第一篇：临床荧光PCR结果分析及常见问题
临床荧光PCR结果分析及常见问题
中国人民解放军三零二医院 王海滨
一、荧光 PCR 技术在临床诊、疗中的应用
PCR 技术是于 1983 年由 Mullis 发明，后来传到我国，但是由于实验污染的问题，1998 年卫生部取缔 PCR 实验方法在临床诊断中的应用。荧光 PCR 出现后，污染减少很多，但近几年由于磁珠的应用，污染又再起。2003 年，PCR 在 SARS 的早期诊断中非常有效，当时使用的是电泳法。H1N1 甲型流感（2009）：荧光 PCR 技术作为确诊指标（755 份 / 天）。疾病易感基因的研究（SNP）： CR1/ 丙型肝炎 IL-28B。疾病（肿瘤）易感基因的鉴定。
二、影响临床荧光 PCR 检测结果的因素
（一）影响临床荧光 PCR 检测结果的常见因素
1.检验因素：
实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平。2.非检验因素：
标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的干扰物质、样本丢失！
（二）加强检测前标本的质量管理——避免问题重复发生
规范标本前处理流程、制度化的重要性，建立不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可行路径（编号和项目错误等），查找标本丢失可能的环节。加强本室新进工作人员流程培训，经常性进行临床医护的交流与培训。
（三）实验室分区
分为：试剂配制、核酸提取、PCR 扩增以及开放产物分析等区域。分区目的：通过物理分割达到标本、试剂或使用器具等被沾染或掺入污染，标本间的交叉污染等。
分区要求：至少要有清洁的试剂配制和核酸制备区
三、试剂配制
（一）试剂配制室的设置与维护
以空间内无核酸气溶胶为准！．正压、清洁进风(壁挂式空调)。
试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品！定期清洁除霜！2 ．有效氯消毒液清洁实验室台面、地面。3 ．移液器：使用前的清洁。．离心机等：每周定期木浆纸巾擦拭，方法。“一次性物品的使用没有质控就没有质量保证
对一个完整的实验，一定要注意有空白对照，阴性对照与临界对照，临界对照是对精密度的考核。另外，有平行定量标准品。如果试验测的是血清，质控标准品也应该是血清，而不是人造核酸。
质控品在结果报告中的应用非常重要： 1.空白对照
一般放在第一孔的位置，监控扩增试剂及环境污染。2.阴性对照
第二孔位置，监控核酸提取，试剂是否污染，可自行制备。3.临界对照
实验室自行制作，是实验精确度需求。4.等效定量标准品
中间位置或最后，实验准确性前提，参与核酸提取，标准范围宽。
（六）质控品的制作
HBVDNA ：介质的选择、临界质控的制作： 400IU/ML-50IU/ML ； HCVRNA ：介质的选择、临界质控的制作： 3000IU/ML-100IU/ML ； EBVDNA/CMVDNA/H1N1/HPV 等定性试剂盒的质控，阳性标本，稳定性实验；质控品的朔源： WHO 标准或 COBAS 等；自建质控品：建立数据记录（稳定性等）；室间质控与室内质控的有机结合！
（七）HBVDNA 结果分析（质控在控与失控）HBVDNA 结果分析，就是荧光曲线的分析，要尽可能保证报告的数值，低限值和高于低限值的线要平行，尽可能不要失控。
临界质控品： 400IU/ml ；基线的选择：平均荧光值的 3-7% ；斜率：保持在 3.0-3.6(均值 3.3)；相关系数： r=0.999。
1.COBAS 定量内标(QS)的失控
PPT21 显示的是 COBAS 定量内标失控的情况。2.不同定量区域 QS 值分布
PPT22 显示的是不同定量区域 QS 的分布，例数是 900 多例。如果内标出现了失控，定量值就无法参考了。
3.假阴性曲线的识别
在荧光 PCR 曲线里面，如果有荧光曲线是阴性、不规则的，要考虑是不是有干扰物质，在试剂配制或者标本里边有干扰物质。此时需要复检。
五、实验室人员（与职称和学历无关）
（一）实验室人员分类
1.实习型：
按照操作说明进行操作，但环节控制、环节间衔接和防污染意识差！2.工作型：
能够再现说明书操作要求，具有质量环节控制意识，具有一定的防污染常识，但发现问题和解决问题能力稍差。
3.示教型：
明晰试验操作的关键环节，并能够对下级工作人员进行演示和示教，具有完整的防污染意识、质量实现和一定的发现问题解决问题能力。
4.专家型：
能对商品试剂盒存在的问题进行改进，具有提前预知的质量意识。
（二）移液器的使用
移液器的使用，是小问题，大学问。1.移液器加吸头的要点，需慢慢压，不能用力压。2.不同量程移液器的应用要点（液体性质）。3.移液器连续分液挂滴对实验的影响。4.如何避免移液器连续分液导致的污染。5.移液器吹打混匀带来的污染！6.移液器的清洗，需要高压吗？ 7.移液器的校准，很多单位无法实现。
（三）质量环节意识的培养（轮流当主任）
1.环节控制能力
质量环节的认知：明晰实验操作环节的组成和目的！关键环节的实现：细节的严谨性与准确性！环节的连贯性与细节实现：实现完整实验！2.防污染素质
实验室环境防污染意识：具备科学防污染清洁意识和实现能力，如标本外溢的处理、实验室环境（空气、桌面、地面、移液器等）清洁，实验废物的管理和处理，离心机的清洁和维护等。标本间交叉污染的预防意识和实现能力：避免移液过程中的隐形迸溅污染（移液器）；试剂加样过程中的沾染污染；标准品的携带污染等。扩增产物的外露污染：产物回流预防能力；产物处理流程。
（四）人员的培养与专业技能比对
不同职务、职称和学历人员同时进行；环节操作与结果同时计分；比对结果记录在案并作为评聘指标。
六、试剂盒的质量与评价
（一）评价标准：抗干扰-理论值与实际值的吻合。
1.特异性：不同血清型对特异性的影响，抗污染性能和污染试剂 2.敏感性：血清量、加样量对敏感性的影响（1+1=2 ？）, 试剂系统的组成与敏感性 : 引物、探针序列的选择与用量，跨栏式试剂： 10 9-10 2 IU/ml 应处在线性范围内、且均存在荧光信号的上平台。
