关于购买实时荧光定量PCR仪申请报告[精选五篇]

第一篇：关于购买实时荧光定量PCR仪申请报告

关于购买实时荧光定量PCR仪申请报告

尊敬的校领导：

自我校2012年提出“五大工程”以来，人才队伍实力与水平得到显著提升，同时我们也清醒地认识到现在高校所面临的生存危机，应对危机唯有发展壮大我校的软实力：大力发展特色学科、特色专业；大力开发研究秦巴山区优势生物资源，立足于秦巴山区，服务于全国。然而，我校在科研仪器设备配置方面还有待提高，我学科现需购置实时荧光定量PCR仪，申购理由如下：

高通量的检测和定量核酸序列的实时定量PCR系统，在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。广泛应用于肿瘤的分子诊断，新药筛选，基因表达研究，转基因研究，单核苷酸多态性（SNP）及突变分析，病原体的分子检测，遗传分析等。

关于实时荧光定量PCR仪功能介绍：我校位于秦巴山区，秦巴山区素有“天然药库”之称，有着丰富的生物资源。随着世界科研水平的发展，目前我校的仪器设备已不能满足科研工作的要求。在对秦巴山区优势中药材功能基因的研究中：（1）对功能基因的发育阶段表达、组织表达情况分析；（2）检测功能基因RNAi干扰效率：功能基因的作用研究中，要对功能基因沉默表达（RNAi）分析，检测RNAi的干扰效率要用到实时荧光定量。（3）对功能基因相关基因表达模式分析。

作为一所

院校，拥有一台性能良好的实时荧光定量PCR仪，是学校发展和从业教师的需求。可行新分析：

（1）研究功能基因，实时荧光定量PCR仪是必不可少的仪器设备；（2）实时荧光定量PCR仪操作简单，经过简单培训即可学会；（3）试剂耗材费

（4）应用广泛

科研领域都在用 主要技术指标：

热循环系统

新型半导体

96/384孔

可升级选配低密度芯片 光学系统

氩离子激光器 全波长光栅 冷CCD 扫描模式

全程扫描

软件系统

Primer Express 3.0探针引物设计软件 SDS 软件 绝对定量 相对定量 等位基因分析 阴阳性结果自动判断

反应系统

最低可在35分钟内完成PCR实验

5ul反应体积（选配低密度芯片可至1ul）

配套试剂盒

30万基因表达试剂盒 200万SNP试剂盒 可代客定做引物模板 专业转基因 致病菌筛选试剂盒 主要性能：

全波长光栅分光，添加新染料无需更换滤光片，同时检测8种以上荧光染料，最大限度实现多重定量，SNP分析等应用。

完备，多样，专用的软件，无需人工计算，完成定量实验

多组份荧光校正软件，一体化硬件设计，辅助ROX荧光，保证定量结果的准确性和高分辨率（装机指标，5000和10000达到2倍的拷贝数）

齐备的试剂盒 帮助客户完成高要求的实验

9、可为客户提供安装操作鉴定（IQ/OQ）验证文件服务，以符合GLP/GMP对生产设备的要求。

技术参数：

（1）色荧光，可用于多重PCR检测（2）激发光源寿命

（3）检测器：

成像系统，无时间差，保证结果的准确（4）温度控制系统：半导体控温（5）温度准确性≤±0.05℃（6）温度控制范围：

（7）动力学线性范围：

个数量级，区分

拷贝两倍差异浓度的样本，其致信度高达多少99.7%（8）支持ROX或其它染料用做参比荧光，同时，软件支持无参比染料设置（9）试剂开放，耗材开放，（10）仪器性能有原厂装机试剂盒验证（11）灵敏度：

（12）激发/发射滤光片：是否支持客户自行添加染料。（13）可检测450～750nm连续波长

（14）数据分析：可同时分析

色荧光PCR数据；有无绝对定量、相对定量功能；可否选择多个看家基因进行数据处理；可否自动根据扩增效率对数据进一步处理，得到更加准确可靠的结果；软件支持分析无限制数量的数据文件，增大反应通量；具有等位基因、熔解曲线分析功能；软件支持进行加样重复及生物学重复结果的统计。

