PCR过程问题全解（推荐5篇）

第一篇：PCR过程问题全解

如何防止PCR形成引物二聚体？

在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？

答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。

PCR模板大约在104-106个拷贝。

答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。

答3：1.从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；

2.可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；

3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；

5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；

6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。

7.增加循环数可以适当降低引物二聚体；

8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；

9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。

10.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。

PCR假阴性的原因分析

PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就被深刻认识到了，同时由于造成假阳性的因素相对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话，那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性，仍然有相当的临床适用价值。但PCR的假阴性在检验工作中仍很严重，并且用些因素经常被人忽略，严重的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目，有什么样的诊断价值。造成PCR假阴性的原因是复杂的，也是多样的。主要有：

1.PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题（如：温控不准等）给临床带来了诸如非特异性扩增（假阳性）、扩增效率下降(假阴性）等问题.2.离心机问题。离心机的质量或使用不正确，造成离心标本模板没有分离出来造成假阴性，窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR，在整个检验工作中都是最易被忽视的问题，只是因为在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。

离心机是常用的固液分离设备，其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速，根据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的，因此对于不同有效半径的离心机相同的转速其离心加速度是不同的，转速的调节要因离心机而异，但很遗憾，日常工作中忽视了这个问题。有效半径短的离心加速度就小，同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热，因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持怀疑态度。

3.试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来，致使扩增无法进行，这是造成假阴性的又一主要因素。

问题1：无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无

原因:

1.模板:含有抑制物，含量低

2.Buffer对样品不合适

3.引物设计不当或者发生降解

4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

对策:

1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

2.更换Buffer或调整浓度

3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物

4.降低退火温度、延长延伸时间

问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：

1.引物特异性差

2.模板或引物浓度过高

3.酶量过多

4.Mg2+浓度偏高

5.退火温度偏低

6.循环次数过多

对策：

1.重新设计引物或者使用巢式PCR

2.适当降低模板或引物浓度

3.适当减少酶量

4.降低镁离子浓度

5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法

6.减少循环次数 问题3：拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：

1.模板不纯

2.Buffer不合适

3.退火温度偏低

4.酶量过多

5.dNTP、Mg 2+浓度偏高

6.循环次数过多

对策：

1.纯化模板

2.更换Buffer

3.适当提高退火温度

4.适量用酶

5.适当降低dNTP和镁离子的浓度

6.减少循环次数

问题4：假阳性

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因：

靶序列或扩增产物

的交*污染

对策：

1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；

2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管

及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存

请问PCR引物存放时间是多少？

这要看是什么状态，要是粉末的话，在－20度可以存放好几年；要是已经把引物稀释成液体状态的话，存放时间就要短一点了，但也可以存放一年左右的时间，甚至更长。

不过这也要看你们实验室的冰箱是不是经常开启，要是是的话，存放时间就很受影响，实验室的冰箱就是经常打开，而且有时候大家找东西要找好长时间，所以引物总是用半个多月的时间，效力就下降了，PCR后的条带明显就没有以前亮了。

建议你合成引物的时候，让公司每个OD分装成一管，每次你用的时候，取一管稀释成使用浓度；或者先稀释到储存浓度，分装后要用的时候再稀释到使用浓度。另外一定要注意避免反复冻融，反复冻融会使存放时间变短的。

最简单的就是分装了,以储存浓度保存,稀释10或20微升,就可以用好些次,即可避免反复冻融还可以避免整管引物都被污染.干粉－20度可以保存一年，稀释后－20度可以保存半年。

可以先稀释成100uM，分装成几管。然后再稀释成50uM和20uM的。每次用20uM的做PCR即可。尽量避免反复冻融。

稀释用的水PH值要求大于7（TE比灭菌去离子水好），并且无菌。

真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失.稀释方法：1 OD260引物干粉约为33微克；

碱基的平均分子量为324.5；

引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量；

引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量

举例：一管标明为2 OD的20碱基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66μg

摩尔数=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol

若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加10/=10pmol/ul,=1mlddH2O充分溶解即可。

如何提高PCR反应的特异性引物

引物设计：引物长度适当，18-24mers，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量； 引物浓度：引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。---生物秀实验频道

Mg2+

较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行最适Mg2+浓度测定

退火温度

Tm对于设定PCR退火温度是必需的。退火温度一般设定为比引物的Tm低5℃的温度。合理的退火温度为55-70℃。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合 巢式PCR 使用巢式引物进行连续多轮扩增，由于同两套引物都互补的靶序列很少，巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，从而提高PCR反应的特异性和灵敏度 递减PCR 通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。这样，特异性最高的目的模板会被优先扩增，并在随后的循环中继续扩增占据优势

热启动PCR 通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度。最常用的是热启动DNA 聚合酶，常温时该酶活性被抑制，94-95℃加热数分钟后回复正常活力开始反应，这样可以避免起始循环温度下的非特异性扩增，大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一

PCR增强剂

包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等，能构降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。

PCR扩增过程中常见的问题及解决方法

PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展PCR研究用应用工作。PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至会得到与事实完成相反的结果。为了使我们能够顺利地开展PCR工作，更好地发挥PCR技术的工具作用，我们根据多年来PCR工作总结的经验，对PCR扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结，提供给广大科研工作者作为参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。

一、假阳性扩增

在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源，一般应从以下步骤着手：

⒈ 试剂污染：

厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。检测方法，可按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水），便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。

⒉ 实验室污染：

这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上，扩弗产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然，所用的移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。解决方法：实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严格地分开，不可互换。PCR室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。

⒊ 采样污染：

在实验过程中，有时会出现一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反复，这种现象大都是由于采样时污染所致，一般来讲正规试剂生产厂家，其试剂出厂时都要经过严格的质量检测、批间，特别是批内差异都极小，不致出现如此明显的反复，这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR扩增非常敏感，而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往注不能去除痕量DNA，这些痕量DNA便成为PCR模板，出现阳性扩增结果，由于采样试管受污染程度不一，所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。

二、假阴性扩增：

如果连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假阴性，出现这现象有以下几种原因：

⒈ 仪器故障：

出现全阴结果，首先考虑到仪器运转是否正常。正确判断仪器的工作状况，是排除假阴性其它原因的基础，仪器运转是否正常是PCR扩增最关键的步聚之一。判断仪器是否正常，首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是否答合要求，各孔之间差异是否符合要求，PCR扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出现假阴性。必须注意的是不能过信名牌，我们经常发现一些名牌机器温度差异高达二度以上。

⒉ 试剂失效或无效：

了解机器是否正常，便可对试剂进行检测。首先要了解试剂是否超过有效期，试存放方法是否达到要求，如果试剂盒在有效期内，贮存方法是正确，那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以用已知阳性样本，或试剂盒提供的阳性对照，严格按说明书操作扩增一次，然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍，作为模板进行第二次扩增，判断结果，如果是阴性说明试剂无效或不合格，如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。

⒊ 试剂的敏感度：

有时试剂检测的阳性率偏低，所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，这种现象往往与以下三种因素有关：①试剂质量不过关；②操作方法不规范；③主观判断标准不科学。对于试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。这里着重提一下：目前经常碰到的一些不科学概念，我们习惯用某些样本应该阴性，某些样本应该阳性，或简单地以阳性率。主观概念判断试剂是否合格这是极不科学的主观推论。如对乙肝血清的测定，就不能用抽象的阳性率应该是60％或20％这样的概念来判断，同样也不能用“二对半”的结果评判“PCR结果”，这是因为“二对半”与“PCR”是两种完全不同的检测方法，其检测结果的意义有质的区别，它为医务人员提供的信息是大不相同的，更加之所使用的“二对半”试剂是否能作为质量评价标准仍待考定。目前世界上较公认的标准品只有雅培的“两对半”试剂，国内的“二对半”试剂据卫生部抽查资料表明，一度合格率在50％以下，怎么可能作为质量评定标准呢！对试剂敏感度的评价标准应该使用下述方法科学地评价，首先选择标准样本如HBV全序列质粒，标准阳性血清，结核菌菌体等用合适的介质如血清、痰液等进行有限稀释按1：

10、1：100、1：1000、1：10000如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一般认为如果标准阳性乙肝的血清用正常血清稀释10000倍以上，结核菌每毫升中在100个左右仍能测出阳性结果时，试剂的敏感度是足够的，判断试剂的灵敏度是足够的，判断试剂的灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，因为病原微生物有不同的型或变异株，合格的试剂不应漏检。最后还要判断试剂盒的异性，一般的实验室可以用不同病原体的样本按说明书操作来判断其对其它病原体扩增时是否也有阳性出现，其特异可达到怎样的精度，经过以上三个方面的研究便可以科学地判断试剂的质量。

三、扩增产物拖尾

有时扩增产物电泳后出现一个个萤光团（Smear现象）或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关：

⒈ 扩增系统不完善：

这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物浓度、DNTP浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。

⒉ 模板处理方法不完善：

PCR扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对PCR主要成分之一DNA聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样作用于聚合酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。

⒊ 引物设计不合理：

引物设计应遵循以下几个原则。首先，引物一般应由15-30个BP组成；其次，引物中碱基应是随机分布，不能有一串相同碱基或出现其它不常见结构；第三，GC碱基含量应在45-55％左右；第四，两个引物在3′未端不能出现同源性。其中以引物与基因组之间的同源性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列，因此我们必须充分利用这些资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其能否用于检测。

四、产物电泳单萤光带及多萤光带一般PCR扩增后，对扩增结果的判断最简单的方法是，琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激发观察其萤光条带，如果有明显和特异性扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在0.1-0.5mM，一般经30个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条20BP左右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。

引物设计相当重要，由于基因组有庞大数量的DNA序列，除了特异性的扩增外，往往很容易产生非特异性产物。如果引物与基因组存在较广泛的同源性，那么就会出现严重的非特异性扩弗，引物不仅与特异性的扩增区域结合，而且也与其它区域发生一系列非特异性结合，而选择引物时，常须考虑敏感性问题，特别是临床检验试剂盒，为了能把少至几个病原体检出，我们大都采用在病原体基因组中重复出现的DNA序列设计引物，如果这些重复序列没有严格的同源性，就在可能出现不同长度的扩增产物而出现多条带扩增。

病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。

PCR基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象。诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟PCR是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解释或解决。想信随着对PCR的深入研究，在PCR的应用过程中不断总结经验，PCR这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。

PCR产物的电泳检测时间

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。

克隆PCR产物

1)克隆PCR产物的最优条件是什么？

最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。

2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？

如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？

A）涂布未转化的感受态细胞。

如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。

B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。

例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：

1000克隆X10（3次方）ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug

转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞

如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。

C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。

T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。

D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。

4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。

B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。

C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。

D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。

E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液 10ul

4种dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+

1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul

PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。做配药品，稀释引物，PCR实验中，对水的要求要很高么?

