第一篇：《园艺植物组织培养实验》教学大纲
《园艺植物组织培养实验》教学大纲
课程编号：131010418s 适用专业：园艺专业 学时数：9 学分数：0.5 执笔者：董华芳
编写日期：2006年8月
一、课程的性质和目的
《园艺植物组织培养实验》园艺专业的必修课程，本课程任务是教授植物组织培养基本实验技术及基础理论，并培养学生运用所学知识和实验方法进行实验研究的能力，为学生以后从事相关工作或研究打下坚实基础。
二、课程的教学内容要求及学时分配
实验一 玻璃器皿、用具和器械的洗涤和灭菌（1学时）
内容要求：
学会正确洗涤玻璃器皿、用具，使之达到实验的要求；学会正确使用高压灭菌锅，并对玻璃器皿、用具和器械的进行正确的灭菌。
教学要求：
掌握洗涤实验用具和高压灭菌的正确方法。实验报告的要求：
写出洗涤实验用品的步骤和正确使用高压灭菌的方法。
实验二 母液的配制（2学时）
内容要求：
学会使用1/10000精度的分析天平和电子天平。
学会正确配置贮备液，包括药品的溶解、混药的顺序。教学要求：
掌握贮备液的配置方法。实验报告的要求：
写出配置贮备液的正确步骤并说明此实验应该注意的问题
实验三 培养基的配制（2学时）
内容要求：
学会熬制培养基。
学会正确分装培养基及封口培养瓶。
培养基的正确灭菌。教学要求：
通过培养基的正确配置及灭菌，使我们对培养基的成分与性质更加清楚，从而更好的利用它。
实验报告的要求：
（1）写出配置培养基的正确步骤
（2）试比较培养基的灭菌和玻璃器皿的灭菌有什么不同。
实验四 植物茎尖快速繁殖技术（4学时）
内容要求：
要求学生掌握植物快速繁殖的程序和操作方法，包括外植体的消毒、接种、继代培养及污染原因的分析及控制方法。教学要求：
掌握茎尖剥离技术。实验报告的要求： 写出植物快速繁殖的程序和操作方法，包括外植体的消毒、接种、继代培养及污染原因的分析及控制方法。
三、课程成绩的考核办法
实验成绩是由实验指导教师依据学生在实验中的表现，实验完成情况以及撰写实验报告情况等综合评定。每次实验成绩评定等级依次为：A、B、C、D等。
四、参考教材
1.《园艺植物离体培养学》，陈振光主编，中国农业出版社，1996年 2.《园艺植物组织培养实验指导书》，姜玲编, 1992年
第二篇：园艺植物栽培学教学大纲
《园艺植物栽培学》理论课程教学大纲
课程名称： 园艺植物栽培学
课程类型: 专业基础课 总 学 时： 45 学
分： 3 适用对象: 园艺专业 先修课程：植物学
一、课程性质、目的和任务
园艺植物栽培学是园艺学的分支之一，主要研究园艺植物的栽培管理技术，是园艺生产的主要理论基础。园艺植物栽培学着重阐述园艺植物栽培的基本原理，包括生长发育规律、园艺植物的繁殖、种植园的规划设计和种植制度、栽培技术运用等原理。通过对本课程的学习，能够掌握园艺品种资源的地理分布和栽培的适宜环境条件，能进行种植园的规划设计，能掌握园艺植物的栽培管理技术等，胜任农业科教、技术推广等部门工作。
二、教学基本要求
了解园艺生产产业（园艺业）的内涵及其在现代农业中的地位和作用，园艺植物资源的分类、分布及利用，掌握园艺植物的生长发育规律及其对环境条件的需求，通晓种植园的规划设计及施工，能建立适应当地条件的种植制度，通晓园艺植物栽培技术，并完整地掌握好某一类园艺植物的栽培技术。
三、课程的重点和难点
教学重点：园艺植物的生长发育规律，特别是以花、果和种子为最终产品的园艺植物的成花和座果机理；环境条件对园艺植物的影响；园艺植物的土肥水管理，特别是无土栽培、有机栽培和节水栽培植物的土肥水管理；园艺植物株形的培养与维护，特别是多年生植物的整形与修剪；设施栽培技术的应用等。
教学难点：园艺植物的生长发育规律，特别是以花、果和种子为最终产品的园艺植物的成花和座果机理；提高园艺植物产量、品质和栽培效益的关键栽培技术的综合运用和优化。
四、教学内容、要求及学时分配
1．绪论（共4学时）
1.1园艺业发展简史和现状 了解 0.5 1.2园艺植物栽培的重要意义 了解 0.5 1.3园艺业发展前景和当前的几个热点 理解 0.5 1.4园艺植物资源和分类 掌握 2 1.5观赏园艺植物（含草坪草）的分类 掌握 0.5 2．园艺植物的生长发育（共12学时）2.1营养生长 理解 4 2.2生殖生长 掌握 4 2.3生长发育与环境条件 理解 2 2.4器官生长相关性 理解 1 2.5生长发育周期 掌握 1