（15）配置专业引物探针设计软件，用于基因引物探针设计，并且保证退火温度一致性。

第二篇：实时荧光定量PCR检测限的统计推断

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

来源：中国论文下载中心

作者：王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武

【摘要】 检测限是检测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQPCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽样反应管的检测结果≥4时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知，1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368，结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996，而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997；而100 000拷贝/L表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。

【关键词】 实时荧光定量PCR；检测限；统计推断

Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCR

Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results≥4,significance of difference(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.Key words：Realtime Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation;Statistical conclusion

检测限是检测方法的重要性能指标，只有在检测报告中明确表达了检测方法的检测限，该检测报告在各实验间及同一项目的各种检测方法间才可进行比较。能检测到的最低分析物浓度为检测系统的检测限。当前，检测限术语混乱，如：灵敏度(sensitivity)、分析灵敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］。每个词语的实际含义中包含有各自的实验方式、数据处理方式及由数据作出的推论等。我们采用统计学方法，以期得到一致的实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)检测限，现介绍如下。

文献中FQPCR检测限的描述

检测乙型肝炎病毒DNA的文献中检测限使用了“最低检出量”［2，3］、灵敏度［5～7］等术语，它等于已知的高拷贝HBV DNA血清10倍系列稀释后能检测到扩增曲线的最大稀释倍数管浓度。表述有：阴性HBV DNA≤106拷贝/升［4］；荧光定量PCR法检测灵敏度102拷贝/ml［5］、104拷贝/ml［6］、8.6×102拷贝/ml［7］；HCⅡ法检测灵敏度1.4×105拷贝/ml［7］；103 Eq/ml理论值时到达检测极限［3］；PCRFP检测HBV DNA的最低检测出量1×101拷贝［2］；bDNA在105 Eq/ml时到达检测极限［3］。以上检测限术语各不相同，且同一方法检测HBV DNA在上述各实验室发出同样的“HBV DNA低于检测下限”的报告时其实际HBV DNA拷贝数相差可达100倍。

FQPCR检测过程简介

以测定血清乙型肝炎病毒DNA为例：将40 μl血清样本加40 μl DNA提取液处理后，将其中2 μl（相当于1 μl血清）加入主反应液（含DNA引物、酶、DNA构件分子dNTP等）管中，在自动热循环上进行温度循环，自动热循环仪记录每一反应管在每一次温度循环的荧光强度，记30次温度循环后结束。在PCR循环过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数称为Ct值（Cyclethreshold),它与反应管中DNA起始拷贝数的对数值（lgN)呈非常显著的直线相关关系。自动热循环仪对标准样品自动生成一条Ct值对于起始拷贝数值（lgN)的工作曲线，并通过该工作曲线来确定待测未知样品反应管的起始拷贝数（N）。当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号时，仪器默认Ct值为30，不计算起始拷贝。确定FQPCR检测限的统计学原理

如果被检物的含量和检测方法的空白响应量的波动服从正态分布规律，则检测限可用多次检测空白的方法来确定。可信限为95%时检测限＝x空白+2.s空白；可信限为99.7%时检测限=x空白+3.s空白。这是目前多数检测限的确定方法。对核酸检测方法的检测限的理解可能与此有差别，但是原理应是一致的［1］，FQPCR检测限也应是推论总体与空白有统计学差异的最小抽样结果。

FQPCR检测限的统计推断

假设病原体在血液等体液中的分布是随机的，则单位体积中(如1.0 μl)病原颗粒数的分布服从Poisson分布。以Poisson分布的概率函数公式计算一次抽样检测出现的结果推论总体概率。从理论上来说，使用PCR测定技术测定病原体核酸序列的量可低至1个拷贝［2］。例如：血清标本中加入等量的DNA提取液，于离心管中煮沸，4 ℃放置，离心，吸取上清液2 μl作模板 进行扩增检测(2 μl上清液相当于抽样1 μl血清)［2］，其中至少有1个拷贝的HBV DNA才能有典型扩增反应，这时检测结果是1拷贝/μl。由Poisson分布的概率函数公式可计算出1次抽样检测结果出现0时，推断总体为1～9的概率见表1。

