第一篇：微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用
微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用
msw生物处理技术主要包括好氧和厌氧生物处理。好氧生物处理如：好氧堆肥、生物反应器填埋等，其工艺中的微生物主要有细菌、放线菌、真菌等微生物种群。厌氧生物处理，如：厌氧消化、厌氧填埋等，其工艺中的微生物又称“瘤胃微生物”，主要有水解细菌、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等。
在msw好氧生物降解过程中，细菌凭借强大的比表面积，可以快速将可溶性底物吸收到细胞中，进行胞内代谢。总的来说，其数量要比放线菌和真菌多得多。当然，在不同的环境中分离的细菌在分类学上具有多样性，主要有假单胞菌属（pseudomonas）、克雷伯氏菌属（klebsiella）以及芽孢杆菌属（bacillus）的细菌。在堆肥过程中，细菌总数的变化趋势是高-低-高。堆肥初期，有机废物中携带有的大量细菌分解有机物质释放能量，使堆体温度上升，此时，常温细菌受到抑制，嗜温细菌活跃；当堆温升至高温阶段，只有少量的嗜热细菌可以活动；高温期过后，随着有机成分的减少，堆体温度降低，嗜温及常温细菌又开始活跃，使细菌总数上升。整个好氧降解过程中，嗜温细菌是堆肥系统中最主要的微生物。
现代生物技术与环境保护
现代生物技术是以DNA分子技术为基础，包括微生物工程，细胞工程，酶工程，基因工程等一系列生物高新技术的总称。现代生物技术不仅在农作物改良、医药研究、食品工程方面发挥着重要作用，而且也随着日益突出的环境问题在治理污染、环境生物监测等方面发挥着重要的作用。自20 世纪 80年代以来生物技术作为一种高新技术，已普遍受到世界各国和民间研究机构的高度重视，发展十分迅猛。与传统方法比较，生物治理方法具有许多优点。
（1）生物技术处理垃圾废弃物是降解破坏污染物的分子结构，降解的产物以及副产物，大都是可以被生物重新利用的，有助于把人类活动产生的环境污染减轻到最小程度，这样既做到一劳永逸，不留下长期污染问题,同时也对垃圾废弃物进行了资源化利用。
（2）利用发酵工程技术处理污染物质，最终转化产物大都是无毒无害的稳定物质，如二氧化碳、水、氮气和甲烷气体等，常常是一步到位，避免污染物的多次转移而造成重复污染，因此生物技术是一种既安全又彻底消除污染的手段。
（3）生物技术是以酶促反应为基础的生物化学过程，而作为生物催化剂的酶是一种活性蛋白质，其反应过程是在常温常压和接近中性的条件下进行的，所以大多数生物治理技术可以就地实施，而且不影响其他作业的正常进行，与常常需要高温高压的化工过程比较，反应条件大大简化，具有设备简单、成本低廉、效果好、过程稳定、操作简便等优点。
所以，当今生物技术已广泛应用于环境监测、工业清洁生产、工业废弃物和城市生活垃圾的处理，有毒有害物质的无害化处理等各个方面。
第二篇：城市生活垃圾处理及污染防治技术政策
《城市生活垃圾处理及污染防治技术政策》（建城［2000］120号）
《生活垃圾转运站技术规范》（CJJ47-2006）
《城市环境卫生设施规划规范》（GB503-2005）
《城市环境卫生设施设置标准》（CJJ27-2005）
《城市生活垃圾处理和给水与污水处理工程项目建设用地指标》(建标［2005］157号）《恶臭污染物排放标准》（GB14554-93）
《工业企业总平面设计规范》（GB50187-2012）
《污水综合排放标准》（GB8978-1996）
《大气污染物综合排放标准》（GB16297-1996）
《工业企业场界噪声标准》（GB12348-2008）
《建筑设计防火规范》（GB50016-2006）
《工业企业设计卫生标准》（GBZ1-2010）
《建筑结构荷载规范》（GB50009-2012）
《建筑给水排水设计规范》（GB50015-2009）
《低压配电设计规范》（GB50054-2011）
《采暖通风与空气调节设计规范》（GB50019-2003）
《工业企业照明设计标准》（GB50034-2013）
《室外排水设计规范》（GB50014-2006）
《生活垃圾转运站运行维护技术规程》（CJJ109—2006）
《城市环境卫生专用设备》（CJ/T18—1999）
《环境空气质量标准》（GB3095—2012）
第三篇：城市生活垃圾处理练习题
四、名词解释
1、垃圾收运
垃圾收运即城市垃圾的收集、贮存及运输，指将垃圾从垃圾产生源头经过运贮、清运和转运三个阶段，最终送往处理处置场的过程。
2、卫生填埋法
指在垃圾的填埋处理过程中，对填埋单元进行防渗处理、疏导沼气、用无毒无害的覆盖材料按规定的技术要求覆盖垃圾表面，并且对收集到的渗滤水和沼气进行工程处理。
3、垃圾清运
垃圾清运是垃圾收集与清除的简称，通常指垃圾的近距离运输。一般用清运车辆沿一定路线收集清除容器或其他贮存设施中的垃圾，并运至垃圾中转站的操作，有时也可就近直接送至垃圾处理厂或处置场。
4、生活垃圾无害化
指对生活垃圾进行工程处理，使之达到不损害人类健康，不污染环境，并安全排放的目的。
5、垃圾压实密度
指由压实机械将垃圾挤压成紧固状态时的垃圾密度。
6、生物膜法
生物膜法是利用附着生长在某些固体表面上的微生物（即生物膜）进行有机污水处理的方法。生物膜是由高度密集的好氧菌、厌氧菌、兼性菌、真菌、原生动物及藻类等组成的生态系统，其附着的固体介质称为滤料或载体
五、问答
1、简述垃圾污染物和危害。
垃圾中主要污染物包括（1）有机污染物，如在堆放腐败过程中产生的大量酸性和碱性有机污染物；（2）无机污染物，如氨、硫化物、重金属离子；（3）生物污染物，如病原细菌、病毒、原生动物及后生动物。
主要危害是污染水体、侵占土地、破坏生态环境、污染大气、孳生害虫。
2、填埋场中甲烷如何产生？如何防止甲烷气体爆炸？
