分析方法的前期开发以及后期验证（范文模版）

第一篇：分析方法的前期开发以及后期验证（范文模版）

分析方法的前期开发以及后期验证 分析方法开发与验证在不同行业有不同的要求，医药化学行业对于质量的控制非常严格，高效液相分析是控制产品质量的重要手段，其开发与验证对其它行业有很好的借鉴意义。

一、分析方法开发

分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、检测波长的选择和梯度的优化几个方面。目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。

1.色谱柱的选择

原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以5um填料的色谱柱长要250mm，3.5um填料的柱长要150mm，基本上都是各个粒径柱长最长的。我比较喜欢近两年新出的亚二微米填料的色谱柱，50mm柱长就能提供很高的理论塔板数，而且柱长和粒径小了，流速增加很多，能节省很多的分析时间，极大的提高工作效率。一般选用直径为4.6mm或3.0mm的柱子，太细了可能会增大柱外效应。填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测的需要。对于API分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。

三种类型包括：

1)普通的C18或相应的C8色谱柱，如Waters的Symmetry C18或C8，YMC的Pack Pro C18或C8，Agilent的RX C8等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱；

2)封端处理的或者极性嵌入型色谱柱，如Waters的Symmetry Shield RP18或RP8，XTerra RP18或RP8，YMC的ODS AQ，Agilent的Zorbax SB AQ等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱；

3)填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基柱等，很多公司都有。

一般不同类型的色谱柱在选择性上会有很大的差异，相同类型的色谱柱生产厂家不同在选择性上也会有差异，这个主要是填料的性质和生产工艺决定的，有时候用一只色谱柱分离不好，除了优化梯度和流动相外，换一个厂家的柱子也是一个很好的选择。相同品牌型号的色谱柱，C18和C8在选择性上没有差异，但是C18保留能力更强，相同的样品分离度更高，我们一般倾向于选择用C18。我们在筛选色谱柱时尽量选择行业内排名前几位的厂家，柱子品质好，开发分析方法时能省很多力气，做出来的分析方法也有保证。一个药从开发到上市可能会持续十几年甚至更长时间，厂家有实力，开发方法时选定的柱子在若干年以后需要时还会有的买，做分析时重复性也能保障。多用几只色谱柱做筛选和分析方法优化，能尽最大的可能提高分析方法的质量，保证检测结果的可信度。

我比较喜欢用的柱子有：Agilent的Zorbax Eclipse XDB-C18、Zorbax Eclipse Plus C18，Waters的Symmetry C18、XTerra RP18、XTerra MS C18等，YMC的柱子有时会是不错的备用选择，菲罗门的柱子菲罗门的柱子国内外市场占有率较高，但是感觉柱子压力高，寿命短，尽量不用，热电的柱子用的也不少，但没什么感觉。

制剂分析方法选择色谱柱的要求基本和API相一样，对于中间体和生产过程中反应跟踪（IPC）分析方法开发使用的色谱柱，我们一般会根据样品性质直接选取一两只普通C18或者封端处理过的色谱柱，简化筛选过程。

2.流动相的选择

常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统

压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。

对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，而做液质就要考虑首选三氟乙酸了，近些年还比较流行加甲酸或乙酸。一般情况下这几种酸没有太大区别，我们更多的是考虑通过加酸改变流动相的pH值，从而改善样品的分离度和峰形。相同进样量样品峰越高则意味着峰形越好，从图中可以看出多数样品在低pH值下峰形都比中性要好，这个主要是由色谱柱本身的性质所决定的。色谱柱主要都是硅胶基质，现有的填料处理工艺无法将硅胶上残余的硅羟基全部去除，硅羟基会造成样品峰拖尾，一般认为硅羟基的pKa在3.5到4.5之间，低pH值能帮助抑制硅羟基的活性，减小拖尾，从而改善峰形，提高分离度。水溶液中添加0.1%（体积）的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左右，用作流动相正好抑制硅羟基的活性，所以开发液相分析方法时流动相首选水加01.%的磷酸，然后再以此为基础做优化。

