第一篇：黄秋葵功能成分提取技术的研究进展论文
摘 要：黄秋葵是一种富含蛋白质，维生素，黄酮及碳水化合物等营养与功能成分的绿色新型保健蔬菜，具有极高的食用和药用价值。本文综述了黄秋葵功能成分物质的提取方法与技术，为其综合开发利用提供科学基础。
关键词：黄秋葵;功能成分;提取;研究进展
黄秋葵(Abelmoschus esculentus)，俗名羊角豆、咖啡秋葵、毛茄、补肾果等，为锦葵科、秋葵属一年生草本植物，性喜温暖，原产于非洲，素有蔬菜王之称，其嫩荚富含果胶及多糖组成的粘性物质，其茎、叶、芽、花、种子富含蛋白质、维生素及矿物盐等活性成分物质，具有极高的营养食用价值和经济价值，而且还能作为一种园林绿化观赏植物，因此，近几年在国内越来越受欢迎[1]。
由于黄秋葵功能活性成分具有极大的应用价值，笔者就提取其多糖、果胶和黄酮等功能成分的方法与技术进行综述，旨在为黄秋葵功能性成分的开发与利用奠定基础。黄秋葵功能成分作用
黄秋葵多糖可作为营养强化剂、增稠剂、悬浮剂和澄清助剂，具有增强体质和抗疲劳等保健作用[2]。其果胶能促进机体内有机物的排泄，减少体内毒素，还能降低体内的胆固醇含量;果胶和多糖等组成的粘性物质，对人体具有促进胃肠蠕动、防止便秘等保健作用，适当多食可增强性功能，还可以增强人体的耐力;另外黄秋葵低脂、低糖，可以作为减肥食品[3-4]。由于其含锌和硒等微量元素，可增强人体防癌抗癌能力;且含有较多维生素A能有效保护视网膜，确保良好的视力，能防止白内障的产生。黄秋葵中富含维生素C，可预防心血管疾病，能提高机体免疫力，而且维生素C和可溶性纤维(果胶)结合，有利于皮肤的保健，可以代替一些化学护肤用品[5-7]。植物多酚具有抗氧化、抑制酶活性、抗致突变、抑菌、消炎和降血压等多种生物活性[8]。生物类黄酮是一种具有较强清除自由基和抗氧化能力的物质，其抗氧化作用甚至比维生素C、维生素E还要高，还具有降脂、抗心血管疾病、抗骨质疏松和防癌抗癌等作用，可在医药、化妆品、食品方面广泛应用[9]。黄秋葵功能成分提取方法与技术
2.1 多糖的提取
2.1.1 超声波辅助法
超声的机械化学作用可破坏细胞壁，加强细胞内的传质作用，从而提高植物中有机化合物的提取速率，同时超声波产生的“空化”作用可极大提高有效成分提取率。黄诚等采用超声波辅助提取黄秋葵多糖[3]，得出最佳料液比、时间、提取液pH值、和温度分别为1∶50、20 min、9和70℃，并在该条件下黄秋葵多糖的得率达6.8%。刘怡彤等利用同一方法提取黄秋葵多糖[10]，得到最佳超声时间为90 min，超声温度为45℃，料液比为1∶45，超声功率为84 W，并在此条件下多糖的含量可达2.671 mg/g。
2.1.2 微波辅助法
微波辐射加热导致植物细胞内的极性物质产生大量的热，液态水汽化，产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，进而导致胞外溶剂进入胞内溶解并释放胞内多糖等物质，较大程度提高了多糖等物质的萃取效率。高愿军等以蒸馏水作为提取剂[11]，采用微波辅助法提取黄秋葵多糖，在微波功率为650 W，料液比为1∶25(g/mL)，浸提温度90℃条件下提取5 min，多糖含量可达2.64%。该方法显著缩短了提取时间。
2.1.3 纤维素酶法
酶法是利用酶反应将原料组织分解加速有效成分的释放和提取。高愿军等采用纤维素酶法浸提黄秋葵多糖[11]，不仅高效、易操作而且对环境友好，最佳工艺条件为：酶解温度45℃，酶解pH4.8，加酶量2%，料液比1∶35(g/mL)，在此条件下得到多糖提取率为6.32%。
2.1.4 水提醇沉法
任丹丹等采用水提醇沉法提取黄秋葵粗多糖[12]，经此提取方法得到黄秋葵粗多糖的产率约为0.40%。水提取的缺点是耗时长且效率低。
2.2 果胶的提取方法
2.2.1 酸解盐析法
黄诚等采用酸解盐析法[13]，以黄秋葵去籽干果为原料提取果胶，通过正交实验得出最佳工艺条件是pH=4，料液比为1∶10，温度70℃，酸解时间110 min，无机酸类型为硫酸，在此条件下黄秋葵果胶的得率能达到29.10%。
2.2.2 微波辅助酸提醇沉法
李加兴等运用微波辅助酸提醇沉工艺[14]，以黄秋葵干果为原料提取果胶，通过响应面分析法优化工艺参数得到最适宜的微波功率为590 W，pH为2.9，浸提温度为74℃，在该工艺条件下浸提30 min可得果胶提取率为24.81%，与传统直接加热法相比大大缩短了浸提时间并提高了提取效率。
2.2.3 酸解醇沉法
刘晓霞等以黄秋葵花粉末为原料[15]，采用酸解乙醇沉淀的方法提取黄秋葵花果胶，并通过响应面分析法对提取工艺进行优化，得到最佳料液比为1∶30，提取温度为90℃，盐酸溶液的pH=1.60和提取时间为2.76h，在此条件下提取果胶的平均得率达32.46%。酸解醇沉法虽然提取率高，但提取温度也高，且耗时长，安全性低，酸提取易破坏果胶多糖的空间结构及活性
第二篇：植物性香料提取技术的研究进展
植物性香料提取技术的研究进展香料是一种能被嗅感嗅出气味和被味感品出香味的物质，是用以调制香精的原料。植物性天然香料也称植物性精油(essential oil)，是由植物的花、叶、茎、根和果实，或者树木的叶、木质、树皮和树根中提取的易挥发芳香组分的混合物。
近年来，美国、El本、韩国等发达国家对天然香料提取技术研究已经相当成熟，对应用研究也很活跃；而目前我国还大多集中在对天然香料提取方面的研究，并且缺乏对深加工技术与高附加值产品方案的研究。因此，全面了解植物性天然香料的提取技术，对我国香料香精行业的发展具有深远的现实意义。发展历史
香料的发展历史悠久，从黄帝神农氏时代人们采集树皮、草根作为医药用品来驱疫避秽开始，现已有5000多年的历史。起初人们把这些有香味的物质作为敬神拜福，清净身心之用，也用于祭祀和丧葬方面，后逐渐用于饮食、装饰和美容。大约在8～l0世纪，人们已经知道用蒸馏法分离香料。1370年第一种用乙醇提取的香水一匈牙利水(Eaudela Reimed Hongafie)出现了，开始只是从迷迭香中蒸馏制得，其后才逐渐从薰衣草等植物中制得。自1420年，在蒸馏中采用蛇形