配制一般化学试剂使用二级水即可。

配制生化试剂，包括引物稀释、PCR所用水，以及转膜、核酸抽提等，必须使用二次蒸馏水或一级水。

[1] PCR引物设计的原则

引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：

1.引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。

2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。

3.引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。

4.引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。

5.引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)[6][7]。

6.∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。

7.引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。

8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

[2] 扩增较大片段DNA的PCR方法

一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：

通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校读活性（3'-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由10*-4降到10*-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA聚合酶I Klenow片段）或AmpliTaq（全长的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq

1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。因而以往的PCR反应产物限制在5.0kb以内。超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。即使将延伸时间定为30分钟（10倍于通常所需）亦无改进。

利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增

美国华盛顿大学医学院的Barnes WM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，Pfu DNA聚合酶虽然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。因此必需将Pfu DNA聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反应顺畅进行。实验证实，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小为27-33nt,即可使反应有效进行。当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。

控制脱嘌呤反应增强扩增效率

在PCR反应体系中某些成分耐热性较差，会影响反应效率。DNA聚合酶的热稳定性一般都是较好的，可能是模板DNA在温度较高的环境中某些位点发生脱嘌呤反应从而阻碍反应的顺利进行。Lindahl和Nyberg的研究结果显示：在70℃ pH7.4的条件下，单链DNA脱嘌 呤反应的速度是双链DNA的4倍；100℃ pH7.0时，100kb的碱基中每分钟将有1个位点脱嘌呤。这一反应与缓冲体系中酸碱度的变化有关。人们注意到：三羟甲基氨基甲烷（Tris）的酸解离常数（pKa）会随温度升高而改变，平均每升高1℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃时pH8.55的PCR反应体系，到95℃热变性时，pH值将变为6.45，这就很可能诱导脱嘌呤反应。为了解决这一问题，可以采取下列措施：

缩短热变性时间，Barnes等在扩增35kb的大片段时，变性条件为95℃5秒，取得满意结果；

尽可能使升温、降温过程缩短，可选择使用导热性能优越的薄壁反应管及较为先进的扩增设备；

适当提高反应体系的pH值，反应最初应控制在pH8.8-9.2范围；

适当增加延伸时间（可长至20分钟）。使用这种方法可以扩增最大为35kb的DNA片段，产物的准确性亦有充分保证，克服了以往基因克隆过程中出现的DNA分子内的碱基重排和可能的毒性危险等问题。

酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

一、RT-PCR

1.cDNA产量的很低

可能的原因：

*RNA模板质量低

*对mRNA浓度估计过高

*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足

*同位素磷32过期

*反应体积过大，不应超过50μl

2.扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅

*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系

*与反应起始时RNA的总量及纯度有关

*建议在试验中加入对照RNA *第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10

*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。

*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：

a.将第一链的反应温度提高至50℃。b.使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。

3.产生非特异性条带

*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。

*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。

*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。

4.产生弥散（smear）条带

*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高

*减少引物的用量

*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数

*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

5.产生大分子量的弥散条带

*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的 *对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）

6.在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果

*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:

10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。

*有可能是引物二聚体的条带

7.扩增产物滞留在加样孔中

*有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。

*另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

8.SSⅢ与SSⅡ有何不同？

*具有更高的热稳定性（达50℃）

*具有更长的半衰期（达220分钟）

*对PCR无抑制

*干冰运输

*Tdt活性更低

SuperScriptⅢ反转录酶

9.为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript？

ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SSⅢ则更稳定。

10.为什么使用基因特异性引物（GSP）？

GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。

11.什么情况下需要使用RNase H？

在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时

12.根据不同的目的选择不同的系统：

目的建议

RT与PCR使用不同的引物

或需要灵活选择PCR DNA聚合酶

两步法RT-PCR系统

高灵敏度

一步法或两步法RT-PCR系统

高特异性

含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统

或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统

高保真度

含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统

长的反转录结果

通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果

含Elongase酶的一步法RT-PCR系统

二、Generacer

1.如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？

使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：

*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）

*23-28个碱基长度，以提高引物特异性

*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低

2.为什么得不到RACE产物？

*加入Hela对照

*低质量的RNA模板

*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成

*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR

*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因

*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。

*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。

3.RACE的PCR结果有杂带

RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：

*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。

*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。

*RNA降解。

*PCR管或试剂污染。

注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。

4.得不到全长的5’RACE PCR产物

*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。

*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。

*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。

三、PCR

在进行PCR时：

*请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物，也没有加入过量的Mg++

*请确保您使用了恰当的退火温度

*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶

四、引物

1.应该选择哪种纯化方法？

取决于实验目的和引物的长度

2.为什么我订购了50nmol，但是收到却只有40nmol？

50nmol是起始量

3.怎样制备100μM的储液？

体积（μl）=质检报告上的nmol数目×10

4.怎样设计引物？

*一般长度20-30bp；

*至少50%的GC含量；

*避免引物二聚体和二级结构；

*引物对的Tm值应该接近。

5.引物序列有插入或缺失？

*使用上游和下游引物多测几个克隆。

*请选择正确的纯化方法。

6.PCR无结果？

*请检查引物设计是否正确；

*请检测OD读数是否正确；

*做一个阳性对照和一个阴性对照。

第二篇：ICP许可证申请问题全解

ICP经营许可证申请问题

什么是ICP经营许可证

ICP许可证，也称互联网信息服务业务经营许可证，或者增值电信业务许可证中的互联网信息服务业务。

为规范互联网秩序，根据中华人民共和国国务院令第291号《中华人民共和国电信条例》、第292号《互联网信息服务管理办法》，国家对提供互联网信息服务的ICP实行许可证制度。

ICP许可证由各地通信管理部门核发。

ICP经营许可证申请流程：

ICP许可证，也称互联网信息服务业务经营许可证，或者增值电信业务许可证中的互联网信息服务业务。

根据中华人民共和国国务院令第291号《中华人民共和国电信条例》、第292号《互联网信息服务管理办法》，国家对提供互联网信息服务的ICP实行许可证制度。

ICP许可证由各地通信管理部门核发。ICP证申请过程是:

贵单位提交材料-----我们整理材料--------提交相关机构审批(2-3个工作日)-------提交通信管理局审批发证(30-60个工作日内)

ICP许可证申请条件：

（一）经营者为依法设立的公司；

（二）注册资本最低限额为100万元人民币；

（三）有可行性研究报告和相关技术方案；

（四）有与开展经营活动相适应的资金和专业人员；

（五）有必要的场地和设施；

（六）有为用户提供长期服务的信誉或者能力；

（七）最近三年内未发生过重大违法行为。

ICP许可证申请材料：

ICP许可证由各地通信管理部门核发。ICP证申请单位应准备的材料：

一、公司法定代表人签署的经营增值电信业务的书面申请(尚未获得企业法人营业执照、拟成立有限责任公司的，应当由全体股东签署;拟成立股份有限公司的，应由全体发起人签署)。

*内容应包括：申请电信业务的名称、业务覆盖范围、公司名称、通信地址、邮政编码、联系人、联系电话、电子信箱地址等。

二、公司的企业法人营业执照副本及有效复印件(尚未获得企业法人营业执照的申请者，应当提交公司的企业名称预先核准通知书或工商预登记证明)。公司注册资金不得少于100万元人民币。

三、公司概况。包括：公司基本情况，拟从事增值电信业务的内部机构设置、技术力量和经营管理人员情况(必须具备不少于两名中级职称以上的专业技术人员或具有两名以上具有相关专业的大学毕业生，生产人员按实际需要配备。申办时应提供相关人员的学历证明或职称证书，以及其在公司的任职情况)，与从事经营活动相适应的场地(场地平面图，房屋产权证明和租赁证明)、设施(已购或欲购的设备清单)等情况。

*人员证明应该包括人员在公司的任职情况和技术专业的本科毕业证书、设施是指从事相关电信业务须购买的设备。

四、经会计师事务所审计的最近的公司验资报告(正式件及复印件)。同时要提交相关会计师事务所的资质证明。

*验资报告必须是最近一年内的，而且要与公司章程里的股东情况相一致。超过一年的验资报告还需提供公司最近的财务审计报告。会计师事务所的资质证明一般是指会计师事务所营业执照复印件。

五、公司章程，公司股权结构及股东的有关情况(自然人股东应提供股东身份证复印件，法人股东应提供股东公司章程)。

*有效公司章程要求复印件上应当有所有股东的签字(法人股东应盖法人公司章)。

六、项目可行性研究报告和技术方案。包括：经营电信业务的业务发展和实施计划、技术方案、服务项目、业务实现方式、覆盖范围、市场调研与分析、收费方案、预期服务质量、投资分析、社会效益和经济效益等。

七、为用户提供长期服务和质量保障的措施(经营者应能提供全天24小时的通信联络手段。有受理用户申告、及时处理用户故障的服务保障措施和迅速修复系统故障的能力，并建立必要的工作制度)。

八、信息安全保证措施。包括信息内容的安全、网络运行的安全、安全保障责任制等安全保障制度(拟从事互联网信息服务业务的，见相关附件：从事互联网信息服务业务网络与信息安全保证书)。

