遏。
生物技术：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原
理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
种龄（inoculumage）：种子罐中培养的菌丝转入下一级种子罐或发酵罐时得培养时间
生物技术药物的特性？
（1）理化性质特性（1）相对分子量大（2）结构复杂：蛋白质和核酸均为生物大分子，蛋
白质含有四级结构（3）稳定性差（2）药理学作用特性（1）活性与作用机制明确：活性物
质对生理功能的调节机制比较清楚（2）作用针对性强：有特定的靶分子、靶细胞或靶器官
（3）毒性低：生物技术药物本身是体内天然存在的物质或它们的衍生物（4）体内半衰期短
（5）有种属特异性（6）可产生免疫原抑制（3）生产制备特性（1）药物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目标产物的杂质：应采取快速分离纯化的方法以除去影响
目标产物稳定性的物质（3）制备工艺条件温和：目的产物不稳定（4）分离纯化困难：需要
多种不同原理的层析单元操作才能达到要用的纯度（5）产品易受有害物质（4）质量控制特
性
质粒的特点：（1）是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。（2）质粒
具有遗传传递和遗传交换的能力（3）质粒具有不相容性：两种亲缘关系密切的不同质粒不
能在同一宿主细胞中稳定共存。4..共价闭合环状DNA(ccDNA)，开环DNA(ocDNA)，线状
DNA(lDNA)在琼脂糖凝胶电泳中
5.复制子松弛型复制子的复制和宿主蛋白的合成功能
无关，宿主染色体DNA复制受阻时，质粒仍可复制；严谨型复制子的复制与宿主蛋白质的合成相关，因此在每个宿主细胞中为低拷贝数，仅1~3个。
6.克隆表达的质粒载体涉及三个要素：
（1）复制子（2）选择标记：由质粒携带的赋予宿主细胞新的表型的基因，用于鉴定和筛选
转化有质粒的宿主细胞。常见的标记：氨苄西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位点
（MCS）：质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列。
7.目的基因常用制备方法
(1)化学合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通
过下列步骤扩增DNA：a）变性：双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；b）退火：降
低温度，引物与单链模板结合；c）延伸：温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，最终与单链
模板形成双链，并开始下一个变性、退火、延伸循环。（3）基因文库法（4）cDNA文库法
8.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：
9.（1）DNA片段之间的连接方式：粘性末端的连接效率高于平头末端。（2）目的基因与载
体的浓度和比例：增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因与载体DNA的摩尔数比应大
于1.（3）连接温度、时间、连接酶的活性及缓冲液。
9.重组DNA导入大肠杆菌，常用的感受态细胞制备方法：氯化钙法
10.重组子的筛选与鉴定：
（1）载体遗传标记法：a)抗生素抗性筛选法
b)互补筛选法：重组子转化成宿主细胞，载体的表达产物与宿主细胞中营养缺陷性突变发生
互补作用，从而实现重组子的筛选。蓝白斑筛选：lacZα基因可编码β—半乳糖苷酶α氨基
端的α互补肽段，与宿主细胞编码的缺陷型β—半乳糖苷酶α实现互补，可分解底物5-溴-4-
氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成蓝色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空载体的宿主细胞呈蓝色。c)营养缺陷筛选法d噬菌斑筛选法(2)核酸分子杂交法
(3)限制性内切酶图谱法(4)DNA序列测定法：双脱氧终止法(5)目的基因表达产物测定法
12.外源基因在大肠杆菌中的表达形式：
(1)胞内表达：(a)非融合蛋白的胞内表达：形成包涵体（B）融合蛋白的胞内表达：在大肠杆
菌内较稳定（2）分泌表达：（a)分泌至周质（b）分泌至胞外
11.外源基因在原核生物中表达的重要调控元件
(1)启动子：是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列，是决定外源基
因在原核生物中表达效率的关键因素。(2)核糖体结合位点：SD序列(3)终止子
13.大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素：(1)外源基因密码子：偏好密码子（蛋白质合成迅速，错配率低）和稀有密码子(2)mRNA结构：减少G、C含量，增加A、T含量(3)表达
载体：高拷贝数、适用范围广、稳定性高、表达产物容易纯化(4)外源蛋白稳定性
14.分离纯化技术应满足下列要求：(1)技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；(2)选
择性要好(3)回收率要高(4)两个技术之间要能直接衔接(5)整个分离纯化过程要快
15.基因重组蛋白的主要分离技术
(1)离心(2)沉淀(3)膜分离(4)双水相萃取