冷凝器后，精油发展迅速，法国格拉斯(Grasse)因生产花油和香水，而成为世界著名的天然香料(特别是香花)的生产基地。此后各地逐步采用蒸馏提取精油，同时从柑桔树的花、果实及叶中提取精油，这样就从香料植物固体转变成液体，提取了植物中的精油，这是划时代的进展。l8世纪后，由于有机化学的发展，人们在对天然香料的提取、成份分析等方面都取得了很大进步。随着天然香料应用范围不断扩大，香料工业急剧发展，天然香料提取技术也得到不断改进ll J。提取技术
2．1 榨磨法
该方法主要用于提取柑桔类果实精油，如柠檬油、甜橙油、香柠檬油、红橘油等。基本原理是采用冷磨或机械冷榨的方法将含芳香油较多的果皮中的芳香油分压榨出来，并喷水使油和水混合流出，再经高速离心机将精油分离出来。此法生产过程在常温下进行，确保了芳香油中萜烯类化合物不发生化学反应，从而使精油质量提高、香气逼真。该法传统上主要采用整果压榨法和果皮海绵吸收法，近代生产方法采用整果冷磨法和果皮压榨法 J。榨磨过程主要包括循环喷淋水、过滤与沉降、离心分离、榨磨后果皮处理几个工艺过程。
2．2 蒸馏技术
2．2．1 水蒸气蒸馏
水蒸气蒸馏是使水蒸气连续地流过容器中样品混合物来进行蒸馏的方法。该法避免了精油长时间在高温下发生破坏分解、水解或聚合，使精油的质量和提取率都得到了一定程度的提高。水蒸气蒸馏法生产精油主要有水上蒸馏、水中蒸馏、直接蒸汽蒸馏(水气蒸馏)三种方式。李玉媛 等分别采用水上蒸馏和水中蒸馏法多次提取云南拟单性木兰鲜叶精油，取精油
平均得率进行比较，研究表明，水上蒸馏较好，不仅精油得率高，香成分也较水中蒸馏法保留的好。罗曼 等采用隔层蒸馏代替水蒸气蒸馏法提取山苍籽油，不仅能够提高精油的提取率，并且所获香料油为无色透明，而靠蒸汽直接蒸馏的香料油茶褐色，即使经精馏，其精油仍呈深黄色。周荣琪 对果皮、枝叶、花等各类芳香植物的提取进行了实验，研究表明，蒸馏方式、加热方式、蒸汽速度、操作压力、操作温度等因素对出油率均有影响。Boutekedjiret等 采用蒸馏的方法对迷迭香精油进行提取，研究表明在各种蒸馏方式中以水蒸气蒸馏操作最为简单，不但可降低香料成分馏出温度，而且可防止分解或变质，薄荷油、桉叶油、迷迭香油等均可采用此法提取。该法设备简单，操作方便，但采用此法处理得到的香精只含有挥发成分，而味觉成分未被提取出，因此在植物类香精油的提取中使用较多。但蒸馏技术存在着操作温度较高、时间较长、低沸点和水溶性组分缺失较大的缺点。
2．2．2 水扩散法
水扩散法提取芳香精油这一新型的提取技术产生于2O世纪9O年代中期，与常规蒸馏相比，其进汽方式截然不同，水蒸气是在低压下自上而下的通过植物层，水扩散表示其中的一个过程(即渗透过程，指提取油从植物油腺中向外扩散的过程)，在重力作用下，水蒸气将油带入冷凝器，蒸汽由上往下作快速补充。水扩散装置具有易搬运、操作简单、节约蒸气、劳动强度低、精油产量高、质量好等优点。
目前国内外对此技术的研究及其应用报道甚少，周荣琪[ 曾用公丁香对这项技术与水蒸馏做了对比实验，得到一些有参考价值的数据，对比结果表明，水扩散技术不仅具有得油率高、蒸馏时间短、能耗低、设备简单等优点，而且油质也较好。这是因为水扩散强化了蒸馏中的扩散作用，抑制了蒸馏中的不利因素水解和热解作用。
2．3 溶剂浸提法
溶剂浸提法是用水、酒精、石油醚以及其他有机溶剂对芳香原料(包括含精油的植物各部分、树脂树胶以及动物的泌香物质等)作选择性的萃取，排除那些不重要的成分，有选择地提取香味物质。
溶剂萃取法的优点是操作简单，且可通过选择不同的萃取溶剂而有选择地提取致香成分。如在苹果香精的萃取中，异戊烷对低级醇类的回收率就高于其它萃取溶剂 ]。但从萃取液中有效地除去溶剂且尽量降低致香成分的损失是溶剂萃取法面临的重要问题。蒸馏一萃取装置(SDE法)使萃取溶剂的用量大幅度减少，较好地解决了在去除溶剂的过程中失去致香成分的问题。朱旗等¨叫用SDE法提取的茶叶香精油中的香气总量、数量及回收率均优于普通溶剂萃取法，特别是醇类和酯类，香气成分尤为突出。与其他提取方法相比，浸提法不仅生产周期长，而且溶剂用量大，设备较复杂，密封程度要求较高，溶剂损耗也增加了产品的成本，因此浸提生产多用于较贵的品种(如茉莉、藏红花等)。
2．4 超临界CO：萃取
超临界CO：萃取技术与一般传统分离方法相比较，具有其独特的优点。CO：临界温度3
1．4℃，临界压力7．28MPa。这样的性质使得超临界CO：萃取特别适用于天然植物中脂溶性挥发油、浸膏、树脂和热敏性产品的萃取。由于其近常温的操作温度，可几乎保留全部天然香气本香成分物质，故产品香气天然感好、香气纯正、色泽浅、无溶剂残留，产品质量高。
另外提取过程简单，故分离过程中损失少，收率高，该法在天然植物有效成分的提取中具有越来越广泛的应用前景。
符史良等⋯用超临界cO：萃取香草兰香料，研究了压力、温度、时间等因素对香料萃取率的影响，确定了从香草兰豆荚萃取香料的最佳工艺条件，并用高效液相色谱(HPLC)测定香料中香兰素的含量。
Luiz等¨ 以SCF—CO，为溶剂，在23～50℃、8．5～12MPa的条件下对柠檬香草精油的超临界萃取进行了研究，综合考虑萃取率、萃取速率和产品的质量，找到了最佳的操作条件：P= 12MPa，t=40oC。所提取的产品充分保留了柠檬香草中的活性成分和其特有的香味。周江等 以超临界c0：为溶剂，采用SFE对香草兰中香兰素的提取进行了研究，得到的最佳萃取条件为55oC，39MPa，产品的提取率可达97．2％，所提取的香兰素充分保留了香草兰的营养成分和活性成分，并具有香草兰独特的香气。Reis—Vasco等¨ 采用一萃两分的工艺流程，对薄荷精油的超临界CO：萃取进行了研究，其选用的最佳工艺条件为：萃取P=10MPa、t=50~C；一级分离P =8MPa，温度t =一16℃，除去其中的腊质成分；二级分离P：=1．8MPa，温度t：=0~C，所得到的精油品质纯正，香气浓郁。研究者还尝试将超临界技术与其他分离技术相耦合。如Chang等‘1 在提取分离绿茶精油时，将SFE技术与吸附分离技术相耦合，收到了提高分离效率之功效。
2．5 超声波萃取
