细胞转染成功与否的八大要素

第一篇：细胞转染成功与否的八大要素

细胞转染成功与否的八大要素

摘要 : 转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。但无论在何种情况下，转染的成功均取决于

知己知彼，方能百战不殆。做细胞转染也一样道理。细胞转染实验的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。但无论在何种情况下，以下八个要素都不容忽视。

要素一：细胞

分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。

贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。

分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等)需要优化。

传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大的差异。一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。

细胞数量(融合率)——只要培养基质(组织培养皿)尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制(接触抑制)，但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及细胞溶解之前的生长情况相关。

培养物污染——培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。各种污染都会导致产生错误的结果。支原体污染——支原体污染在所有培养细胞中的比例为5-35%，它可改变细胞生长特性，酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。特别是，支原体对采用脂质、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙或腺病毒介导的转染技术有所干扰，其结果致使非典型转染或转染效率偏低。这些影响会导致实验结果的不可靠以及时间和珍贵细胞系的损失。和细菌及真菌不同，支原体污染无法通过视觉检查发现。它们非常小甚至能够通过大多数的无菌滤膜;它们还对常用抗生素有抗药性。所以必需进行支原体污染的常规筛查。

要素二：载体DNA

一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。

载体的完整性——载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。

载体制备物——各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。制备产物中残余的污染物(如CsCl，内毒素)可能会影响转染效率。

载体构造(启动子/增强子/ORI)—转染体系通常用带有强病毒调节元件(如，RSV，CMV，和SV40)的对照载体进行优化和比较。然而，病毒启动子/增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40体系可高效表达large T抗原(如，COS);而在其他许多细胞系中，则是CMV启动子更为有效。

除此之外，各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。要素三：组织培养试剂

一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。基础培养基——培养基的成分包括营养物质(氨基酸，葡萄糖)，维生素，无机盐，和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果在使用时不是新鲜，加入就可能会产生问题。配置时要使培养基务必避光保存;因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。

胎牛血清——血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。采集血清所用动物的年龄、营养水平和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量，从而引起显著生物学变化。

添加剂——某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质(如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等)。CO2培养箱——细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95%的CO2培养箱。用CO2是为了控制pH值，细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。有些培养基需要CO2 浓度为5%来有效控制pH值，而另一些则需要10%的CO2。需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。如果培养箱内培养条件与所需条件不一致(温度、湿度和CO2)则会导致实验结果的板间变异。来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌/细胞的污染也都可能影响到细胞生理。

要素四：使用瞬时转染来生产蛋白瞬时转染表达蛋白

以往为了获得蛋白质的高表达产量，必须先转染细胞，然后挑选一个稳定的转染细胞系进行蛋白的扩增和富集。而挑选这样一个细胞系往往需要花费数周甚至数月的时间，这既可能是由于试剂的细胞毒性也可能是由于转染的低效率。如果是因为转染试剂具有细胞毒性，那么只有少数细胞能够存活，从而导致蛋白质的产量很低。而如果是因为转染成功的细胞太少，那么那些未转染的细胞生长速度大大超过转染成功的细胞，其结果同样也只能产生少量的目标蛋白。使用一种温和的可以转染大多数细胞的转染试剂，就可获得蛋白质的高表达。

现将一些影响蛋白高效表达的关键因素分列如下： 细胞系(有些类型的细胞比其他细胞产量高)质粒骨架(例如：增强子，启动子，转录调控元件)目的蛋白(有些蛋白很难获得高表达量)目的蛋白的cDNA序列(例如：密码子的优化)培养条件(营养物，代谢废物，转染抑制物)当这些因素都得到优化，并加入合适配比和数量的转染复合物(转染试剂-质粒)后，就可获得至少达到平均表达水平的稳定表达克隆。

要素五：瞬时转染和稳定转染

制备一种稳定细胞系的第一步是选择一种同时含有选择性标记物和目的基因的载体。选择性标记物通常是可以产生一种蛋白质或者酶来帮助细胞在某些毒性物质存在下存活的基因。

一旦选好了质粒载体，无论瞬时或者稳定表达都采用一样的转染方法。在加入选择性试剂之前，被转染的细胞至少要在标准培养基中培养过夜。这样就使细胞有时间表达足量的蛋白使之能够耐受选择性试剂的作用。细胞于是在加有选择性试剂的培养基中生长。那些未成功转染质粒的细胞即被杀死。而只有那些成功转染的细胞能够生长。有的时候，还可以将选择性试剂持续加入到培养基中，以维持对细胞的选择压力。