16基因重组蛋白的主要纯化技术:
(1)离子交换层析(2)亲和层析(3)凝胶过滤层析(4)反相层析和疏水层析
17.选择分离纯化方法的依据：
（元，层析分离次序的选择也同样重要。(3)根据分离纯化工艺的要求来选择(a)具有良好的稳
定性、重复性和较高的安全性(b)尽可能减少组成工艺的步骤(c)分离纯化工艺所用的时间要
尽可能的短(d)工艺和技术必须高效
18．基因工程药物的质量控制要点
(1)蛋白质含量的测定(2)蛋白质纯度检测(3)蛋白质分子质量测定(4)蛋白质等电点测定(5)蛋
白质序列分析(6)内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析
19.蛋白质含量的测定
(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考马斯亮蓝法(5)SDS-PAGE扫描分析法
20.蛋白质纯度的检测：电泳法、层析法、质谱法、末端氨基酸残基分析法
21.蛋白质Mr测定有SDS-PAGE法、凝胶层析法、质谱法
22.蛋白质等电点测定的常用方法：等电聚焦法。
23.蛋白质序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析
根据体外培养时动物细胞对生长基质的依赖性，可将动物细胞分为
(1)贴壁依赖性细胞(2)非贴壁依赖性细胞(3)兼性贴壁细胞
1.动物细胞培养的环境条件
(1)培养温度（哺乳类37℃，昆虫25~28℃）(2)pH值（大多数7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本营养物质(6)渗透压
3.动物细胞的培养特性
(1)比微生物细胞大得多，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；(2)
倍增时间长，生长缓慢，正常二倍体细胞的生长寿命是有限的；(3)对培养基要求高，易受
微生物污染，培养时需要添加抗生素；(4)生长大多需贴附于基质，相互粘连以集群形式存
在，并有接触抑制现象；(5)多半将产物分泌在细胞外，便于收集和纯化；(6)对蛋白质的合成条件和修饰功能与细菌不同，动物细胞可对蛋白质进行完善的翻译后修饰，特别是糖基化，与天然产品更一致，更适合于临床应用。
4.原代培养的主要步骤
(1)从健康动物体内无菌条件下取出适量组织，剪切成小薄片；(2)加入适宜浓度的胰蛋白酶
或胶原酶和EDTA等进行消化作用使细胞分散；(3)将分散的细胞进行洗涤并纯化后，以2×
10^6~7×10^6 /ml的浓度加到培养基中，37℃下进行原代培养，并适时进行传代培养。分为
组织块培养和单层细胞培养两种方法。
5.动物细胞深低温保存的基本原理
在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停滞状态，故可以长期保存。
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发
生机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等，能引起细胞
死亡。目前为了保存细胞，都采用液氮低温（-196℃）冻存的方法。
6.动物细胞的复苏
其原则是快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻
存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
7.动物细胞营养要求特点
(1)碳源不能为无机物，大多为葡萄糖；(2)氮源不能为无机物，主要为各种氨基酸；(3)在很
多情况下尚需添加5%~20%的小牛血清或适量的动物胚胎浸出液。
8.动物细胞的大规模培养方法
(1)悬浮培养法(2)微载体培养法(3)多孔载体培养法(4)微囊化培养法(5)中空纤维培养法
9.诱导动物细胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)电击法(4)激光法
10.转基因动物生物反应器（整体掌握？）
(1)转基因动物乳腺生物反应器（药用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）
(2)转基因动物血液生物反应器（人血红蛋白、抗体或非活性状态的融合蛋白）(3)转基因动
物尿液生物反应器（促性腺激素）(4)转基因鸡（蛋）生物反应器（人干扰素）
1.单克隆抗体技术的基本原理
基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞和B细胞的融合。骨髓瘤细胞在体外
培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫B细胞和骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代
细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗
体的能力。通常使用HAT（H为次黄嘌呤、A为氨基蝶呤、T为胸腺嘧啶核苷）选择培养基
对杂交瘤细胞进行筛选。未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡，未融合的骨髓瘤细
胞合成DNA的从头合成途径被培养基中的A阻断，又因缺乏HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸
核糖转移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培养基中的H和T完成DNA的合成过
程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT和TK，因此能在HAT培养基
中长期存活与繁殖并分泌抗体。
2.单克隆抗体的大量制备主要方法:（1）体内培养法（2）体外培养法
6.重组ScFv的应用:(1)用于构建和生产免疫毒素(2)用于肿瘤的影像分析和治疗
7.噬菌体抗体库技术的基本原理:用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗
体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，可以方便地利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。
7.噬菌体抗体库构建过程
(1)从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B细胞，提取mRNA并反转录为cDNA；
(2)应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的抗体基因片段；
(3)构建噬菌体载体；(4)用表达载体转化细菌，构建全套抗体库。
通过多轮的抗原亲和吸附（结合）-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。其中，噬
菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤。
减毒活疫苗的优缺点：
优点：
（1）通过自然感染途径接种，可以诱导包括体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫在内的更全面的免疫应答，使机体获得更广泛的免疫保护；（2）由于使用的是活的微生物他们可以在体内
长时间起作用而诱导较强的免疫反应，且由于活的微生物有增殖的特性，理论上只需要接
种一次，即可达到满意的免疫效果；（3）可能引起水平传播扩大免疫效果，增强群体免疫屏
障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐剂，生产工艺一般不需要浓缩纯化，价格低廉。
缺点：
(1)一般减毒活疫苗均保留一定残余毒力，对一些个体如免疫缺陷者可能诱发严重疾病，并
且由于种种原因如基因修饰等，减毒活疫苗可能出现毒力回复即“返祖”现象；(2)减毒活
疫苗是活的微生物制剂，可能造成环境污染而引发交叉感染等，并可能滞留在环境中形成传
染源；(3)缺损颗粒可能干扰免疫效果，因此产品分析评估较为困难；(4)保存运输等条件要
求较高，如需冷藏等。
1.灭活疫苗的特点：(1)灭活疫苗常需多次接种；(2)接种灭活疫苗产生的抗体滴度随着时
间而下降；(3)灭活疫苗需要量大。
第七章 发酵工程制药
1.发酵类型：(1)微生物菌体发酵(2)微生物的酶(3)微生物的代谢产物发酵(4)微生物转化发
酵(5)生物工程菌发酵
2.微生物发酵生产药物的分类：(1)抗生素类(2)氨基酸类(3)核苷酸类(4)维生素类(5)甾体类
激素(6)多糖类(6)治疗酶及酶抑制剂
3.菌种保藏方法：(1)斜面低温保藏法(2)石蜡油封存法(3)沙土管保藏法(4)麸皮保藏法(5)甘
油悬液保藏法(6)冷东真空干燥保藏法(7)液氮超低温保藏法(8)宿主保藏法
4.种子液具备的条件：(1)菌种的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；(2)
生理状态稳定；(3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；(4)无杂菌污染，保证纯种培养；()保持稳定的生产能力
5.微生物的发酵方式：（1）分批发酵（2）补料—分批发酵（3）半连续发酵（4）连续发酵
5.发酵过程的中间分析项目：（1）产物产量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌丝形
态
6.发酵过程的影响因素及控制：（1）菌体浓度的影响及控制（2）营养物质对发酵的影响
及控制（3）温度的影响及控制（4）PH的影响及控制（5）溶氧的影响及控制（6）二氧化碳的影响及控制（7）泡沫的影响及控制（8）染菌对发酵的影响
第四篇：生物技术制药教学大纲
第一章 绪论（2学时）第一节 生物技术概述 1 生物技术的概念 2 生物技术发展史 第二节 生物技术制药 1 生物技术制药的概念 2 生物技术在制药中的应用 我国生物技术制药现状和发展前景 4 医药生物技术发展展望
第二章 生物药物（10学时）
1．生物药物的来源、特性、分类与制备。（2学时）
2．氨基酸类药物：氨基酸类药物研究概况；在医药中的应用；氨基酸生产。（2学时）3．多肽、蛋白质类药物：多肽、蛋白质类药物的特点、分离纯化方法、工业生产制备过程。（2学时）
4．核酸类药物：概述（分类、应用）；生产方法；核酸类药物的制备。（2学时）5．糖类药物：制备；纯化。（2学时）
第三章 基因工程制药（8学时）
通过本章学习，了解基因工程药物研制的意义，掌握基因工程药物的研制过程、研制方法。1概述。
2基因工程药物生产的基本过程。(2)3目的基因的获得：直接分离法；从基因文库中筛选；逆转录法；人工合成法。4目的基因与运载体的体外重组：常用载体；目的基因与运载体的体外重组。5重组分子导入受体细胞；导入方法；影响转化的因素；阳性重组体的筛选。(2)6基因表达：大肠杆菌中的基因表达；真核基因在原核生物中的表达方式；真核基因在真核生物中的表达；真核基因在动物细胞中的表达。(2)7基因工程下游技术；下游技术的要求；基因工程菌的稳定性；基因工程菌发酵。8基因工程药物的分离、纯化：分离纯化的基本过程；分离纯化的技术。