超声提取的机制包括机械机制、热学机制及空化机制_1。超声萃取的空化作用是：存在于萃取液中的微气泡(空化核)在声场作用下振动，当声压达到一定值时，气泡迅速增长，然后突然闭合，在气泡闭合时产生激波，在波面处造成很大压强梯度，因而产生局部高温高压，温度可达5000K以上，压力可达上千个大气压，将植物细胞壁打破，香料得以浸出，从而提高萃取率。所以选择合理的声学参数，使萃取液达到最大空化状态，才能获得良好的萃取效果。杨海燕等 在自制的超声萃取试验装置上进行了超声萃取宽叶缬草中香料的试验研究。正交
试验显示，影响萃取吸光度值的主次因素为：萃取温度、萃取浓度、萃取时间。较优水平为萃取浓度10g／50mL、温度为45℃、时间2h。进行超声和不加超声对比试验表明，加超声比不加超声提高吸光度值12％～40％。文献_1 报道了一种
新型超声反应器，并将其应用于天然香料的提取T业中。此技术主要是利用超声波破碎细胞(空化作用)和强化传质(机械作用)，在天然植物的浸取过程中，粉碎植物细胞，释放出其内容物，以达到从中提取有效成分的目的，并起到提高传质速率、缩短浸取时间、提高有效成分得率的作用。
2．6 微波辐射诱导萃取技术
微波辐照诱导萃取法基本原理是促使香料植物组织的维管束和腺胞系统的细胞破裂，活性物质沿破裂的细胞自由流出，被萃取剂捕获并溶解其中的一个过程¨。微波萃取的方法一般分为常压法、高压法、连续流动法。与传统提取方法相比，新方法的特点是快速、节能、节省溶剂、污染小而且有利于萃取热不稳定的物质，可以避免长时间高温引起的物质的分解，特别适合于热敏性组分或从天然物质中提取有效成分 J。：另外，微波萃取的传热与传质方
向一致，因而加热均匀，萃取效率高。国外已有很多学者利用微波萃取香料，加拿大环境署Pare于1994年申请了美国专利，他们对薄荷、洋葱中的挥发油进行了提取。将剪碎的薄荷叶放入盛有正己烷的玻璃烧杯中，经微波短时间处理后，薄荷油释放到正己烷中，与传统的乙醇浸提相比，微波处理得到的薄荷油几乎不含叶绿素和薄荷酮。20s的微波诱导提取与2h的水蒸汽蒸馏、6h的索氏提取相当，且提取产物的质量优于传统方法。
1991年Jean等 在对熏衣草油进行微波提取时就获得了比水扩散技术多2．5％的乙酸芳樟酯和9．1％的芳樟醇。该方法与常规蒸馏法和萃取法相比，所得产品品质好、色泽浅、质地醇，而且微波辐射诱导萃取具有高效率、高选择性、不会破坏天然热敏性物质等优点。
另有Chen等 以正己烷：乙醇提取迷迭香及薄荷叶中的挥发油为研究体系，系统研究了微波场中的温度分布，考察了物料量、微波功率、照射时间等对微波提取的影响，并研究了微波提取挥发油的动力学过程。微波萃取法具有虽然具有良好的再现性，但此技术应用于天然香料的提取，鉴于基体物质和萃取体系的复杂性，其萃取机理还需进一步研究。
2．7 吸附法
吸附生产天然香料基本上有两种形式，即非挥发性溶剂吸收法和固体吸附剂吸收法。与其他方法相比，吸收法加工过程温度低、芳香成分不易破坏，产品香气最佳。鲜花或食品所挥发的香气或香气成分宜采用吸收法进行捕集。但其存在手工操作多，生产周期长，生产效率低等问题。非挥发性溶剂吸收法根据吸收时的温度不同可分为温浸法和冷吸收法两种。温浸法所用非挥发性溶剂为精制的动物油脂、橄榄油、麻油等。冷吸收法所用非挥发性溶剂为精制的猪油和牛油。在冷吸收法摘除的残花中，仍含有一些芳香成分，可用挥发性溶剂浸提法提取制取浸膏。固体吸附剂吸收法是利用吸附香气成分的吸附剂提取低沸点的香气成分，其特点在于能富集、提取沸点低的香气成分，且不会破坏香气的组分和性质。但高沸点的组分较少，因此精油收率一般较低。多孑L吸附树脂对极性较小的有机分子的有强吸附作用，因而主要用于头香制备。
2．8 微胶囊双水相萃取技术
双水相萃取分离技术是近年来溶剂萃取技术与其他技术相结合产生的一种新的分离技术。双水相能有效分离细胞匀浆中的极微小碎片，提取醛、酮、醇等弱极性至无极性香味成分，提取过程不需加热和相变，分相时间短，能耗低。但目前只限于生物物质、中草药有效成分的分离方面。
刘品华_2 提出的微胶囊双水相法，把微胶囊技术和双水相萃取技术相结合，用于提取植物精油、能避免提取过程中的高温、氧化、聚合等情况发生，有效地保护了精油的天然组分，通过调整精油和盐的用量改变分配比，可控制囊化萃取物中精油的各种成分比，以达到有目的、最有效的、最佳分配比的囊化萃取。此技术应用前景较好。
2．9 酶提取技术
梅长松等 用纤维素酶(CE)法提取松针中的天然香料，确定了酶法提取松针叶中有效成分的最佳工艺条件。与普通的水提取法相比，酶法具有提取条件温和，提取率高等优点，提取率可以提高40％以上。存在的问题与展望
近年来，随着气相色谱、高效液相色谱、质谱、核磁共振谱、红外分光光度法和紫外分光光度法在有机分子结构分析中的广泛应用，人们加快了对天然香料的提取和食品成分的研究进展，发现了一批很有价值的新型香料化合物，香料工业也取得了很大进步。在对天然香料提取的研究过程中，超临界萃取技术、超声波技术、微波技术等在香料工业中的应用也越来越广泛，这些新技术的应用，给古老的香料工业注入了新的生机和活力。但是由于发展不成熟，虽然这些新技术都具有可行性，各具特点，但也还存在着许多问题，例如超声波萃取技术中对合理的声学参数选择的研究、微波提取天然香料的萃取机理的研究等都有待有待进一步开展。同时，在选择提取方法时，注意对我们现阶段掌握的各项提取技术进
行综合的利用，将会是香料工业未来发展的一个突破，也是未来香料提取技术的一个发展研究方向，如超临界CO 萃取与分离技术中的分子蒸馏联用技术，超临界CO 萃取与吸附分离技术相耦合等都能有效提高提取效率，将新的提取方法结合新的分析技术，也将有助于香料提取工业的发展。另外，对新的提取技术要加强推广应用，例如应用超(亚)临界CO：萃取法提取精油的研究已取得初步成果，但仍局限于食品工业方面，今后应加强在提取领域的应用开发；微胶囊双水相萃取技术目前也只限于生物物质、中草药有效成分的分离方面，但其在提取植物精油方面具有良好的应用前景，应加强开发应用。
第三篇：植物提取物抗氧化成分及研究进展
植物提取物抗氧化原理及成分研究
抗氧化是抗氧化自由基的简称。因为人体常与外界接触，平时的呼吸、外界污染、放射线照射等因素会导致人体内产生自由基，过量的自由基会导致人体癌症、衰老和其它疾病，而抗氧化自由基（以下简称“抗氧化”）可以有效克服这些危害。因此，抗氧化已成为保健品和化妆品市场的主要研究课题之一。
