谈FMS核算系统使用心得

第一篇：谈FMS核算系统使用心得

谈FMS核算系统使用心得--龙川公司 黄倩

如今，财务系统遍布华润集团各个成员公司已十分普遍，华润集团是一个信息化全面发展的企业，单单就我们财务涉及的就有8大系统，包括FMS核算系统、TMS资金系统、HFM合并系统、预算系统、5C报表系统、国资委决算系统、工程造价系统。这几个超级实用的系统也给我们带来许多的便捷，下面向大家简单介绍我们最常用每天都接触的Oracle FMS系统。

一、什么是FMS FMS其实是一家目前全球最大的信息管理软件及服务供应商Oracle公司开发的财务核算管理软件，FMS里面包括物资采购供应链-应收模块-应付模块-资产模块-总账模块-支付模块-现金流模块-传送HFM合并报表模块这几大块，功能非常强大。

二、FMS的主要特点及使用流程

简单的说FMS是财务数据核算的基础，通过使用FMS核算核算汇总公司财务数据，简单从物资采购到成本核算，再到费用核算，再到在建工程转固定资产核算，从采购员采购物资开始，在系统录入采购需求订单，仓管领料退库等，月底统一请求传送FMS系统总账模块，由于集团物资是统一集中采购，我们称之为集采，综合会计负责每月总账、应收应付、资产、成本核算，月末统一核算并汇总传送到总账，在每月2号17：00前完成系统月结，并在当天调整现金流量表，并及时传送至HFM合并系统，进行集团数据合并生成合并数据，对与成员公司的ICP关联方进行对账，对不符数据进行调整，减少对Excel的依赖，全部在系统上进行操作，保证财务数据核算的准确性，简化传统数据核算不必要的繁琐流程，优化财务组织架构和报告体系。

图

核算系统到合并、预算系统、5C、国资委流程图

三、系统问题解决

自从2012年12月后各种系统上线以来，公司对各类系统操作可以说已非常熟练，当然，那么强大的系统也会有它缺陷，比如系统的一些设置可能就不能那么全面的满足我们日常的使用，又或者系统常规出错导致崩溃用户无法自行解决等等，尽管如此我们也有解决诸如此类问题的办法，我们可以通过JIRA平台来提交问题缺陷请求，让大区核算运维来帮助我们，大区系统运维也会通过QQ交流群来解决系统常规问题，如果连大区运维层面都无法解决，那我们还可以提交至集团项目组人员，让这些问题都能迎刃而解。当今社会是一个信息化时代，集团通过各种信息化系统来优化、标准化我们业务操作和控制流程，让一切都回到最基本的东西，变得简单起来，使公司成本、风险降到最低，利益最大化，简单化是财务管理的目标，集团推广的各种系统都是一种创新和发展，给我们成员公司带来了便利、更是创造了无限的价值。

第二篇：飞行管理系统(FMS)学习小结

飞行管理系统（FMS）学习小结

飞管的主要作用及意义：

飞行管理系统（FMS）是通过组织、协调和综合机上多个电子和机电子系统的功能与作用，生成飞行计划，并在整个飞行进程中全程保证该飞行计划的实施，建立及执行LNAV和VNAV的导航，优化飞机性能，实现飞行任务的自动控制，使飞机在飞行过程中以最佳飞行路径、最佳的飞行剖面和最省油的飞行方式完成从起飞到进近着陆的整个飞行过程。装有飞行管理系统的飞机，不仅可以大量节省燃油，提高机场的吞吐能力，保证飞机的飞行安全和飞行品质，而且可以大大提高驾驶舱的综合化、自动化程度，减轻驾驶员的工作负担，带来巨大的无可估量的经济效益。

飞管的组成及功能：

组成：

现代飞机上FMS是一整套包括一堆子系统的系统，由一个许多计算机、传感器、无线电导航系统、控制板、电子显示仪表、电子告警组件以及执行机构联系起来的大设备系统。不同的机型飞行管理系统的构成不尽相同，典型的飞管系统主要是由四个部分组成：

