小鼠MCAO总结

第一篇：小鼠MCAO总结

小鼠MCAO模型

一、实验器材：

1.手术器械：眼科剪

1、显微剪

1、钩镊

1、直镊

1、显微镊

2、止血钳

1、持针器

1、缝合线（2-0/5-0）、缝合针、麻醉剂：10%水合氯醛（350mg/kg）2.栓线：0.18mm（20~25g）、0.20mm(25~30g)；在栓线10mm的位置用黑色记号笔标记；75%酒精清洁后置1: 2500单位肝素化生理盐水中备用。

3.其他用品：酒精棉球、75%酒精、生理盐水、注射器（1ml、2ml）、黑色记号笔、固定鼠用粗线绳、鼠板

二、步骤：Zea Longa 线栓法

1.麻醉：10％水合氯醛腹腔注射（350mg/kg）2.术前准备：仰卧位固定大鼠，备皮消毒 3.分离血管及挂线：

1)自胸骨柄到下颌骨间取长约1cm 正中切口。见下颌下腺，将其分离至两侧；

2)见右侧肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌、二腹肌形成的三角区，镜下分离此三角区内，暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）； 3)首先分离CCA于其上挂线1；

4)随后向头侧分离ECA血管及其分支，于ECA上头尾侧分别挂线2、3；

5)然后清除CCA分叉部脂肪，观察ECA分支与ICA关系，分离ICA及ECA分支，于其上挂线4；

6)注意操作轻柔避免迷走神经、舌咽神经、气管损伤，避免过度牵拉血管使其严重移位或断裂。

5.结扎：死结：线1、2；活结：线4；不系结：线3 6.剪口插入：

1)将鼠台逆时针旋转90°，在ECA上距分叉1~1.5mm用显微剪剪一切口； 2)将标记好的线栓由此切口插入CCA 中；

3)将鼠台转回，将线栓从CCA拔出至分叉稍尾侧，右手将线栓转向滑入ICA，右手拉开线4活结，后继续插入ICA，待有阻力时再进入少许，深度1cm+，到达大脑中动脉与前交通之间；

4)顺利插入后将丝线4扎紧，抽出线3减去多余线头。6.缝皮

7.术后：小鼠俯卧位，头略抬高，至于温湿度适宜环境。

三、注意事项：

1.雌性鼠对于牵拉等操作的反应更强烈，故建议选择雄性大鼠作为实验对象。

2.大鼠解剖学变异：一般而言，Fisher-344大鼠MCA解剖变异较小，闭塞后形成的梗死体积一致性好；Wistar-Kyoto 大鼠变异相对最大； 而Sprague-Dawley大鼠介于两者之间。3.麻醉：10%水合氯醛腹腔注射（30ml/kg），一般可持续1~1.5h。如按标准体重计算的麻醉剂量效果欠佳，可使用总量的10%进行追加。需注意反复多次或过量追加易造成动物死亡，或导致清醒推迟而影响再灌注前评分，从而使再灌注时间不能统一界定在2h。水合氯醛可使动物呼吸频率下降50%左右,但一般不会导致动物窒息而死亡。术中严密观察动物呼吸频率、深度及有无痰鸣音等。

4.分离气管前肌肉时注意保护好甲状腺和甲状旁腺。甲状腺呈鲜红色，紧密贴在气管前壁上，甲状旁腺位于甲状腺外上方，颜色略淡。血管分离要到位，使用电凝器可明显减少小血管的出血，从而保证手术野清晰，尤其是肌肉内部的血管和 ECA 的一些细小分

支，未明确时不可随意离断。结扎血管时要注意力度和方向，由于血管被膜被分离后血管表面相当光滑，结扎不牢可能导致难以控制的出血；术中还要注意保护与血管紧密相依的神经，注意观察神经的颜色、反光性和轻触时的感觉，切勿损伤或离断。牵拉迷走神经时可见动物呼吸明显减慢甚至血液呈深紫色，出现肢体末端紫绀。在无法给予辅助通气时，应暂停操作。一般来说，动物呼吸可恢复到麻醉后的平稳状态，血液颜色也可恢复到正常，这时再继续手术较为安全。