3．园艺植物种植园的规划设计和种植制度（共2学时）3.1种植园规划设计 了解 0.5 3.2种植制度 理解 0.5 3.3园艺生产计划的制定和实施 了解 0.5 3.4园艺生产技术档案的建立和利用 了解 0.5 4．园艺植物的繁殖（共10学时）4.1育苗场地的条件与规划 了解 0.5 4.2种子繁殖 理解 2 4.3嫁接繁殖 掌握 4 4.4扦插繁殖 掌握 1 4.5压条繁殖 掌握 1 4.6分生繁殖 掌握 1 4.7组织培养及无病毒种苗繁殖 了解 0.5 5．园艺植物的定植（共2学时）5.1定植时期 掌握 0.5 5.2定植密度和定植方式 理解 0.5 5.3定植前种苗的准备和整地 理解 0.5 5.4定植与定植后管理 理解 0.5 6．种植园的土肥水管理（共2学时）6.1土壤耕作方法 掌握 0.5 6.2土壤改良及消毒 掌握 0.5 6.3营养和施肥 掌握 0.5 6.4灌溉、排水和节水栽培 掌握 0.5 7．园艺植物的植株管理（共6学时）7.1植株生长控制的目的和意义 理解 0.5 7.2果树与观赏树木的修剪技术 掌握 2 7.3果树与观赏树木的树形 掌握 2 7.4果树修剪的实施 掌握 0.5 7.5草本植物的植株调整技术 掌握 0.5 7.6植物的观赏应用与造型 掌握 0.5 8．园艺植物产品器官管理（共4学时）8.1根用类园艺产品器官管理 掌握 0.5 8.2茎、叶用类园艺产品器官管理 掌握 0.5 8.3花类园艺产品器官管理 掌握 0.5 8.4果实类园艺植物产品器官管理 掌握 0.5 9．园艺产品的采收及采后管理（共2学时）9.1园艺产品的采收、分级、包装 掌握 1 9.2贮藏原理与贮藏方法 了解 0.5 9.4其他采后处理措施、运输、切花了解 掌握0.5 3 10.课程总结复习（共1学时）
五、考核方式
期末闭卷考试，考试范围与分数比例如下：（1）绪论 2%（2）种类与分布 4%（3）生长发育 30%（4）规划设计和种植制度 4%（5）繁殖 30%（6）定植 2%（7）土肥水管理 4%（8）植株管理20%（9）产品器官管理 2%（10）采收及采后管理 2%
六、推荐教材和教学参考书（黑体，小4号字）
1．教材：
李光晨，范双喜主编《园艺植物栽培学——面向21世纪课程教材》,中国农业大学出版社，2007，第2版
2．参考资料：
（1）郗荣庭主编，果树栽培学总论，农业出版社，1999，第3版（2）浙江农业大学主编，蔬菜栽培学总论，农业出版社，1984，第2 版（3）刘海涛主编，花卉栽培基础，广东人民出版社，2001，第1版
大纲制订人：王晓琴 制订日期：2009-9-1
第三篇：植物组织培养论文
植物组织培养的发展及其应用
刘兆书、王梦瑶、王瑞雄、尹树明、左通通
（石河子大学，生命科学学院，新疆石河子，832000）
摘要:植物组织培养作为一种有效的技术手段已被广泛应用于生产实践的各个领域。本文从植物组织培养技术的发展，总结了植物组织培养的发展历史及发展现状，重点介绍了组织培养技术在育种和脱毒快繁方面的应用，为今后植物组织培养的进一步发展和应用打下基础。
关键词：植物组织培养；发展；快繁；脱毒；育种
德国的植物生理学家Haberlandt提出细胞全能性理论以后，在无数科学家的努力下，植物组织培养经过近百年的发展历程后，该技术日趋完善和成熟，得到了广泛的应用。随着科学技术的不断发展，研究领域的不断拓展与深入，植物组织培养技术的应用也越发的广泛。育种方面的应用非常广泛，已经形成了一门理论和技术；在工厂化育苗方面，产生巨大的经济及社会价值;同时植物组织培养技术的发展也促进设施农业、食品、工业、医药业等领域发展，现就植物组织培养技术的发展和应用作简单总结。
1、植物组织培养的发展
1.1植物组织培养的发展历史
1838-1839年，德国的植物学家T.Schleidon和动物学家T.Schwann提出细胞学说。1902年德国的植物学家Haberlandt提出:高等植物的器官和组织，具有植物细胞全能性。1904年Harming在无机盐和蔗糖溶液中对萝卜和辣根菜的胚进行培养，发现离体胚可以发育成熟，并提前萌发成小苗。1937年White发现了B族维生素，建立了第一个由已知化合物组成的培养基，该培养基被定名为White培养基。同时法国的Gautherer和Nobecourt也发现了B族维生素的重要性，三个人被誉为植物组织培养学科的奠基人。1952年Morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得脱毒植株。1953-1954年Muir利用震荡培养和机械方法获得了万寿菊和烟草的单细胞，实施了看护培养，使单细胞培养获得了成功。1957年Skoog和Miller提出生长素和细胞分裂素控制器官形成。1958年英国学者Steward通过体细胞胚胎发生途径获得了人工体细胞胚，这一实验证实了Haberlandt的细胞全能性理论。到20世纪60年代组织培养进入快速发展阶段，在基础理论、实际操作方面不断取得进展，比如在植物体细胞杂交、单倍体育种、种质资源保存、快速育苗、人工种子制造、次生代谢物生产等方面取得了可喜的成果。
1.2植物组织培养发展现状
1.2.1国内的研究发展现状 我国的组织培养与国外相比起步相对较晚，但发展却比较快。20世纪70年代我国掀起了单倍体育种的高潮，在作物育种上取得了一些实用性的成果。据不完全统计，目前我国用花药或花粉育出的植物已超过22科52属160种。目前我国组培已经进入了生产阶段，实现了花卉、果树、蔬菜等100多个品种的工厂化生产。花卉出口年创汇达800多万美元。