在一定的湿度、温度和厌氧环境下，填埋场中的有机物成分在厌氧微生物作用下，经水解、酸化和产甲烷化三个阶段，产生甲烷和少量二氧化碳。
甲烷气体浓度达到5-15%，遇火即引起爆炸。故应严格控制填埋场库区甲烷浓度不超过5%。对于小型填埋场，可采取自然排放法，对于大型填埋场，应设置导气设施并对甲烷气体进行燃烧处理或资源化利用。
3、什么叫卫生填埋法？与传统填埋法相比，有哪些优点？
卫生填埋法指在垃圾的填埋处理过程中，对填埋单元进行防渗处理、疏导沼气、用无毒无害的覆盖材料按规定的技术要求覆盖垃圾表面，并且对收集到的渗滤水和沼气进行工程处理。
与传统填埋法相比，卫生填埋法采取了防渗措施，防止了渗沥液对水体的污染；采取了疏导沼气的措施，避免沼气富集带来的安全隐患；按要求每日覆盖，最大程度上减少了蝇类等害虫的孳生。
4、垃圾中的主要污染物有哪些？
主要污染物包括：（1）有机污染物，如在堆放腐败过程中产生的大量酸性和碱性有机污染物；（2）无机污染物，如氨、硫化物、重金属离子；（3）生物污染物，如病原细菌、病毒、原生动物及后生动物。
5、卫生填埋法的优点。
与传统填埋法相比，卫生填埋法采取了防渗措施，防止了渗沥液对水体的污染；采取了疏导沼气的措施，避免沼气富集带来的安全隐患；按要求每日覆盖，最大程度上减少了蝇类等害虫的孳生。
6、简述卫生填埋场的单元分层作业。
卫生填埋应分层采用单元作业法，单元作业工序为卸车、推辅、压实、覆盖，并应编制科学合理的填埋作业计划，每层垃圾厚度应为2.5-3m，每层垃圾须压实至0.6t/m3以上，压实后须覆土20-30cm厚。
7、卫生填埋场的单元分层作业。
同第6题。
8、如何防止填埋场甲烷气体爆炸？
同第2题。
9、什么叫垃圾卫生填埋？
同第3题。
10、什么叫垃圾处理？
垃圾处理即对产生的垃圾进行收运、处理和处置，以达到垃圾无害化、减量化和资源化目的的工程手段。
11、哪些物质禁止作为填埋物？
填埋物严禁包含下列有毒有害物：（1）有毒工业制品及其残物；（2）有毒药物；（3）有化学反应并产生有害物的物质；（4）有腐蚀性或有放射性的物质；（5）易燃、易爆等危险品；（6）生物危险品和医疗垃圾；（7）其他严重污染环境的物质。
12、垃圾污染物的主要危害有哪些？
同第1题。
13、垃圾污染物主要有哪些？
同第1题。
14、垃圾收集器在卫生原上有哪些要求？
居民户在住宅内使用的垃圾桶（箱）最好是带盖的，在存放垃圾时可使桶处于密闭状态，避免垃圾容器在住宅内散发臭味。垃圾在住宅内存放时间不宜过长，居民应及时将桶内的垃圾倒入街旁的垃圾容器，倾倒完垃圾后，要及时冲刷垃圾容器，以使其始终保持卫生状态。在住宅内要特别注意易分解厨房废物的卫生存放问题，尽量降低它对住宅卫生的影响，尤其在夏季，垃圾在住宅内存放时间过长，就会造成腐败发臭孳生蝇蛆，也会使垃圾容器过满，引起许多住宅内的卫生问题。家庭废物中的纸板、塑料容器和玻璃容器等最好能够分类存放，集中出售给废品回收部门，这样既可避免各类成分相互混杂，降低可再利用产品的质量，也可以简化处理程序，降低处理成本。
另外，垃圾在容器内存放，会有一些黏附物质残留在容器内，如不及时清除会造成苍蝇孳生的条件，也会造成桶体腐蚀，散发臭味，因而要提倡垃圾容器（包括垃圾桶、箱、大型垃圾容器和其他各类垃圾容器）净化。
15、卫生填埋的优点。
同第5题。
16、灭蝇有哪些方法？
填埋场苍蝇的控制方法，首先是保证卫生填埋工艺的执行，即每天进行垃圾压实和泥土覆盖，这能有效控制苍蝇的孳生。对垃圾暴露面上的苍蝇，一般采用药物喷雾或烟雾灭杀，还可用苍蝇引诱药物诱杀。在填埋场种植驱蝇植物，也是有效控制苍蝇密度的方法，且可防止药物造成的环境污染，是今后非药物灭蝇的发展方向。在填埋场的生活区，室外可采用低毒低残留药物喷雾和诱杀剂杀灭，还可用捕蝇笼诱捕，室内可采用粘蝇纸，悬挂毒蝇绳，或在玻璃窗上涂抹灭蝇药物等。
17、什么叫传统填埋法？
传统填埋法是和卫生填埋法相对的简陋的垃圾土地处置手段，填埋场内无防渗措施，对填埋场内产生的渗沥液、沼气不进行严格的处理，对水体、大气和生态环境的污染严重。
18、传统填埋法的弊端？
（1）地下水均受污染，许多有毒有害物质在一般地下水中不存在，却在填埋场周围的地下水中出现。
（2）不加疏导和处理的沼气也严重污染了填埋场周围的空气，甚至造成爆炸。
19、什么叫垃圾预处理？其目的是什么？
垃圾预处理是指对固体废物进行压实、破碎、分选等单元操作技术的手段。
对于要填埋的废物，通常要把废物按一定方式压实，这样它们在运输过程中可以减少运输量和运输费用，在填埋时可以占据较小的空间或体积。
对于焚烧和堆肥的废料，通常要进行破碎处理，破碎成一定粒度的废物颗粒将有利于焚烧的进行，也利于堆肥化的反应速度。
在对废物进行资源回收利用时，也需要破碎、分选等处理过程。比如从塑料导线中回收铜材料，首先要把塑料包皮切开，把塑料与铜导线分开，再把分开的塑料破碎，进行再生造粒，这样就实现了铜和塑料分别回收利用的目的。
20、污水好氧生物处理的机理。
污水好氧处理是在有游离氧（分子氧）存在的条件下，好氧微生物降解有机物，使其稳定、无害化的方法。微生物利用废水中存在的有机污染物（以溶解状和胶体状为主），作为营养源进行新陈代谢。
21、简述生活垃圾的组成。
城市生活垃圾的组成主要指其物理成分构成，按照我国目前的分类方式可分为三大类十小类——有机物（植物，动物），无机物（砖瓦陶瓷，灰土），可回收物（纸类，塑料橡胶，玻璃，金属，纺织物，木竹）。城市垃圾的组成受多种因素影响，如自然环境、气候条件、城市发展规模、居民生活习性（食品结构）、家用燃料（能源结构）以及经济发展水平等。故各国、各城市甚至各地区产生的城市垃圾组成都有所不同。
22、什么是垃圾转运站？
是指将垃圾由小型收集车转载到大型运输工具的中转设施。其可以具有分选、压缩、打包等功能。
23、简述卫生填埋场的单元分层作业。
同第6题。
24、哪些物质禁止作为填埋物？
同第11题。
25、卫生填埋应满足哪些技术要求？