5.关于是否结扎 PPA 文献报道尚不一致。可沿ICA一直分离至看到其入颅分支与PPA分叉处，观察线栓走行状况，若顺利将长度约1cm的线栓插入，则可固定线栓而无需对 PPA进行操作； 如只进入5mm左右即遇到明显阻力，则线栓进入PPA的可能性很大，此时可将线栓撤离至ECA/ICA处，提起PPA，以帮助线栓沿ICA进入颅内而最终阻塞MCA。

6.Koizumi等1986年首次报道不开颅经CCA插入尼龙线栓致MCA闭塞；之后，Longa等进行了改良，将栓线从ECA插入，再灌注时将栓线抽回ECA内，通过CCA实现再灌注。Koizumi使用的丝线末段均匀包被硅胶，直径增加近30~40%，插入后不仅可伸入大脑前动脉ACA）近端，肯定阻塞ACA及前交通动脉，而且阻塞MCA及后交通动脉开口处，彻底阻塞MCA及其所有侧枝供应血管，形成供应区域完全缺血，因此局部梗死面积大，均匀一致，各动物间差异较小。Longa使用的4-0尼龙线末端球形扩大，但并非直接闭塞MCA，而是依靠结扎同侧ICA和其球形扩大的末端伸入ACA腔内、阻断经前交通动脉来自对侧ACA的血流形成局灶性脑缺血，但不能阻断来自后交动脉的侧枝供应，且丝线末端伸入ACA腔内位置不同，所起作用差异很大，因此形成的梗死面积很小，各动物之间差异较大。宋红松等建议采用Koizumi方法。丁香园：

1.注意尽量不要损伤在颈内颈外分叉下的交感神经节。2.栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了，有时候很顺利一插到底，但有时候在中间就怎么也进不去了，这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度。因此，碰上这种明显阻力时，一定不能盲目向前使力插，越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管。这时候正确的作法是往外抽出较多栓线，也许会有一定的动脉血流出，不必慌，只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲，一般都能进去，反复试几次还不行最好换根栓线，很可能前端也经变形角度变了！颈内动脉的走向为内上方,可以用眼科镊夹住鱼线插,但进去后要注意,别太用力,要不血管就要破了

3.栓线不能在血管里反复进退，否则及容易造成蛛网膜下腔出血，而且很容易误解为模型成功，因为这时的神经功能改变也很明显，但并不是由于栓塞引起的

4.大鼠仰卧时，ICA从CCA分出后下行（向背侧）约5mm又分为两支A，即走向乳突泡（Mastoid bulla）的 翼腭A和进入颅内的ICA的延伸部分。因为翼腭A的走向几乎和分

支前的ICA走向相同，而ICA的延伸部分则是改向头侧走行，所以插线时会很自然的进入翼腭A。进线时，用镊子将ICA轻轻往头侧推一下，使ICA和其延长的分支成一直线，同时顺势插线，可很容易的进入颅内。或使栓线有一定程度的弯曲，且只要保证栓线向屋顶方向弯曲，一般都能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。

5.注意手的感觉，轻缓推进，直至感觉到阻力为

止（当遇到阻力后，再插线会见到线弯曲）。可能有人会说，把血管插破了也未感觉到阻力或线遇阻后的弯曲。一个原因是线太硬，另一主要原因是当栓线从血管切口插入后为防止血液从此处流出，需要结扎一条细线，这条线结扎的松紧程度很关键，应在不流血的情况下尽可能的松，这样你会发现进线时很轻松，一旦遇到阻力，就会感觉到。后者至关重要，请体会。