要素六：转染方案

一般原则：建立一套适当的转染方案;首先从一种标准方案开始，然后通过改变试剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。转染复合物的制备——诸如转染试剂/DNA配比，离子强度，缓冲液pH值，以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒可用无菌水或TE缓冲液稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂，就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物;如果制备复合物所使用的培养基含有血清，它就会对转染产生抑制。制备转染复合物的最佳孵育时间是一个非常关键的环节，对于不同的转染试剂而言可能差别很大。

转染试剂/DNA配比(负载比)——所有的转染试剂都会在某一个试剂/DNA配比时最为有效。有时候这种最佳配比的所在范围非常狭窄;而且对于每种实验体系都必须进行优化才能得到最佳配比。形成转染复合物所用的稀释剂——对于多数试剂而言，很关键的一点是要使转染复合物能在普通基础培养基或盐溶液中形成。转染复合物的加入——有两种替换方法可用来将转染复合物加入转染细胞：1.将复合物浓缩液逐滴加入培养基，或者2.将转染复合物先用培养基稀释，然后进行培养基更换操作。第一种方法更简便，而第二种方法则更因为避免了试剂在局部浓聚而产生毒性，所以会使结果的一致性更好。

要素七：时间进度

一般原则提示：要确保最终结果的成功;建立一个合适的时间进度进行转染实验以保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。转染的开始——在转染前12小时，将细胞分种于培养板中。在细胞达到50-80%的融合率时开始转染，这样就可以使它们在实验结束时达到接近100%的融合。细胞对转染复合物的摄取通常在0.5-6小时的时间内完成。在这段时间后，就不会再发现转染效率有所增长。

培养基更换——某些转染试剂在摄取阶段之后需要更换培养基。如果转染必须在没有胎牛血清存在的条件下进行，那么这一步骤就必不可少。而对于可在血清存在的情况下使用的无毒性转染试剂时，如果有足够的培养基用于后续表达阶段，就可以省略这一步。如果将转染复合物留在培养基中直到进行检测，那么对有些细胞系而言转染效率会有所提高，而另外一些细胞在转染开始几个小时之后其转染效率就不会再有升高。虽然在转染步骤之后转染试剂/DNA复合物通常不一定要从培养体系中清除，但在此后的长期生长阶段换用新鲜的培养基却是必须的。如果转染细胞需要生长3-7天，换培养基就尤其重要，这样一来就使它们有时间达到最高的蛋白表达量。

时间测定——转染开始后的24-48小时内，报告基因产物的浓度逐渐增加;而这种增加取决于增强子的强度、表达外源蛋白中所涉及的细胞反应，存活细胞的健康状态，以及营养因素等。在转染后等待3-7天收集蛋白进行纯化较为常见了。

最后就是平时可能会忽略的转染试剂本身的脱靶效应off-target effect，转染试剂本身对基因表达水平(高表达或低表达)的影响，有时候可能会造成假阳性的结果。

我自己的体会是，一般的细胞，用脂质体2000和fugeneHD转染效率相差不大，虽然最近有文献说脂质体2000脱靶效应很高，但国内在乎的人貌似不多;但是干细胞，原代细胞和肿瘤细胞等一些比较难转的细胞系，Fugene HD比较温和，细胞毒性很低，转染效率明显要好;悬浮细胞，各有千秋，不敢说一定可以，重在尝试，要是都不行，就电转吧。

要素八：交叉污染

如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。

作者：keeii 点击：1087次

第二篇：细胞转染及克隆筛选

筛选之前确定G418浓度： 1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2，G418 是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的 G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。加药时间和维持浓度

1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。

2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。

筛选时的培养液

加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题： 1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3 细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。3，适当增加血清浓度。