1.2.2国外植物组织培养的研究发展现状 国外的组培发展的比较快，20世纪70年代在美国形成了兰花产业。80年代后，以商品为目的的组培苗生产量以20%-30%的速度递增，年产组培苗在10万株以上的植物微繁殖公司约占50%，年产量大于50万株的公司约占25%，整个西欧年产组培苗达2亿多株。
2、工厂化植物快繁及脱毒方面的应用
组织培养技术有几乎不受地理环境和季节的限制、遗传背景一致、生长周期短、成本低等诸多优点。同时，结合茎尖培养方法可以去除植物病毒、使植物复壮、提高质量和产量，所以，离体快繁和植物脱毒是目前植物组织培养应用最广泛的一个方面，尤其在兰花、名贵树种、马铃薯、草毒等无性繁殖为主的植物显的更是尤为重要。据估计，目前全球有关生物技术产业的年交易额约为1 500亿美元，其中50%一60%与农业有关。植物组培苗的贸易额约占总额的10%，即150亿美元，并以每年15%速度递增。
在我国，离体快繁育苗技术的开发应用起步于20世纪80年代初。如华乐种苗有限公司，年生产能力在500万株以上兰花克隆苗，主要出口日本、美国、荷兰、德国等，北京杉友兰业生物科技有限公司，年生产能力为350万株兰花克隆苗，连云港振兴恒巨生物科技有限公司，年生产蝴蝶兰克隆苗3 000万株，产品远销欧洲、美洲、亚洲等十多个国家和地区。据不完全统计植物快繁涉及观赏植物、蔬菜、果树、药材等300种以上，其中观赏园艺植物约200种，约占60%。在脱毒方面，如通过脱毒的马铃薯、甘蔗、甘薯、大蒜、草毒、香蕉平均可以增产30%以上，兰花、水仙、康乃馨、大丽花通过脱毒后植株生长势强、花色艳丽、花朵大、产量高。
3、在植物育种上的应用
植物组织培养技术对培育优良作物品种开辟了全新的途径。目前，国内外已把植物组织培养普遍应用于作物育种，并在单倍体育种、胚胎育种、细胞融合育种、细胞突变育种、基因工程育种等方面取得了较大进展。3.1单倍体培养育种
通过对植物的花药、花粉、未受精的子房或胚珠进行组织培养获得单倍体(其中以花药和花粉培养应用最为广泛)，单倍体在培养过程中利用秋水仙素处理，可使染色体加倍，成为纯合二倍体植株，这种培养技术在育种上的应用称为单倍体育种。研究表明，常规育种一般需要8-10 天或更长的时间，而通过单倍体进行育种一般仅需要4-5 天的时间，单倍体育种具有程序简单、育种周期短、基因型一次纯合等优点，单倍体育种是常规育种程序和方法的重大改革，尤其在林业等生长周期长的物种中效果更为显著。因此，单倍体育种在国际上引起了很大的重视，各国纷纷开展单倍体育种方面的研究工作。3.2胚胎培养育种
植物的胚(包括成熟胚和幼胚)、胚珠、子房和胚乳的离体培养技术统称为胚胎培养，其应用领域主要包括胚胎发育机理、克服杂交不亲合、胚胎拯救、克服自交不亲和、克服珠心胚的干扰、打破种子体眠、获得体细胞胚和人工种子等方面，因此在农作物、园艺作物、林木和药用植物上有着广泛应用。
在克服杂交不亲合、克服自交不亲和方面主要通过植物离体受精来实现，在广义上通过离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉、离体精细胞和卵细胞融合等均称做植物离体受精。但严格意义上的离体受精或试管受精是20世纪90年代精、卵离体融合成功。该技术不仅可以克服植物授粉不亲和问题，还可以进行胚胎、种子和果实发育机理等基础研究。人工分离的精细胞和卵细胞融合后进行合子胚培养，已在玉米、药用牡丹、婴粟、烟草等植物上获得成功。植物离体受精技术是植物细胞工程中的重要实验技术，为研究植物胚胎发育机理提供了新的实验系统，为开发新的植物转基因途径提供了可能。
胚培养在打破种子体眠应用较为广泛，种子体眠的原因很多，利用组织培养方式打破种子体眠一般有种胚发育不全或种子含抑制物抑制种胚发芽2种情况，如胚乳发育尚不完全的兰科种子可以通过组织培养的方式获得再生植棵，而莺尾属、蔷薇科、野麦等植物可以通过组织培养的方式打破抑制物对种子发芽的影响。另外，胚培养还可以应用于胚胎拯救。
胚乳培养的主要目的是获得具有利用价值的三倍体植株，再经过染色体加倍获得六倍体，从而育出多倍体新品种。目前有40多种植物的胚乳培养达到了不同程度的细胞分化或器官分化，不少植物已获得了再生植株。我国在马铃薯、小麦、水稻、苹果、桃、称猴桃等多种植物上得到了胚乳再生植株。同时，胚乳培养产生的混倍体，可用于染色体工程方面的研究。3.3细胞融合培养育种