6.栓线一旦进入ACA，就要把上面提到的那根细线适度扎紧（“适度”很重要，会影响到再灌流时大鼠的生死存亡），此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。血管外的栓线不要留得过长，更不要缝在皮外，大鼠醒来后会自己拔出。

7.如果你用的是中长效麻醉剂，插线成功后，固定丝线，然后让其俯卧位，而且稍稍抬高其颈部，才能确保模型成功。8.术后一定要注意保暖。

9.插入线拴要轻柔熟练，速度尽可能快，以避免时间长了血管内血栓形成。

10.手术后评分的主观因素很大，有用5分制和11分制的，我个人认为用5分制比较准些。11.大鼠大脑中动脉永久性闭塞性脑缺血模型，梗死体积出现的最小时间点可能为2h，体积随时间进行性增大，至12h基本趋于稳定

12.整个试验是很费动物的，存在15-30％的淘汰率（如果你做的好），但注意严格控制自己淘汰的动物（纪录具体情况）。

13.除了刚才说的蛛网膜下腔出血外，还有一些老鼠肺出血明显，整个肺暗红，我也想不出原因，不知道是不是医学临床所说的脑肺综合症.14.术后处理：由于术后动物尚未清醒,因此护理也很重要。但为保证栓线成功,达到预期的阻塞时间,防止栓线脱落暂时把动物留在手术台上,保证动物不会因挣扎而把栓线过早脱落,但仍需监测体温,并注意保暖。再灌注后动物可放入笼中。另外笼中应保持干燥,没有积水及粉尘,防止动物误吸而窒息。我们在实验中发现一些模型症状不典型甚至没有症状,都是由于动物苏醒后极力挣扎使栓线过早脱落所致。手术后大鼠存活期可以满足通常的实验需求,一般来讲,随着栓塞和再灌注损伤时间的延长,死亡率会上升。大鼠在术后24～48小时最容易死亡,这种死亡是严重脑缺血损伤造成的,较直接的因素是脑水肿。用线栓制作持续性局灶性脑缺血模型时,术后要肌注庆大霉素预防感染;如果动物模型要生存1周以上,必要肌注速尿,防止因脑水肿动物在短期内死亡。术后饮水中加入葡萄糖,保证动物术后有充足的能量生存到实验要求的时间。

舍去标准：

⑴栓线插入深度不足18 mm,且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠 ⑵ 蛛网膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis环动脉有凝血块的大鼠，因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤，而非MCAO/Reperfusion损伤。3）手术时出血较多，症状很重的动物。死亡原因分析：

首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是插线太深，以后注意插线深度；如无出血，则还要再看是否有严重的半球水肿，如水肿严重，则表明死因是脑缺血时间太重，需要缩短缺血时间；如既无出血，又无明显的脑水肿，那就要注意动物状态或生活环境是否太差。

第二篇：小鼠游泳实验及解剖总结

小鼠游泳实验及解剖总结

1测试小鼠的抗疲劳能力~有时候还需要测定其恢复能力~但实验周期长，故不作要求~

2首先抓取小鼠，在天平上放一个烧杯，去零，称重，记录小鼠体重，为m g 称保险丝，保险丝体重为小鼠体重百分之十~ Ps 方法：要用到刻度尺，首先称一定长度的保险丝的重量，如记为a cm，重量为n g，则我们要量取的保险丝长度为x=0.1m*a/n

3用细绳系上保险丝（要注意细绳的长度要适当），怎么系呢，系在尾巴根部，用一烧杯扣住小鼠，烧杯开口处有一小嘴，所以让小鼠的尾巴露出来即可~2个人操作，一个人用手按住烧杯，一手捏住小鼠尾巴中部，一人则将系有重物的细绳系在小鼠尾巴中部~

4一人将小鼠放入装有温水的超大量筒，一人开始将小鼠放入烧杯的同时，一人开始计时，等到小鼠下沉10秒，则停止计时。

5记录时间即可啦~ 补充：扔进大量筒之前可以先将小鼠打湿，为什么呢？因为小鼠的毛比较蓬松，里面充了空气，所以当把小鼠放进大量筒后，可能对实验有影响~有时甚至把小鼠毛给刮掉~ 比较严格的实验还要求小鼠要空腹，不然小鼠肚子里有粪便，对小鼠体重也影响~