表1 总体为1～9时抽样为0的概率及总体（略）

在FQPCR检测HBV DNA中，当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号(即当Ct≥30)，反应管检测结果为0时，推论总体拷贝数为1～9的概率之和>0.581 92，总体为其他的概率之和<0.5(此时报告0拷贝的可信限度低于50%)。总体为1时一次抽样结果分别为1～9时的概率见表1。当一次抽样结果≥4时，推论总体为1的概率≤0.015 33，所以对于病原体的检测，一次抽样反应管检测结果≥4拷贝时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而上述检测血清中病原体时一次抽样反应管的检测限是4拷贝/μl。当总体为1、2、3时一次抽样结果为0的概率分别是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室间质量评价样本靶值选择1拷贝/μl、2拷贝/μl、3拷贝/μl时，无论实验室实际检测质量如何高，都将有36.79%、13.53%、4.98%的实验室检测结果为0而被判为不符合［按靶值的对数值GM±0.5 log(10)［9］作为可接受的定量范围］。2005年卫生部室间质量评价中靶值为1.51拷贝数/μl的样本符合率仅35.2%；Mancini C 等［9］报道一些实验室对检测下限附近的样本(3.00 log IU/ml)准确定量有困难；Raggi CC等［10］也报道28.6%的实验室(12/42)对最低浓度的样本不能定量。这些都是因为检测下限附近的样本一次抽样结果为0的概率太大所致，对此我们将另文详细讨论。造成上述文献中检测限差异较大的可能原因如下：用于10倍系列稀释的已知高拷贝HBV DNA血清本身拷贝数的差异；对检测限的理解差异，由一次抽样没能检测到典型扩增的稀释血清管推论总体浓度为0的可信度太低(<50%)；抽样单位的任意放大：在上述HBV DNA检测中，抽样单位是1 μl血清［如血清前处理过程中有抽提(浓缩)过程，取2 μl上清液相当于实际含12.5 μl血清，则抽样单位也只是12.5 μl］，而报告结果的单位是ml甚至L。当总体为1拷贝/μl时表示一次抽样结果为0的概率达0.368，结果在0拷贝/μl～4拷贝/μl的概率为0.996；而总体为1 000拷贝/ml时表示一次抽样结果为0的概率为0，结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997(Poisson分布总体>50时近似正态分布，范围是X±uα*√X，可信限为99.7%时uα=3);总体为100 000拷贝/L时表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR检测为例，其他病源体核酸的FQPCR检测也与其相同，检测限是抽样反应管的检测限4拷贝/反应管；如反应管中加入模板量相当于12.5 μl血清则检测限相当于0.32拷贝/ μl。此推断仅是针对FQPCR技术本身的检测限度，未就临床上有意义的最小病源体核酸的拷贝数进行讨论。【参考文献】

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第三篇：荧光定量PCR的应用

荧光定量PCR 的原理及应用

荧光定量PCR 是一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR 技术的有机结合，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,是对原有PCR 技术的革新,扩大了PCR 的应用范围。

实时荧光定量PCR（FQ-PCR）作为荧光定量PCR技术的一种，是基于荧光能量传递技术,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色基团转移到受体发色基团,受体荧光染料发射出的荧光信号强度与DNA产量成正比,检测PCR 过程的荧光信号便可得知靶序列的初始浓度。它融汇PCR 技术的核酸高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,直接探测PCR 过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。目前已在众多领域有广泛的应用。

1、FQ-PCR 在预防兽医学中的应用

PCR 技术的应用有许多局限,不能准确定量,假阳性率太高,只要有微量病原体存在就可以得到阳性结果,这不能完全作为诊断依据,只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。FQ-PCR实现了PCR 从定性到定量的飞跃,有效解决PCR 污染和对模板定量不准确等问题。