9基因工程药物的质量控制:材料的质量控制;培养过程的质量控制;纯化工艺工程的质量控制。(2)第四章 动物细胞工程制药（8学时）1 概述： 形态及生理特性。（2）生产用的动物细胞：生产用动物细胞的要求；生产用动物细胞的获取。4 基因工程细胞的构建和筛选；真核细胞基因表达载体的构建；基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选。（2）动物细胞的培养条件和培养基 6 动物细胞培养的基本方法（2）7 动物细胞大量培养的方法和操作方式 动物细胞生物反应器及检测控制系统：搅拌式生物反应器；气升式生物反应器；流化床生物反应器。（2）
第五章 抗体制药（4学时）1概述
2单克隆抗体：制备；细胞融合；杂交瘤的培养、筛选及克隆化。（2）
3鼠源性单克隆抗体的改造：Ig分子的结构模式图；结构改造；基因工程抗体。4抗体的应用：临床检验；层析介质；导向药物。（2）
第五篇：生物技术制药重点总结
1.生物药物：又称为生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它基础学科的科学原
理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的技术。
2.生物技术药物： 采用DNA重组技术或其它生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白和
核酸类药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂、血浆因子等。
3.质粒载体：质粒是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。分三种构型：共价闭合环状
DNA(cccDNA)、开环DNA(ocDNA)、线状DNA(IDDNA)。在琼脂糖凝胶电泳中迁移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA
4.目的基因的常用制备方法主要包括化学合成法、PCR法、基因文库法和cDNA文库法等。
5.PCR法是指聚合酶链反应，是根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模
板特异性的扩增DNA。在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通过三个循环步骤扩增DNA：：①变性—双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；②退火—温度下降，引物与单链模板结合（温度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最终与单链模板形成双联DNA, 并开始下一个循环。
6.cDNA文库法：cDNA是指与mRNA互补的DNA。cDNA文库法是指提取生物体总mRNA，并以mRNA作为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA的一条链，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，将全部cDNA都克隆到宿主细胞而构建成cDNA文库。
7.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：
①DNA片段之间的连接方式；粘性末端的连接效率高于平头末端。
②目的基因与载体的浓度和比例；增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因于载体DNA的摩尔数比应大于1。③连接温度，时间，连接酶的活性及缓冲体系。
8.重组DNA导入宿主细胞的方法：转化、转染、显微注射和电穿孔。
9.互补筛选法（最常见蓝白班筛选法）需添加X–gal（X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈蓝
色）和IPTG（是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质）筛选物质进行筛选。
10.菌落原位杂交：又称探针原位杂交法，制备与目的的基因某一区域同源的探针序列，根据核酸杂交原理，探针序列
特异性地杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位监测。
11.凝胶过滤层析：凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法。基本原理是：根据生物
大分子的蛋白质的质量的大小来实现目的蛋白的分离纯化。在凝胶过滤层析中所用的凝胶是一种惰性的不带电荷具有三维空间结构的多孔网状物质，凝胶的每个颗粒的微粒结构就如一个筛子，当样品随流动相经过凝胶柱时，较大的分子内不能进入凝胶网孔内而收到排阻，将与流动相一起首先被洗脱下来，而较小的分子进入部分凝胶网孔内，所以流出的速度相对较慢。
12.反相层析（RPC）和疏水层析（HIC）的比较：是根据蛋白质疏水性差异来实现分离纯化。先比反相层析而言，疏
水层析回收率较高，蛋白质变性的可能性较小。反相层析和疏水层析的差异在于前者在有机相中进行，蛋白质经过反向流动相与固定相作用有时会发生部分变性，而后者通常在水溶液中进行，蛋白质在分离过程中一般仍保持其天然构象。