小鼠解剖

解剖方法类似于蟾蜍解剖~用大头针固定~辨别雌雄，雌性有三孔：尿道，阴道，肛门。雄性少了阴道。对于雄性，有时候可以看到睾丸在外面，有时候在肚子里面~不同小鼠情况可能不同

观察的有心脏，肺部，食道，味，盲肠，颌下腺，舌下腺，腮腺，淋巴，胰脏，脾脏，输卵管，子宫，卵巢等等 颌下腺（2片）深红色，前段一块覆盖着半透明的舌下腺，因为半透明且覆盖在颌下腺上，所以也呈现深红色，所以可以将舌下腺那一片掀开，再放回去，可能比较容易观察，有的小鼠可能淋巴发育比较成熟，会覆盖在舌下腺上，注意区别。

盲肠：没有路的长，很容易辨别的吧。

对于雌性，要分清子宫（类似Y形）输卵管，卵巢的相对位置。

第三篇：小鼠品系介绍

Swiss、KM、ICR、CD-1小鼠品系来源与优缺点

1.品系名称由来

（1）Swiss：1926年美国Rockfeller研究所的Clara Lynch博士从瑞士（Switzerland）Centre Anticancereux Romand的de Coulon实验室引入非近交白化小鼠，培育成Swiss小鼠。

（2）KM：1944年3月17日卫生部北京生物制品研究所汤飞凡教授从印度Hoffkine研究所引进Swiss小鼠，饲养在中国昆明中央防疫处。由于该小鼠起初引入地是昆明，故称之为昆明小鼠，这就是昆明小鼠品系名称的由来。

（3）ICR：1948年，美国费城癌症研究所（Institute of Cancer Research, ICR）Hauschka以多产为目标，用Rockfeller研究所培育出的Swiss小鼠群进行选育，培育出Ha/ICR，以后由美国肿瘤研究协会分送各国饲养实验，各国称为ICR小鼠。中国科学院遗传研究所在1973年从日本国立肿瘤研究所引进，1979中国医学科学院分院动物中心引进，1978年北京检定所引进，1983年上海计划生育研究所从瑞士苏黎世毒理学研究所引进。

（4）CD-1：1948年Edward Mirand博士将费城癌症研究所培育的Ha/ICR引入Roswell Park Memorial Institute，命名为HaM/ICR。1959年美国Charles River Lab引入该品系并于同年进行了剖腹产，并命名CD-1（ICR），并注册CD-1®商标。

2.优缺点

（1）KM：优点是抗病力和适应力很强，繁殖率和成活率高。KM小鼠基因库大，基因杂合率高，在中国昆明小鼠作为实验动物用于生物医学研究已有半个多世纪之久，一直是我国生产量、使用量最大的远交群（封闭群）小鼠，被广泛应用药理学、毒理学等领域的研究，以及药品、生物制品的生产与检定，药典中甚至将KM小鼠作为某些检测项目的指定用动物。目前国内已从KM小鼠远交群中先后培育出不少近交系小鼠：C-1，615，TA2，AMMS/1等。缺点：国内各地昆明小鼠遗传背景不很一致，不同地饲养的昆明小鼠封闭群的生长发育与繁殖性能存在较大差异。