（1）严格实行单元作业、分层作业；垃圾应定点倾卸、摊铺、压实。应以一日为一小单元或每班次为一小单元，宜每日一覆盖。压实容重为0.6t/m3以上
（2）根据填埋场垃圾成分及场地压实机配置不同而异，填埋层厚宜2-3m，但最厚不得超过6m。
（3）层间覆土应大于20-30cm或用人工衬层材料覆盖。
（4）设有渗沥液导流及处理设施。
（5）设有气体导排设施。
第四篇：lamp技术介绍以及在微生物检测中的应用
研究生课程论文
程:
目
名:
院:
业:
号:
微生物检测技术
LAMP技术及其在微生物检测中的应用
王 飞
生命科学学院
微生物
2011216016 11 年 12 月日
课 题姓 学
专
学
LAMP技术及其在微生物检测中的应用
摘要：环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展出的一种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传统PCR方法相比，LAMP不需要热循环，为等温扩增，且由于LAMP反应中产生大量的副产物一白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物可不经过电泳，通过肉眼观察或浊度计即可判定结果。因此LAMP是一种不需要热循环仪、肉眼即可判定结果的高度特异和敏感的DNA扩增方法。近年LAMP技术在病原微生物检测及食品微生物检测上已有广泛应用，本文就LAMP极其在这两方面的研究进展作一综述。关键词：LAMP；环介导等温扩增；核酸扩增
Application of LAMP in detection of microorganism
Abstract: LAMP(loop-mediated isothermal amplification)method, which develops in recent years, is a sensitivity, special and convenience nucleic acid amplification technique.To compare with the traditional PCR, LAMP, which needn’t hot circle, is constant temperature amplification.Because LAMP can produce a mount of coproduce, magnesium pyrophosphate, which is a white precipitation, the result can be estimated by eyes or nephelometer without electrophoresis.In recent years, the application of LAMP in detection of disease pathogen and microorganism in food had been wide studied.These articles summarize the studies in these two aspects.Key words: LAMP;loop-mediated isothermal amplification;nucleic acid amplification
1.引言
核酸体外扩增技术是分子生物学领域最重要的研究手段之一，以检测核酸为基础的分子诊断技术已广泛应用于临床医学和微生物检测等领域。目前，核酸体外扩增技术主要包括常规PCR扩增和等温扩增两大类。常规PCR包括单一PCR[1]、[2][3][4-8]复合PCR、套式PCR、竞争性PCR和实时荧光定量PCR，等温扩增包括核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)[9]、滚环DNA 扩增(rolling circle DNA amplification，RCA)[10]、指数式扩增反应(exponential amplification reaction，EXPAR)[11]、连接酶链扩增反应(ligase chain reaction，LCR)[12]、链置换扩增反应(strand displacement amplification，SDA)[13]和环介导等温扩(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[14]技术等。常规PCR扩增由于快速、灵敏度和特异性高等优点广泛用于分子诊断领域，但由于常规PCR扩增需要配套的控温精密的仪器和复杂的实验程序，大大提高了检测成本。等温扩增技术是近年来发展迅速的一类核酸体外扩增检测技术，其区别于常规PCR扩增技术的关键在于扩增反应的温度不同，无需控温精密的实验仪器和复杂的实验程序。上述几种等温核酸扩增技术中，LAMP技术由于具有快速、高效、灵敏度高、特异性高和可定量分析等优点已经广泛用于临床和微生物分子诊断领域。本文就LAMP技术的原理、引物设计及其在分子诊断和检测领域的应用进行综述。
2.LAMP的技术特点
2.1 LAMP技术的定义
LAMP是一种敏感的链取代核酸扩增技术,这种方法能在恒温条件下(约65℃)、一个小时内,将目的DNA从几个拷贝扩增到109个拷贝。LAMP技术扩增、检测目的核酸片断,一般以200~300bp为宜,一般实验流程包括:GenBank检索目的基因片断(并通过BLAST确定该片断与其他物种基因的同源性),人工或在线设计引物组,引物合成、Bst DNApolymerase large fragment(若进行RT-LAMP扩增,还需加入AMV反转录酶)及相关缓冲液准备,确定反应体系、扩增,反应结果判定等[15]。2.2 LAMP引物