九、证明公司信誉的有关材料。

*指公司获得的奖项(没有可不提供)。

十、公司法定代表人签署的公司依法经营电信业务的承诺书(尚未获得企业法人营业执照、拟成立有限责任公司的，应当由全体股东签署;拟成立股份有限公司的，应由全体发起人签署)。

十一、申请经营的电信业务依照法律、行政法规及国家有关规定须经有关主管部门事先审核同意的，应当提交有关主管部门审核同意的文件。(具体咨询电话见此文档最后)

十二、公司法定代表人对申请材料真实性的承诺。

十三、申请业务中包含互联网信息服务的，须提交拟经营网站的域名证书。

*域名证书的域名所有者必须是公司本身或者公司的股东。域名所有者是公司的股东的，还要提供股东的域名转让使用授权书。

十四、应提交的其他材料。

ICP许可证需要多长时间能下证：

如果材料完善、并将填写正确的ICP申请表送至通信管理局后，ICP证将在60个工作日内颁发下来。

注册资金不足100万怎么申请ICP：

注册资金不足100万怎么申请ICP?申请ICP许可证的条件之一就是要满足申请资金达到100万元，如果注册资金不足的话，也可以办理ICP，下面我们就来介绍几种方法，供您参考。

可以去做增资，把公司注册资金增资到100万。也可以找ICP代办公司，让他们帮你解决问题。金三咨询是一家很不错的ICP代办公司，如果需要的话，可以前来联系，电话：4006661429

申请ICP经营许可证注销应报送的材料：

ICP经营许可证又称互联网经营许可证，是增值电信业务经营许可证的一种，其业务种类是互联网信息服务业务。ICP经营许可证的有效期为5年，在有效期内不想继续使用该证书了，或者到了有效期不想继续经营该项业务了，就要到相关部门办理注销了。注销这一资质时需要准备好下列材料。

申请互联网信息服务(ICP)经营许可证项目注销应报送的材料：

一、单位介绍信。

二、公司企业法人营业执照有效复印件、公司章程、会计师事务所出具的验资报告及法人身份证复印件。(变更前后的营业执照都要提供)

三、提供ICP经营许可证原件。

四、申办互联网信息服务(ICP)经营许可证项目注销申请书。

第三篇：《散步》全解

七年级上册教材全解 01 散

步 莫怀戚

●学习目标 1．知识与能力

整体感悟课文内容，通过比较阅读提高审美情趣。2．过程与方法

精读时，你将学会以小见大、结尾升华主题的写作方法。3．情感价值观

细读品味后，你还会从文中受到尊老爱幼、珍爱亲情、珍爱生命的情感熏陶。

●文题全解 1．题目解说

散步的意思是随便走走，是一种休息方式。本文主要写的就是作者一家三代四口人一次典型的散步经历。所以文题就是文章主要内容的高度浓缩，也是文章的线索，作者通过把散步中几个相关的细节连缀起来，从而揭示祖孙三代人互敬互爱的这个主题。2．作者简介

莫怀戚，当代作家。3．背景资料

本文选自1985年8月2日的《中国青年报》。作者写此文之前，确实有一次全家三辈四口人散步的亲身经历，里面的真人真景及部分真事也与课文内容毫无二致，但作者并没有产生创作动机。1985年，作者从他的好友美国汉学家柯尔特先生那里得知：在美国人眼里，中国人尊老爱幼、赡养父母是全世界做得最好的，而在美国是不可想像的。作者听后感慨不已：我们自己丢掉的，发达国度的人却拾起来。于是作者开始重新审视这份看起来很陈旧已无什么价值的民族遗产。写作的念头就此产生了。

●正文全解

1．句段全解

我们在田野散步：我，我的母亲，我的妻子和儿子。【散：sǎn散文，松散；sàn散开，散步】

【段解：这段交待事件：散步；地点：田野；人物：我、我的母亲、我的妻子、我的儿子。属于“开门见山”开头法。】

母亲本不愿出来的。她老了，身体不好，走远一点就觉得很累。我说，正因为如此，才应该多走走。母亲信服地点点头，便去拿外套。【信服：相信并佩服】她现在很听我的话，就像我小时候很听她的话一样。【句解：这句话表达了一个中年儿子与老年母亲所特有的骨肉深情。儿子小时候听母亲的话，说明儿子是好儿子，母亲是好母亲；母亲老了，听成年儿子的话，说明母亲懂得尊重儿子，而儿子也懂得关心老人。母子之间的感情是亲切的、和谐的、始终如一的。】

【段解：这段交待了散步的缘由(原因)。并且为下文背母亲埋下了伏笔。】

天气很好。今年的春天来得太迟，太迟了，有一些老人挺不住。但是春天总算来了。我的母亲又熬过了一个严冬。【熬：áo熬夜；āo熬菜。严冬：寒冷的冬天】

这南方初春的田野，大块小块的新绿随意地铺着，有的浓，有的淡；树上的嫩芽也密了；田里的冬水也咕咕地起着水泡。这一切都使人想着一样东西——生命。

【段解：这两个自然段是一个过渡。其中第四自然段描绘了新绿、嫩芽、冬水，展现了春天的气息，生命的呼唤，写得富有诗意。读后使人似乎闻到了乡间田野泥土的芬芳，衬托了作者一家散步时祥和、欢乐的情绪。语言清新，文字优美。】

我和母亲走在前面，我的妻子和儿子走在后面。小家伙突然叫起来：“前面也是妈妈和儿子，后面也是妈妈和儿子。”【句解：写出了儿子的天真可爱、聪明智慧，话里充满了生活的情趣。】我们都笑了。

【段解：这一段开始入题，用儿子的话为下文所要揭示的深刻思想内容做铺垫。】

后来发生了分歧：【分歧qí：不一致，有差别】母亲要走大路，大路平顺；我的儿子要走小路，小路有意思。不过，一切都取决于我。我的母亲老了，她早已习惯听从她强壮的儿子；我的儿子还小，他还习惯听从他高大的父亲；【句解：这两句话中前后加点的词不能互换。她“早已习惯”写的是上一代母子关系，他“还习惯”写的是下一代父子关系。同是一个“我”，在母亲眼里是“强壮”的，而在儿子的眼里则是“高大”的。用词符合实际、准确恰当。】妻子呢，在外面，她总是听我的。一霎时，【霎（shà）时：时间短】我感到了责任的重大。我想一个两全的办法，找不出；我想拆散一家人，分成两路，各得其所，【各得其所：每一个人或事物都得到合适的安顿。】终不愿意。我决定委屈儿子，因为我伴同他的时日还长。【时日：时间和日期。】我说：“走大路。”【句解：走大路方便老人。“我”理所当然地照顾母亲。反映了对母亲的尊敬和孝顺。】

但是母亲摸摸孙儿的小脑瓜，变了主意：“还是走小路吧。”【句解：走小路孩子感兴趣。母亲慈祥，想让孙子高兴，改变了主意。反映了母亲对孙子的喜欢和爱护。“走大路”“”走小路”这两处细节描写，具体体现了一个幸福的家庭在散步中互敬互爱的融洽气氛。】她的眼随小路望去：那里有金色的菜花，两行整齐的桑树，尽头一口水波粼粼的鱼塘。【粼粼(1ín)：形容波光。】【句解：叙事中穿插景物描写，展现春天的生机，春天的活力，透露出一种新的希望。】 “我走不过去的地方，你就背着我。”母亲对我说。

【段解：这两个自然段写“我：爱幼，更尊老；母亲听从儿子，更爱孙子。展现了一家人相互体谅、生活和谐的画面。】

这样，我们在阳光下，向着那菜花、桑树和鱼塘走去。到了一处，我蹲下来，【蹲：dūn 蹲下；樽zūn：酒樽】背起了母亲，妻子也蹲下来，背起了儿子。我的母亲虽然高大，然而很瘦，自然不算重；儿子虽然很胖，毕竟幼小，自然也轻。但我和妻子都是慢慢地，稳稳地，走得很仔细，好像我背上的同她背上的加起来，就是整个世界。【句解：这句话的含义是：“我”和“妻子”人到中年，站在人生的中点上，肩负着承前启后的责任。对上，肩负着赡养老人的义务；对下，承担着培养教育子女的重任。形象地表明了我对生活有一种使命感。】

【段解：这一段主要写散步时“我”背母亲，妻背儿子过水沟的细节。刻画了一家人尊老爱幼的动人场面。最后一句是全文的画龙点睛之笔，揭示了中年人要对生活有一种使命感，因为中年人肩负着承前启后的责任，对继承和发扬中华民族尊老爱幼的传统美德起着桥梁和纽带作用。】

●整体把握

1．主题全解

作者通过选取祖孙三代一家人在田野里散步这个生活侧面，生动地展示了这一家人互敬互爱、和睦相处的深厚感情和生活情趣，体现了中华民族尊老爱幼的传统美德。2．结构全解

略

●问题研究

1．写法归纳

(1)按照顺叙展开，事件一目了然。

本文开头交待了事件发生的时间、地点、人物、缘由，属于“交待要素”开头法。接着作者按照事情发展顺序写出了事情的开始、发展、高潮和结尾。记叙的六要素在本文体现得非常清晰，使读者对事件一目了然。这种记叙的顺序就是顺叙。

(2)选取平凡小事，以小见大立意。

采用日常生活中看似平常的题材，来表现具有深刻社会意义的主题，这种写法就是以小见大立意法。采用这种方法写文章，要求选取平凡生活中富有典型意义的题材。并非随意捡来的一件小事、一个场景、一个生活片段便可以表明一个大道理的，要能从本质上把握“小事”与整个时代、社会和生活的内在联系。

《散步》写祖孙三代人在一起散步的平凡小事，表现出一家人之间的互敬互爱，体现了中华民族的传统美德。作者选取“散步”这一生活侧面，表现那种对人类社会的繁衍、发展具有重要意义的道德、情感，用的是“以小见大”的写法。文章不长，但是写得情趣盎然，很有波澜。儿子“叫起来”是一波，一波初平，行路分歧又起，最后小路遇水塘阻挡是余波，矛盾的产生和解决进一步突出了家人之间的深厚感情，使散步过程饶有意趣。