在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，再有就是醋酸盐，常用的盐浓度在10~20mM左右。以前因为色谱柱填料生产工艺的问题，往往需要在流动相里添加三乙胺来减少拖尾，但是三乙胺对色谱柱的寿命有很大影响，现在新的色谱柱都不再需要了。流动相里有时会需要调节pH值到碱性，具体pH要视色谱柱的耐受范围而定，常用NaOH、KOH溶液或氨水做为调节缓冲盐溶液碱性pH的试剂，也可以往水里单独添加氨水做碱性流动相。

在缓冲盐做流动相时，出峰太早、峰形很差、相似结构的化合物峰因为拖尾或峰型太宽而不能达到基线分离时，可以考虑使用离子对试剂，常用的离子对试剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐，但是流动相里使用离子对试剂时，系统需要的平衡时间长，样品保留时间不是很稳定，因为离子对试剂的背景吸收基线会很差，且做完样品后需要长时间清洗，所以我们尽量不使用离子对试剂。

使用缓冲盐时要注意流动相混合以后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致基线漂移严重的问题，尤其是在流动相里添加醋酸铵以后，在低波长下梯度变化时基线下降非常严重，严重影响对含量较小杂质的准确定量，可以考虑在乙腈里加入10%的水，水中预先加入10倍水溶液浓度的缓冲盐，这样梯度中A、B两项盐的浓度相同，可以避免基线漂移严重的问题。原料药一般结构式比较大，分子构成比较复杂，开发分析方法时用水加磷酸效果可能效果不好，通常还要求最少尝试2和6.5两个pH值的磷酸盐缓冲溶液，并依据结果对流动相进行pH优化，如效果不理想再进一步尝试其它缓冲盐溶液。开发中间体或者IPC的分析方法时可以根据经验酌情简化流动相的选择过程。3.梯度的优化

梯度优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间，优化样品的分离度。有机相起始比例越小，样品保留时间越长，随着梯度的改变，样品出峰的先后顺序也有可能改变。我们做梯度优化时主要调整梯度的起始比例和斜率。现在的色谱柱或者采用了新的封端工艺，或者内嵌极性基团，耐水的能力都比较高。在酸性条件下很多化合物都以离子形式存在，极性较大，为了提高样品的分离度，尽量使用大比例的水做梯度的起始。对于添加缓冲盐的流动相要注意梯度变化过程中流动相组成改变时不能有盐析出。

对于水加0.1%磷酸的流动相，开始时可以采用95%的水做起始，以95%的有机相结束，注意根据实际情况在梯度最后用大比例的有机相冲洗几分钟，以保证把小极性的杂质洗脱下来，防止样品残留到下一针。梯度的斜率一般采用凹线型的先小后大，梯度变化先慢后快，在此基础上再对梯度进行优化。

使用缓冲盐溶液的梯度水相起始比例一般要从10~20%开始，为了防止盐析出，在梯度最后避免用纯的有机相做冲洗，梯度斜率采用恒定的就可以，在此基础上根据方法运行的情况对梯度进行调整。

一般一个API的样品采集的时间控制在40~50分钟左右，样品出峰在15~20分钟左右比较好，如果有极性非常小的杂质存在可以在最后加一段时间的大比例有机溶剂冲洗色谱柱，最后再设置10分钟左右的重新平衡时间。中间体和IPC的样品分析方法时间可以根据需要减半或者时间更短。

4.波长的选择

做分析方法开发需要二极管阵列检测器，做色谱峰纯度检查和选择检测波长，通过色谱峰纯度检查来保证主峰里没有掩盖其它杂质，做纯度检测对波长选择的要求比较简单，原则是把尽量多的杂质在色谱图上体现出来。很多杂质只有在低波长下才有紫外吸收，所以我们选择尽可能低的波长，乙腈的截止波长在190~195nm，用乙腈做流动相检测波长可以选择在210~220nm。也有公司要求分别选取产品紫外吸收最强的波段和210~220nm两个波段做对比，哪个纯度低以哪个为准，这样可以更严格的控制产品的质量。