LAMP技术的引物设计，比PCR技术要复杂[16]。它针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，包括对内引物FIP和BIP，和一对外引物F3和B3。若再增加一对环引物(1oop primer)，便可使反应加速，提高扩增效率。相关文献[17,18]对引物设计的技术做了详细的报道，并且目前已开发出用于LAMP引物设计的相关软件，如Primer Explorer version 3软件，使引物设计更加简便。2.3 LAMP扩增原理
60～65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，是一种动态活性温度，因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环[19]。扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段，上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换DNA聚合酶作用下向前延伸启动链置换合成，外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出完整的FIP连接的互补单链，FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构，自我碱基配对形 成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链，迅速以3`末端的F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA 合成延伸形成茎环状结构，该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2 阶段是扩增循环阶段，以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，迅速以3′末端的B1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB,它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。2.4 LAMP产物的检测
(1)电泳检测：LAMP的产物可以用琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察，由于产物是混合物，故呈现出特异的梯状条带，经限制性内切酶酶切之后呈现单一靶序列条带[20]。
(2)荧光检测：SYBR Green I 荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA
［21］双链结合时，肉眼观察荧光染料由橘黄色变为绿色，紫外线下可以发出荧光，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA 分子的数量，荧光强度检测可以用实
时定量PCR仪进行。
(3)浊度检测：是其特有也是最常用最便捷的检测方法，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2＋结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。反应方程式如下：
（DNA）n-1 ＋ dNTP＝（DNA）n ＋ P2O74－ P2O7 ＋ 2Mg ＝Mg2P2O7（沉淀）
其具有极高的特异性，只要用肉眼观察[22]或浊度仪在400nm光下检测浊度就能 够判断扩增与否，并对起始模板定量，达到实时定量的检测[23]。2.5 LAMP的特点
LAMP 与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：
(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断，对于RNA 的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行（RT-LAMP）,不需要特殊的试剂及仪器。
(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失，核酸扩增在1h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20～30min均可检测到扩增产物,且产物可以扩增至109倍,达0.5mg/mL，应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。
(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。同时LAMP还有一些不足的地方。由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度 好在300bp以内，大于500bp则较难扩增，故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高，极易受到污染而产生假阳性结果，故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离[21]方面均逊色于传统的PCR 方法。
4－
2＋3.LAMP技术在人类传染病病原检测中的应用
3.1 DNA病原检测
DNA类致病病原主要为DNA病毒和DNA细菌。相对而言，LAMP技术对DNA病毒的检测研究相对较多。
2005年Enomoto等[23]对单纯疱疹病毒的I型和II型分别设计LAMP引物，彼此之间保持高度特异性，并发现琼脂糖凝胶电泳比沉淀直接观测在灵敏度上高2～10倍；对18份病人拭子进行检测，I型和II型检出率分别为50％和56％.特异性为