细胞融合所使用的材料一般是指利用除去植物细胞壁的裸露细胞即原生质体，通过原生质体融合，可克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍，为广泛重组遗传物质开辟了新途径。同时，因去壁后的原生质体消除了核酶等对外源DN A的破坏，为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条伴。另外，在有些没有有性生殖能力或其有性生殖能力很低(如香蕉、木薯、马铃薯、甘蔗等)的植物作物改良中，体细胞杂交具有不可取代的重要性。通过大量的研究认为叶肉组织分离的原生质体较好，遗传性较为一致。在原生质体融合方面主要有物理(如电融合)、化学(如高PIE高钙、聚乙二醇)、生物(如仙台病毒)等融合方式。3.4细胞突变体育种
在研究中发现，通过愈伤组织获得的再生植株中常常出现基因型变异。这是因为无论是愈伤组织还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界环境(如物理因素、化学物质等)的影响而产生诱变。利用这一特点结合人工诱变方法包括物理诱变(Y射线、X射线、电子束、离子束、激光、紫外线等)、化学诱变(甲基磺酸乙醋、秋水仙素、叠氮化钠、平阳霉素、52BU ,EB等)和生物诱变(转座子插入突变、跳跃基因等)获得了一大批植物新品种和新材料。目前，这种方法已筛选出抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的植物突变体。
3.5基因工程育种
通过基因枪或农杆菌进行植物基因工程育种的关键环节之一是建立一个高效的组织培养再生体系。植物遗传转化的理想受体系统应具有高效稳定的再生能力，研究认为用于基因转化的受体系统，应具有80%-90%的再生频率，且每个外植体必须具有能再生的丛生芽，其芽数量越多越好。目前，用于遗传转化的受体主要有二种途径，一是外植体在激素的诱导下产生愈伤组织后再培养成体细胞胚即体细胞胚发生途径，二是诱导外植体产生单极性不定芽后再培养生成完整的再生植株即器官发生途径。目前，与组培技术结合的转基因的方法主要有农杆菌介导和基因枪两种方法。
参考文献：
[1]郝玉华.我国植物组织培养的发展现状与前景展望[J].江苏农业科学，2008（4）:20-23.[2]盛玉婷.植物组织培养技术及应用进展[J].安徽农学通报.2008(9):45-47.[3]李永欣,工义强.植物组织培养的应用研究概述[J].江苏林业科技,2005,32(3):44-46.[4]王家麟.植物组织培养及其应用研究概况[J].黑龙江农业科学，2006(3):86-89.[5]陈长征.植物组织培养脱毒快繁实验技术综述[J].安徽农学通报，2010,16（14）:56-58.[6]梁一池,杨华.植物组织培养技术的研究进展[J].福建林学院学报.2002(8):23-26.
第四篇：《园艺植物生物技术》实验教案
实验一 现代生物技术实验室与实验仪器
一、实验目的
实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代分子生物学实验室的规划与布局及常用仪器设备的主要功能的认识，掌握高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等关键仪器的使用方法。
二、实验场所选择及实验内容
园艺学院植物分子生物技术实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要相关仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭菌锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、实验方法与步骤
1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。
2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问。
四、实验注意事项
实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。
五、思考题
1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。
2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？实验二 质粒DNA的提取、纯化及检测
一、实验目的
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取时最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例介绍质粒的抽提过程，应掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
二、实验原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
三、主要仪器及试材
含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液及离心机、移液枪、离心管及质粒DNA提取有关试剂。