二、分析方法验证

为了保证分析检测结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的准确性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。从本质上讲，方法验证就是根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法符合检测项目的要求。方法验证在质量控制上有重要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是制订质量标准的基础。方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不尽相同。

1.专属性

专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为选择性。对于纯度检测，可在标准品中加入产品中的已知杂质，或者直接用粗品，考察产品峰是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪，可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。一般要求产品和杂质之间的分离度大于2.0。

2.线性

线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原料或产品的浓度呈线性关系的程度。线性是定量检测的基础，需要定量检测的项目都需要验证线性。一般用贮备液经过精密稀释，或分别精密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5个以上），按浓度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归计算，考察分析方法的线性。

3.范围

范围指在能够达到一定的准确度、精密度和线性时，样品中被分析物的浓度区间。简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度最大值和最小值。需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80％～120％。

4.准确度

准确度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做真实度，需要定量得分析方法均需要验证准确度。准确度应在规定的范围内建立，对于原料药可用已知纯度的标准品或符合要求的原料药进行测定，必要时可与另一个已建立准确度的方法比较结果。

5.精密度

精密度是指在规定条件下，同一均匀样品经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度。精密度一般用相对标准偏差表示，取样检测次数应至少6次。

精密度可以从三个层次考察：重复性、中间精密度、重现性。

a、重复性是在相同的操作条件下、较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。一般是用100％浓度水平的样品测定6次的结果进行评价。

b、中间精密度：同一实验室，在日期、分析人员、仪器等内部条件改变时，测定结果的精密度。

c、重现性：指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度。

6.检出限

检出限是指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，不需要准确定量。检出限体现了分析方法的灵敏度。检出限的测定可以通过对一系列已知浓度被测物的试样进行检测，以能准确、可靠检出被测物的最小浓度来确定，也可把已知浓度样品的信号与噪声信号进行比较，以信噪比为3：1时的浓度确定检出限，一般要求能够达到进样浓度的0.05%。

7.定量限

定量限是指样品中的被分析物能够被定量检测的最低量，其测定结果需要一定的准确度和精密度，定量限体现了分析方法灵敏定量检测的能力。检测需要严格控制含量的杂质，必须考察方法的定量限，以保证杂质能够被准确定量。一般以信噪比为10：1时相应的浓度或进样量来确定定量限。

8.耐用性

耐用性是指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干扰能力，主要的变动因素包括：流动相的组成、流速和pH值、色谱柱、柱温等。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。

9.系统适用性试验

液相色谱分析方法主要依赖高效液相色谱仪和色谱柱，在做方法验证时，有必要将高效液相色谱仪、色谱柱、流动相与实验操作、待测样品等一起当作完整的系统进行评估，并将系统适用性作为分析方法的组成部分，系统适用性便是对整个系统进行评估的指标。一般系统适应性的要求为：分析方法能够达到0.05%的检出限，主峰的拖尾因子0.5

分析方法开发与验证是一个整体，在实际工作中，一般是先开发分析方法，经过适当的优化以后再做方法验证，验证的部分内容在分析方法开发时就要做，比如说分析方法的专属性验证。分析方法验证并非必须验证所有的内容，只要注意验证内容充分，足以证明分析方法的合理性就可以了，如杂质限度检测一般只需要验证专属性和检出限，而精密度、线性、定量限等涉及定量测定的项目，则不需要验证。

有时需要对分析方法进行全面或部分的再验证。当原料药合成工艺发生改变时，可能引入新的杂质，杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证，以证明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成份的含量测定应无干扰。当分析方法发生部分改变时，如检测波长发生改变，则需要重新进行检测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证，以证明改变后的分析方法的合理性、可行性。