筛选时出现的问题及其解决办法：

1，问题1。做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？

a、可以减少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度温箱预热，并且PBS润洗细胞层，以减少可能残存的血清的影响；

b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散；

c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可隆了呀

d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果 步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。

我的建议：

1、在100mm dish中挑克隆，细胞分的稀一点。

2、把细胞全部消化下来，在96孔板中逐步稀释获得单克隆

2，问题2。筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表

达量高且能稳定表达的，不大容易。这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。

3，问题3。细胞形态的改变：稳定转染后阳性克隆均出现不同程度的细胞形态的改变。想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。不过，我转的是一种抑癌基因。

4，问题4。单克隆化的时机和个数：加药筛选时, 一般等到确认的转染细胞长到70%以上时,再做有限稀释法, 以克隆出阳性细胞, 同时要保持适当的药物浓度,以防突变和污染。若细胞长好了,如有40%以上,就可以有限稀释了一般，筛选5，6个克隆就有需要的克隆，但保险起见，筛10个吧。

5，从单克隆化时开始，就要加大营养，清和生长因子。单克隆化的操作方法；

1.方法1。单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。培养SPC-A1（人肺癌细胞），转染了EGFP，然后进行了G418抗性筛选和96孔板单克隆筛选，最终获得了成功将我的实验步骤写出来，希望对你有所帮助。

2.方法2。实验步骤大致为：预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的细胞培养液，0.1ml/孔，并放于细胞培养箱中温育，然后胰酶消化稳定表达GFP的细胞，细胞液稀释至密度为1000cell/ml的单细胞悬浮液，上述细胞液接种于96孔板的第一排，0.2ml /孔，从中吸取0.1ml细胞溶液接种于第二排，混合后，从第二排中吸取0.1ml接种于第三排……，一直到第八排，最后一排都丢弃0.1ml细胞液，操作示意图见下图。一般来说，每一列都会有某个孔中只有1~2个细胞。

3.方法3。我的改进之处：我在显微镜下观察，标记孔中小于10个细胞的孔，然后在显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住，然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一共获得了6株单克隆。但需注意的是：时间不能超过30min，否则细胞极容易死亡。解决操作时间长的方法：拿一个96板，在里面随便种一些细胞，然后用牙签练习，我练了5～6次后非常熟练了

培养液：最好是含15％的胎牛血清，加大营养，有利于细胞生长；另外一种方法是对还没有变黄的细胞液进行过滤，过滤后的培养含有很多生长因子，可以作为单克隆的培养液。然后先在显微镜下把要挑的单克隆初看一遍，算一下大概要挑几个，然后在96孔板内先加好培养基，再将6孔板内的培养基吸出，加入少量的胰酶，大概能盖住板底即可，然后在显微镜下观察细胞状态，在有些变圆时，即用10ul枪在显微镜下直接吸克隆，放入事先准备好的加了培养基的96孔板内，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使细胞松散扩散开了时，已经吸了将近十个克隆了，动作快一些时能吸十几个克隆，我做过几次了效果很好，没有出现污染。（在要进行操作时，用酒精将手好好擦擦，将显微镜用新洁尔灭也擦一下，一般不会有什么问题），你可以试试，只要小心一些就行了。

5.方法5。关于稳转的方法，好像园子里很多xdjm都用的是有限稀释法来作，但是我们实验室基本上都不用九十六孔做有限稀释来作单克隆的，一般的做法都是这样： 1。3.5cm皿铺细胞，长到大概80％以上的时候作转染。

2。转染后一天消化，传到一个大皿（1：6）或者两个大皿（1：12）。3。再过一天后加入带G418的培养基。

4。依据细胞不同，大概从加入G418的第三天到第八天之间细胞开始出现大量死亡，活下来的细胞就形成单克隆。

5，单克隆长到相对较大的集落后，于显微镜下用200ul枪挑取细胞集落，一般挑上48个，种在两块24孔板上。

6。于24孔板上继续培养，约4、5天后即可消化传代，取部分作收蛋白western之用，根据western结果确定真阳性。

我们基本上都是这样pick stable的，除非一些对细胞生长抑止作用强大或者apoptosis的inducer之类的基因比较难挑到stable外，一般还都能挑到 stable。当然，转染效率不能太低，超过50％就相对比较容易了，10％以上的可能最后形成的细胞集落就少，而且真阳性也较少。对于那些转染效率很低的细胞，我会连续转染三次（中间如果细胞长满了就传代），好像比较有效。