[24][25]90％和100％。Yoshikawa和Ihira等分别建立了人疱疹病毒6型和7型的LAMP检测方法，他们设计的LAMP引物具有高度的特异性和敏感性，且对人疱疹病毒 6型的研究还发现，当提高引物浓度时，灵敏度可提高一倍。Suzuki等[26]对巨细胞病毒进行了LAMP技术的研究，不但证实了该技术用于巨细胞病毒检测敏感、特异，还对构建巨细胞病毒质粒cDNA标准品的定量检测进行了探讨，其检测标准曲
线的相关系数达到99．4％。Yamada等[24]对细小病毒B19也进行了相应检测，证实LAMP技术比常规PCR技术灵敏100倍，还成功尝试了SYBR Green I直接染色判定检测结果。
在细菌病原检测方面，Hara-Kudoa等[27]对沙门氏菌的39个血清型220个菌株进行了LAMP检测，运用了3种结果判定方法；灵敏度达到2．2cfu／管，明显高出常规PCR。Maeda等[27]在对牙龈卟啉单胞菌的检测中也运用了3种结果判定方法，发现琼脂糖电泳和SYBR Green I的检测极限相近，直接沉淀观测法则低10倍；此外，通过real-time PCR和real-time LAMP的比较发现，后者在快速性、便捷性上有较大优势。最近，Yano等[23]对肠毒素大肠杆菌的LTI及STI基因的LAMP研究再次验证了该法的特异性(非LTI及STI基因型的Ecoli及其他细菌均不扩增)及高灵敏性，加人环引物后扩增时间可以从60分钟缩至35分钟。3.2 RNA病原检测
人类传染病的RNA病原主要是指RNA类病毒。RNA类病毒的基因组有变异大和进化快的特点，它不但是许多重大传染病的病原，也是当前人们研究的重点。Thai等根据SARS冠状病毒的保守序列1b Rep gene开放读码框设计了包括环引物在内的6条引物，进行了一步法RT—LAMP检测；检出时间早至11分钟，检测极限达到0.01PFU，灵敏度比RT-PCR高100倍；对49例临床鼻、咽拭子进行RT-LAMP和RT-PCR对照检测，RT-LAMP的灵敏性达到100％,产物经限制性内切酶酶切及测序验证其特异性达到87％。Shirato等[26]对59例人呼吸道合胞病毒进行了RT-LAMP、病毒分离和免疫学检测，检出率分别为61％、34％和56％;此外，还对RSV的A、B亚型分别设计特异引物，并进行产物酶切鉴定。研究表明，RT-LAMP是一种稳定可靠、敏感度高的实用型检测技术。今年Yoshida等[27]建立了从临床病样中检测腮腺炎病毒的LAMP方法，其引物组针对腮腺炎病毒基因组中血红球凝集素一唾液酸苷酶编码区域设计，可用于鉴别腮腺炎Hoshino疫苗株和循环野生株。
Pafida等[28]建立了不同血清型登革热病毒的一步法real-time RT-LAMP检测，该法的检出率达100％,而常规RT—PCR和细胞培养分离的检出率只是87％和81％ 且不与黄病毒科其他病毒有交叉反应。Kumsaki等[28]对危害性很大的埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)也进行了real-time RT-LAMP检测研究。在体外转录得到高浓度
3目标RNA后实施定量RT—LAMP检测，26分钟内可以测到10拷贝，30分钟内可以测到104个拷贝。Toriniwa等[25]也成功地将real-time RT-LAMP应用到日本乙脑病毒的检测上。
由于诺如病毒(Nomvirus)基因型间的多样性和型内的高变异性，其RT—LA MP引物的设计难度较高，操作也相对复杂。Fukuda等[26]对I型和Ⅱ型诺如病毒分别设计了9条和13条特异引物，并对26份临床粪便进行一步法单管RT-LAMP扩增，结果RT-LA MP对I型和Ⅱ型诺如病毒的检测极限分别达到100个拷贝／管和1000个拷贝／管；与传统的RT-PCR相比，RT-LAMP对工型诺如病毒的特异性为94％，I型诺如病毒为100％。[25]4.LAMP在食品病原微生物检测中的应用
4.1食品中大肠杆菌的检测
肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli EHEC)是指能够引起人类出血性肠炎的一类大肠杆菌,主要经口传播。该菌引起的食物中毒首先在美国于1982年爆发,之后在世界各地相继发现病例。即使在卫生条件较好的国家,大多数肠道传染病已基本得到控制,但EHEC感染问题仍日益严重,越来越受到各国的高度重视。在美国、加拿大、英国和日本等发达国家,都发生过E.Coli O157的暴发流行。2001年卢林秋等进行的调查表明,我国食品中也存在E.Coli O157菌株。EHEC类型多,血清型复杂,常规检测方法难以有效实现快速、灵敏地进行全面检测。2003年Maruyama[27]等用原位LAMP方法检E.ColiO157∶H7O27(有一个stx1基因和两个stx2基因)的stx2基因,并用FITC标记抗E.ColiO157∶H7抗体,在紫外下照射。试验结果显示,较原位PCR而言,温和的渗透性及低等温条件使得原位LAMP引起较少的细胞损伤,并且在DNA扩增中允许使用荧光抗体标记。此外,Maruyama还发现LAMP方法的背景颜色较浅。因此,LAMP方法是一种特异性强、敏感性高、省时、省力的EHEC检测方法。
侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli EIEC)是一种肠道侵袭性细菌。它侵入肠黏膜上皮细胞,在细胞内繁殖引起细胞变性,使肠上皮出现损伤,导致黏膜固有层发生炎症、溃疡、出血,临床上表现出细菌性痢疾症状,所以当初称之为志贺痢疾样大肠杆菌(Shigelloid E.coli)。国内于1984年首次报道了EIEC引起的食物中[28]毒。可见EIEC是一组较重要的腹泻病原菌。然而,由于其生化反应不典型,部分血清型与志贺菌属间存在抗原交叉,从而给鉴定工作带来了很多困难。因此,在日常检测工作中往往被忽视或误报为志贺菌属。从流行病学方面来考虑,准确的病原学诊断是必不可少的。2005年Song[29]等用LAMP方法对EIEC和志贺氏菌的同源基因ipaH进行检测。作者从病人的腹泻样便中分离出38株肠病原体用于检测LAMP方法的特异性,一株志贺氏菌YSH6000用于比较LAMP和PCR的敏感性。LAMP方法对所有的致贺氏菌及EIEC呈阳性,对其它菌呈阴性;整个LAMP实验在2h以内完成,其最小检测限达到8个菌落单位。相比较而言, PCR的检测限为8×102个菌落单位。LAMP方法是特异性强、敏感性高的EIEC快速检测方法。4.2沙门氏菌的检测