第二篇：分析方法的验证(精)

分析方法的验证

分析方法的验证，就是对药品分析实验所采用的分析方法是否完全达到了预期目的，或证明由分析方法误差而导致试验结果判断错误的概率是否在允许范围之内，而进行的科学证明。

分析方法的验证以验证参数表示。在制定药品质量标准时，可通过这些参数证明所建立的分析方法是否适当。本文所述分析方法验证是指下述情况：药局方新收载品种质量标准的建立；药局方已收载品种质量标准的修订；根据药局方的通则建立替代方法。

定量限界是指样品中所含的被测物质可被进行定量的最小量或最低浓度。定量限界所述样品测定值的精度，以相对标准偏差表示，一般为10%。2.5.2 评价方法：通常定量限界可以通过空白样品或被测物定量限界附近的样品测定值的标准偏差以及定量限界附近的标准曲线的斜率算出。例如，根据定量限界附近的标准曲线的斜率以及空白样品测定值的标准偏差，由下式求出定量限界。

DL=10σ/slope

DL：定量限界

σ：空白样品测定值的标准偏差

slope：定量限界附近标准曲线的斜率

应用色谱法时，测定值的标准偏差可以用信噪比代替。分析方法的定量限界应比质量标准中规定值要小。2.6 线性关系

2.6.1 定义：线性关系是指分析方法能够得到与被测物质的量或浓度具有直线关系的测定值的能力，必要时，被测物质的量或浓度的测定值也可以是从数学公式中得到的变换值。

2.6.2 评价方法：准备一系列不同浓度(量)的被测样品，按照分析方法的操作步骤进行测定，用测定值得到的回归方程及相关系数对线性关系进行评价。必要时，将测定值由回归方程算出的残差对被测物质的量(浓度)作图，不应具有某种特定的趋势。通常，采用5个不同量(浓度)的样品作线性关系的研究。2.7 范围(Range)

2.7.1 定义：分析方法验证中所述范围是指具有一定精度和准确度的被测物质上限及下限量(浓度)之间的领域。对于上述具有线性关系的分析方法则指：具有一定精度和准确度，并且使线性关系成立的被测物质上下限量(浓度)之间的领域。

2.7.2 评价方法：分析方法验证的范围一般为标准中规定值的±20%左右，对范围的上下限值及范围中央值附近的样品进行精度、真度及线性的研究讨论。

验证参数

类型Ⅰ

类型Ⅱ

类型Ⅲ

定量试验 限度试验 准确度+ 精密度 并行精度+ 室内再现精度-* 室间再现精度+* 专属性 + + + + 检出限界定量限界-直线性+ 范围

+

+

注：-：一般不需要；+：需要；*：视情况而定。室内或室间再现精度选择其一进行评价，日本药局方通常选择后者进行评价。

类型Ⅰ需做鉴别试验，即对药品中的主要成分及其特征进行鉴别。类型Ⅱ需做检查试验，即对药品中的杂质或不纯物的量进行测定。类型Ⅲ需做含量测定和溶出度试验，即对药品中的成分进行测定(成分包括稳定剂、添加剂等)和药品有效性试验。分析方法验证用语

4.1 适应性/牢固性(Robustness)指故意将分析条件在小范围内变化时，测定值不受影响的能力。例如，反应的pH值、温度、室间及试药的量等分析条件在适当的范围内改变时，对测定值的稳定性进行研究讨论。测定值对于分析条件不稳定时，应对方法加以改进。适应性的研究结果在分析方法中以表示分析条件的有效数字或注意事项的形式得以体现。