2．重点难点

理解通过细节描写，展示人物感情的写法。

细节是指人物细微的举止行动或细微的情节。细节具有典型意义，如果运用恰当，会耐人寻味。在《散步》一文中表现互敬互爱的细节有：母亲和儿子发生分歧，“我”经过思考决定：“走大路”——走大路方便老人。“我”理所当然地照顾母亲，反映了对母亲的尊敬。母亲改变了主意：“还是走小路吧!”——走小路孩子感兴趣。母亲慈祥，想让孙子高兴，改变了主意，体现了母亲对孙子的喜欢和爱护。这两处细的情节，反映了两代人的具体心态，表现了一个幸福的家庭在散步中互敬互爱，十分融洽的气氛。又如：“我蹲下来，背起了母亲，妻子也蹲下来，背起了儿子。”这个背母亲的细微动作，不只有尊老的含义，也体现出了“我”具有的一种使命感。●练习全解

一

朗读全文。题目“散步”是从文章主要事件的角度确定的，你觉得这个标题好吗?请你换一个角度为本文拟一个标题，并说说你的理由。

本题在标题上做文章，意在整体把握课文内容，也是揣摩标题艺术。第一问，可以回答“好”，也可以回答“不好”，只要言之成理即可。另拟标题，可以各显神通，拟好后交流一下，相互评判，鼓励创意。

二

“我蹲下来，背起了母亲，妻子也蹲下来，背起了儿子„„但我和妻子都是慢慢地，稳稳地，走得很仔细，好像我背上的同她背上的加起来，就是整个世界。”说说你对这段话的理解，并与同学交流。

本题要求理解语句的深层含义，重点应放在“整个世界”四个字上，兼及其他。

答案参见“句段全解”中最后一段的“段解”。

三

下面这篇短文也是讲三代人的故事。与课文比较，哪个故事更感动你?说说你的理由。

三

代

林文煌

在交叉路口转弯的时候，我的脚踏车把一位陌生先生的右脚踝压伤了。本来我是安全避闪的，当我看到那位先生一手牵着一个刚会走路模样的小男孩，一手牵着一个步履蹒跚的年老中风病患者时，我立刻紧急煞车，把车头倾向一边。岂料就在这时，他突然急速地跨前一步，自己撞了上来。

我赶紧跳下车，不安地说：“对不起!对不起!”

他一边弯下腰按摩脚踝，一边和气地抬起头：“我不怪你，是我自己撞上的„„也许是我太多虑了，我以为车子如果不会撞上我的小孩，便会撞上我的父亲，于是下意识地上前阻挡。”

在我惊魂未定、讷讷不知所措的时候，那位先生已牵着小孩和老者慢慢离去，我愣愣地目送他们，三个脚步迟缓的背影构成一幅感人的画面。我有搁下车子跟上去帮助那位先生的冲动。可是，我没有那样做：我发觉小孩和老者好像那位先生肩上的一副担子的两头，再艰苦他也不肯放下任何一头的。

《三代》与《散步》主题相近，又有差异，情节则差别较大。本题作比较阅读，培养鉴赏能力。阅读是个性化行为，“感动”这种情感更是个性化的，说《散步》更感动人，可以；说《三代》更感动人，也可以，能言之成理就好。《三代》说的是，宁可自己受伤，也要保护一老一小；《散步》说的是，孝顺第一。衡量作品，也要从社会价值上去考虑。

第四篇：不动产业务整理手册(问题参考)全解

不动产业务整理手册

不动产业务与问题整理手册

（仅供参考）

2016年6月

I

不动产业务整理手册

业务案例整理

1.房产、土地均已办理第一次转移登记，但在房产再次或多次办理转移过程中土地未随之办理转移登记，要求将土地使用权直接办理到现房产权利人名下的情况。建议：可以办理。需查清历次房产登记档案，理清产权交易和房产变化脉络，脱节的历次权利人全部到场签字，并作询问笔录，审查相关税费，无查封、抵押等限制条件的，可以直接办理到现房产权利人名下。如有查封情形，需权利人到法院主张权利，解封后再办理。

如缺少中间权利人的，需在门户网站公告30日后，按上述办法直接办理到现房产权利人名下。

主要依据：“地随房走”，“房随地走”，《物权法》第一百四十七条“建筑物、构筑物及其附属设施转让、互换、出资或者赠与的，该建筑物、构筑物及其附属设施占用范围内的建设用地使用权一并处分。”

2.房产在第一次转移登记后再次或多次转移登记，土地已预区分但未办理转移登记的，要求直接办理到现房产权利人名下的情况。

建议：可以办理。需查清历次房产登记档案，理清产权交易和房产变化脉络，历次权利人全部到场签字并作询问笔录，审查相关税费，无查封、抵押等限制条件的，可以直接办理到现房产权利人名下。如有查封情形，需权利人到法院主张权利，解封后再办理。

如缺少中间权利人的，需在门户网站公告30天后，按上述办法直接办理到现房产权利人名下。

房产属房改房或集资建房的，需查看出让金缴纳情况，收回协议和出让合同。（最好能查到当地政府关于房改房的处置意见，即政策性文件。）

3.房产在第一次转移登记后再次或多次转移登记，土地未办理预区分的，要求直接办理到现房产权利人名下的情况。

建议：同时符合以下条件的可以办理：出让土地、土地用途没改变，取得规划竣工验收合格证且无查封、抵押等限制条件。

不动产业务整理手册

需查清历次房产登记档案，理清产权交易和房产变化脉络，历次权利人全部到场签字，并作询问笔录，审查相关税费，无查封、抵押等限制条件的，可以直接办理到现房产权利人名下。同时，在网站发布“土地已转移情况”的公告，如有查封情形，需权利人到法院主张权利，解封后再办理。

如缺少中间权利人的，需在门户网站公告30日后，按上述办法直接办理到现房产权利人名下。

不动产权证只记录房产信息。原土地证信息写在“权利其它状况”栏中，并注明“土地未分摊”字样。受理业务部发函给开发公司，督促尽快办理预区分登记，随即通过OA抄报土地利用处（科）（有的地方叫地租处），由土地利用处（科）审查该宗地批后监管情况，15日内反馈到不动产登记中心。（备注：此办法需要局内部协调有关业务[处]科室共同参与）

如土地用途改变，需开发商到土地利用科办理相关手续后方可办理。如土地利用处（科）发现该宗地有违反合同、擅自提高容积率等事项的，应及时采取制约措施。

4.房产已办理第一次转移登记，出让土地未分摊，要求单独作房产抵押的情况。

建议：可以办理。单独房产抵押，房产证“不变不换”，可以只办理房产抵押。但应告知抵押权人可能存在的隐患。如单方产要转移需要告知权利人不可转移。

抵押登记时还需提供大土地证的复印件，抵押权人书面说明“已知晓土地未分摊”。并在房产证记事栏中记明不动产单元号。

（备注：此办法要与事先协调告知房产公司以及相关金融单位）

5.房产已办理第一次转移登记，划拨土地未分摊，要求单独作房产抵押的情况。

建议：可以办理。单独房产抵押，房产证“不变不换”，可以只办理房产抵押，但登记人员应告知抵押权人可能存在的隐患。

抵押登记时需提供大土地证的复印件，抵押权人书面说明“已知晓宗地为划拨土地和土地未分摊”，抵押权人与抵押人书面承诺“实现抵押权时，首先补交土地价款”。并在房产证记事栏中记明不动产单元号。

（备注：这是山东的做法，值得商榷，应该说是存在瑕疵和风险的。）

不动产业务整理手册

6.房产已抵押，要求办理土地抵押（独用宗）的情况。

建议：可以单独办理土地抵押（抵押期限不超过房产抵押期限)。但房产未抵押的，要求房地一致办理。

7.土地已抵押，要求办理房产登记并抵押（独用宗）的情况。

建议：需抵押权人同意，收回并注销土地证和他项权利证，办理不动产权证后再办理抵押登记。

8.房产、土地以前分开抵押的，解押时分开解还是一块解的问题。

建议：以前分开做抵押的，解押时应分开解。

（但是否应该规定，如果解压后还需再抵押时是否必须房地一并抵押？）

9.开发商用多幢房产办理在建工程抵押，现想解除其中一幢，能否办理。

建议：这种情况需要看当时抵押是否分幢抵押，如果是分幢抵押可以解除其中一条记录,没有分开抵押的话，需要开发商解除全部的抵押，重新抵押。

不解除抵押的情况下也可以在不动产登记证明上注明，不需要先解除抵押再办理。

10.开发商用几幢房子中未出售的房产（其中一部分已出售）办理在建工程抵押的，能否办理

建议：可以办理，需要除去其中已经出售的一部分

11.宅基地只有房产证，没有土地证，能否办理不动产权证？

建议：不能办理。必须能找到合法的土地审批手续才能办理不动产权证。

12.宅基地没有房产证，能否直接办理土地证转移登记？

建议：不能办理。只有办理不动产权证后方可转移。

13.土地大证挂接问题

建议：对于没有小土地证的，办理业务前需要进行土地分摊，确保房产证与土地

不动产业务整理手册

证保持权利一致，然后办理业务。如果强制挂接大证，会导致权利不一致，出现以下问题：

1、查封登记、抵押登记，如果挂接大土地证，大土地证会被查封、抵押，会影响该宗地上的其它不动产办理业务。

2、挂接土地大证，做完第一次转移后土地大证信息会进入历史，影响后续业务办理，下次再做业务时需要从历史表中把原来的土地大证信息进行恢复。

3、对于储藏室、车库等，是否挂接大证？如果主辅都挂土地大证，会导致证书的土地面积累加。

按照正常业务流程应该如下：

日照现在已经不做土地的分摊，经与局方协商，按照以下方法处理：（1）已经有小土地证或是分割证明的需要挂接对应的小土地证或分割证明。（2）没有小土地证或是分割证明的不要挂接土地证书，直接挂在宗地上。