1.1在动物病原菌检测和鉴定中的应用

炭疽杆菌作为人兽共患病的病原,尤其炭疽杆菌的芽胞可作为生物武器的病原。科学家在100 L 纯化空气中加入炭疽杆菌芽孢,进行FQ-PCR检测,1 h 内炭疽杆菌的单个芽孢就被检测到。

1.2在动物病毒检测和鉴定上的应用

FQ-PCR已应用于许多病原体的检测,如对艾滋病病毒、乙型肝炎病毒DNA、尖锐湿疣皮损中HPVD-NA、与鼻咽癌关系密切的EB 病毒、结核分支杆菌、巨细胞病毒、A 型和B 型流感病毒等病原体的检测。

3.3在动物寄生虫检测和鉴定中的应用

常用TaqMan 探针。如在被感染猪和鼠组织、全血、羊水以及脑脊髓液中的弓形虫定量,其检测极限相当于套式PCR , 但准确率大大提高。

2、FQ-PCR在畜牧业中的应用

科学家采用TaqMan 探针检测鸡γ干扰素、采用RT-FQ-PCR 证明中国黄牛背最长肌中cap nl mRNA 表达量与宰后3 d 的牛肉嫩度高度相关等。

3、FQ-PCR在其他方面的应用

3.1在动物检疫领域的应用

FQ-PCR 可对动物源性饲料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量检测。

3.2细胞因子表达定量检测

常用FQ-PCR 测定细胞因子mRNA 表达情况,分析机体免疫状态。利用FQ-PCR 测定鸡、猪在注射疫苗、免疫增强剂以及在感染某种疾病情况下体内细胞因子的mRNA 表达水平。

3.3环境监测

应用FQ-PCR 对水资源及居家、办公环境中的大肠埃希菌、藻青菌和一些寄生虫进行监测。

3.4转基因生物中的应用

用一个已知拷贝数的内源基因作为参照,同时对样品作内源基因和外源基因的FQ-PCR。两者达到荧光阈值时的Ct 值可得到外源基因的拷贝数;FQ-PCR 还可用于转基因动物的纯合性鉴定及对转基因后外源基因表达情况进行监测。

第四篇：实时荧光定量PCR系统的工作原理及用途

实时荧光定量PCR系统的工作原理及用途

工作原理：

荧光定量PCR仪，是采用一种新的核酸定量技术，即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的仪器。其主要部件包括产生温度梯度的热力学结构、进行荧光激发的激发光源、对发射光进行检测的检测系统以及数据获取分析软件工作站

用途：

随着荧光定量PCR技术的发展成熟和完善，使得荧光定量PCR仪得以在临床检测上，如对病毒、病菌及其它致病微生物，致病基因的检测。荧光定量PCR仪不仅限于临床检测，在基础研究中，对某一样品中目标基因含量的测定需求是相当广泛的，荧光定量PCR仪具有操作方便、反应快速的特点，可以对一些微量样品进行检测。在食品卫生检疫方面，进口的粮食、食品是否安全，是否含有危险或潜在危险的成分，也都可以用荧光定量PCR仪进行检测。此外一些生物类的恐怖袭击等，都可以用荧光定量PCR仪进行快速检测。

第五篇：实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文

1993 年，Higuchi 等人将PCR 技术和封闭式检测相结合，对目的核酸数量进行定量分析，提出了荧光定量PCR 技术的概念。1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，达到定量核酸的目的，自此Real-Time PCR 技术才得以真正的推广和应用。到目前为止，实时荧光定量已被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等科学领域。原理

Real-Time PCR 是在PCR 反应体系中加入荧光物质，利用荧光信号对整个PCR 进程进行实时监测，从而达到对未知起始模板进行定量分析的目的。它是一种将酶动力学、核酸扩增、光谱分析和实时检测技术相结合的技术。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号，这样就可以通过荧光信号强度变化实时监测PCR 产物量的变化，从而得到一条描述PCR 动态进程的曲线，即扩增曲线。