4.2 实验室 指试验进行的场所、设施。分析方法验证中所述改变实验室是指试验者、装置以及试药的批号等试验条件发生变化。

4.3 试验法 指药局方中的试验方法，例如鉴别试验、检查试验等。试验方法应包括样品的制备、规定值、分析方法等。

4.4 生产者危险率 指合格的制品由于试验原因而错判为不合格制品的发生概率。一般以α表示，也叫第一过失率，也就是在限度试验中所说的假阳性率。4.5 消费者危险率 指不合格的制品由于试验原因而错判为合格制品的发生概率。一般以β表示，也叫第二过失率，也就是在限度试验中所说的假阴性率。4.6 测定次数 指分析方法操作程序中规定的次数，为了提高分析方法的精度，有些试验明确规定试验次数在2次以上，分析方法验证是对包括分析方法所规定的测定次数在内的分析方法的评价。它与为了提高分析方法的精度进行重复分析时的重复次数不同。

4.7 测定值 一次分析所得到的一个数值。

第三篇：JP13分析方法的验证

JP13分析方法的验证

JP13分析方法的验证

分析方法的验证，就是对药品分析实验所采用的分析方法是否完全达到了预期目的，或证明由分析方法误差而导致试验结果判断错误的概率是否在允许范围之内，而进行的科学证明。

分析方法的验证以验证参数表示。在制定药品质量标准时，可通过这些参数证明所建立的分析方法是否适当。本文所述分析方法验证是指下述情况：药局方新收载品种质量标准的建立；药局方已收载品种质量标准的修订；根据药局方的通则建立替代方法。

1、日本药局方收载分析方法所需资料

1.1 概要 对分析方法作简要说明，包括所采用分析方法的必要性，特点与优点及有关验证的要点。如系分析方法的修订，则需阐明新方法与原方法的区别以及新方法的优势。

1.2 分析方法 本项记载的有关分析方法的内容要足以能对分析方法进行评价，并且必要时可用复核试验进行评价。分析方法主要记载内容包括：分析的步骤、标准品及样品的制备方法、试剂与试药的调配、注意事项、分析系统是否正常运转的检验证明方法(例如高效液相色谱法中的分离效率的研究)、分析结果的计算公式、测定次数等。并且，如果使用了药局方以外的装置，还需详述有关内容；如果使用了新的标准品，则必须提供其物理、化学及生物学特征数据，并提供其质量标准。

1.3 有关分析方法验证的资料 本项应包括求导各验证参数的试验设计、试验数据、计算结果及检定结果等。

2、验证参数(validationcharacterisitics)

分析方法适当与否可通过验证参数进行评价，下面列举了最典型的分析方法验证参数的定义及其评价方法。

验证参数的有关术语及定义因分析方法的应用领域不同而不同，本文所使用的术语及定义仅限于日本药局方。评价方法项下所述内容也仅为简要概述。确定验证参数的方法很多，采用何种方法没有具体限制。但是，验证参数的限值常因确定方法的不同而发生变化。故此，确定验证参数的实验方法、实验数据、计算方法等应尽可能详细地记述。

本文分析方法验证中未包括验证参数适应性/牢固性(Robustness)的讨论，这是由于牢固性的研究主要在分析方法的开发设计阶段进行，其研究结果可以在方法的分析条件或注意事项中得到体现。

2.1 真度/准确度(Accuracy/Trueness)

2.1.1 定义：所谓准确度，指分析方法所得测定值的偏离程度，通常以测定值的总平均值与真值之间的差来表示。

2.1.2 评价方法：准确度一般以测定室内重现精度或室间再现精度时所得总平均值与真值的差表示。真值一般使用理论值(如滴定法)，如果理论值不存在或即使存在但很难求出的情况下，可采用经过确证或认可的数值来代替(如制剂分析常以原料药的测定值作为真值)。分析方法的专属性强，可以推断其分析方法的误差就小。由推出的真值与室内(室间)再现精度的标准偏差即可计算出真值的95%置信区间，并可判断这个区间是否包括0点，或区间的上下限值是否在分析方法

1所要求的精度范围之内。

2.2 精密度(Precision)