本文从多种类植物提取物抗氧化成分及其原理出发，阐述了各界近年来利用植物对抗自由基的研究进展。
一、植物提取物抗氧化原理
不同的植物提取的有效成分不尽相同，同样，抗氧化作用的植物提取物也有很多不同成分，其作用机理也有所区别，西安源森生物从以下几方面进行了总结阐述：
（一）作用于与自由基有关的酶
与自由基有关的酶类分为氧化酶与抗氧化酶两类，植物提取物的抗氧化作用体现在抑制相关氧化酶的活性和增强抗氧化酶活性两方面。1.抑制氧化酶的活性
生物体内许多氧化酶，如P-450 酶、黄嘌呤氧化酶(XOD)、脂氧化酶、髓过氧化酶(MPO)和环氧酶等，与自由基的生成有关，能诱发大量的自由基。
另外，诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)在缺血再灌注时活性增加，产生大量NO而导致氧化损伤。
研究表明，许多植物提取物对上述各种氧化酶有抑制作用，从源头抑制自由基生成。黄酮类化合物中的槲皮素、姜黄素在缺血再灌注损伤时可抑制 iNOS 的活性，从而起到抗氧化作用；绞股蓝皂苷可以降低异常增高的XOD 和MPO 的活性，改善糖尿病大鼠肾脏的氧化应激，延缓肾脏损害的进展。2.增强抗氧化酶活性
机体存在具有防护、清除和修复过量自由基伤害的抗氧化酶类，如过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶等。SOD 是体内超氧阴离子的主要清除者，将其催化分解为H2O2，但H2O2也具有氧化损伤作用，CAT 将其转化为O2和 H2O。同时 H2O2也可通过 GSH-Px 的催化和还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成H2O，同时生成氧化型谷胱甘肽。
许多研究表明，植物提取抗氧化成分不仅能防护体内抗氧化酶，还能增强机体内抗氧化酶活性，如黄酮类中的槲皮素能减少胰岛β细胞的氧化损伤，同时还能恢复Fe2+致肾细胞损伤动物的SOD、GSH-Px 和CAT 的活力；皂苷类物质对氧自由基本身影响较少，但大多能提高体内 SOD、CAT 等抗氧化酶的活性，从而增强机体抗氧化系统功能。
此外，一些天然物质可在基因与转录水平上诱导体内抗氧化酶如 SOD 的表达，发挥其抗氧化作用。
（二）抗氧化成分之间互补和协同作用
植物提取物抗氧化成分之间存在相互补充、相互协调的关系，在体内通过电子和 / 或质子转移、作用于氧化酶和抗氧化酶、螯合钝化过渡金属离子、影响基因表达等途径联合发挥抗氧化作用。
研究发现不同浓度的茶多酚和西洋参之间均存在明显的协同增效作用，并且随着浓度上升，协同增效作用也相应增强。VE 和VC对鹰嘴豆抗氧化多肽的还原能力有显著的增效作用，且VC与鹰嘴豆抗氧化多肽的协同作用较VE更强，所有的协同作用随添加量和作用时间的增加而增强。
（三）直接清除或抑制自由基
植物提取物能够作为氢质子或电子的供给体，直接猝灭或抑制自由基，终止自由基的连锁反应，发挥抗氧化功能。1.提供质子
大部分抗氧化成分都是氧自由基清除剂，如多酚类物质、甾醇、VE等，原因之一是其本身可以释放出体积小、亲合性很强的氢质子，捕捉高势能的极活泼的自由基使之转变为非活性或较为稳定的化合物，同时自身转变成较氧化链式反应生成的自由基更稳定的物质，从而中断或延滞链式反应。2.提供电子
植物提取物发挥抗氧化作用的另一个原因是通过电子转移直接给出电子而清除自由基，如多酚类、植物多糖、维生素等。β-胡萝卜素有很好的抗氧化性能，能通过提供电子抑制活性氧的生成达到清除自由基的目的；而VC是通过逐级供给电子而转变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸以实现清除活性氧自由基的目的。
（四）螯合钝化过渡金属离子
过渡金属离子(如 Fe2+、Cu2+等)在氧自由基产生过程中是必需的，如 F e2 +既能介导脂质过氧化，也是•OH 等自由基产生的催化剂。
植物提取物中的黄酮类化合物具有4-酮基，5-羟基的分子结构，且B 环3′和4 ′位的连位羟基含有孤对电子，因而能螯合金属离子。能通过配位电子螯合钝化促氧化金属离子的抗氧化成分还有单宁、多糖、活性肽、植酸、柠檬酸等。
二、植物提取物抗氧化成分研究
植物提取物的抗氧化活性成分主要有生物碱类、皂苷类、维生素类、多酚类、多肽类和多糖类等，这些成分大多从谷物、中草药、蔬菜、水果、植物饮品和香辛料提取而来。西安源森生物就以上几类物质的抗氧化性进行说明：
（一）生物碱类
生物碱(alkaloids)是一类大多具有复杂含氮环状结构、显著生理活性的有机化合物，绝大多数分布在高等植物中，尤其是双子叶植物，如毛茛科、罂粟科、茄科、芸香科、豆科等。影响生物碱抗氧化活性的结构因素主要是立体结构和电性，杂环中氮原子越“裸露”在外，越有利于充分地接近活性氧并与之反应，抗氧化效果就越好；供电子基团或者能使氮原子富有电子的结构因素也可增加其抗氧化活性。
具有抗氧化作用的生物碱类有马钱子碱、苦豆碱、四氢小檗碱、去甲乌药碱、木兰碱、川芎嗪、小檗碱、海罂粟碱、药根碱、番荔枝碱等。
（二）皂苷类
皂苷(saponins)是中草药中一类重要的活性物质，根据苷元的化学结构不同分为甾体皂苷和三萜皂苷两类，前者多存在于百合科和薯蓣科植物中；后者多存在于五加科和伞形科等植物中。
近年研究表明，大多数皂苷具有明显的抗氧化作用，包括：五加科皂苷(包括人参、西洋参、刺五加)、豆科(包括黄芪、大豆、甘草)等。绞股蓝、红景天、灯盏花、七叶、柴胡、苦瓜、虎杖、罗汉果、油茶等所含的总皂苷成分也具较强的抗氧化活性。西安源森生物公司给i以五加科皂苷、豆科皂苷和红景天、虎杖、苦瓜提取的总皂苷成为作为抗氧化类主打产品。
（三）维生素类