实 时荧光定量PCR 扩增曲线可以分为4 个阶段: 基线期、早期指数期、对数-线性期和平台期，见图1。在基线期(通常1 ～ 15 个循环)，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化;早期指数期，荧光信号超过背景信号并到达阈值(通常为基线信号标准偏差的10 倍)，此时循环数称为Ct(Cycle threshold)值或Cp(Crossingpoint)值，Ct值与模板起始浓度的对数值成反比线性关系，因而Ct值可被用来定量模板起始浓度;对数-线性期，在理想反应条件下每经历一个循环，PCR 产物加倍;平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始模板拷贝数。实时荧光定量PCR 能准确地确定初始模板拷贝数，结果重现性好，误差小，与常规PCR 在终点定量上相比更具重要意义。实时荧光定量PCR 结果不仅可以定性(判断一段序列的存在与否)，还可定量(确定基因的拷贝数)，而常规PCR 只能做到半定量。另外，实时荧光定量PCR 的反应和检测都是在封闭的反应管中进行的，样品污染几率大大降低，无需扩增后的实验操作，大大节省了实验时间，提高了实验效率。Real-Time PCR 定量类型

实时荧光定量分析包括绝对定量和相对定量。绝对定量是对未知样品绝对拷贝数进行测定的方法;相对定量不是测定样品的绝对拷贝数，而是比较样品之间同一目的基因的相对表达量，以期分析样品之间目的基因的表达差异。

2.1 绝对定量

绝对定量是使用一系列已知浓度(通常为5 ～ 6个梯度稀释的浓度)的标准品绘制标准曲线，建立Ct值与起始模板量[总核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)] 的对数值之间的线性关系，达到对未知样品绝对的定量。标准曲线的绘制首先是标准品的选择，标准品可以是DNA(重组质粒DNA、基因组DNA、纯化的RT-PCR 产物及合成的寡核苷酸DNA)或RNA(体外转录RNA[5，8-10])。但是为了保持与待测样品间扩增效率的一致性，标准品应尽量选择与待测样品结构近似的样品，该方法要求梯度稀释的标准品都必须与待测样品同时平行扩增，且待测样品浓度应包含在已知标准品浓度范围之内。

2.2 相对定量

相对定量解析方法相对复杂，一般用于基因表达分析。根据选用的标准不同可分为以质量单位为标准的相对定量和以内参基因为标准的相对定量。以质量单位(细胞的数目或核酸的微克数)作为标准的相对定量优点是实验设计概念简单，数据分析处理简单易学，缺点是很难准确量化初始材料;而以内参基因作为标准的相对定量优点是能准确量化初始材料的载量，尤其当初始材料受限时，进行相对表达分析十分方便。缺点是要求得到一个或多个在所有待测样本中恒定表达的内参基因。目前，使用较多的是以内参基因作为标准的定量方法。

2.2.1 内参基因的稳定性评价为了确保定量结果的可靠性和准确性，在qRT-PCR 中需选择合适的内参基因对不同样品之间因质量、RNA 的提取效率以及反转录效率不同所产生的差异进行校正，从而实现对不同样品中RNA 的定量和数据归一化。理想的内参基因应满足以下条件: 1)在不同发育阶段和不同组织器官中表达稳定;2)表达不受生物学、实验条件的影响;3)其稳定的表达水平与目的基因表达水平相近。在植物qRT-PCR 研究中用的最多的内参基因通常是看家基因(housekeepinggenes)，然而越来越多的研究表明，看家基因在不同类型细胞和不同生理状态下的表达并不是恒定不变的，若盲目选择看家基因作为内参，可能会导致基因表达分析结果不准确，甚至得到相反的或者错误的结论。因此选择合适的、稳定的内参用于基因表达的差异分析非常关键。目前，geNorm、NormFinder、BestKeeper、DeltaCT等分析方法被广泛用于内参基因的筛选与评价。Xie 等将上述4 种方法整合成一个在线的分析工具—RefFinder，用于各种实验条件下内参的筛选，避免了单个分析方法的片面性。