2.2.1 定义：精密度是指从均匀样品中抽取的复数个供试品进行重复分析测定时，所得到的一系列测定数据彼此之间的一致程度。测定值的误差以偏差、标准偏差、或相对标准偏差的形式表示。精度根据重复实验的条件不同以三个水平表示，分别称为：并行精度、室内再现精度、室间再现精度。

并行精度(Repeatability/Intra-assayprecision)：指实验室、实验者、实验日期、装置、器具以及试药的批号等实验条件均未改变的情况下，从均匀样品中抽取的复数个供试品短时间内进行重复分析测定时(并行条件)的精度。

室内再现精度(Intermediateprecision)：指同一实验室内，实验者、实验日期、装置、器具以及试药的批号等实验条件一部分或全部改变的情况下，从均匀样品中抽取的复数个供试品进行重复分析测定时(室内再现条件)的精度。

室间再现精度(Reproducibility)：指在不同实验室间，从均匀样品中抽取的多个供试品进行重复分析测定时(室间再现条件)的精度。

2.2.2 评价方法：首先，要保证精度研究所用样品的数量和均匀性。溶液应为均匀性样品，在得不到均匀性样品时，通常将大量制剂粉碎混合至认为均匀或制剂的各组分混合至认为均匀的样品作为均匀性样品使用。如果同时做两个水平以上的精度评价时，可以采用诸如单因素方差分析等实验方法，但为了正确得出分析方法的精度，必须有足够的实验次数、分析条件的水平数及实验室数。并且要对可预想到的致使分析发生变化的要因进行研究。各水平的精度以偏差、标准偏差、相对标准偏差、偏差的90%置信区间以及与其相对应的标准偏差的区间来表示。将其与分析方法所要求精度的标准值进行对照，以确定分析方法是否可行。通常是以室内(间)的再现精度作为方法取舍的依据。

2.3 专属性/特异性(Specificity)

2.3.1 定义：专属性指分析样品中有共存物质的情况下，对被测物质进行正确测定的能力，即表示分析方法的识别能力。如果分析方法的专属性有个别缺陷，可以用其他方法加以补充。

2.3.2 评价方法：确证分析方法是否达到试验目的，确实能够对被测物质进行鉴别或定量。例如，分析方法的专属性可以通过比较A为仅含被测物质样品(阳性对照)；B为含有制剂的其他各组成成分及不纯物或分解产物中添加被测物质的样品；C为不含被测物质，仅含制剂的其他组分、不纯物及分解产物的样品(阴性对照)，根据A、B、C三种样品的分析结果进行评价。如果不纯物不易得到时，可以用含有不纯物的样品(如经时发生变化的样品)替代。

2.4 检出限界(Detection Limit)

2.4.1 定义：检出限界是指样品中所含的被测物质可被检出的最低量或浓度。在检出限界内并不意味着一定就能够进行定量。

2.4.2 评价方法：通常以消费者危险率及生产者危险率在5%以下来规定检出限界。检出限界可以通过空白样品或检出限界附近的样品测定值的标准偏差以及检出限界附近的标准曲线的斜率算出。例如，根据检出限界附近的标准曲线的斜率以及空白样品测定值的标准偏差，由下式求出检出限界。

DL=3.3σ/slope

DL：检出限界

σ：空白样品测定值的标准偏差

slope：检出限界附近标准曲线的斜率

应用色谱法时，测定值的标准偏差可以用信噪比代替。分析方法的检出限界应比质量标准中规定值要小。

2.5 定量限界(Quantitation Limit)

2.5.1 定义：定量限界是指样品中所含的被测物质可被进行定量的最小量或最低浓度。定量限界所述样品测定值的精度，以相对标准偏差表示，一般为10%。

2.5.2 评价方法：通常定量限界可以通过空白样品或被测物定量限界附近的样品测定值的标准偏差以及定量限界附近的标准曲线的斜率算出。例如，根据定量限界附近的标准曲线的斜率以及空白样品测定值的标准偏差，由下式求出定量限界。