1、传感器分系统——惯性基准系统（IRS）、大气数据系统（DADC）及无线电导航、发动机控制等系统

IRS是FMC基本传感器，向FMC提供2~3台IRU输出的导航数据（飞机纬度位置，真航向，磁航向，南北和东西向速度，俯仰和倾斜角，高度，升降速度，地速），FMC进行加权平均，主要参数有PPOS、GS、TRK、WIND等。

DADC通过ARINC429向FMC提供高度、温度、马赫数、空速等信息。

2、处理分系统——飞行管理计算机系统（FMCS）

FMCS包括FMC和CDU，是飞管系统的中枢。

3、执行分系统——自动飞行系统（AFCS）AFCS也有称作自动驾驶/飞行指引仪系统，由飞行控制计算机（FCC）、方式控制板（MCP）以及一些其他部件组成。

AFCS是FMCS的执行部分，对AP、FD、STB/TRIM、A/T提供综合控制。AFCS-MCP给FMC提供LNAV、VNAV制导衔接，选择目标空速、目标马赫数，FMC向飞行控制计算机（FCC）提供经济目标空速、目标马赫数。

A/T（自动油门）是FMCS的执行部分，FMC通过FCC向A/T提供目标推力，从而控制飞行速度。

A/T包括油门伺服机构（放大器、电机）和油门杆。

4、显示分系统一般是EFIS和ECAM。

组成及数据流关系，如下图所示：

功能：

飞管系统的基本功能包括飞行计划、导航与制导、性能优化与预测、电子飞行仪表系统显示。目前，一个典型的飞行管理系统不仅能够根据飞机、发动机性能、起飞着陆机场、航路设施能力、航路气象条件及其装载情况，生成具体的全剖面飞行计划，而且能够实现多种功能，包括：通过主飞行显示系统显示和指示有关飞行信息；通过无线电通信与导航系统获得通信、空中交通和无线电导航数据；通过飞行操纵系统控制飞机的姿态；通过自动油门系统调节发动机功率；通过中央数据采集系统收集、记录和综合处理数据；通过空地数据链系统收发航行数据；通过机上告警系统提供系统监控和告警等功能。

飞行计划：

导航：

性能：

具体功能后续补充。

飞管的发展及国内外现状： 飞管最初是从导航演变而来，逐步整合性能、显示等功能，大致经历以下5个发展阶段：区域导航系统、性能管理系统、飞行管理系统、四维导航和新一代飞行管理系统。

FMS的研究，国外开展要比国内早，其研究已经趋于稳定，并且有相应的FMS产品应用于大型民用飞机上。例如波音和空客等。目前的飞管系统产品的核心技术主要控制在美国霍尼韦尔等少数公司手中。从当前世界上飞行管理系统的应用情况来看，目前生产飞行管理系统产品的公司主要有美国的霍尼韦尔、罗克韦尔·柯林斯和通用航空电子，英国的史密斯航空航天公司，法国的泰莱斯航空电子公司和加拿大的CMC。