（2）ICR：优点是除了抗病力和适应力强，繁殖率和成活率高之外，从全球范围来看，ICR小鼠的使用更为普遍，其背景资料也更为丰富，而且发表文章时动

物品系这一考核指标更容易被接受。缺点：与KM小鼠相同，不同地域饲养的封闭群差别也较大。

（3）CD-1：是ICR小鼠的升级替代品系。因为Charles River Lab已经注意到了ICR小鼠的缺点，为了减少CD-1小鼠因不同地域饲养而引起的不同封闭群之间在生长发育与繁殖性能上的差异，Charles River将世界各地繁殖的CD-1种群按计划定期轮换，形成了具有国际遗传学标准的CD-1 IGS（International genetic standard）小鼠。这也是CD-1小鼠特有的优势，1999年北京维通利华公司从Charles River引入CD-1核心群，成为中国大陆唯一授权使用其注册商标权的单位。

第四篇：MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结（精选）

MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结

2008-06-19 00:00 来源：丁香园

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知识总结

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1517 关键词： MEF小鼠 胚胎成纤维细胞

小鼠胚胎成纤维细胞的富集

1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。

8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。

10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。

12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。

注释：

我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。

培养基成分：

88％ DMEM 10％ FBS 1％ NEAA 1% 双抗

对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。

小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代

1、移去MEF培养基

2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。

6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。

7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。

8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。

注释：

MEF培养基成分：

89% DMEM(Gibco # 12100-046)10% FBS(Gibco # 16000-044)1% NEAA(Gibco # 11140-050)MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。

小鼠胚胎成纤维细胞的冻存

重悬培养基：

80% DMEM 20% FBS 1% NEAA 冻存培养基：

60％ DMEM 30％ FBS 20％ DMSO

1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。

3、将细胞吹打下来。

4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。

5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。

6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。

7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。

8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。

9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。

10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）

11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。注释：

提前标注好冻存细胞的以下信息：

细胞系名称

传代的代数

冻存细胞的数目

日期

Initials 注明冻存/解冻形式

小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏

1、将冻存瓶从液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）

4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。

5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。6、1000rpm离心5min。

7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。

8、放入37℃培养箱。

9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。

1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。

2、关于提取MEF的比较好的protocol

3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。

4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：

（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。

（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。

网友crepi 的观点：

1、我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点

2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了

3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱

4、原代培养的最大天敌还是污染

网友baichangming的观点：

MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。

网友北羽迦楼的观点： 细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。

我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。

附带一句，易消化易贴壁是fibroblast的共性。

第五篇：小鼠尾静脉注射心得

小鼠尾静脉注射心得

对血管的选择

1.小鼠尾部有三条静脉，左右两边各一条而且比较浅，容易穿刺；中间一条较深不容易找到，建议尽量不要选择。另外穿刺选择尾部中下1/3-1/2处比较好，因为此处皮肤较薄，可以用75%的酒精反复擦拭穿刺部位血管，使其充盈，并使皮肤的角质层软化，便于穿刺。或者在注射之前，小鼠尾巴用温水泡大约2min,（水温大约50℃），这样才能使血管充分舒张。注射前用干棉球擦干，从下往上扎。这样的好处是万一一次扎不进，还可以继续使用此血管。

2.针的选择：书上说使用的是1ml的注射器，有人在实验中用的是头皮针，后接1ml注射器，因为头皮针针头更小，对血管的损伤更小，适合连续多次给药，其次使用头皮针穿刺后，我们可以通过回血来判断穿刺是否成功。（4号半1ml 注射器已经足够且容易进针。

3.注射手法：左手食指和中指上下夹住你所选择血管的靠近身体的一边，无名指和小指垫起一块纱布或者纸巾（建立一个穿刺的平面的作用），拇指压住所选血管的尾尖端，上下夹住血管的距离应以不影响右手持针上下移动为宜。（否则容易人为建立穿刺的角度，而使右手持穿刺针穿刺过深，导致穿刺失败。）右手持穿刺针，针斜面向上，针与皮肤稍成一角度（10℃左右），进针后要将针头稍向上挑，然后将针向里送一点。如果在血管里，则无阻力，并且能看见针。若针看得很清晰，则扎到了皮下，若针看不清，则针扎深了。看到回血表明成功，还可以回抽，见到回血后表明穿刺已进入血管，可以给药。