（这就是我的观点之一，也就是原来有的沿用，没有的直接挂大宗地）

不动产业务整理手册

14.自然人之间的担保抵押能否办理的问题。

建议：房地可以办理。单独以土地抵押的不办理。

《中华人民共和国物权法》中均未对抵押权人的范围进行限制

实施细则中第八十一条【抵押登记提交材料】自然人、法人、其他组织为保障其债权的实现，依法以不动产设定抵押的，可以由当事人持不动产权属证书、抵押合同与主债权合同等必要材料，共同申请办理抵押登记。

债权合同中包含有抵押条款的，可以只提供债权合同。

15.房产已办理第一次转移登记，土地未预区分，需不需要收回原土地证，土地证能不能再做剩余部分抵押的问题。

建议：需收回原土地证，在记事栏注明相关事宜，如不能收回，需在门户网站发布公告，公告内容注明“土地已转移情况”。土地证不能再做抵押登记。

16.房屋权利性质是房改房，走转移登记，那么房屋性质会发生改变吗？

所有房改房的土地使用权类型都是划拨，而且，土地使用权类型是划拨的在出售给另一个人时，在办理另一个人新土地证时都必须依照当地政府规定补交相应的土地出让金，补交后土地的使用权类型自然就变为了出让性质，这是房产的性质应变为商品房。

17.宅基地土地证已经办理完过户，新土地证还未发放，能否办理房产过户？

建议：不能办理。土地已经确权。不能办理转移。国家会统一确权房产，直接办理不动产证。

18.房地产开发商委托办理业主不动产证，土地证房产证都没有的情况下做转移登记。小区比较老，没有办理出土地证和房产证。

建议：可以先做房地产商的首次登记，不出证书，然后再做转移登记。19.7个土地证要办成一个不动产证书，土地未分摊，权利人不变

建议：能办理。必须材料齐全，先土地注销，然后进行首次登记

土地证的权利人都是同一人，仅仅是将7个土地证合起来，不涉及土地的转移，不动产业务整理手册

抵押，查封等业务。

20.7个土地证，上面有抵押 信息，现局方要求7个证再有抵押的状态下合成一个土地证，然后再走抵押变更流程，问是否可以办理？（上面还有房产信息）

建议：能办理。必须材料齐全，先土地注销，然后进行首次登记，确认没有进行任何的土地使用权与房屋所有权的登记

土地证的权利人都是同一人，仅仅是将7个土地证合起来，不涉及土地的转移，抵押，查封等业务

21.房产做过预告登记，现在要做转移登记，买卖双方不变，业务人员想直接做转移业务；

建议：不能办理。

房产做过预告登记，数据是有预告状态的，会有一条实测数据和一条预测数据，如果不做预转现业务，有可能会出现一个房产证可以做两次业务的情况。22.一宗地占多个地籍子区，地籍子区代码无法选择

不动产暂行条例有一条说明跨子区相关业务处理，由一个登记机构进行登记，登记结果通知相关部门，子区代码定主要子区区域（或由局方定）

23.办理抵押登记或转移登记，土地证跟房屋所有权证用途不一致如何办理？

土地存在多用途情况，按实际的填写即可。

24.只有土地批复，但未发土地证，有房产证，如何办理转移登记或抵押登记业务

土地批复相当于土地登记证书，配号过程可以不勾选土地证。办理登记需要在审批意见中备注说明该情况

25.小区已经发房产证，土地总证被法院查封（查封时已经告知法院部分房产已经卖给有关业主）能否办理不动产转移登记？

已查封不能进行转移登记，如果进行国有建设用使用权及房屋所有权首次登记是可以的

国有建设用地使用权被查封或者预查封的，申请人与查封被执行人一致的，不影响办理国有建设用使用权及房屋所有权首次登记

26.开发商开发的小区已颁发总的土地使用证，但业主只颁发了房产证，没有颁发分摊后的土地使用证，小区内业主房屋发生转移应如何办理？

对于已建设完毕的小区土地总面积不再分摊，在新发的不动产登记证书上只标注

不动产业务整理手册

好房屋发生转移业主的具体位置。原登记在开发商名下的土地证书由市不动产登记中心收回，七日内拒不交回的依法公告注销，公告期15个工作日，公告所需时间不计算在登记办理期限内。公告期满无异议或者异议不成立的，应当及时记载于不动产登记簿。

对于未完全建成的小区，土地总证书暂不收回，等全部竣工后，开发商将土地总证书连同楼盘信息表一并交回市不动产登记中心,分摊时按照楼座基地面积分摊，基底面积以阳台外1.5米为界。

27.土地性质是划拨土地的房改房、经济适用房、部分公房出售（划拨土地上建住宅）等是否可以出售

对于土地性质是划拨土地的房改房、经济适用房、部分公房出售（划拨土地上建住宅）等，按照成交价的1%收取土地出让金后办理过户,对于上述三种情况以外的划拨土地协议出让方式，但不签到出让合同和网上审批，按现行基准地价的70%缴纳出让金后予以登记。

28.双用途的怎么办理

一宗土地上同时存在商业与住宅用途的宗地，对于两种用途界限清晰的，按实际用途进行划分后再进行登记；无法分清界限的，如一层是商铺，二层以上是住宅的，对于住宅不再分摊，商业要进行分摊。

29.城中村建房用地（土地为代管国有土地，属宅基地），房产证办理了过户手续，现申请过户领取不动产证书，如何解决？

虽然城镇居民与房改房可以按地税评估价的1%收取出让金后办理，但是这种土地暂时不能办理，因为对于出让金的缴纳方式无法确定（不符合城市规划，没法签订出让合同。潍坊也一直没办，办了几户是按照基准地价的40%收取的出让金，但是利用科认为应当是70%）。

30.不动产统一登记后，土地是否还要分摊？若分摊如何分？

应该进行分摊，按楼基座分摊（建议是楼体最外端向外1.5米为分摊范围）。31.已发放的房产证占地面积超出土地证上的土地范围，如何办理？

这属于违建，只登记合法部分，如果违建很少（没有超过5%），可以按照实际建筑面积进行登记。

不动产业务整理手册

32.小区内各业主已经取得房产证，土地总证被法院查封，能否办理不动产转移登记？

需要与法院进行沟通。

33.办理登记业务时，是否进行婚姻关系审核，还是谁申请登记谁？

婚前不用审核，婚后可以约定，也可以审核。

34.单位职工房改房未办理产权证，现在原单位已破产，如何办理不动产证书？

到房管部门找房改资料，如果房改资料齐全，可以办理。资料不齐则补上对应的材料。

35.同一宗地在多个金融部门进行抵押

由不动产登记中心负责给除首次办理抵押登记之外的相关金融部门出具抵押贷款告知书，履行告知责任。同时在不动产登记证明上标注清楚抵押贷款的顺序。36.同一宗地用土地使用证或房产证办理抵押登记或转移登记的，原土地使用证与房产证用途不一致

可以办理抵押登记，用途按照原用途填写；如发生转移需办理登记，必须先办理房或地用途变更手续，使其一致后再进行不动产登记。37.土地使用年限即将到期办理抵押登记，分两种情况处理：

1、用途是住宅的，根据《中华人民共和国物权法》第一百四十九条“住宅建设用地使用权期间届满的，自动续期”的规定，无论土地是否到期均可办理抵押登记。

2、用途是住宅以外其他用途的，抵押期限在土地剩余使用年限以内的，可办理抵押登记，否则不能办理。

38.有土地批复文件，未进行土地确权登记，但已办理房产证，能否办理房产转移或抵押业务？

抵押业务可以办理，转移的话需要税费齐全（土地房产均齐全，主要是出让金和契税），就可办理。

39.房产坐落在两宗土地上，开发商用房产总证作抵押，能否办理？

先由开发商提出书面申请，再合宗。合宗时开发商写出承诺，承诺放弃土地使用年限长的年限（需要审核合宗后是否符合建设用地规划许可，是否符合建设条件，是否调整了容积率。）。

40.民间借贷的个人对个人，个人对公司或是公司对公司的，能否办理不动产抵押？

自然人、个人之间可以办理抵押登记，典当行的抵押也可以办理，但是非金融的不动产业务整理手册

法人之间要小心并依法办理，特别是法人之间不可以走款 41.开发商用房产总证作抵押，土地未分割的，能否办理？

可以办理，先公告，再办理。

42.开发商用其中一栋房产办理在建工程抵押，同时土地也已经办理抵押，现在想用另一栋房产办理在建工程抵押的，能否办理？

可以办理，办理时需要注明土地的抵押顺位（在不动产登记证明上注明即可，告知金融机构）。

43.土地已办理抵押，现在申请办理房产抵押，能否办理？

可以，抵押额不能超过总的房地价值。

44.农村宅基地抵押登记能否办理？有房产证，土地不符合一户一宅规定的，能否办理转移、抵押、更名等手续？

因为相关法律没有出台，所以不能办理抵押登记。对于转移的，可以依法收回后再审批给他人。

45.土地抵押未到期，已有业主办理预告登记，现其他业主申请办理预告抵押登记，是否应解除土地抵押登记？

不需要解除土地抵押，但是需经第一家金融机构同意后再办理。

第五篇：桥梁工程总结全解

名词解释

1.桥梁全长：桥梁两端两个桥台的侧墙或八字墙后端点之间的距离。对于无桥台的桥梁为桥面行车道的全长

2.多孔跨径总长：梁式桥、板式桥涵的多孔跨径总长为多孔标准跨径的总长；拱式桥涵为两岸桥台内起拱线的距离，其他形式桥梁为桥面系车道长度。

3.跨径：结构或构件支承间的距离。对于梁式桥、斜拉桥和悬索桥，它是指相邻两桥墩中线之间的距离，或墩中线至桥台台背前缘之间的距离；对于拱桥，则是指净跨径。

4.计算跨径：对于具有支座的桥梁，是指桥跨结构所支承的相邻墩台上的支座中心之间的距离；不设支座的桥梁为上、下部结构相交面中心间的水平距离

5.净跨径：指设计洪水位上相邻两个桥墩之间的净距。

6.桥面净空：桥梁行车道、人行道上方应保持的空间界限。

7.五点重合法：求悬链线拱的拱轴系数时，要求拱圈的五个关键控制截面，即拱顶，两拱脚和两个四分点达到压力线和拱轴线必须重合，从而使各拱圈截面不产生过大的弯矩峰值，这种设计方法称为五点重合法。