沙门氏菌(Salmonella)是引起食品中毒和伤寒的主要病原菌,主要通过污染食品和水源而传播。沙门氏菌引起的食物中毒最常见。约占细菌性食物中毒的42.6%-60%。目前所使用的沙门氏菌分离培养、生化反应、血清学和传统PCR技术等检测方法操作繁琐、费时、灵敏度低、易污染,已不适于食品和水源的卫生监测和流行病学调查。2005年,KayokoOhtsuka[30]等对疑被感染沙门氏菌的水样鸡蛋中进行抽样(110个样品)检测并与分离培养及PCR做比较。结果显示, PCR漏检了10%, LAMP及分离培养的检出率为100%;LAMP是比分离培养更快速、灵敏的检测技术。因此, LAMP方法是快速、灵敏、特异的沙门氏菌检测方法,是鸡蛋车间管理的可靠监控手段。4.3白斑综合症病毒的检测
白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是世界水产养殖业危害最严重的病原之一,它不仅存在对虾中,而且存在于其他的甲壳类动物中,例如,螃蟹、小龙虾等。该病毒分子量较大、结构特异,是已知动物病毒中最大的病毒。
Lightner报道,WSSV在所有对虾病毒中,毒力最强,危害最大。2003年Tomoya Kono等根据WSSV-DNA序列设计4条引物F1、F2、B1c、B2c(大小分别为20nt、19 nt、22 nt、20 nt),用LAMP方法和巢式PCR对对虾组织中分离的WSSV-DNA进行扩增,比较了两种方法的检测限。结果表明,LAMP的检测限达到1fg,一步法PCR的检测限是100pg,二步法PCR是10fg,说明LAMP方法的灵敏度远远高于PCR。由此可知, LAMP方法是WSSV的快速、高效检测方法。4.4检测传染性造血器官坏死病毒
LAMP方法不仅可以扩增DNA,而且可以扩增RNA。只要在原反应体系中加入RNA反转录酶(15U/μL)即可传染性造血器官坏死病(infectioushematopoietic
necrosis virus, IHNV)是一种RNA病毒,主要引起大马哈鱼和虹鳟鱼苗和幼鱼的传染性造血器官坏死病,造成脾脏和前肾造血器官坏死。IHNV是迄今为止世界上已经报道的共约50种鱼类病毒中危害极为严重的一种。2004年Gunimaladevi等首次发表了用LAMP方法检测虹鳟鱼及鲑鱼中的IHNV。作者同时用LAMP及RT-LAMP方法检测虹鳟鱼的IHNV,并比较LAMP与巢式PCR的检测灵敏度。研究结果显示, LAMP和RT-LAMP方法的检测限相似,而比PCR高一个10的数量级。此研究表明LAMP方法具有简便、快速、特异性和灵敏度高等特点,是极具前途的快速检测IHNV的方法。
5.LAMP技术前景展望
LAMP 是本世纪发展起来的一种分子生物学技术，虽然还存在诸多的缺点和不足，但它在不断地改进和完善，它最主要的优点是不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单、扩增快速高效，适合各种条件下的快速检测，实用性强，故其应用范围越来越广泛。综上所述，我们有理由相信LAMP 作为一种核酸扩增的快速检测方法，将会有更广阔的应用前景。
参考文献：
[1] Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al.Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science, 1985, 230(4732):1350-1354.[2] Shuber AP, Grondin VJ, Klinger KW.A simplified procedure for developing multiplex PCRs.Genome Res, 1995, 5(5): 488-493.[3] Gilliland G, Perrin S, Blanchard K, et al.Analysis of cytokine mRNA and DNA;detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(7): 2725-2729.[4] Tyagi S, Kramer FR.Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.Nat Biotechnol, 1996, 14(3): 303-308.[5] Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, et al.Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.Biotechniques, 1997, 22(1): 130-131, 134-138.[6] Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al.Real time quantitative PCR.Genome Res, 1996, 6(10): 986-994.[7] Morrison TM, Wiss JJ, Wittwer CT.Quantifation of low-copy transcripts by continuous SYBR green I monitoring during amplification.Biotechniques, 1998, 24(6): 954-958, 960, 962.