DL=10σ/slope

DL：定量限界

σ：空白样品测定值的标准偏差

slope：定量限界附近标准曲线的斜率

应用色谱法时，测定值的标准偏差可以用信噪比代替。分析方法的定量限界应比质量标准中规定值要小。

2.6 线性关系

2.6.1 定义：线性关系是指分析方法能够得到与被测物质的量或浓度具有直线关系的测定值的能力，必要时，被测物质的量或浓度的测定值也可以是从数学公式中得到的变换值。

2.6.2 评价方法：准备一系列不同浓度(量)的被测样品，按照分析方法的操作步骤进行测定，用测定值得到的回归方程及相关系数对线性关系进行评价。必要时，将测定值由回归方程算出的残差对被测物质的量(浓度)作图，不应具有某种特定的趋势。通常，采用5个不同量(浓度)的样品作线性关系的研究。

2.7 范围(Range)

2.7.1 定义：分析方法验证中所述范围是指具有一定精度和准确度的被测物质上限及下限量(浓度)之间的领域。对于上述具有线性关系的分析方法则指：具有一定精度和准确度，并且使线性关系成立的被测物质上下限量(浓度)之间的领域。

2.7.2 评价方法：分析方法验证的范围一般为标准中规定值的±20%左右，对范围的上下限值及范围中央值附近的样品进行精度、真度及线性的研究讨论。

3、试验分析方法的分类

根据试验目的，试验方法主要可以分为以下3种类型，各类型分析试验方法的验证所要求的验证参数见表1。应该指出，这仅是一个原则，评价分析方法所必需的验证参数将随分析方法的特点及试验目的而改变。

表1 试验类型与所要求的验证参数

其一进行评价，日本药局方通常选择后者进行评价。

类型Ⅰ需做鉴别试验，即对药品中的主要成分及其特征进行鉴别。类型Ⅱ需做检查试验，即对药品中的杂质或不纯物的量进行测定。类型Ⅲ需做含量测定和溶出度试验，即对药品中的成分进行测定(成分包括稳定剂、添加剂等)和药品有效性试验。

4、分析方法验证用语

4.1 适应性/牢固性(Robustness)指故意将分析条件在小范围内变化时，测定值不受影响的能力。例如，反应的pH值、温度、室间及试药的量等分析条件在适当的范围内改变时，对测定值的稳定性进行研究讨论。测定值对于分析条件不稳定时，应对方法加以改进。适应性的研究结果在分析方法中以表示分析条件的有效数字或注意事项的形式得以体现。

4.2 实验室 指试验进行的场所、设施。分析方法验证中所述改变实验室是指试验者、装置以及试药的批号等试验条件发生变化。

4.3 试验法 指药局方中的试验方法，例如鉴别试验、检查试验等。试验方法应包括样品的制备、规定值、分析方法等。

4.4 生产者危险率 指合格的制品由于试验原因而错判为不合格制品的发生概率。一般以α表示，也叫第一过失率，也就是在限度试验中所说的假阳性率。

4.5 消费者危险率 指不合格的制品由于试验原因而错判为合格制品的发生概率。一般以β表示，也叫第二过失率，也就是在限度试验中所说的假阴性率。

4.6 测定次数 指分析方法操作程序中规定的次数，为了提高分析方法的精度，有些试验明确规定试验次数在2次以上，分析方法验证是对包括分析方法所规定的测定次数在内的分析方法的评价。它与为了提高分析方法的精度进行重复分析时的重复次数不同。

4.7 测定值 一次分析所得到的一个数值。

本文译自第13版日本药局方附录参考资料3所载内容。

第四篇：药品质量标准分析方法验证

药品质量标准分析方法验证

一、目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求。

二、用途

（一）药品质量标准起草时，分析方法需经验证。

（二）药物生产方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。

三、需验证的分析项目

1.鉴别试验；

2.杂质定量或限度检查；

3.原料或制剂中有效成分含量测定；

4.制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；

5.溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法

四、验证内容

准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性

（一）线性（Linearity）

在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

•方法：应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列不同浓度标准溶液的方法进行测定（n≥5）。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。