维生素(vitamins)既是不可少的食品营养素，也是人体最重要的抗氧化物质。植物中的抗氧化维生素主要有VE、VC 和胡萝卜素，但它们在特定情况下也可成为促氧化剂。1.V E VE 是各种生育酚的统称，其中α-生育酚生物活性最大，若以它为基准，β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的生理活性分别为 40%、8% 和 20%，其余活性极其微弱。在大多数情况下，VE 的抗氧化作用是与脂氧自由基或脂过氧自由基反应，向它们提供氢离子，使脂质过氧化链式反应中断，是最重要的脂溶性断链型抗氧化剂。2.VC VC 又称抗坏血酸，是含有 6 个碳原子的α-酮基内酯的酸性多羟化合物。具有可解离出氢离子的烯醇式羟基，是最重要的水溶性捕捉型抗氧化物，能通过逐级供给电子而实现清除活性氧自由基；还能保护 VE 和促进 VE 的再生。3.类胡萝卜素
类胡萝卜素共有600余种，均为具有11 个双键的类异戊二烯结构，β-胡萝卜素是典型代表。研究发现有显著抗氧化性的还有叶黄素、玉米黄质、番茄红素和虾青素等。
β-胡萝卜素是VA 的前体，由4 个异戊二烯双键首尾相连而成，分子两端各有一个β-紫萝酮环，主要有全反式、9-顺式、l3-顺式及 l5-顺式 4 种形式。有很好的抗氧化性能，能通过提供电子抑制活性氧的生成达到清除自由基的目的。
叶黄素共有 8 种异构体，主要存在于甘蓝、菠菜等深绿色蔬菜及金盏花、万寿菊等花卉中。玉米黄质主要存在于枸杞子、玉米、菠菜和亚洲柿子等食物中。叶黄素和玉米黄质总是伴生存在，作用也十分近似，主要表现在抗氧化方面，能减少氧化胁迫对眼睛的伤害，即对视网膜黄斑部由光线所诱发的氧化作用有抵抗能力，能够预防因视觉斑降解引起的衰老。另外还能预防晶状体中蛋白和脂质的氧化，从而降低老年性白内障的发生。
番茄红素是一种无环类胡萝卜素，化学结构是一个非环的、含有11 个共轭双键和 2 个非共轭双键组成的线性全反式结构。能接受不同电子的激发，生成基态氧或三重态氧番茄红素，一个三重态氧番茄红素可猝灭成千上万个单线态氧自由基，抗氧化能力是 VE 的100 倍、VC 的 1000 倍，是自然界最强的延缓衰老的抗氧化剂。
虾青素是一种特殊的氧化型类胡萝卜素，不仅同其他类胡萝卜素一样在分子中有很长的共轭双键，而且在其两个紫罗兰环的 3、4 位上各有一个羟基和不饱和酮基，这种相邻的羟基和酮基可构成α-羟基酮。这些结构都具有比较活泼的电子效应，能向自由基提供电子或吸引自由基的未配对电子，极易捕获自由基，因此虾青素具有较一般类胡萝卜素更强的抗氧化性。
（四）多酚类
植物多酚类抗氧化物质就其化学结构的不同，可分为鞣质、类黄酮、酚酸3 大类。1.鞣质类物质
鞣质类又称单宁(tannins)，在植物中广泛分布，通常是指相对分子质量在 500～3000 的植物多酚。根据分子结构不同和水解难易可分为 3 类：水解鞣质(如没食子单宁、鞣花单宁)、缩合鞣质(如原花色素、低聚原花色素)、缩合鞣质与水解鞣质中的葡萄糖以碳键连接而成的复合鞣质(如山茶素 B、番石榴素 A)。
影响鞣质类抗氧化活性的因素有3个：单元的结合方式；羟基是否游离；六羟基二苯甲酰基(HHDP)、没食子酰基(gall)、脱氢六羟基二苯甲酰基(DHHDP)基团的种类及数量。当单宁结合单元(如儿茶素)以可水解的酯键、苷键结合时，分子的抗氧化能力增强，而以碳碳键结合成缩合型时，分子抗氧化能力大大下降；酚羟基游离时有利于活性上升；HHDP、gall、DHHDP 基团的活性顺序为HHDP ＞ gall ＞ DHHDP，在结合单元中，这 3 个基团数目越多，活性越大。
2.类黄酮物质
类黄酮(flavonoids)也称为黄酮类化合物，在多酚类物质中种类最多，几乎所有植物的所有组织均含有这类天然产物。泛指两个苯环(A －与 B －环)通过中央三碳键相互连接而成的一系列化合物，可进一步分为黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类、二氢黄酮醇类、黄烷-3-醇类(也即儿茶素类)、异黄酮类、查尔酮类及花色素类等亚族。黄酮类化合物具有不同的抗氧活性，其抗氧活性的大小与化合物的结构密切相关。酚羟基及其取代基位羰基、羟基成苷、羟基甲基化和Δ2(3)双键)的位置和数量是确定其抗氧化活性的重要因素。
一般认为，B环上的邻二酚羟基对黄酮类抗氧化活性起主要作用；一个环上的邻二羟基与另一个环上的对二羟基产生很有潜力的抗氧化性，A 环上的 5、7、8 位增加羟基可以不同程度地增加抗氧化能力。许多黄酮类化合物显示出明显的抗氧化特性，代表性的有刺槐素、槲皮素(栎精)、柚皮素、黄杉素、茶多酚、大豆异黄酮、三羟基查尔酮、矢车菊色素等。3.酚酸类物质
酚酸是指同一苯环上有若干个酚性羟基的一类化合物。自然界植物中发现的具有抗氧化性的酚酸类物质可分为 3 类：第1 类是羟基苯甲酸及其衍生物，如原儿茶酸、没食子酸、丁香酸等；第 2 类是鞣花酸及其衍生物，如3-羟基苯乙酸；第3 类是羟基肉桂酸(羟基苯丙烯酸)及其衍生物，如绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸、香豆酸、芥子酸等。
酚酸类物质的抗氧化能力，在化学结构上的规律与黄酮类一样，即凡在苯环上具有相邻酚性羟基者，比没有的要强得多，如具有联苯三酚结构的的没食子酸及其各种衍生物，比只有两个羟基的强。而具有邻苯二酚结构的如绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸，其抗氧化能力远比只有一个羟基的阿魏酸、芥子酸强。
（五）活性肽
具有抗氧化性质的多肽类物质被称为抗氧化活性肽(bioactive peptides)。国内外研究人员已从不同植物来源的蛋白质中提取到各种具有抗氧化活性的肽类物质，然而能了解细致分子结构，并进行相关机理研究的天然抗氧化肽仅限于谷胱甘肽，更多的是各种天然蛋白酶解物中具有一定抗氧化活性低分子混合肽，如大豆肽、玉米肽、小麦肽、米糠肽、花生肽。此外，在黑米、菜籽、灵芝、桂花、枸杞等植物蛋白质原料中均获得了具有抗氧化作用的活性肽。西安源森生物实验室研究表明：构成肽的氨基酸种类、数量及氨基酸排列顺序决定着肽的抗氧化能力。具有抗氧化能力的氨基酸及其衍生物有半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸和缬氨酸、5-羟色氨酸等。
（六）多糖类
多糖(polysaccharides)是由10个以上多种单糖聚合而成的天然高分子物质。近年来，人们对多糖及复合物的抗氧化活性作用有了越来越深入的认识。