国内对于飞管的研究还处于初期阶段，目前国内飞行管理系统的产品较少。

第三篇：材料核算系统会同

材料核算系统会同__ABCD___系统发生数据联系。

A.账务系统B.成本系统C.应收帐款系统D.应付帐款系统

标准答案： A、B、C、D

12.下列会计档案中，保管期限为15年的有___ACD___。

A.原始凭证B.现金日记账C.会计移交清册D.记账凭证

13.从计算机数据管理技术的发展来看，会计核算软件经历的阶段有__ACD____。

A.人工管理B.手工核算C.文件管理系统D.数据库系统

14.会计软件安全可靠性措施的完备性具体是指__ABCD____。

A.操作人员的使用权限的控制B.凭证输入过程中的错误检查

C.未审核的凭证不允许记账D.强制备份、数据恢复

会计电算化的重要作用体现在__ACD____。

A.提高会计数据处理的时效性和准确性，提高会计核算的水平和质量，减轻会计人员的劳动强度

B.会计电算化已经成为一门金融会计学、计算机科学、信息科学和管理科学为一体的边缘科学

C.推动会计技术、方法、理论创新和观念更新，促进会计工作进一步发展

D.提高经营管理水平，使财务会计管理由事后管理向事先预测、事中控制转变，为管理信息化打下基础一般会计报表的数据来源有ABC。

A.从本表或其他报表取数B.从账务处理系统的总账、明细账、辅助账，以及其他核算子系统取数

C.从系统外部取数，包括直接手工输入、软盘或通讯线路传入等D.公式取数

计算机网络按通信介质分类，可分为__AC____。

A.光纤网B.专用网C.同轴电缆网D.星型网

会计电算化的意义有__ABCD____。

A.提高会计工作效率B.提高会计人员素质C.推动企业管理现代化D.促进工作职能的转变 《会计核算软件基本功能规范》中对记账凭证的编号有以下__AD____规定。

A.同一类型的记账凭证必须保证当月凭证编号的连续 B.同一类型的记账凭证当月凭证编号可以不连续

C.不可以由键盘手工输入凭证编号D.可以由会计核算软件自动产生凭证编号

固定资产管理子系统应具备的功能有___ABCD___。

A.管理固定资产的增减变动情况B.管理固定资产卡片C.计提折旧D.计算固定资产净值

第四篇：酵母表达系统使用心得

Pichia酵母表达系统使用心得

甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。甲醇酵母部分优点：

1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产；

4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化；

5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。

产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。第一步——构建载体

Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。

红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。

leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的

时间了。

基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；

②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）；

③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题；

④无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；

⑥Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；

⑧测序引物可以用α-factor信号引物，也可以用5'AOX1引物；

⑨如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列，因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物，会影响表达，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列（x=任何氨基酸），因为这些序列容易受到容酶体的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser这样的氨基酸。除此之外许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录，也需要多加注意。

第二步就是将线性化的DNA转化入Pichia酵母中：

Xiang Yang：EasySelect试剂盒准备了三种菌株：X33，GS115和KM71H。我倾向于选择X33，因为这个菌株转化率和表达量相对而言较高，如果你有电转仪（electroporator），可以尝试一下。如果没有的话，EasySelect也准备了化学转化试剂——EasyComp Transformation，但是由于转化率的缘故，我建议使用电转仪。

leslie：在得到了正确的序列之后就可以准备转化毕赤酵母了，试剂盒携带有的是X-33，GS115和KM71H这三种毕赤酵母（另外常用的还有SMD1168），每种酵母的特点有些不尽相同

（Manual上写的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而GS115与X33一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培养基中生长缓慢，但是也有利于翻译后加工，比如形成二硫键，糖基化等等，另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变，造成蛋白水解酶活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。

一般来说，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Mut-)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用，如在人血清白蛋白(HSA)(为分泌型蛋白)的表达中就看不出两种类型的细胞之间有什么明显差别。

所以一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化，这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同，因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。

另外有个保存问题，原始酵母菌一定要保存好，因为酵母在传代多次后会影响其转化率和表达量，所以一方面分多管分装保存于-80℃，另一方面如果出现了转化或者表达的问题，在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在准备酵母菌的同时也需要准备质粒，由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高，量也较大（5-10ug），因此许多时候都会用PEG大提质粒，或者用大提试剂盒，总而言之要准备好足够量的质粒，并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。在转化前质粒需要进行线性化，这主要是为了增加重组率（EasySelect试剂盒表达量高的一个重要原因也就在于其原理是将目的片段整合到载体上，大大的增加了目的片段的表达）。线性化位点个人认为也会影响到表达量，对于基因片段不大的蛋白可以考虑用几个线性化位点同时进行转化筛选，但是如果片段大，就有可能供选择的机会少，而且也有可能遇上没有合适的线性化位点的情况，这个时候也不是说不能进行表达，但是准备的质粒就要增加10倍，另外也可以进行部分酶切（即先进行预实验，掐定时间和酶量保证被切开的质粒有部分是在线性化位点切开而基因片段保存完好）。

在线性化之后的质粒就可以酒精沉淀回收了——中间步骤需要使酶失活，说明书建议是热失活或者EDTA，个人认为前者比较好，主要是担心EDTA对于转化的影响，另外这三种酶失活的温度都是65℃/20min。沉淀回收之后是离心10分钟，用80%的酒精洗涤后风干，这一步需要多加注意保证风干完全，因为有实验证明残留的酒精对于转化的影响颇大。