3.重复性：取决于核酸提取方法与扩增效率。
（二）关于临界检测结果的漂移
例如，本场检测的时候，一个病人，一次检测是 53IU，一次是 <20IU，这都是漂移，这个技术方法性能本身，是正常的和合理的。但这种漂移的原因，是试剂盒核酸提取的稳定性问题。
七、关于内标
（一）实时荧光定量 PCR 无需内标
实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。
1.Ct 值的重现性：
PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct 值是恒定的。
2.Ct 值与起始模板的线性关系：
由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准与标本同步进行核酸提取的曲线定量方法。
（二）内标对实时荧光定量 PCR 的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则 PCR 反应变为双重 PCR，双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。正因如此，定量方法虽然加入内标，仍为一种半定量方法。
美国 Texas 大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。
AppliedBiosystems 公司的 7700 型实时荧光定量 PCR 仪是全球公认的荧光定量 PCR 的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。
（三）内标对 PCR 扩增的影响
PPT34 显示的是内标对 PCR 扩增的影响。
左图，可以看到加入内标后线性范围变窄，无内标线性范围较宽。右图，无内标时是直线，有内标后，变成曲线。
个人建议：试剂盒在报批时，或使用单位对试剂盒质量进行评估时，使用内标对试剂盒性能进行评价！检定：正如 ELISA 试剂盒的批批检！
八、如何就分子诊断结果与临床和患者沟通？
医生和患者，都会对检验结果提出一些质疑。质量、速度应该还是个硬道理，应该权威的结果加虚心的请教。
第二篇：荧光PCR检测原理
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。其特点有：
(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。
(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。实时荧光定量PCR技术的基本原理
在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR技术的应用 1.基因工程研究领域
① 基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。
② 转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。③ 单核苷酸多态性（SNP）及突变分析：实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基于两条探针和基因组的不稳定性。基因突变基于两条探针，一条探针横跨突变点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体得稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。这样便可对突变和多态性进行分析。2.医学研究领域
① 病原体检测：由于实时荧光定量PCR方法可靠性和重复性好，并且操作简便、快速、结果判断客观，目前，人们用此方法对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。
② 药物疗效考核：利用实时荧光定量PCR技术检测临床样品中与抗药性相关的基因的表达。结果证明，实时荧光定量PCR系统是定量检测抗药基因表达的可靠方法，应用这种技术可以预测化疗将引起的反应。
③ 肿瘤基因检测：肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。
目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因、肿瘤MDRI基因、白血病WTI基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现。荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。3.其他领域
用实时荧光定量PCR方法对免疫组分进行分析是其应用的重要方面。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。检测方法
1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR定量PCR扩增荧光曲线图
PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）2.TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。服务流程
1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息； 2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；
3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；
5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率； 6.正式定量实验：对所有样品上机检测； 7.实验结果和数据分析，形成报告。收费标准