已有大量研究指出，从植物中提取分离得到的多糖类化合物具有抑制脂质过氧化作用、清除自由基、抑制亚油酸氧化等抗氧化作用。枸杞多糖、金樱子多糖、黄芪多糖、油柑多糖、牛膝多糖、大蒜多糖、三七多糖等 100 多种植物多糖具有抗氧化作用，具有抗氧化活性的植物多糖不断被发现。
（七）其他类
还有许多成分如萜类(苍术酮、生姜单萜)、醌类(丹参醌、大黄蒽醌)、褪黑素等均为有效的植物源抗氧化成分。
三、结语
研究资料显示目前大多数抗氧化研究均采用体外实验，整体或在体实验资料较少，难以系统、准确地反应天然成分抗氧化作用的全貌。以整体实验为主，体外实验为辅，综合酶学、免疫学、药理学等多学科知识建立一套全面客观、高效快速的动物实验模型来综合评价物质的抗氧化性是以后研究需要重点解决的问题。
在为保健品市场提供有效应对高血压、糖尿病、肿瘤、帕金森症、老年痴呆等病症的优质抗氧化类植物提取物之外，西安源森生物公司已将“安全抗氧化植物提取物的营养保健食品应用”列为主要研究课题之一，以紧抓《食品安全法》颁布实施所带来的市场机遇。
第四篇：成分输血护理技术
成分输血护理技术
成分输血就是用物理或化学方法, 将血液中各种有效成分分离出来, 分别制成高浓度, 高纯度的制品 , 然后再根据患者的病情需要, 采用缺什么, 补什么的原则, 很容易达到一个有效的治疗剂量, 使输血更加有针对性。成分输血是安全输血的重要措施。护理人员在输血过程中, 若能正确, 安全, 有效的顺利实施, 可达到预期的目的, 否则就会给患者增添新的痛苦, 乃至危及生命, 这就要求护士必须加强输血的护理。
1、血源特征 1、1 新鲜冰冻血浆(FFP)。临床上新鲜血浆立即放入-50℃的具有风冷装置的速冻箱, 在最短的时间内冷冻血浆, 将完成速冻的血浆再放入-20℃以下冰箱内贮存, 使用前在37℃ 的恒温水浴箱内融化后, 等于新鲜血浆, 新鲜冰冻血浆保持期为1年, 1年后为普通冰冻血浆, 保质期为5年。
1、2 悬浮红细胞。新鲜全血或保存不久的库血经离心或静置, 使红细胞下沉后, 将上层血浆分离出来, 剩下的红细胞和少量血浆即为悬浮红细胞。在4± 2℃冰箱内保存, 以ACD抗凝剂的红细胞有效期为21 d, 5 d 之内称为新鲜红细胞, 用CPD-A 抗凝剂的红细胞有效期为35 d, 10 d 之内为新鲜红细胞。
1、3浓缩血小板。在22 ± 2℃震荡条件下可保存24 h, 在4℃ 储存时。活性很快下降, 6 h 后大约仅有40% 存活, 12 h后仅有20%左右存活, 故储存血即使是新鲜血, 其中的血小板也难达到止血作用。特制的血小板保存袋在22 ±2℃ 震荡条件下可保存5 d, 应用二甲基亚砜作保护剂, 低温(-80℃)保存血小板近几年也也取得了突破性进展, 使血小板的保存期达到半年。1、4 浓缩白细胞。在4℃ 条件下可保存24 h, 室温下保存不应超过8 h。
2、输血安全的护理 2、1输血前的护理：
输血前患者的心理护理。护士在输血前应耐心地向患者及家属解释输血的目的, 重要性, 方法和输血中及输血后可能出现的不良反应, 取得患者的合作, 为输血治疗打下良好的心理基础。2、1、1 输血前要采血检测患者的甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等, 同时按输血申请单要求逐项填写, 连同血样送输血科, 并与输血科人员一起校对并登记。2、1、2 输血前了解患者有无输血史及不良反应, 必要时, 遵医嘱给予抗组胺或者类固醇药物。2、1、3 熟练掌握输血原则, 是安全输血的关键。因此临床护士采配血样, 领血时, 应做到:（1）若患者正在进行输液, 输血,不宜在同侧手臂采血;（2）护士到输血科取血时, 应与输血科人员认真核对输血资料, 包括患者姓名, 病案号, 科室, 病房, 床号, 血型;献血者条形码, 血液编码, 血型, 血液容量, 血液种类, 采血日期, 有效期, 血袋及血袋标签完整性, 血液颜色有无异常, 有无溶血, 渗漏;交叉配血试验结果。2、1、4 了解患者体温, 脉搏, 血压, 呼吸及有无过敏史, 流产史, 死胎史, 是否查过Rh 血型和其它特殊血型, 并详细记录在输血护理单上, 并备好防治输血不良反应的药物等。2、1、5 输血静脉的选择。一般选用四肢浅表静脉, 可根据输血患者当前的具体情况而定, 输血器应选用带滤网的12~ 18号针头输注, 保证输血通畅。2、2 输血中的护理 2、2、1注意观察输血反应症状和体征。输血时应遵循先慢后快的原则, 输血反应多发生于输血后5 ~ 15 m in。常见症状: 倦怠感、背痛、发热、皮肤瘙痒、胸闷、胸部压迫感、呼吸困难、呕吐及沿输血静脉走行出现发热、疼痛、肿胀等。输血反应的体征: 颜面潮红, 紫绀, 出冷汗, 皮疹, 脉快而细弱, 脉律不齐, 血压下降以及休克等[ 4]。当患者出现上述症状, 体征时,应立即停止输血, 迅速报告医生, 并将输血装置, 血袋等保锱下来, 连同相关表格、标签等一起送检, 以便查明原因。2、2、2 输血过程中禁止加入其它药液, 以免发生凝血或溶血。2、3 输血后的护理 2、3、1 由于输血穿刺针头粗, 故拔针后应压迫局部3 ~ 5min, 以防止出血, 如有出血倾向应适当延长时间, 直至不出血为止。2、3、2输血后数日至2周内有出现迟发性溶血反应的可能,护士应注意观察患者的全身情况, 生命体征的变化、血常规、尿的颜色、性质及量等, 以便早期发现异常及时治疗。2、3、3 有些输血反应如: 疾病、感染等发病较晚, 护士应做好出院指导, 嘱患者定期来院检查。2、3、4 一次性输血器和注射器经毁形, 浸泡, 消毒后由专门机构回收集中处理。输血后的血袋及不良反应回报单, 一并送至输血科, 低温保留24 h, 再由指定人员回收焚烧处理。
第五篇：酵母双杂交技术研究进展
酵母双杂交技术研究进展
提 要 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。作为一个完整的实验系统，它自建立以来经过了不断的改进与完善，不仅进一步提高了实验结果的可靠性与精确性，而且在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。这些都将对功能基因组学和蛋白质组学的研究起到促进作用。