接下来就是酵母转化了，这是令许多人头疼的一步，也是影响实验决定表达的关键步骤。转化方法有不少，例如电转，化学转化，原生质体转化，其方法的难易程度和转化率高低呈反向递减的，也就是说电转最容易，转化率较高（但要求有电转仪），而原生质体最麻烦，而且效果不好（比较传统），因此不建议使用，EasySelect说明书上这么建议，并且也详细说明了电转，化学转化（EasyComp和LiCl）方法的过程，可以按部就班。需要注意的是（电转过程）：

①最好每次都从平板上挑酵母菌，用培养过的酵母放置时间不要超过一个星期；

②扩大培养的浓度一定要控制好，个人认为不需要OD600达到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，这个时候的酵母比较新鲜，转化率比较高； ③整个感受态制作过程中一定要在冰上操作，离心最好也用冷冻离心机，这是影响转化的关键——为了进一步保证这一点，无菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和电转杯都要预冷；

④电转仪需要预热，所以准备感受态的时候就可以把电转仪打开了，电转后山梨醇的加入要快，曾有人做实验证明晚一秒就会降低转化的数量级，虽然不一定可信，但是我个人也认为这个过程要快，电转后可以看看时间，如果时间过短（比如(4)就可能说明杂质较多，会影响转化率；

⑤转化后温育是个增加同源重组，增加存活率的过程，需要注意不要感染了大肠杆菌，再加入培养基30℃摇一段时间，可以取部分涂板（不同浓度抗生素），或者也有人将菌短暂离心，弃去上清，剩余全部涂板以保证转化率。

(化学转化)

如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。

主要过程为： 取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。

LiCl转化 取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12 000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入 50%PEG240ml 1mmol/L LiCl

ml 单链鲑精DNA

25ml 线性化质粒DNA 10 ml(约10mg)用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml YPD培养基于30℃ 200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100µg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培养2-3天。

第三步——挑克隆筛选

Xiang Yang：在protocol中用了许多篇幅来指导这一步，包括如何去通过平板筛选，观测生长速率来确定Mut表现型等。这个过程需要3到5天，而我一般只用用了4个小时进行PCR（AOX引物）筛选。

leslie：完成转化后就是克隆鉴定的过程了，包括高拷贝筛选，PCR鉴定和表型鉴定的过程，其中我做的比较多的是PCR鉴定（因为比较快），具体过程protocol上说的很清楚，其实也很简单，就是冻融破菌进行菌落PCR，但是其中许多具体细节问题也挺让人头痛的，第一就是破壁的问题，许多人用PCR方法进行鉴定都无法得到结果，甚至在表达出了以后还是无法得到这张鉴定图片，主要原因之一就是无法正常释放酵母基因组，一般通过培养菌然后进行沸水和-20℃冷冻循环过程裂解细胞在目的蛋白片段比较合适的范围以内是可以得到好的结果的，但是有时候片段过长，模壁就会阻碍扩增，所以我们实验室会用蜗牛酶（很便宜的酶来的）来帮助溶菌，我看许多实验室也会这么做，不过加入的时间不同而已，其次也有奢侈的用试剂盒的。

第二就是是模板量，个人建议模板真的不要加太多了，按照说明书的上的5ul我觉得还是多了，而且建议总体积不用这么大，当然加入模板的量也与自己培养菌的浓度以及用来冻融的菌数量有关。其次是假阳性和假阴性结果，在Mut-和Mut+情况是不一样的，如果用的是5'AOX引物，KM71H会出现3.6kb的片段，而Mut+则会出现AOX1基因原本长度的片段——大约长2.2kb，因此如果的基因片段长度相似，要注意区分。建议PCR过程中使用多对引物进行反应，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各种对照多了有利于比较——当然前提是你不能晕了头。