优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）
（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数
（如图1所示）。
1.荧光阈值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15 2.Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1.TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2.SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。3.分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。1．传统定量PCR方法简介
1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。2．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．内标对定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。
第三篇：荧光定量PCR的应用
荧光定量PCR 的原理及应用
荧光定量PCR 是一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR 技术的有机结合，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,是对原有PCR 技术的革新,扩大了PCR 的应用范围。
实时荧光定量PCR（FQ-PCR）作为荧光定量PCR技术的一种，是基于荧光能量传递技术,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色基团转移到受体发色基团,受体荧光染料发射出的荧光信号强度与DNA产量成正比,检测PCR 过程的荧光信号便可得知靶序列的初始浓度。它融汇PCR 技术的核酸高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,直接探测PCR 过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。目前已在众多领域有广泛的应用。
1、FQ-PCR 在预防兽医学中的应用
PCR 技术的应用有许多局限,不能准确定量,假阳性率太高,只要有微量病原体存在就可以得到阳性结果,这不能完全作为诊断依据,只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。FQ-PCR实现了PCR 从定性到定量的飞跃,有效解决PCR 污染和对模板定量不准确等问题。
1.1在动物病原菌检测和鉴定中的应用
炭疽杆菌作为人兽共患病的病原,尤其炭疽杆菌的芽胞可作为生物武器的病原。科学家在100 L 纯化空气中加入炭疽杆菌芽孢,进行FQ-PCR检测,1 h 内炭疽杆菌的单个芽孢就被检测到。
1.2在动物病毒检测和鉴定上的应用
FQ-PCR已应用于许多病原体的检测,如对艾滋病病毒、乙型肝炎病毒DNA、尖锐湿疣皮损中HPVD-NA、与鼻咽癌关系密切的EB 病毒、结核分支杆菌、巨细胞病毒、A 型和B 型流感病毒等病原体的检测。
3.3在动物寄生虫检测和鉴定中的应用
常用TaqMan 探针。如在被感染猪和鼠组织、全血、羊水以及脑脊髓液中的弓形虫定量,其检测极限相当于套式PCR , 但准确率大大提高。
2、FQ-PCR在畜牧业中的应用
科学家采用TaqMan 探针检测鸡γ干扰素、采用RT-FQ-PCR 证明中国黄牛背最长肌中cap nl mRNA 表达量与宰后3 d 的牛肉嫩度高度相关等。
3、FQ-PCR在其他方面的应用
3.1在动物检疫领域的应用
FQ-PCR 可对动物源性饲料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量检测。
3.2细胞因子表达定量检测
常用FQ-PCR 测定细胞因子mRNA 表达情况,分析机体免疫状态。利用FQ-PCR 测定鸡、猪在注射疫苗、免疫增强剂以及在感染某种疾病情况下体内细胞因子的mRNA 表达水平。
3.3环境监测
应用FQ-PCR 对水资源及居家、办公环境中的大肠埃希菌、藻青菌和一些寄生虫进行监测。
3.4转基因生物中的应用
用一个已知拷贝数的内源基因作为参照,同时对样品作内源基因和外源基因的FQ-PCR。两者达到荧光阈值时的Ct 值可得到外源基因的拷贝数;FQ-PCR 还可用于转基因动物的纯合性鉴定及对转基因后外源基因表达情况进行监测。
第四篇：PCR实验常见问题
【实验】PCR常见问题总结
作者: gene121(站内联系TA)发布: 2005-07-04 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。1假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。2出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。3出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。二.PCR污染与对策
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因
(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性。
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。对照试验