8.矢跨比：指拱桥中拱圈（或拱肋）的计算矢高与计算跨径之比。9.纯压拱：在某种荷载作用下任意截面弯矩等于零

10.合理拱轴线：一些特殊的分布荷载，和荷载分布规律有关的拱轴线。

11.拱桥按结构体系分类：简单体系拱桥、组合体系拱桥、刚架体系拱桥

1.简单体系拱桥：桥面系是局部承力和传力结构，不考虑与主拱联合受力。是有推力拱，水平推力由墩台和基础直接承受。

2.组合体系拱桥：可以是有推力拱，也可以是无推力拱。

3.刚架系杆拱桥：刚架系杆拱中拱肋与桥墩固结，不设支座，采用预应力钢绞线作为拉杆来平衡拱的推力，拉杆独立于桥面系之外，不参与桥面系受力，而桥面系为局部受力构件。

12.斜拉桥塔梁之间的组合方式：漂浮体系、支承体系（包括半漂浮体系）、塔梁固结体系、刚构体系。1漂浮体系：主梁在顺桥方向变形不受索塔约束，主梁水平荷载不直接传递到索塔。

优点：顺桥向负担小和主梁弯矩分布均匀，纵桥向周期长，减轻地震作用。

缺点：结构刚度小，顺桥向变形大，施工期间稳定性差。

2支承体系：塔梁之间有竖向支承、在顺桥向有一定水平约束的结构形式，其中半漂浮体系在顺桥向无约束。优点：索塔对主梁懂得纵向水平约束刚度越小，结构受到的水平地震作用越小，顺桥向水平变形增大。缺点：刚度较大的支点使得主梁出现比较大得负弯矩。

3塔梁固结体系：塔梁之间固结，但塔与墩之间用支座传递荷载的结构形式。

优点：索塔弯矩小、主梁受力均匀，整体升温引起温度应力小。缺点：结构刚度小，变形较大，支座承受反力大。

4刚构体系：塔、梁、墩三者之间固结的结构形式。

优点：刚度大，变形小，索塔部位不要设置支座，结构维护容易，施工过程稳定性好。缺点：支点处主梁弯矩大，索塔要承受很大的温度应力和水平地震作用。

13.鞍座：设在塔顶及桥台上直接支承主缆并将主缆荷载传递给塔及桥台的装置。

14.锚碇：锚块基础、锚块、主缆锚固系统及防护结构等的总称。

问答题

一．桥梁的组成？

桥梁结构一般分为上部结构与下部结构。上部结构包括桥面铺装、桥面系、承重结构，以及连接部件；下部结构为桥墩、桥台和基础，有时下部结构仅含桥墩与桥台，将桥梁基础单列。桥梁上、下部结构之间常采用连接。上部结构是在线路遇到障碍而中断时，跨越这类障碍的主要承载结构。下部结构的主要作用是承受上部结构传来的荷载，并将它及本身自重传给地基。

二．桥梁有哪些基本类型？按照结构体系分类，各种类型的受力特点是什么？

答:梁桥、拱桥、斜拉桥、悬索桥。按结构体系划分，有梁式桥、拱桥、钢架桥、缆索承重桥（即悬索桥、斜拉桥）等四种基本体系。梁式桥：梁作为承重结构是以它的抗弯能力来承受荷载的。拱桥：主要承重结构是拱肋或拱圈，以承压为主。刚架桥：由于梁与柱的刚性连接，梁因柱的抗弯刚度而得到卸载作用，整个体系是压弯构件，也是有推力的结构。缆索桥：它是以承压的塔、受拉的索与承弯的梁体组合起来的一种结构体系。

三．公路桥面的构造？桥梁上有哪些基本的附属设施？

公路桥面构造包括行车道铺装、排水防水系统、人行道（或安全带）、缘石、栏杆、照明灯具和伸缩缝等。附属设施包括桥面系、伸缩缝、桥梁与路堤衔接处的桥头搭板和锥形护坡等。

四．预应力钢筋的布置：纵向力筋、横向力筋和竖向力筋 纵向力筋的布置：

1.连续配筋：对小跨度的等截面连续梁桥，采用就地灌注施工的，其纵向力筋可按照结构各部位的受力要求进行连续配筋。

2.分段配筋：大跨度变截面预应力梁桥通常采用悬臂施工方法。悬臂伸出施工时，对梁体施加负弯矩筋；在两梁段合龙后（称为体系转换），再张拉正弯矩筋和其它力筋。

3.逐段加长力筋：由于力筋供料长度、施工方法和结构受力等方面的原因，有时需要采用连接器把主筋对接或逐段加长。逐孔施工、顶推法施工的连续梁常用。

4.体外布筋：力筋布置在主梁截面以外的箱内，配以横隔板、转向块等构造，对梁体施加预应力。

5.后连续力筋：对于采用先简支后连续方法施工的预应力混凝土连续梁桥，后连续采用预应力筋布置，必须先预留张拉槽孔和预埋管道，待连续部分的混凝土浇筑完毕后，穿束张拉后连续的力筋，实现整体梁的连续。

五．箱梁的受力特点和简化计算？ 箱梁桥上的恒载一般是对称作用的，它使箱梁发生弯曲，而车辆活载一般是偏心作用，使箱梁发生扭转。另外，风力，列车横向摇摆力，支座高程的误差以及基础不均匀沉降等也会使箱梁发生扭转。对曲线桥，即便是对称作用的荷载，也会导致箱梁扭转，因此，结构所受到的外力可综合表示一偏心作用的荷载.简化计算1 经验估值法 2用修正偏心压力法求活载内力增加系数 经验估值法：对于箱型具有一定厚度且有横隔板加劲的箱型梁，忽略歪扭变形的畸变应力：将活载偏心作用引起的约束扭转正应力和扭转坚应力分别估计为活载对称作用下平面弯曲正应力的15%和剪应力的5% 用修正偏心压力法求活载内力增大系数：鉴于箱梁截面横向刚度和抗扭刚度大，则荷载作用下梁发生变形时可以认为横截面保持原来形状不变，即箱梁各个腹板的扰度也呈线性规律。因此通常可以将箱梁腹板近似看做等截面的梁，先按修正偏压法求活载偏心作用下边腹板的荷载分配系数，再乘以腹板总数，这样就可以得到箱梁截面活载内力的增大系数。六．拱桥的分类

1、按行车道位置分：上乘式、中乘式、下乘式

2、按结构体系分（承重结构受力图式分）：简单体系拱桥、组合体系拱桥、刚架系杆拱桥

受力特点：简单体系拱桥：桥面系是局部受力与传力结构，不考虑与主拱联合受力

组合体系拱桥：主拱与梁等构件共同受力，对主拱的受力要求相对降低

刚架系杆拱桥：采用预应力钢绞线作为拉杆来平衡拱的推力，拉杆不参与桥面系受力，桥面系为局部受力构件

3、按主拱的截面形式分：板拱、肋拱、双曲拱、箱拱

七．拱桥高程：桥面高程、拱顶地面高程、起拱线高程和基础底面高程。

拱桥桥面的高程的确定：一方面由两岸线路的纵断面来控制，另一方面还要保证桥下净空能满足泄洪或同行的要求。

起拱线高程：为了尽量较小桥墩基础底面的弯矩，节省墩台圬工数量，选择低拱脚设计方案。八．为什么说拱桥的主拱的矢跨比是拱轴设计中的主要参数之一？ 拱桥的水平推力与垂直反力之比值，随矢跨比的减小而增大；当矢跨比减小时，拱的推力增大，反之则水平推力减小；无铰拱随矢跨比减小其弹性压缩、温度变化、混凝土收缩及墩台位移产生的附加内力越大；拱的矢跨比过大使拱脚段施工困难；矢跨比对拱桥的外形及周围景观的协调产生影响

九．矢跨比对拱桥受力的影响？ 计算表明，恒载的水平推力与垂直反力之比值，随矢跨比的减小而增大。当矢跨比减小时，拱的推力增大，反之则水平推力减小。推力大，相应地在拱圈内产生的轴向力也大，对拱圈本身的受力状况是有利的，但是对墩台基础不利。同时，当拱圈受力后因其弹性压缩，或因温度变化、混凝土收缩，或因墩台位移等原因，都会在无铰拱的拱圈内产生附加内力，而拱愈坦即矢跨比越小，附加内力越大。十．拉索布置形式：

1.索面数量：单索面、双锁面和多索面。双索面分为双平行索面和双斜索面。

2.拉索在顺桥向布置有辐射形、扇形和竖琴形。

辐射形：拉索倾角大，传递竖向荷载效率高，张力水平分立小，减轻主梁轴向压力。

扇形：索力传递接近于最合理，构造能满足施工要求。

竖琴形：优点：避免拉索之间相互交叉的视觉效应，景观效果好，且对主梁的轴向变形约束刚度大。缺点：竖向传力效果比较差。

3.拉索布置按间距分类：密索和稀索。

密索体系：拉索布置密集，可以改善主梁受力条件，索力较小，锚固方便。

稀索体系：主梁无索跨度大，弯矩大，要求主梁截面大，自重也大，索的拉力大，锚固困难。

十一．斜拉索的组成：钢索、两端的锚具、减震装置和保护措施。十二．悬索桥：由主缆、加劲梁、塔柱和锚定组成。悬索桥的结构体系根据加劲肋的构造分为：单跨、三跨简支和三跨连续。