掉了毛的鸵鸟：巴斯德毕赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子的转录终止子(5’AOX1和3’AOX1),他们被多克隆位点分开,外源基因可在此插入,此外，载体中还包含组氨酸脱氢酶基因(HIS4)选择标记（HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入，整合后使组氨酸缺陷型宿主（his4）恢复野生型.HIS4区或AOX1区位点的整合都使转化子具有HIS4基因，因而可利用表型差异进行筛选，酵母GS115具有组氨醇脱氢酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的载体而具有HIS＋表型以筛选转化子.）及3’AOX1区,当整合型载体转化受体菌感受态细胞时,他的5’AOX1和3’AOX1能与染色体上的同源基因重组,从而使整个载体和外源基因插入到受体菌染色体上，在加入甲醇作为唯一碳源的培养基中,外源基因在5’AOX1启动子的控制下表达.在载体中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于筛选高拷贝转化子,转化子的拷贝数与抗G418的能力有关,通过筛选抗G418能力强的酵母即可获得高拷贝转化子.外源基因是以同源重组的方式插入到酵母菌的染色体中,因此不易丢失，多次传代后酵母仍能稳定表达外源蛋白，具有良好的遗传稳定性.第四步——表达

Xiang Yang：将你的克隆在YPD培养基中培育到OD600值达到6.0，就可以离心收菌。用表达培养基（比如BMMY）重悬沉淀，在30ºC培育过夜。

leslie：筛选鉴定出自己的重组子可以说什么都不能证明，还是要看这一步的酵母表达，有许多人在酵母表达上花费了大量的时间——不同于大肠杆菌的两天出结果，一次毕赤酵母的表达就需要起码一周的时间，筛选了上百上千的克隆，但是仍然是竹篮打水一场空，我个人建议如果在筛选完3批以上就可以放弃这一批转化的酵母菌，另外调整进行重新转化。

另外刚开始的时候可以用小量表达，可以用5ml：生长慢型，生长快型，阴性对照（空质粒），阳性对照（可以是曾经表达成功的重组子）和没有进行转化的酵母菌的单克隆，BMGY中培养到OD值2-6，离心收菌（如果怕污染或者麻烦，可以放置酵母菌一段时间，一半为20-30分钟，让菌沉淀下来，小心倾倒去上清培养基获得菌），转入BMMY中诱导表达，这些步骤都需要在超净工作台里进行，如果要区分是否染菌，可以取一些到显微镜下观察，或者闻气味（酸甜的是酵母），观颜色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表达，有可能会在没有达到4天的时间培养基就干了，所以可以适当补充一些，以及在摇床里放置盛有无菌水的深口瓶，来保持摇床里湿度。

诱导物甲醇注意要在超净台中打开，可以分装到灭过菌的瓶子中——当然甲醇是不能灭菌的，而且也要注意在用酒精灯过甲醇瓶口的时候要小心，如果真的引起爆炸那可就损失大了。另外如果觉得每天添加甲醇麻烦，也有人用一次性注射器透过纱布添加甲醇，这个方法可能会造成染菌，慎选。说到纱布就想到了通气性问题，酵母在无氧和有氧的情况下都可以存活，但是在甲醇诱导的情况下毕赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧气量对于这一基因的表达影响重大，但是由于害怕感染大肠杆菌，纱布裹的也不能太少，最好专辟出一个摇床进行三十度酵母表达，这样可以考虑将纱布减少到3—5层，同时需要注意的是摇瓶内菌液体积不要超过10-30%。

每天取样出来进行SDS-PAGE电泳鉴定，能这样最好，不过每天做胶跑胶染色真的很麻烦，可以汇集一批同时跑，不过样品一定要煮过冻存，而且每次取样不要反复冻融，最好分装保存——因为蛋白经煮沸变性会不稳定，容易降解。另外为了防止蛋白在分泌出来的过程就降解了（特别是小分子蛋白），也可以通过调节培养基pH值抑制蛋白水解酶的活性（这一方面说明书讲解得详细），还可以加入酪蛋白氨基酸等保护物质，竞争性抑制蛋白水解酶 的活性来防止表达产物降解。