1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 防止污染的方法
(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。
(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。
(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。
第五篇：临床定量PCR实验室设计建设及管理
临床定量PCR实验室设计建设及管理SICOLAB
一、近年来，PCR技术在临床医学中得以快速应用，特别是在肝炎、结核、艾滋病、性病、SARS等病原微生物诊断以及部分遗传性疾病诊断和癌症的辅助诊断等方面的应用。
二、临床定量PCR实验室管理
临床定量PCR实验室由卫生部管理，依据国家卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）《临床基因扩增检验实验室工作规范》、（卫检字[2002]8号）、《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》（2002-1-14）、《临床基因扩增实验室申请表》及《临床基因扩增实验室验收表》执行。实验室申办程序包括：
（1）填写调查表，由省临检中心审核；
（2）正式填写申请表，上报卫生部临检中心；
（3）评审由卫生部、省专家参加，并报省卫生厅备案；（4）合格单位名单由卫生行政部门在媒体公示。临床定量PCR实验室应具备以下条件：标准的实验室设计设置、专业的技术人员、标准操作程序（SOP）和质量管理文件等。
1、实验室设置及人员管理在实验室设计上，建立单流向、一体化的临床定量PCR实验室是安全准确进行基因扩增检验和保障生物安全的重要措施。其具有理想的布局结构、标准的风向设置、严谨的防护措施、简明洁净的外观、合适的环境条件与参数等。它具体包括建设好“3个实验区”（试剂准备区、标本制备区和PCR扩增区及其各自缓冲区）和“3个系统”（单向气流控制系统、单向物品传送系统、生物安全控制系统）。对于人员管理，首先应制定一系列规章制度。检验人员要严格遵守操作规程，制定日常工作中的质量控制流程，严格执行查对制度和考核制度，具有实事求是的工作作风。检验人员必须满足以下条件：
（1）经有资质的单位培训，考试合格取得上岗证后持证上岗。（2）专业主管为本科以上学历和中级以上职称3a以上工作经历。（3）工作人员须有专业技术职称。
（4）培训单位须由省卫生厅指定，经卫生部临检中心认可。
2、实验室操作规程的规范化建立符合当今实验室的管理模式，形成管理文件，包括质量手册、质量体系程序文件和标准操作程序（SOP）等。质量手册主要包括目录、批准页、前言、质量方针、组织结构、人员管理、实验室设施环境、仪器设备、生物防护措施、标准操作程序、标本管理、记录、报告、应急处理及实验室的工作制度等。SOP文件是最具体、最具可操作性，也是使用频率最高的文件，其精髓就是使所有与实验室检验质量有关的环节都有章可循，要让每一个操作人员都了解并严格遵照执行管理制度和标准操作程序。此外，所有实验的原始资料均应存档；所有的记录均应规范登记在册；原始登记表应记录试剂来源、批号，质控血清的来源及测定值，并注明是否在控；检验者及审核者应签名。如果实验结果对临床诊断有决定意义，其样本应留存，至少要与病历的保存期一致。规范化的管理和操作保证了实验结果的准确性和可靠性，而且便于各项数据资料的核实。
三、临床定量PCR实验室的质量控制
PCR技术自Mullis创立以来广泛应用于多种疾病检测，但PCR测定不同于一般临床检测，由于其灵敏性很高，即使有极少量DNA污染也会造成假阳性，因此对实验条件要求非常严格。检验者在操作过程中必需牢固树立“无基因观念”，严格操作规程，防止一切可能的污染，包括以前的扩增产物、天然基因组DNA、试剂配置、气溶胶、实验所用的器具等。一旦发生污染，实验即不能进行，而且查找污染源非常困难，因此避免发生污染重在预防，并贯穿于PCR检测的全过程。因此质量控制在PCR检测过程中尤为重要。
室内质量控制室内质量控制是指一个实验室内（荩荩下转第87页荩荩）部对所有影响质量的各个环节进行系统控制。目的是控制本试验室常规工作的精密度，提高常规工作前后的一致性。临床PCR实验室应开展所有检验项目的室内质量控制，并做好记录和分析[5]。PCR检测包括标本采集、核酸提取、基因扩增、产物检测等步骤，每个步骤都应有相应的质控措施。其中最关键的是标本采集和核酸提取，按照卫生部临床检验中心《临床基因扩增实验室工作规范》严格执行。室内质控贵在坚持，重在不断总结提高。3.2室间质量评价室间质量评价是实验室质量控制体系中的重要部分，是保证患者检验结果及其报告的准确性和可靠性，以及各实验室间结果可比性的重要手段。卫生部临床检验中心组织的全国性室间质量评价活动现已扩展到细菌、免疫、血液、体液、治疗药物监测、分子诊断等领域。临床PCR实验室应积极参加省、市及卫生部临床检验中心组织的各项活动，如实验室室间质量评价、质量评价总结会议、研讨会和学习班，各医院间相互学习、沟通和交流，不断改进和完善本实验室的质量管理。实事求是地汇报室间质评结果，认真地研究反馈的评价信息。接受卫生部或省临检中心的现场调查，如果1个质评项目连续2次成绩不合格，整改并停止项目收费3个月。及时发现问题，做好失控分析和记录，找出问题所在，采取相应措施，力求实验室结果准确、可靠、及时、可比，更好地服务于临床。
随着PCR实验室管理方法的不断完善，新试剂盒的相继推出，实验室设备的改良及实验方法的不断改进，定量PCR技术已经发展成为日益强大和用途广泛的技术。此外，PCR技术不同于常规的检验技术，必须按照PCR实验室的一系列要求开展工作才能保证操作的安全性和结果的可靠性。可以预计，PCR技术将会给临床医学检验方法带来一场巨大的变革，并逐步进入我国卫生机构的各级实验室，更好地为临床某些疾病的早期诊断和治疗提供服务。
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