悬索桥的分类：自锚式悬索桥、带斜拉索的悬索桥、斜拉-悬索混合的悬索桥。

悬索桥与其他桥式相比，为什么跨度大，优势体现在哪里？

1材料用量和截面设计方面。其他桥型的承重构件的截面面积，随着跨度增加而增加，致使材料用量大。而大跨度悬索桥加劲梁不是主要承重构件，面积不需要随跨度增大而增大。

2构件设计方面：许多构件截面积的增大时容易受到客观制约的，但悬索桥的主缆、锚定和塔这三项主要承重构件在扩充其截面积或承载能力方面遇到的困难比较小。3主缆具有非常合理的受力形式。对于拉压构件，应力在截面上得分布比较均匀，对受弯杆件，在弹性范围内应力分布呈三角形。就充分发挥材料的承载能力来说，拉压的受力方式较受弯合理，而受压构件需要考虑稳定性问题。由于主缆瘦啦，截面设计较容易，因此悬索桥跨度是最大的。（为什么悬索桥的跨度最大？）

4在施工方面。主缆先架好，而主缆可以有细小钢丝集合而成，使得建造大跨度桥梁使用的大直径缆索能够通过小型安装完成。主缆完成后就是一个现成的悬吊式脚手架。虽然要采取措施防御大风，但同其他桥比起来风险也较小。净跨径: 对于梁桥是指设计洪水位上相邻两个桥墩或桥墩与桥台之间的净距离；对于拱桥是指两拱脚截面最低点之间的水平距离。计算跨径: 对于有支座的桥梁，是指桥跨结构相邻两个支座中心的距离，用表示;对于拱桥,是指相邻两拱脚截面形心点之间的水平距离 3 桥梁全长: 指桥梁两端两个桥台的侧墙或八字墙后端点之间的距离，对于无桥台的桥梁为桥面系行车道的全长.4 设计洪水位: 桥梁设计中按规定的设计洪水频率计算所得的高水位 5 荷载折减系数：计算结构受力时，考虑活荷载标准值不可能全部布满和各构件受载后的传递效果不同，对荷载进行折减的系数。分为横向折减系数和纵向折减系数。6 偶然作用：是指在结构使用期间出现的概率很小，一旦出现，其值很大且持续时间很短的作用。永久作用：是指在结构使用期间，其量值不随时间而变化或其变化值与平均值比较可忽略不计的作用。可变作用：是指在结构使用期间，其量值随时间变化，且其变化值与平均值比较不可忽略的作用。9 荷载横向分布影响线：指表径桥路上车辆、人群荷载沿横桥上对主梁分配的荷载程度的系数 矢跨比：指拱桥中拱圈（或拱肋）的计算矢高与计算跨径之比（），亦称拱矢度，它是反映拱桥受力特性的一个重要指标 合理拱轴线：能使拱的各个截面弯矩为零的拱轴线。五点重合法：求悬链线拱的拱轴系数时，要求拱圈的五个关键控制截面，即拱顶，两拱脚和两个四分点达到压力线和拱轴线必须重合，从而使各拱圈截面不产生过大的弯矩峰值，这种设计方法称为五点重合法。净矢高：指从拱顶截面下缘至相邻两拱脚截面下缘最低点连线的垂直距离，以表示。标准跨径: 对于梁桥，是指两相邻桥墩中心线之间的距离，或桥墩中心线至桥台台背前缘之间的距离；对于拱桥，则是指净跨径，用表示 连拱作用 ：支承在有限刚度桥墩上德连续多孔拱桥，在拱圈受力时，各孔拱圈桥墩变形相互影响的作用 预拱度：为了平衡桥梁使用时的上部结构和施工时支架的各变形值，在桥梁浇筑时预先施加的一个上拱值。17 简单体系拱桥是有推力拱，拱的水平推力直接由墩台或基础承受，主拱圈是桥跨结构的主要承重构件 拱桥的联合作用是指当活载作用于桥跨结构时，拱上建筑参与主拱圈共同承受活载的作用 桥梁的建筑高度是指桥面与桥跨结构最低边缘的高差

20总跨径是计算跨径之和 作用效应是指永久作用、可变作用、偶然作用等桥梁作用于桥梁上引起其结构外加变形或约束变形 22 建筑高度：指桥上行车路面（或轨顶）标高至桥跨结构最下缘之间的距离。桥下净空高度：指设计洪水位或通航水位至桥跨结构最下缘之间的距离。桥梁高度：指桥面与低水位之间的高差或为桥面与桥下线路路面之间的高差 容许建筑高度：公路（或铁路）定线中所确定的桥面（或轨顶）标高，对通航净空顶部标高之差，又称为容许建筑高度。最不利荷载组合：对于桥梁结构可能同时存在的荷载，使其产生最不利效应时的荷载组合。拱轴系数：是指拱脚的恒载集度和拱顶恒载集度的比值 作用效应组合：对结构上可能同时出现的作用，按照产生最不利效应时进行的组合。

简答题 梁式桥按承重结构的静力体系的分类和特点？

分为简支梁桥、悬臂梁桥、、连续梁桥、T形钢构桥及连续-钢构桥。简支梁桥受力简单梁中只有正弯矩，体系温变、张拉预应力等均不会在梁中产生附加内力，设计计算方便，最易设计成各种标准跨径的装配式结构。将简支梁桥梁体加长，并越过支点就成为悬臂梁桥。将简支梁梁体在支点上连接形成连续梁，连续梁受温度变化及混凝土收缩等影响产生的纵向位移也就较大，使伸缩缝及活动支座的构造复杂化。T形刚构是一种墩梁固结、具有悬臂受力特点的梁式桥。连续钢构桥是预应力混凝土大跨梁式桥的主要桥型之一，它综合了连续梁和T形钢构桥的受力特点，将主梁做成连续梁体，与薄壁桥墩固结而成。主拱圈高度如何拟定？

答：根据跨径大小、荷载等级、主拱圈材料规格等条件决定 选择拱轴线的原则？常用的拱轴线型有哪些？什么是合理拱轴线？ 答：选择拱轴线的原则是尽可能降低由于荷载产生的弯矩值，充分利用圬工材料抗压性能。常用的拱轴线型有圆弧线、抛物线和悬链线。合理拱轴线是拱桥上拱圈截面只受轴向压力而无弯矩作用的拱轴线。“五点重合法”如何确定空腹式悬链线拱的拱轴线和拱轴系数？

答：五点重合法：使悬链线拱轴线接近其恒载压力线，即要求拱轴线在全拱有5点（拱顶、拱脚和1/4点）与其三铰拱恒载压力线重合。6 简支梁桥的设计计算应包括哪些内容？

答：有受弯构件正截面承载力计算、受弯构件斜截面承载力计算、裂缝宽度计算、挠度计算。简述“全预应力混凝土梁”和“部分预应力混凝土梁”各自的优缺点？ 答：全预应力是在全部荷载最不利组合作用下，正截面上混凝土不出现拉应力。部分预应力是在全部荷载最不利组合作用下构，构件正截面上混凝土允许出现裂缝，但裂缝宽度不超过规定容许值。悬臂梁桥和连续梁桥为什么比简支梁桥具有更大的跨越能力？它们的主要配筋特点是什么？

答：这主要是由于悬臂体系梁桥和连续体系梁桥存在支点负弯矩，所以，其跨中弯矩比相同跨径相同荷载的简支梁桥的跨中弯矩显著减小。同时，由于跨中弯矩的减小可以减小跨度内主梁的高度，从而降低钢筋混凝土用量和结构自重，而这本身又导致了恒载内力的减小，所以它们具有更大的跨越能力。由于负弯矩的存在，它们主要的配筋特点是在支点附近需要配置承受负弯矩的力筋，在跨中附近需要配置承受正弯矩的力筋。悬索桥的基本组成、构造类型、结构体系和受力特点？

答：其主要结构由主缆、桥塔、锚碇、吊索、加劲梁等组成，构造类型组合体系桥型，结构体系为利用主缆和吊索作为加劲梁的悬挂体系，受力特点是在吊索的悬吊下，加劲梁相当于多个弹性支承连续梁，弯矩显著减小；悬索桥的活载和恒载通过吊索和索夹传递至主缆，再通过鞍座传至桥塔顶，经桥塔传递到下部的桥墩和基础；主缆除承受活载和加劲梁的恒载外，还分担一部分横向风荷载并将它直接传到塔顶。什么叫矮塔部分斜拉桥，它有什么特点？

答：1，埃塔部分斜拉桥由于拉索不能提供，足够的支承刚度，故要求主梁的刚度较大。因拉索只提供部分刚度，所以命名其为部分斜拉桥。

2，特点：塔较矮；梁的无索区较长，没有端锚索；边跨与主跨比值较大，一般大于0.5；梁高较大；受力一梁为主，索为辅；斜拉锁的应力变幅较小，可按体外预应力索布置。连续梁桥中通常布置三向预应力筋，他们分别和什么内力相对应？

答：纵向预应力抵抗纵向受弯和部分受剪，竖向预应力抵抗受剪，横向预应力抵抗横向受弯 斜拉桥的基本组成、构造类型、结构体系和受力特点？

答：斜拉桥由斜索、塔柱、主梁三部分组成，是一种桥面体系受压，支承体系受拉的多次超静定结构。从塔柱上伸出并悬吊起主梁的高强度钢索起着主梁弹性支承的作用，从而大大减小梁内弯矩，使梁截面尺寸减小，减轻了主梁的重量，加大了桥的跨越能力。在这三者中，塔柱以承压为主有时还要承受较大弯矩，主梁受弯也受轴向压力或拉力。为什么大跨度连续梁桥沿纵向一般设计成变高度的形式？

答：

1、大跨度连续梁桥恒载内力占得比重比较大，选用变高度梁可以大大减少跨中区段因恒载产生的内力；

2、变高度梁符合内力分布规律；

3、采用悬臂法施工时，变高度梁又与施工的内力状态相吻合；

4、从美学观点出发，变高度梁比较有韵律感，特别是位于城市中的桥梁 变高度连续体系梁桥箱梁的梁高应如何拟定？

答：在不受截面设计中建筑高度限制的影响的前提下，连续箱梁的梁高宜采用变高度的，其底曲线可采用二次抛物线、折线和介于两者之间的1.5-1.8次抛物线形式，具体的选用形式应按照各截面上下缘受力均匀、容易布束确定。根据已建成桥梁资料分析，支点截面的梁高H支约为（1/16—1/20）L(L为中间跨跨长)，跨中梁高H中约为（1/1.6—