除非是类似带GFP这样能直接观察到是否真阳性的基因，我们才用有限稀释法来作，要不好像也太麻烦了吧？耗时也多

单克隆化后细胞特点和处理：

1.单克隆后细胞生活习性改变：考虑质粒的表达对细胞的生长有一定的影响，查文献确认一下。

2.单克隆后的培养需要多加些血清，再传代时保证板子不影响细胞贴壁，避免出现传代后细胞浮起来后死亡的现象。

3.筛选成单克隆后，不加药培养2代，再加药继续筛选两代，此时如果不出现死亡细胞则可以认为是稳定细胞系。复苏后加G418传代2次，然后按部就班。

4.过一段时间再筛选时，G418的浓度有人认为需要比稳转时小写，此外，加药后对蛋白质的表达，细胞形态有影响，因此做功能时要停药培养合适时间后再做。5.稳转PA317细胞后再此筛选（需要隔一段时间再加压筛一次），细胞也是死的厉害，不过还是可以筛到，不过需要用合适的浓度。可以在细胞传几代后，分出一小部分，不加G418培养一段时间，然后再加你维持细胞的抗性的G418浓度培养一天看细胞会不会死亡，如果死亡，说明外源基因还没有丢失。

6.有人这样做的：转染加药一段时间后，板子上出现了几个克隆，如果有几十个克隆，然后挑其中七八个克隆到24孔板里继续加药筛选，等24孔长满后再转到6孔板继续加药筛选，6孔板里长差不多满后，每孔消化下来大概一半做WB鉴定目的基因表达，剩一半留着继续加药培养，等WB结果出来有阳性的孔就保留下来，阴性的丢掉。

单克隆化后鉴定：

1.稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。原因：瞬转是在强启动子下,稳转时你得到的细胞株可能失去了此启动子,或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下。

2.转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后（传代10代以上）还表达你想要蛋白的单克隆可以认为是整合了质粒的。

第三篇：一个人成功与否

一个人成功与否，关键在于他的心态。心态好了，会使人用积极的状态去面对各种事情；心态不好，就会使人消极萎靡，万事不成。所以说，心态会主宰人的成败。

若想成功，就要有一个阳光的心态。这就需要在日常生活中不断地让自己变得积极起来，心灵之中有了阳光就会让自己对各种事情都有一个积极的看法，会使自己的心灵的阴暗面变得更少。同时还会给别人一个非常好的印象，如果总是看生活中的消极方面，因为一点小事和别人大吵起来。那一定是一个不会生活的人，真正会生活的人。一定会让自己变得开朗、热情、豁达、大度，只有这样才会成功。

虽然有了阳光的心灵，但是在生活中难免会遇到一些问题。这个时候一定要说“我能行”，不要说“我不行”。自己一定要学会在消极中找到积极的地方，每个人都可以做最好的自己，时刻要记住一句歌

着名的国学大师翟鸿燊说过：“积极地人走到哪里，人们都喜欢，消极的人总会因为他那张脸坏了风水，所以，不要做气氛和情绪的污染者。”这就联系到沟通了，一个消极的人总会把自己的坏情绪带给别人，让人很难接受。孔子的学生颜回有两大优点：1。不二过2。不迁怒。不迁怒往往是一个人有修养的表现。可能是一个人惹了你生气，但不要把气撒在另一个人身上，否则，就会被别人看不起的。自己有不顺心的事了，一定要让自己冷静下来，改变一下看问题的角度，转移一下自己的不良情绪，然后，寻找解决问题的办法。千万不要像苍蝇一样到处传播负面的情绪，让别人去费心。一定要从积极的方面考虑，做出一个让自己高兴，也让别人高兴的事情。