0 引言
随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，大量关于基因结构的信息不断涌现，对这些信息进行系统研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。这不仅需要利用计算机进行生物信息学的分析和预测，而且必须结合生物学实验获取证据。为适应同时对多个基因或蛋白进行研究的发展趋势，已出现了很多新技术，如DNA微阵列技术（DNA micoarry）,基因表达的系列分析（SAGE）,肽质谱分析法，蛋白双向胶电泳技术及酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。酵母双杂交技术的基本原理
1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统〔1〕。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。酵母双杂交技术的应用现状
酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相
互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。常见问题的解决与改进
酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。另外,报告基因通常整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：
(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。
（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来,酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进,并且已取得较好的效果。
在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。造成假阴性的原因主要有两 方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。
转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度cDNA库进行筛选时，必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化，相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时,共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中,通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库，但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。因此，大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法。酵母双杂交技术的新发展
酵母双杂交技术在应用中发挥了巨大的作用，但人们也注意到了它有一定的局限性。为此发展了多种适应不同目的需要的改型的双杂交技术。
反向双杂交技术 在研究中检测并鉴定出那些能阻断两个蛋白间相互作用的因素有重要意义。在研究那些能使相互作用被阻断的因素(如寻找哪些结构域上发生突变可使相互作用中
断或那些分子可以阻断相互作用)时，传统的双杂交技术有较大的局限性。因此，反向双杂交系统(Reverse Two-Hybrid System)应运而生。这项技术的特点是采取了反选择筛选策略。根据反选择设计的不同，大致可以分为两类。一类是用便于反选择的URA3或CYH2基因作为报告基因。URA3基因编码尿嘧啶合成途径中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）转变为细胞毒性物质，使细胞无法生长。反之，在能生长的细胞中，外界因素已使蛋白间的相互作用不能发生，而我们想知道的正是这些因素。因此，只要对存活的克隆进行检测就可以得到结果。Vidal等人用这种技术发现了影响转录因子E2F1中与DP1相互作用必需区内的点突变。另一类是将常规报告基因(如HIS3)置于大肠杆菌转座子Tn10编码的tet-抑制因子(TetR)/操纵基因控制之下。待测蛋白之间发生相互作用后首先激活tet-R基因表达抑制因子TetR,TetR结合到tet操纵基因后就抑制了报告基因的表达，结果转化子不能生长。只有当待测蛋白之间的相互作用被某种因素所阻断而无法激活tet-R基因时，报告基因才能摆脱tet操纵基因的控制而表达，使转化子获得在选择培养基上生长的能力。Shih 等人利用这种方法鉴定出cAMP-应答元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位点的Ser133突变会阻断其与辅助激活因子(CREB结合蛋白)的相互作用。
三杂交技术 在许多细胞内信号传递过程中，两个蛋白间的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究这些大分子对蛋白间相互作用的影响过程中发展了一种新的技术系统——三杂交系统(Three-Hybrid System)，其本质与双杂交是相同的，只是需通过第三个分子的介导把两个杂交蛋白带到一起。例如小配体三杂交系统(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以渗透的二聚体化学诱导物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作桥梁，将AD和BD融合蛋白连接到一起，激活报道基因的表达。研究较多的是免疫抑制剂FK506。Belshaw等将FK506与环孢菌素A(Cyclosporin