2.2.2 引物的特异性及扩增效率的检测为了使结果准确可靠，qRT-PCR 中还要求引物的特异性好，扩增效率接近100%。刘正霞等研究显示，引物的特异性和扩增效率对定量PCR 结果分析有显著影响。

引物的特异性评估: 引物的特异性可以通过凝胶电泳、PCR 产物克隆测序以及qRT-PCR 的熔解曲线来检查。凝胶电泳的条带若为单一条带，则说明PCR 产物特异性好，若有多条则说明特异性差，需要优化PCR 反应条件和体系或重新设计引物;PCR产物克隆测序结果在去除载体序列后与原序列进行比对，分析测得的序列是否位于上下游引物之间;在qRT-PCR 中，可以通过熔解曲线来判断引物的特异性，若熔解曲线为单峰则说明引物的特异性好。通过上述3 种方法均可以对设计的引物进行特异性检测，以便筛选特异性较好的引物进行后续实验。扩增效率的计算: 相对定量结果的准确性还受到目的基因和内参基因的PCR 扩增效率影响。一般来说，扩增效率接近100%是优化实验使得结果重复性好且可靠的最好标志。实际操作时，反应的扩增效率应该在90% ～ 105%之间，如果扩增效率低，可能原因是引物设计不佳，或是反应的条件没有优化;扩增效率大于100%时，可能的原因有非特异性产物扩增，如引物二聚体、错配等引起的PCR 产物产生。传统计算扩增效率的方法是将已知模板稀释成一系列梯度浓度(不少于5 个点)，并进行实时荧光定量PCR 实验，利用拷贝数的对数值和Ct值建立标准曲线。评价标准曲线的优劣有两个指标，相关系数(r)和斜率。相关系数反映标准曲线的直线性，越接近1 说明直线性越好，定量越精确;斜率与扩增效率相关，计算公式: 扩增效率(E)= 10(-1 /斜率)-1。在PCR 过程中，扩增效率在指数期相对稳定，但是随着循环数的增加，Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物，甚至DNA 模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，扩增效率也就越来越趋向于0。通过标准曲线得出的扩增效率不能反映PCR 进程中扩增效率的变化。由于PCR 结果往往是通过Ct值来计算的，由扩增效率引起的最终差异只能反映在Ct值上的变化。

为了减小这种情况引起的误差，在定量时确保各样品浓度值在一系列梯度浓度的范围内，即Ct值在标准曲线范围内。此外，尚有根据PCR 进程中的原始数据或扩增曲线的形状，再基于不同的数学算法开发出来的一些软件来计算扩增效率的。这些算法或软件使得扩增效率的计算更加简单易行，特别是对于那些表达量很低的基因很难通过一系列的梯度稀释来求扩增效率。该方法缺点是不同软件基于的算法不同，因此各软件得到的结果也有差异;噪音导致可用的数据点很有限，计算的扩增效率也就不精确。

2.2.3 数据处理方法对于不同的实验需求，我们可以采用不同的方法进行实验设计和数据分析，在这里只讨论以内参基因为标准的相对定量方法。常用的方法有双标准曲线法、2-△△Ct法、用参照基因的△Ct法和Pfaffi 法，应用每种方法必须对应适应的条件。双标准曲线法: 首先分别对目的基因和看家基因的5 个(尽量不少于5 个点)浓度梯度稀释的标准品制作两条标准曲线。各待测样品与标准品同时进行反应，得到目的基因的Ct值，分别代入目的基因的标准曲线，得到看家基因的Ct值，分别代入看家基因的标准曲线，这样就可以换算出各待测样品目的基因和看家基因的起始模板量。其次，利用内参对各待测样品进行归一化，即用目的基因的定量结果除以看家基因的定量结果。最后对不同样品之间目的基因的表达量进行比较，通常将对照样品的表达量作为1，计算出相对量，再进行样品间相对量比较。2-△△Ct(Livak)法: 2-△△Ct 法是定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，但条件是目的基因和内参基因扩增效率都接近100%，且相互间效率偏差在5% 以内，否则会产生较大的误差。