13.蛋白质含量测定方法：紫外吸收法、BCA法、福林—酚试剂法（lowry）、考马斯亮蓝法、ELISA法等。
14.蛋白质纯度检查的常见方法：SDS-PAGE法（最常用）、非变性PAGE法、层析法等。
15.蛋白质序列的分析方法：N-端氨基酸序列分析法（基本原理Edman法）、C-端氨基酸序列分析法。
16.体外培养动物细胞的类型：贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞。
17.动物细胞与微生物细胞，植物细胞相比较具有的特点：
①比微生物细胞大得多，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差
②倍增时间长生长缓慢，正常二倍体细胞的生长寿命是有限的③对培养基的要求高，易受微生物污染，培养时常常需要添加抗生素
④生长大多需贴附于基质，相互黏连以集群形式存在，并有接触抑制现象
⑤多半将产物分泌在细胞外，便于收集和纯化。
18.动物细胞的营养要求是：1.碳源不能为无机物，大多为葡萄糖
2.氮源也不能为无机物，主要为各种氨基酸
3.在很多情况下尚需添加5%-20%的小牛血清或适量的动物胚胎浸出液
19.动物培养基可分为：天然培养基，合成培养基和无血清培养基三大类.20.原代细胞：直接将动物组织或器官经过粉碎，消化而制的的悬浮细胞称为原代细胞.21.悬浮培养法：是细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法，它适用于一切种类的非贴壁细胞，兼性贴壁细胞，可连续测定细胞浓度，连续收集部分细胞进行继代培养，也无需消化分散，细胞收率高
22.木瓜蛋白酶水解IgG分子可产生两个抗原结合片段（Fab）和一个可结晶片段（Fc）
23.胃蛋白酶水解IgG分子可产生一个F(ab’)2和若干裂解小分子片段（pFc’）
24..单克隆抗体技术的基本原理：基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞与B细胞的融合。骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体，而抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了连个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
25.骨髓瘤细胞发生回复突变每3-6个月应用8-氮杂鸟嘌呤（8-AG）筛选一次，以便杀死突变细胞
26.细胞融合的方法：常用的有转动法和离心法.27.杂交瘤细胞的克隆化的方法有：有限稀释法和软琼脂平板法，显微操作法
28.双特异性抗体：是含有两个不同配体结合位点的抗体分子，它有两个不同的抗原结合部位（两个臂），可分别结合两种不同的抗原表位。其中一个可与靶细胞表面抗原结合，另一个则可与效应物（如药物，效应细胞等）结合，从而将效应物直接导向靶组织细胞。
29.细胞内抗体：亦称内抗体，主要是指细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体。
30.如何构建噬菌体抗体库？构建噬菌体抗体库通常包括以下几个过程：1.从外周血或脾，淋巴结等组织中分离B细胞，提取mRNA并反转录为cDNA2，应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的抗体基因片段3，构建噬菌体载体4，用表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多伦的抗原亲和吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异性地抗体克隆。筛选为关键环节和步骤。
31.疫苗的组成：具有免疫保护性的抗原（Ag）如蛋白质，多肽，多糖或核酸等与免疫佐剂混合制备而成。
32.佐剂是指能非特异性的增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，可先于抗原或与抗原一起注入机体。
33.目前用于人体的佐剂只有两种：1，铝佐剂（氢氧化铝或磷酸铝）2，MF59
34.灭活疫苗和活疫苗的特点比较：（P122,表5-4）
35.联合疫苗包括多联疫苗和多价疫苗，多联疫苗可用于预防由不同病原微生物引起的传染病，而多价疫苗仅预防同一
种病原微生物的不同亚型引起的传染病。
36.核酸疫苗是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起机体保护性
免疫反应的抗原的编码基因和载体组成。核酸疫苗又称为基因疫苗，基因免疫或核酸免疫
37.酶的分离纯化过程必须遵循以下原则：
1、全部操作一般在低温（0-4摄氏度）进行。
2、在分离提纯过程中，不能
剧烈搅拌。
3、在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA,少量 –巯基乙醇等
4、在分离提纯过程中要不断测定酶的的活力和蛋白质浓度，以对纯化过程进行检测。一般用两个指标来衡量分离纯化方法的好坏：总活力的回收率和比活力提高倍数。
38.传统的酶固定化方法大致可分为载体联合法，交联法和包埋法
39.固定化对酶稳定性的影响：
1、热稳定性提高
2、对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高
3、对PH，蛋白酶，储存
盒操作条件的稳定性提高
40.目前常用的菌种保藏方法有：
1、斜面低温保藏法，一般可保存1-6个月左右
2、石蜡油封存法，一般可保存1-2年左右