A)构建成异源二聚体，它能把分别与FK506和环孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活报告基因。Licitra将FK506与地米塞松(dexamethasone)通过共价键连接成二聚体。通过实验进一步证实了FK506与蛋白FKBP-12间的特异性相互作用，表明用这种方法鉴定蛋白与小分子间的相互作用是切实可行的。RNA与蛋白之间的相互作用是许多细胞生命活动的基础，例如mRNA的翻译，早期发育以及RNA病毒的感染等。然而可用于这方面研究的简便方法却很少。RNA三杂交系统(RNA Three-Hybrid System)的建立为分析RNA与蛋白之间的相互作用提供了有效的手段。这个系统主要是由一个RNA分子和两个都能结合该RNA的蛋白质组成。此RNA的一部分与一个已知蛋白结合后就可利用它的另一部分去筛选新的RNA结合蛋白。因此这种技术既可检测由RNA介导的两个蛋白质之间的相互作用，也可筛选鉴定新的蛋白结合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突变体RevM10与Gal4 DB域融合作为诱饵蛋白，利用该RevM10蛋白能识别并结合其靶RNA中Rev蛋白反应元件(Rev responsive element,RRE)的作用去筛选同样也能与此RNA结合并已与Gal4 AD域融合的未知蛋白。根据同样的原理，如将一个已知RNA与RRE融合形成杂合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作为诱饵，便可用于筛选该RNA结合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌体衣壳蛋白能识别结合其基因组内一种21核苷酸的RNA茎环结构的特性，将RNA噬菌体衣壳蛋白与Lex DB域融合，构建成可用于寻找体内的RNA结合蛋白的酵母三杂交系统。
核外双杂交技术 在传统的酵母双杂交系统中，蛋白之间的相互作用是在细胞核内发生的。因此,它不能检测某些在核外蛋白之间的相互作用。为了克服这种局限性，近年来有人建立了核外双杂交技术。其中SRS 和USPS就是这种技术的两个代表。SRS也称Sos蛋白召集系统(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分别将待测蛋白X与哺乳动物细胞的一种鸟苷交换因子(EGF)Sos蛋白融合；将Y蛋白与锚定在酵母细胞膜上的Src肉豆寇烯化信
号蛋白融合，并使它们共表达于一个cdc25-2基因温度敏感型突变的酵母菌株内。由于该菌株中cdc25-2基因编码的EGF蛋白在36℃条件下不能激活细胞膜上的Ras蛋白，Ras途径不通。所以细胞无法在36℃条件下生存。但如果待测蛋白X与Y之间发生相互作用就能把Sos蛋白带到细胞膜上并激活附近的Ras蛋白，从而打通Ras途径，使该菌株获得在36℃条件下生存的能力。Aronheim等用此技术鉴别出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分离到了一个AP-1抑制因子JDP2。USPS也称为基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的设计是根据这样一个事实，即真核细胞中遍在蛋白与某一蛋白之间新生成的融合会被遍在蛋白特异的蛋白酶(UBPs)迅速切开，但这种切割只有当遍在蛋白正确折叠时才会发生。研究发现，遍在蛋白基因的N端和C端这两部分即使分离，只要共表达与同一个细胞内，它们仍能正确折叠。将待测蛋白X与带有点突变的遍在蛋白N端片段融合，将待测蛋白Y与下游接有报告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它们共表达与同一个细胞内。因遍在蛋白N端片段内含有点突变，它与C端片段之间不能自然形成正确的折叠。只有当蛋白X和Y之间发生相互作用时才能克服点突变的影响，使遍在蛋白的两端形成正确折叠，从而引来UBPs切除与C端片段连接的报告蛋白。此技术建立之初是通过Western blot检测有无被切下的报告蛋白来判断待测蛋白之间是否发生了相互作用的，所以操作比较繁琐，不便于推广。最近有人对它作了改进，以一种融合的转录激活因子PLV作为报告蛋白。PLV一旦被从遍在蛋白C端片段上切下，它就会进入细胞核内激活特定的报告基因，如：LacZ 和HIS3等。这样就可以根据转化细胞是否生长及显色来判断待测蛋白之间有无相互作用。因此极大地简化了操作步骤，提高了筛选效率。酵母双杂交技术发展与应用的趋势
在后基因组时代更具意义且更能发挥酵母双杂交技术的领域是研究生命活动中的网络调节。第一个具有开拓性的工作是Bartel利用酵母双杂交技术建立了一个T7-噬菌体的网络调节图(linkage-map)。Fromont-Racine等对筛选到的阳性克隆进行鉴定测序，并将它们分为5类，然后对其中的四类(非编码序列除外)通过15轮的筛选与分析，绘制出一张综合了酵母蛋白相互作用的全局性信息图。这是以往的实验所难以获得的。
为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库。它主要有以下特点：
(1)来源于多种组织器官和细胞系，因此含有几乎所有基因的cDNA；
（2）所含各种cDNA的丰度趋于平衡；
（3)含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。
这样既避免了5’非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多。
最后，有必要指出的是，酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。
胡文峰
2007040380106
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