如果使用的是分泌型培养基，按道理收集培养基上清就可以进行下一步分析了，但是由于培养基中的蛋白浓度PAGE胶一般是检测不出来的——除非你的表达蛋白量非常大。所以需要进行浓缩，方法有TCA法，硫酸氨盐析，PEG沉淀，透析，超滤等等，当然最简单的就是煮沸蒸发水分浓缩了。另外跑胶的时候同时对照酵母胞内蛋白，以防没有分泌出来。SDS-PAGE的配置参见分子克隆，注意你的蛋白大小与胶的浓度的对应性，如果小到20kD以下，可以考虑用tricine胶，不过是个需要全盘重新准备的过程，要考虑清楚。如果选用的载体是带有信号肽的，虽说是分泌表达好纯化，但实际上毕赤酵母本身还是有本底表达的，而且有时候会造成假阳性，所以最后表达过程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具体的细节可见Western Blotting前传：想成为高手吗？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白没有合适抗体（如果是利用从大肠表达出来的蛋白做出的抗体也有可能与用真核系统表达出来的蛋白无法发生免疫作用），可以选用anti-myc或者anti-his的，前提当然是你的蛋白没有提前终止。

其它在表达中可能出现的情况包括表达量低，没有分泌表达（针对pPICZa系列），头两天蛋白量较大，无法重复，表达出来的蛋白偏大等等，需要分各个方面分析原因，比如蛋白明明加上了信号肽，但是就是无法分泌出来，这可能是蛋白结构在通过细胞膜的时候受到了阻碍，可能需要重新转化，更换线性化位点或者更换菌株；如果蛋白表达第一天较高，但是之后越来越少，这很有可能是蛋白降解了或者产生了竞争表达；毕赤酵母无法重复的问题比较严重，许多情况下在第一次获得了高量表达之后就再怎么也重复不了这个结果，遇到这种情况真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索条件还能怎么样呢？而表达出来的蛋白分子量偏大则是个正常现象，除了糖基化以外还有其它原因，比如二聚体，这些需要进行WB或进一步实验验证。

第五步——发酵和产物纯化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），经过简单的纯化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一个大小为45kDa，可以通过二硫键形成反向平行二聚体(antiparallel homodimer)的糖蛋白，经过纯化，我通过一个细胞增殖实验(cell proliferation assay)检测了其活性，结果表明表达出来的蛋白在体外有完全的活性。并且我也在体外利用受体分析了蛋白结合活性，与对照(通过大肠杆菌和Bacular细胞未带tag的蛋白)相比，his-tag有一点副作用。

伊可丽：由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况，使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中，培养液的pH值无法控制，培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验，仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件，使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。

总而言之，EasySelect系统是一个便于操作的酵母表达系统，我已经使用这一系统表达过15个类似物了，每一个我都获得了超过1mg/1升培养液的纯化蛋白。

第五篇：畅言语音教具系统使用心得

畅言语音教具系统使用心得

作为一名农村小学的英语教师，我一直都有一个愿望：让学生在每节课的课堂上都能听到地地道道的英语口语，师生畅言语音在课堂上用英语畅所欲言。但是由于多方原因，要达到这种境界似乎很难。

最近“畅言智能语音教具系统”的到来，让我的教学工作有了新的起色。一开始看到畅言智能教具，并没有在意。后来在慢慢的摸索，逐步使用的过程中，我终于体验到了它强大而奇妙的功能。现在，我在教学中已越来越离不开它了。我认为这套教具对于英语教师自身素质、英语课堂教学效果和学生的综合能力等各方面的提高有着重大作用。

下面就简单谈谈使用畅言语音教具的体会：

一、简单方便易操作，提高教学效率。

首先，畅言智能语音教具系统用法非常简单，教师只需用识别笔点击课本上的内容，主机就朗读相应的英文单词、句子，唱歌曲歌谣等等，不但节省了录音机倒带的时间，而且解放了教师。这样一来教师可以巡视、关注每一个学生的情况，了解学生学习效果，适时指导，增大了课堂容量。

其次，识别笔可以一笔多用，除了点击要播放的内容以外，识别笔的激光灯可以当作教鞭使用，引导学生观看要学习的目标；识别笔上的任意功能键还可以帮助维护课堂秩序，提醒学生们集中注