[8] Whitcombe D, Theaker J, Guy SP, et al.Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence.Nat Biotechol, 1999, 17(8): 804-807.[9] Compton J.Nucleic acid sequence-based amplification.Nature, 1991,350(6313): 91-92.[10] Lizardi PM, Huang X, Zhu Z, et al.Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification.Nat Genet, 1988, 19(3): 225-232.[11] Van Ness J, Van Ness LK, Galas DJ.Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(8): 4504-4509.[12] Barany F.Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase.Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88(1): 189-193.[13] Walker GT, Fraiser MS, Schram JL, et al.Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplification technique, Nucleic Acids Res, 1992,20(7): 1691-1696.[14] Notomo T, Okayama H, Masubuchi H, et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res, 2000, 28(12): E63.[15] 刘巍,毛新亮.LAMP技术及其在人类传染病病原体检测的研究进展[J].应用预防医学, 2007,l3(4):274-279.[16] 赵飞，邹为民．LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用[J]．南方水产，2007，3(2)：7 1-75.[17] Notomi T, Okayama H, MasubuchiI H, et a1．Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]．Nucleic Acids Res, 2000, 28(12)：E63．
[18] Nagamine K，Hase T，Notomi T.Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J].Mol Cell Probes，20O2, 16(3)：223-229．
[19] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al．Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res, 2000, 28（12）：63.[20] Parida M M, Santhosh S R, Dash P K, et al．Development and evaluation of reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and real-time detection of Japanese encephalitis virus [J].J Clin Microbiol, 2006, 44(11)：4172－4178． [21] Mori Y, Nagamine K, Tomita N, et al．Detection of loop-mediated isothermal amplification
reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J].Biochem Biophys Res Commun, 2001, 289(1)：150－154．
[22] Mori Y, Kitao M, Tomita N, et al.Realtime turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA[J].J Biochem Biophys Methods, 2004, 59(2)：145－157．
[23] Enomoto Y，Yoshikawa T，Ihira M，et a1．Rapid Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infection by a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method[J]．Journal of Clinical Microbiology，2005，43(2)：951-955．
[24] Yoshikawa T，lhira M，Akimoto S，et a1．Detection of Human Herpesvirus 7 DNA by Loop-Mediated Isotherm al Amplifiestion[J]．Journal of Clinical Microbiology，2004，42(3)：1348-1352．