1、2.5）H支。在具体设计中，还要根据边跨与中跨比例、荷载等因素通过几个方案的比较确定。什么是拱上建筑？实腹式和空腹式拱上建筑的组成？

答：由于主拱圈是曲线型，一般情况下车辆无法直接在弧面上行驶，所以在行车道系与主拱圈之间需要有传递荷载的构件和填充物。这些主拱圈以上的行车道系和传载构件或填充物统称为拱上建筑。

实腹式拱上建筑由拱腔填料、侧墙、护拱和桥面系等部分组成，一般适用于小跨径拱桥。空腹式拱上建筑最大的特点在于具有腹孔和腹孔墩。腹孔有拱式腹孔、梁(板)式腹孔两种形式。腹孔跨径不宜过大，腹孔的构造应统一。

桥梁纵断面的设计的主要内容有哪些项？

答:桥梁纵断面设计包括确定桥梁的总跨径,桥梁的分孔,桥道的标高,桥上和桥头引道的纵坡以及基础的埋置深度等。混凝土桥面是由哪些部分组成的？各部分的作用是什么？

答：

1、道床：减弱对桥的冲击；缓和列车的震动；防治枕木移位；将车轮集中荷载分布到梁顶面；调整轨底标高。

2：桥面铺装：防治车道板磨耗；保护主梁免受雨水侵蚀；减缓冲击；分散汽车荷载。

3：防排水系统：使桥面快速排水，防治桥面水渗透到主梁内部；增加结构的耐久性。

4：伸缩缝：使桥面自由伸缩，桥面连续，车辆驶过时平顺，防止雨水和杂物渗入。

5：防撞墙：防治汽车重装桥面护栏，同时作为机动车道和人行道或非机动车道的分隔带 17 桥面的防排水系统有何作用？常用的构造措施和施作方法有哪些？

答：应迅速排除桥面上积水，并使渗水的可能性降至最小限度。城市桥梁排水系统应保证桥下无滴水和结构上无漏水现象 设置桥梁纵坡的原因和目的是什么？

答:为使雨水迅速排除，防止或减少雨水对铺装层的渗透，从而保护了行车道板，延长桥梁使用寿命。桥面铺装、伸缩缝的作用、要求和类型？

答：桥面铺装作用是保护桥梁主体结构，承受车轮的直接磨损，防止主梁遭受雨水的侵蚀，并能对车辆集中荷载起一定的分布作用。因此，桥面铺装应有一定的强度，防止开裂，并耐磨损。主要类型有普通水泥混凝土、防水混凝土、沥青混凝土。伸缩缝为了保证桥跨结构在气温变化、活载作用、混凝土收缩与徐变等影响下按静力图示自由变形，要求1.能保证结构温度变化所引起的伸缩变形2.车辆驶过时应能平顺、不打滑、无突跳、过大的噪声与振动3.具有安全排水防水的构造防止雨水侵蚀、垃圾及泥土的阻塞对伸缩缝本身以及对桥面以下支座和其他结构的损坏、对功能正常发挥作用。类型有充填式伸缩缝、钢板伸缩缝、橡胶伸缩缝、组合伸缩缝。行车道板的定义是什么？其作用是什么？

答：定义：行车道板是直接承受轮压的混凝土板，它与主梁梁肋和横隔梁联结在一起的结构板。作用：承力、传力、连接。画图表示出温度降低时拱弹性中心处的水平力。P302 23 画出系杆拱桥简图，指明系杆位置所在，简述其作用。拱桥如何处理不等跨分孔问题 ?

1、采用不同的矢跨比：矢跨比与推力大小成反比

2、采用不同的拱脚标高

3、调整拱上建筑的重力

4、采用不同类型的拱跨结构：小跨采用板拱，大跨采用肋拱或中承式拱 拱桥的优缺点（P19和P229）优点：

（1）在竖直荷载的作用下所产生的水平反力，使得与同跨径、同截面的梁相比，拱的弯矩和挠度及剪力要小得多

（2）拱桥的跨越能力很大，外形美观 缺点

(1)

主拱在合拢之前不是拱结构，需要借助其他辅助措施，施工难度大

(2)

拱脚水平推力较大，下部结构的工程数量也相应增加，对地基条件要求较高(3)

拱以受压为主，稳定性能问题突出 拱桥与梁桥相比在受力性能上有哪三点差异？

竖向荷载作用下，支承处存在水平推力，且全拱均匀相等

由于水平推力使拱桥截面弯矩比同截面的梁桥小

主拱主要承受弯压内力 拱桥的主要设计标高有哪四个？

拱桥的设计标高主要有四个：桥面标高、拱顶底面标高、起拱线标高和基础底面标高 29 拱轴线的型式与拱上建筑的布置一般有哪四点关系？ 小跨径实腹式拱桥采用圆弧线拱轴线

小跨径空腹式拱桥采用悬链线拱轴线

大、中跨径可采用空腹式近似悬链线拱轴线

轻型拱桥或全透空的大跨径拱桥可采用抛物线拱轴线

拱桥如何处理不等跨分孔问题？

1、采用不同的矢跨比：矢跨比与推力大小成反比

2、采用不同的拱脚标高

3、调整拱上建筑的重力

4、采用不同类型的拱跨结构：小跨采用板拱，大跨采用肋拱或中承式拱 分析题

一

预应力混凝土连续梁梁桥活载内力计算的方法？

答：1.按空间结构计算活载内力 按空间结构计算连续梁桥活载内力的方法有：

(1)按最不利布载计算各主梁(肋)的荷载横向分布系数，按平面杆系结构计算绘制该主梁(肋)的纵桥向内力影响线；

(2)将荷载乘以荷载横向分布系数，沿桥梁纵向按最不利位置分别将荷载加至影响线正负效应区，即可求得绝对值最大的正负活载内力。2.按平面杆系结构计算活载内力 计算方法与空间结构类同，只是无需计算横向分布系数。二 预应力混凝土连续刚构梁桥的主梁截面和预应力筋布置特点？ 答：

1、由于刚构桥的主梁除了在跨中部分承受正弯矩外，在支点附近还要抵抗较大的负弯矩，因此在进行截面设计时往往要加强截面底部的混凝土受压区。常用形式有带马蹄形的T形截面，箱型截面，适用于中等跨径及大跨径的桥梁。为了适应向支点处逐渐增大的负弯矩，梁高及梁底均可相应地加大。

2、带挂梁刚构桥的悬臂部分只承受负弯矩，因此将预应力筋布置在梁肋顶部和桥面板内，以获得最大的作用力臂，预应力筋分直筋和弯筋两类，直筋的一部分在接缝处端面上锚固，一部分直通至悬臂端部锚固在牛腿端面上。肋内的弯筋则随着施工的推进逐渐下弯而倾斜锚固在各安装块件(或现浇段)上。为了使位于梁肋外承托内的力筋也能下弯锚固，通常还要使它们在平面内也作适当弯曲。下弯的力筋能增加梁体的抗剪能力。在大跨径桥梁中还可在肋内设置专门的竖向预应力筋来增强梁肋的抗剪作用。

对于带铰刚构桥，悬臂部分也可能出现正负异号的弯矩，在此情况下梁的底部也应布置适当的纵向预应力筋。

三

如何用等代荷载、内力影响线计算拱桥的活载内力？ 答：

1、计算集中力荷载：

①首先画出计算截面的弯矩影响线、水平推力和支座竖向反力影响线；

②根据弯矩影响线确定集中力荷载最不利（最大、最小）的加载位置；

③以荷载值乘以相应位置的影响线坐标，求得最大弯矩（最小弯矩）及相应的水平推力和支座竖向反力。

2、计算均布力：

①下图是某等截面悬链线无铰拱桥左拱脚处的弯矩及水平推力和支座竖向反力影响线，首先将均布荷载布置在影响线的正弯矩区段。

②根据设计荷载和正弯矩区影响线的长度，可由《拱桥》手册的均布荷载表查得最大正弯矩的等代荷载及相应水平推力和竖向反力的均布荷载和，及相应的面积。

③再以分别乘以最大正弯矩及相应水平推力和竖向反力的面积，即可求得拱脚截面的内力。最大正弯矩：

与相应水平推力：

与相应竖向反力：

式中：─—为荷载横向分布系数；—为车道折减系数；

则与相应的拱脚截面的轴向力为：

同理，再将荷载布置在影响线的负弯矩区段，可求得最大负弯矩及相应水平推力﹑竖向反力和拱脚截面的轴向力。

④其它相应截面的轴向力和剪力分别按式下两式计算。

拱顶：

轴向力：

拱脚：

其它截面：

拱顶：

数值很小，一般不计算

剪 力：

拱脚：

其它截面：

数值较小，一般不计算

《公路圬工桥涵设计规范》(JTG D61-2005)第5.1.1条中规定，计算由汽车荷载产生的拱的各截面正弯矩时，拱顶至拱跨1/4点应乘以折减系数0.7，拱脚应乘0.9，拱跨1/4点至拱脚，用直线插入法确定。

四

实腹式悬链线拱的拱轴线和拱轴系数如何确定（含拱轴系数公式推导）？

答：定拱轴线一般采用无矩法，即认为主拱圈截面仅承受轴向压力而无弯矩。

拱轴系数的确定：拱轴系数：，拱顶恒载分布集度为 ：

（4-20）

拱脚恒载分布集度为：

（4-21）

式中： ─—分别为拱顶填料、拱圈材料及拱腹填料的容重；

─—为拱顶填料厚度，一般为300～500mm；

─—为主拱圈厚度；

─—为拱脚处拱轴线的水平倾角； 由几何关系有

（4-22）

由以上各式可以看出，尽管只有

为未知数，其余均为已知，但仍不能直接算出。所以，在具体计算值时可采用试算法确定。具体做法如下：

①先根据拱的跨径和矢高假设，再由《拱桥》附录表（Ⅲ）-20查得拱脚处的值；

②将值代入式（4-21）计算出后，再与一同代入式（4-11），即可求得值。

③再与假设的值比较，如两者相