意力；另外在课堂上需要结束学生热烈讨论的时候，用此键可以起“唤醒”和“终止”的作用，提高了各个教学环节的学习效果。

二、优化英语课堂，调动学生学习英语的积极性。

传统的英语课堂教学，组织形式单一。只有老师的讲解、提问、学生的回答、跟录音机反复读，很难吸引学生的注意力，智能语音教具系统给这样的课堂注入了新的活力。

畅言智能语音教具中语音合成，自制教具的功能，可以把任意实物，图片，卡片等制成生动有趣的有声教具，让他们自己开口说英语，还可以利用人与主机对话交流，使英语课堂变得更加直观、形象、真实、从而课堂变得生动活泼有趣。例如，在讲动物单词的时候，我自己录制了猫和狗的叫声，来引入单词教学；讲蔬菜水果单词时，我将相应单词读音输入识别码中，然后贴到相应图片上，用笔一点就能说话，这样一来，学生觉得很奇妙，自然兴趣就提高了。还可以利用合成声音，选择女声或男声朗读，使学生在纯正的语言中感知英语。并通过有声实物，标准声音，有声图片等把枯燥的单词，抽象的叙述以生动活泼的形象显现出来，使学生的大脑变得异常兴奋，注意力非常集中，学习的积极性随之调动起来。

三、提高教师自身素质，促进学生的发展。

畅言智能语音教具系统提供的“发音评测”、“中英文朗读”功能为我们教师自身发展提供了很好的学习工具，在一定程度上也促进了学生的发展。

“发音评测”相当于随时随地的口语校正“老师”，利用它可以对教师自己的发音进行测试，比较差异，提高发音的标准度。也可以对学生单词、句子和篇章的发音准确性进行评测，系统立即打分，得出错对辨率，我们可以对照标准，改正错误的发音。

“中英文朗读”功能中的“每日推荐”板块提供了大量的英文阅读材料，是老师提升英语阅读及听力能力的绝妙的好机会，每日内容不同，涉及面广，我们不需要花大量的时间和精力去寻找或购买英语报刊等，很轻松地就能增加我们的课外知识，提高我们的语言综合运用能力。

除此之外，畅言智能语音教具系统还有许多重要的功能：

第一，畅言智能语音教具系统实现了中英文对照朗读功能，这 是区别于其他英语语音教具的一大亮点。

一般的语音教具仅能播放英语课文的朗读，很难实现英汉同步播放。为了能更好的利用畅言智能语音教具软件系统解决此类矛盾，服务于现代英语教学，我的想法是：在语音合成过程中同时输入英文和中文，对发音人进行配合选择，这样便可以听取中英文对照的朗读，解决了部分学生的听力理解较差的难题。具体的做法是将手头的中英文对照文本，或者是一段中文一段英文的文本上传至畅言智能语音教具软件，在软件的“高级朗读模式”中，可以用中文发音人（“中文男声”或者“中文女声”）来朗读中文，用英文发音人（“英文男声”或者“英文女声”）来朗读英文，这样，就可以听到中英文对照朗读了。若有的中英文对

照文本，英文较简单只需要朗读英文部分，而中文部分不需要朗读，那么可以这样设置：选择英文部分，选择英文男声或女声发音人；选择中文部分，选择“不朗读”即可。

第二，借助畅言智能语音教具中英文“高级朗读模式”你还可以根据课文的难易，学生的反应适当调节朗读的速度，获取最佳的听觉效果。

第三，系统软件上附带的“生词表”可以说是一本“活字典”，不仅可以帮助教师和学生查找任何一个生疏的单词，还可以点读、跟读、模仿，一定程度上降低了学生出现哑巴英语的可能性。从“生词表”中，可以看到生词以字母顺序进行排列，当鼠标指向某个词语或短语时，会给出词语相应的解释，使用者可以点击“试听”来听取标准的读音。最为便捷的是，用户还可以任意搜索需要的词语或者选择是否需要显示词语的解释，这样为使用者提供了很大的方便。

总之，智能语音教具的到来，对我们广大英语教师来讲真是增添了一个好帮手，它给我们带来了很大的的方便，丰富了教学手段，使课堂生动起来，给学生带来了学习英语的好环境，大大调动了学生学习英语的积极性，增强了学习兴趣。相信，在我和它以后相处的日子里，我会进一步加深对它的认识，更好的将它应用于现代英语教学中。