[25] Ihira M，Yoshikawa T，Enomoto Y，et a1．Rapid Diagnosis of Human Herpesvirus 6 Infection by a Novel DNA Amplification Method．Loop-Mediated Isothermal Amplification[J]．Journal of Clinical Microbiology，2004，42(1)：140-145．
[26] Suzuki R，Yoshikawa T，lhira M，et a1．Development of the loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of cytomegalovirus DNA[J]．Journal of Virological Methods，2006，132(1-2)：216-221．
[27] Yamada Y，Itoh M，Yoshida M，et a1．Sensitive and rapid diagnosis of human parvovirus B19 infection by lop-mediated isothermal amplification[J]．British Journal of Dermatology，2006．155(1)：50-56． [28] Hara-Kudoa Y，Yoshinob M，Kojimab T，et a1．Loop-mediated isotherm al amplification for the rapid detection of Salmonella[J]．Journal of Clinical Microbiology，2005，253(1)：155-161．
[29] Maeda H，Kokeguchib S，Fujimoto C，et a1．Detection of periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis by lop-mediated isothermal amplification method [J]．FEMS Immunology and Medical Microbiology。2005，43(2)：233-239． [30] Yano A, Ishimaru R，Hujikata R，et a1．Rapid and sensitive detection of heat-labile I and heat-stable I enterotoxin genes of enterotoxigenic Escherichia coli by Loop-Mediated Isothermal Amplification[J]．Journal of Microbiological Methods，2007，68(2)：414-420．
第五篇：PCR技术在微生物鉴定中的应用
昆虫分子生物学
课程论文
学
院: 课
程: 学
号:
姓
名:
植物保护学院
昆虫分子生物学
任课教师:
职称:
教授
成 绩:
2015年8月29日
PCR技术在微生物鉴定中的应用
摘要 随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，特别是在微生物检测中的应用。细菌16S rDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表型鉴定更高，从鉴定的准确率来看，其具有的优势毋庸置疑。同时，随着微生物检测技术的不断发展,BOX-PCR技术在微生物的多样性研究中也已得到应用。使用真菌ITS区域序列通用引物PCR扩增和DNA序列测定的方法，简便快速、成本低稳定性好、结果可靠，适合实验室常规使用，可用于常见的和疑难真菌菌种快速鉴定。
关键词 PCR；16S rDNA；BOX-PCR；ITS；细菌；真菌
PCR(polymerase chain reaction, PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成扩增特定DNA片段的方法，1985年美国Karray等学者首创了PCR技术并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖、环境科学、食品安全等领域，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库、遗传病传染病的诊断、法医学鉴定、物种起源、生物进化分析、流行病学调查等。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR（mutiplex，PCR）技术[4]、实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）技术[5]、单分子PCR技术[6]等。PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列，人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸，引物在体外将待检DNA序列模板在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’~3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后合成了新链可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中扩增产物的量，以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR技术在细菌鉴定中的应用
细菌检测包括传统的形态学检查、分离培养、生化鉴定、免疫分析等多种方法，其中
点击咨询 