•数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图

UV法：吸光度A一般在0.2～0.8，浓度点n＝5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应达到0.9999(n＝5)，方程的截距应近于零。

HPLC法: 用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为5～7，用浓度c对峰高h或被测物的响应值(峰面积A)之比进行回归处理，建立回归方程，r应大于0.999，截距应趋于零。

（二）准确度（accuracy）

准确度是指用该方法测定的结果与真实值接近的程度，用百分回收率表示。

测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。回收试验：空白+已知量的对照品（或标准品）测定，测定值为M

回收率R测定平均值空白100% 加入量

加样回收试验 ： 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为MRMP100% A

数据要求：可向制剂中加入已知量的被测物对照品进行测定规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次。

（三）精密度（precision）

精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)表示。

相对标准偏差（RSD），也称变异系数（CV）

RSDS100%S2xi

n

11.重复性(repeatability):

在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。

2.中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。

3.重现性(reproducibility)不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。

数据要求：需报告RD，RSD和可信限。

（四）检测限（LOD）

检测限系指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。

1．非仪器分析目视法

用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

2．信噪比法

用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

（1）空白值＝0时；①测定背景10次以上，求出标准差S空。②将S空乘以三倍；③在工作曲线上求出3 S空相对应的浓度X；即为方法的检出值；

（2）空白值不等于0；①测定背景10次以上，求出标准差S空；②在工作曲线上求出3 S空 相对应的浓度X； ③ 将求得的对应浓度值加上空白值即得该方法的检出限。

（五）定量限（LOQ）

指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。

常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为10∶1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定，也可按1984年国际纯粹和应用化学联合会(IVPAC)规定：用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定方法的实际测定下限。

仪器分析：通过测定一组空的样品的背景信号后计算标准差S。以1OS来估算定量限度。（以定量限度制备的样品来验证）

非仪器分析：通过分析己知被测物浓度的样品并确定一个样品中被测物可被准确和精密测定出的最低浓度（量）。

（六）耐用性

指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量在正常情况下实验结果重现性的尺度。

分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同的实验者对同一样品的分别测试而获得的。（获得的这种再与正常检定下的精密度进行比较，从而确定该法的耐用性）

（七）专属性

（八）范围

•典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。

•液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类色谱柱，柱温，流速等。

•气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体、柱温，进样口和检测器温度等。

经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。

含量测定需进行的方法学验证项目：准确度、精密度、专属性、线性、范围、耐用性

五、各种含量测定方法对效能指标的要求

1.容量分析法：用原料药精制品(含量>99.5％)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2％；进行回收率试验。回收率一般在99.7～100.3％之间。

2.UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于应在98％～102％之间。

3.HPLC法：要求

第五篇：分析方法验证或确认内容

分析方法验证内容确定

（1）化学（仪器）分析方法验证内容可按下表确定

（2）化学（仪器）分析方法确认内容可由两名检验人员分别对同一批产品进

行检验（如可能，使用不同的仪器），比较两人的检测结果来证明方法在本实验室（人员、分析仪器、试剂等）的适用性，也可根据确认目的和评估结果选择相关内容进行确认。

（1）生物分析方法验证内容可按下表确定

注：“是”代表该项内容需要验证，“否”代表该项内容不需要验证。（2）生物分析方法如需确认，则根据确认目的和评估结果选择相关Ⅱ内容进

行确认。

微生物分析方法验证内容确定

（1）若为药典或其他法规的方法，验证时按药典的规定进行验证（2）若为药典或其他法规的替代方法，则需按下表进行验证

注：“是”代表该项内容需要验证，“否”代表该项内容不需要验证。