使用2-△△Ct 法之前，必须验证目的基因和内参基因的扩增效率。其操作步骤如下: 首先，对所有的待测样品和对照样品，用内参基因的Ct值归一化目的基因的Ct值: △Ct = Ct(目的基因)-Ct(内参基因);其次，用对照样品的△Ct值归一化待测样品的△Ct值: △△Ct =△Ct(待测样品)-△Ct(对照样品);最后，计算表达水平比率: 表达量的比值= 2-△△Ct。如果目的基因和内参基因有同样的扩增效率，但是扩增效率不等于2，那么2-△△Ct 法的公式可以修正为用实际扩增效率值代替等式中的2。如果目的基因和内参基因扩增效率不相近，可以优化或重新设计实验。用参照基因的△Ct法: 用参照基因的△Ct法是2-△△Ct法的一种变化形式，它更容易掌握且结果相同。与2-△△Ct得到的△Ct值相比，△Ct法是每个样本之间参照基因与目的基因的Ct值的差值。虽然这种方法的操作步骤简单，但同样也能真实衡量基因表达水平，将参照基因的表达水平计算在内。结果显示，主要的差异是校准样本的表达水平不是1。如果用这个方法得到的表达值除以所选的校准样本的表达值，计算结果与2-△△Ct 法的结果正好相同，即表达量的比值= 2(△Ct(内参基因)-△Ct(目的基因))Pfaffi 法: 当目的基因和内参基因的扩增效率相近时，用2-△△Ct法定量相对基因表达是最合适的方法，但是如果两个扩增子扩增效率不同，必须选择另一种方法来确定不同样本之间目的基因的相对表达量。Pfaffi 法则是目前最好的选择方法，计算公式为:表达量的比值= C(A-E)/D(F-B)(C 和D 分别是目的基因和内参基因的扩增效率;A 和E 分别是对照样品和待测样品中目的基因的Ct值;F 和B 分别是待测样品和对照样品中内参基因的Ct值)。

2.2.4 归一化归一化是对所有样品之间的差异进行校正。不同的样品，即使反应时使用相同量的总RNA，但因细胞来源不同，RNA 总表达量并非一致。因此仅仅将反应时RNA 量统一，起始的细胞数也不一定相同。其实在进行表达量分析时，比较的是相同数量细胞中的某个基因拷贝数目。实际上要将样品材料统一到相同细胞数提取是非常困难的，同时还不能保证RNA 提取效率、反转录效率以及PCR 扩增效率完全相同。基于上述原因，在进行表达量分析时，有必要选择内参基因对所有样品进行归一化处理，以获得目的基因特异性表达的真正差异。

筛选出稳定的内参基因后，先对目的基因归一化处理，然后进行表达差异分析。目前进行归一化分析的方法有两种: 单基因归一化和多基因归一化。实时荧光定量最早被用于基因表达差异分析时，大多文献报道都是以单个基因作为内参基因，对目的基因的表达量进行归一化。然而，基于单一内参基因进行归一化存在许多缺点，可能导致比较大的误差。因此，多个看家基因开始被应用于归一化分析中。在中药领域中的应用