4.穿刺结束后，用纱布压住穿刺部位反折尾部进行止血。良好并彻底的止血对于血管可以起到很好的保护作用，这对于需要天天穿刺给药是非常有用的。（一般小鼠需要按压时间很长，否则易引起出血。）

5.用细针头皮下进针（我用的是4号）从远端打起，后面的皮薄一点，较容易打成功（个人看法），打成功时进针会很顺畅，注药没有阻力，一般不会自己回血，若不成功再往近端打，但一般一条血管打过三次还不成功的话最好先暂停，因为刺激后血管会收缩，很难打，歇一会儿换另一边打。还有一点，信心很重要！有了信心才能找到感觉。

1.将小鼠固定好,将尾巴拉直，绷紧，这是成功的第一步。

小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。

或者用这个方法：1 小鼠要固定好，自制一个笼子，前面通气，中间最好有一个挡板，让小鼠不能后退，筒子后面开一个口，尾巴从这里出来，这样固定牢靠；

2、注射前尾巴用稍热的水浸泡几分钟，有利于注射；

3、先远后尽，不要一开始就从尾根部，那样失败了不好办；

4、进血管后注意保持稳定，针尖很容易刺穿血管的。至于能否穿进，个人手感如何，全靠自己啦。多练习，一定很快掌握的，不难，绝对不难！我练习10余只小鼠就比较熟练了

2.用酒精棉球擦拭尾巴,使血管扩张;或者用热水或者热毛巾焐热，使静脉扩张；选用适当的针头，越细越好；在尾部较靠近上段的地方注射，这里血管比较大。用酒精或热水擦拭，擦拭的时候，可把尾巴用力扯在桌面上。注射状态为尾巴发白，紧靠白色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉。

3.用左手的食指,中指,无名指及大拇指将小鼠尾巴固定,;手法：握住1ml注射器前面0.1ml处。右手小指搭在拽着鼠尾的左手拇指处 按此手形进针；看针尖前面那个斜面有3/4（关键），如果血管充盈则进1/2，进入，停，上挑针头，进针；左右轻摆动，如可动，可注射。原则是：把你第一次打进的手形，完全固定下来，每次都重复。

4.注射:注射时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，尾巴与桌边紧贴转弯处为进针部位，一般选择距尾尖1/4或1/3处进针，此处皮肤较薄，血管清晰，进针容易。进针时针头与桌面平行，针尖稍稍朝下，从中指及无名指与拇指接触处稍上方进针，一旦进入，须将针头稍稍上挑进入，针头沿血管进入，肉眼可关察到针头前进。如果针头在血管中前进，可明显地感觉到针行通畅，毫无阻力。若针头不在血管中，手感针行有阻力，有一种堵的感觉。进针时不要太深，针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，推液时无阻力则说明成功了！如针头处出现皮丘则说明在皮下，推出重来。进针处最好在尾巴的1/3-1/2处，甚至可以更下一点。这样一次失败了还可以往上再来，不要马上在最高处打，因为你们要打这么多天。要为以后作准备。用热水、酒精、红外都可以扩张血管。可以视情况而用。总而言之，最重要的是“熟能生巧”。你最好先练习一下或请高手相助。不然到了最后几天，真的很难打的。

2。注射：针进入后，切记手不可发抖，因为血管壁非常薄，容易扎穿。推药时，要缓推。若进针成功，推药顺畅，无阻力；若推药时感觉有阻力，说明针头不在血管中，须及时拔出，重新进针。一般选用4号或4号半针头。最好用打疫苗的2毫升一次性注射器。尾静脉注射并不难，主要是一种感觉。若用上十只鼠练手，你必会找到感觉。心要静，手要稳，要有耐心。我研一的时候尾静脉注射让我头疼万分，越急越打不进去。后来静下心来，边注射边找感觉，很快就熟练了。

祝你找到感觉

5.通过看有无回血来测试针是否在静脉内;

6.注射.