第四篇：成功要素

成功与否

一个人成功与否，取决于五个因素：

1、学会控制情绪

2、健康的身体

3、良好的人际关系

4、时间管理

5、财务管理 如果你想成功，一定要学会管理好这五个因素，为什么把情绪放在第一位呢？把健康放在第二位呢？是因为如果你再强的身体，如果你情绪不好，就会影响到 你的身体。现在一个人要成功20%靠的是智商，80%靠的是情商，所以你要控制好你的情绪，情绪对人的影响是非常大的。人与人之间，不要为了一点点小事 情，就暴跳如雷，这样是不好的。就像动作明星史泰龙说的：过去不等于现在，只是暂时停止成功。任何事情发生，必有目的，必有助于我！你要经常的对自己说，这只是我在风雨中磨练性格的一天。

所以在生活中，你要养成什么样的心态呢？你要养成“三不”、“三多”(不批评、不抱怨、不指责；多鼓励、多表扬、多赞美）。你就会成为一个受社会大众欢迎的人。

如果你想让你的伙伴更加的优秀，很简单，永远的激励和赞美他们。即使他们的确有毛病，那应该怎么办呢？这时是不是应该给他们建议？在生活中你会发现 有这样一个现象：有人给别人建议的时候，别人能够接受，但是有人给别人建议的时候，别人就会生气。其实建议的方式是最重要的，就是“三明治”：赞美、建 议、再赞美！

想一想，你一天赞美了几个人，有的人可能以为赞美就是吹捧，就是拍马屁。赞美和吹捧是有区别的，赞美有四个特点：

1、是真诚的

2、是发自内心的

3、被大众所接受的

4、无私的

如果你带有很强的目的性去赞美，那就是拍马屁。当你赞美别人时候，你要大声的说出来，当你想批评别人的时候，一定要咬住你的舌头！

第五篇：电子求职信的成功与否

求职信可以帮助你从其他应聘者中脱颖而出，它应该简明地突出你的相关实力。一定要注明你所申请的具体职位，如果必要，还要留下联系方法。通过电子邮件回复时，最好遵守招聘广告的要求，但尽可能增加个性化。如果可以查到名字和地址，一些应聘者喜欢把个人资料打印出来寄给用人单位。

尝试打电话和得到尽可能多的内部资料，这个方法有时并不奏效，因为许多人事部门不喜欢擅自提供姓名和另外的资料。最好记住，这些邮箱地址后面是活生生的人。由于兼容性的问题，最好把求职信和简历写在邮件内，而不要做成附件，招聘者可能无法打开你的附件，如果打开了，也许不会再是你精心设计的式样。玛丽?纳米克(MaryNemmich)和弗兰德?乔特(FredJandt)认为”几乎我们访问过的所有简历网站和招聘者，都警告应聘者提交简历时，不要做成电子邮件的附件。”因为现在很多网站害怕那些随着应聘信而来的病毒，有的网上招聘专家甚至建议某些公司把所有带有附件的电子邮件全部删除。所以，在求职信中，你应当突出的是你要申请的职位和你的资历，这些是招聘者最为关心的问题了。

严谨一些是非常有必要的，你知道招聘经理们怎么评论那些通过E-mail发送有错字的简历的人吗?没戏。找工作的规矩一点也不因为发送简历方式的更改而变得更为宽松了。正确地说，是比原来更严格了。

也有人问过，我想申请这个公司的两个职位该怎么办?这要取决于你发送简历的站的数据库软件的功能了，有一些软件能自动过滤掉第二封信件，以免造成冗余;在另一种情况下，一些软件可能会根据你的个人技能分类而把你的简历转给合适的人。这都很难说。所以在这样的简历上针对不同的职位进行修改实际上不算一个好主意。我们的建议是：在这种情况下，不妨针对申请职位的不同做两份格式迥异的简历，分别申请不同的职位。各大公司的简历筛选机制都各不相同，这是一个很值得研究的问题。

很多在国际范围找工作的人都有一种很强的失落感，他们往往制作一份比较通用的简历，然后给每个收简历的人发送一份，在这种情况下他们不可能充分了解每一个招聘者的情况，也不可能根据申请职位的不同而对简历进行修改，这些简历往往就是泥牛入海无消息了。这种求职战略基本上是失败的，对于国际化的求职者尤甚。除非你通过各种途径或渠道确切地知道你具备招聘单位急需的某种特定的技术知识或专业技能，否则就不要这样去求职。