液氮、及DNA提取有关试剂。
四、实验方法与步骤
（一）试剂配制:
1、LB培养基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分装至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高压灭菌15min，室温贮存。
2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。
3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后-20℃保存。
4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。
5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配制。
7、溶液III:醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（视冰醋酸情况，也可按6:3:1配制），贮存于4℃。
8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
9、苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。
10、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
12、溴化乙锭（EB）：10mg/ml
13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装贮存于-20℃。14、6×loading buffer（上样缓冲液）:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖与三角烧瓶中，加100ml 1×TBE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TBE），即可上样。
（二）实验步骤
1、取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB固体培养基上划线37℃过夜培养。
2、用无菌牙签或枪头挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床-250r/min过夜培养。
3、吸取1.5ml菌液，12000g离心1min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净。
4、加入200ul预冷的溶液I，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底混匀沉淀或碎块）。
5、加入400ul新配置的溶液II，轻柔颠倒混匀（不可剧烈震荡），并将离心管置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
6、加入300ul预冷的溶液III，温和颠倒混匀，见白色絮状沉淀，置于冰上3-5min，使杂质充分沉淀（溶液III为中和液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀）。
7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇或2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g ×15min。
8、倒尽上清，加75%乙醇浸洗沉淀除盐1-2次，4℃离心 10000g×10min，弃上清，将沉淀在室温或超净工作台上风干。
9、将沉淀溶于40ul 灭菌超纯水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存备用。
10、取制备的质粒DNA 1-2ul，加适当loading buffer混匀上样，1%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳1h进行检测。
五、实验注意事项
1、实验中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物质，操作时应注意防护，尽量减少台面污染。
2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。
3、质粒电泳检测一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。
六、思考题
简述质粒DAN提取的步骤。
实验三 PCR技术