3、砂土管保藏法，保藏期约1-10年
4、麸皮保藏法，保藏期在一年以上
5、甘油悬液保藏法，-20度保藏期约为0.5-1年，-70度下保藏期可达10年
6、冷冻真空干燥保藏法，5-15年
7、液氮超低温度保藏法，15年以上
8、宿主保藏法
41、产物产量的测定方法有：生物测定法和化学测定法，一般采用化学测定法，以求迅速跻身反应生产情况。中国微生物菌种保藏委员会CCCCM中国典型培养物保藏中心CCTCC
美国典型菌种保藏中心 ATCC美国的北部地区研究实验室NRRL
英国的国家典型菌种保藏所NCTC日本的大阪发酵研究所IFO
德国菌种保藏中心DSM42、中间反应产量测定：产物产量、ph值、糖、氨基酸、菌丝形态。
43、PH对发酵的影响有哪些？
1.PH影响酶的活性，当PH值抑制菌体的某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻
2.PH影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行
3.PH影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用
4.PH影响代谢方向，PH不同，往往引起菌体代谢过程不同，是代谢产物的质量和比例发生改变。
44、基因工程菌发酵生产的特点？采用基因重组技术构建的基因工程菌与细胞，由于带有外来基因，对其进行培养和
发酵的工艺技术通常与单纯的微生物细胞的工艺技术有不同之处。基因工程菌发酵的目的主要是实现外源基因的高效表达，以获取大量的外源基因产物。而外源基因的高技术表达不仅涉及宿主、载体与外源基因三者之间的相互关系，与所处环境条件密切相关。基因工程菌发酵一般分两个阶段：前期是菌体生长阶段，后期是菌体生长阶段。
45、基因工程菌不稳定性的原因？主要表现在质粒的不稳定性以及表达产物的不稳定性。而质粒的不稳定性又分结构的不稳定性以及分离不稳定。结构不稳定性是由于转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排与损失。分离的不稳定性是细胞分裂过程中发生的不平均分配，从而造成质粒的缺陷型分配，以致造成质粒丢失。引起质粒载体不稳定性的原因只要是宿主新陈代谢负荷的加重，大量外源蛋白的形成对宿主细胞的损害，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长的快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致了基因工程菌的不稳定性。
46、突变生物合成：采用一些诱变剂，如紫外线，激光，高速电子流或一些化学药物如亚硝基胍，溴化乙啶等对药物的产生菌进行诱变，是他们丧失合成某种中间体的能力，因而不能合成原来结构的化合物，陈武阻断突变株。在发酵培养这些阻断突变株时添加某些天然或化学合成的化合物作为中间体，这些突变株能利用这些中间体合成一些新结构的最终化合物，这个过程称为突变生物合成。
47、微生物转化系酶促化学反应，具有与通常有机化学反应不一样的特点：
1.以具有活性中心和特殊空间结构的酶作为催化剂
2、对作用的基质有严格的选择性和专一性
3、酶催化反应的速度极高，非一般催化剂可比
4、一般在常温常压下进行，反应条件温和
48、微生物对甾体转化反应的特点：在微生物转化过程中，专一，有效的菌体量的多少，以及甾体底物在水相的溶解
性等问题成为影响转化率的重要因素，目前采用的两阶段发酵及两相发酵方法很好的解决了这些甾体微生物转化中的问题。
49、蛋白质药物对化学修饰的意义：
50、最常用的修饰剂有：主要是水溶性高分子聚合物，如葡聚糖、右旋糖苷、肝素以及低分子肝素、多聚唾液酸、聚
乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG、白蛋白等。目前以PEG最常用的。其毒性小、无抗原性、溶解性良好。
51、修饰策略有随机修饰与定点修饰两类。氨基修饰主要用随机修饰，在利用特定的修饰剂可以实现定点修饰。巯基
修饰多为定点修饰。羧基修饰为定点修饰。
52、选择PEG修饰剂应该考虑的因素：PEG的Mr，修饰位点，水解稳定性和反应活性。
53、核酶：核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具有催化活性的核酸分子。目前已知的具有核酶催化功能的RNA结
构至少可以分成5类：发夹状核酶，锤头状核酶，I型内含子核酶，RNaseP核酶，丁型肝炎病毒核酶等
54、反义核酸：是指具有抑制基因表达作用。包括反义RNA、反义DNA分子，由部分RNA和部分DNA形成RNA-DNA
嵌合分子，以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物，这些分子统称反义核酸类药物。
55、褔米韦生经美国FDA批准上市成为第一个反义核酸类药物。
56、RNAi:即RNA干扰现象，是近几年发现的一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默过程。主要阶段：
启动阶段和执行阶段
57、小干扰RNA(siRNA)：在启动阶段，当细胞由于病毒感染等原因出现双链RNA分子或带有较长双链的发卡结构
RNA时，细胞中的Dicer的核酸酶会识别其双链RNA，将其降解成21~23bp长的小干扰RNA。主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。
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