3.1 基因表达分析

荧光定量PCR 最普遍的应用是基因表达分析。从基础科学研究到实际应用，检测基因表达都是基本的也是很重要的一项工作。Olofsson 等对黄花蒿不同组织中萜类代谢途径上的基因进行表达差异分析，为评估青蒿素的前体对青蒿素产量的影响提供科学参考。植物在生物和非生物胁迫下，基因表达水平的相对变化与次生代谢产物累积相关性的研究越来越受到科研工作者的青睐。如Cheng 等用YE、Ag + 和MeJA 3 种诱导子组合诱导丹参毛状根。结果发现，在处理24、36 h 后，SmCPS 的表达量显著上调，次生代谢产物隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ的含量也随之显著上升，这表明丹参酮类化合物含量的升高可能与SmCPS 基因表达量的上调有关。在植物的不同发育阶段，其次生代谢产物的累积量及基因的表达水平也会不同。如Kim 等对人参在叶片不同开放期(闭合阶段、中间阶段、全开放阶段)其体内人参皂苷及生物合成途径上的关键酶基因进行检测。结果显示，在中间阶段和全开放阶段人参皂苷生物合成途径上的酶基因PgSS 和PgSE 的表达量比闭合阶段增加约1.5 倍，PgDDS 的表达量则增加4 倍以上;主根和侧根中，人参皂苷的含量在叶片开放的中间阶段达到最大值，而叶片中人参皂苷的含量在全开放阶段达到最高。此外，实时荧光定量的差异表达分析在中药领域得到广泛应用，如在甘草、黄花蒿等药用植物中都有大量的研究。

3.2 中药品种及真伪鉴别

中药的真伪直接影响临床用药的准确性和中药的质量，因此对于中药品种真伪的鉴别历来是中药研究中极为重要的工作。Xue 等依据骨碎补的正品及其混淆品trnLtrnF间隔序列，设计Scorpion 探针，通过实时荧光定量对骨碎补的真伪进行鉴别，同时对多个混合样品(正品中加入一种混淆品，按一定比例梯度混合)建立标准曲线，以分析正品中混淆品的掺入量。另外，Xue 等基于升麻及其替代品之间内转录间隔区(ITS)序列的长度、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)含量的差异，采用LightCycler 定量仪扩增升麻及其替代品的ITS 序列，并分析各产物的熔解曲线。通过解链温度的差异区分鉴别升麻及其替代品，为快速、稳定鉴别升麻及其替代品建立了标准。董玉茹等将限制性内切酶引入熔解曲线分析中，建立了一种新的单核苷酸多态性(SNP)分型方法，成功实现了对金银花与山银花、白术与苍术品种及真伪的鉴别。此外，有研究者基于实时荧光定量PCR 技术，分别对铁皮石斛近缘种冒充铁皮石斛以及三七粉掺假等现象建立快速的检测方法。小结

植物在生长、发育及受外界环境刺激等过程中，其基因在不同时空的表达存在着很大差异。对基因的表达量进行差异分析，是了解生物体生长、发育和调控等机理的一个重要内容。Northern 杂交、Southern 杂交和原位杂交等都可以用来进行目的基因的定量分析，但这些方法耗时且敏感性较差。普通PCR 终点定量的缺陷是扩增出来的DNA 产物需要通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭(EB)染色后才可以显示出来，这些步骤耗时且不易精确定量。此外，由于酶动力学的特点，在PCR 反应进程中有基线期、早期指数期、对数-线性期和平台期，理论上来说，所有样本的DNA 扩增量最后是相同的，但实际上，不同样本的平台期是不一样的。在这种情况下，通过终点定量分析，反而将反应效率中很小的差别放大出来，造成定量的不准确。实时荧光定量为起始定量，误差相对较小，这使其在定量方面得到快速的发展。PCR 产物长度或组成不同，其熔解曲线(熔链温度)也存在差异，因此可根据熔解曲线的差异进行物种的鉴别。中药鉴定要解决其中一个很重要的问题就是真伪。实验过程中，我们可通过设计特异性引物来扩增不同的样品，从而得到不同的PCR 产物，再根据相应的熔解曲线鉴定中药材的真伪和掺伪的中药材。此外，实时荧光定量PCR 还可广泛用于等位基因分析及转基因生物检测等。

实时荧光定量PCR 自建立以来，发展迅速、应用广泛，拥有许多优点。近年来，许多科研工作者基于实时荧光定量PCR 的基本原理对其进行不断地研究和改进，使实时荧光定量PCR 得到了进一步的完善。随着实时荧光定量PCR 的不断标准化，该技术将在生物学、医学基础研究等科研领域中得到更加广泛的推广与应用。