一、实验目的
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。通过本实验应掌握PCR原理，学习PCR操作过程。
二、实验原理
PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在环境下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
三、主要仪器及试材
含有外源cDNA片段的质粒或转基因苹果、番茄叶片总DNA；外源基因的特异引物及PCR仪与相关试剂。
四、实验方法与步骤
1、调整模板浓度至5ng/ul。
2、按下列体系配制反应混合液，混匀，离心5秒（注意加1滴矿物油覆盖PCR管）。
Template DNA
2ul（20ng）10×buffer
2.0ul MgCl2（25mM）
1.5ul Primer F（10uM）
0.2ul Primer R（10uM）
0.2ul dNTPs（2mM）
2.0ul Taq（5U/ul）
0.2ul Add ddH2O to
20ul
3、PCR反应循环条件设置：
95℃
3min
1cycle 94℃
1min
55℃
1min 72℃
90s
35cycles 72℃
10min
1cycle 4℃
forever
4、检测：加2ul溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15ul反应产物点样电泳
5、在1%琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
五、实验注意事项
1、引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；
2、PCR反应的各种成分不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；
3、根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；
4、注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。
六、思考题
简述PCR技术的原理和步骤。
第五篇：《园艺植物生物技术》实验教案
《园艺植物生物技术》实验教案
实验一 现代生物技术实验室与实验仪器
一、实验目的
实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代分子生物学实验室的规划与布局及常用仪器设备的主要功能的认识，掌握高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等关键仪器的使用方法。
二、实验场所选择及实验内容
园艺学院植物分子生物技术实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要相关仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭菌锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、实验方法与步骤
1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。
2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问。
四、实验注意事项
实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。
五、思考题
1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。
2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？
实验二 植物组织培养
一、实验目的
植物组织培养是现代生物技术研究的重要技术手段，在原生质体融合、病毒脱除、离体快繁及遗传转化等领域发挥着不可替代的作用。胡萝卜以其培养体系成熟、再生容易而被视为组织培养的理想外植体材料，本实验通过胡萝卜的组织培养使同学们掌握基本培养基的配制、灭菌及培养的基本技能。
二、实验原理
基于1902年德国科学家哈勃兰特（Haberlandt）提出植物细胞的全能性理论，即指已分化的细胞仍然具有分化发育成新个体的潜能。在适宜的培养条件下，植物的细胞、组织或器官都具备再生成完整植物的能力。
三、主要仪器及试材
仪器：pH计、微波炉、高压灭菌锅、超净工作台、培养室、三角瓶、封口膜、无菌滤纸、手术刀片、镊子、酒精灯、记号笔等
试材：新鲜胡萝卜，培养基配制所需相关试剂
四、实验方法与步骤
（一）培养基母液的配制（小规模实验应按比例减少，避免造成很大的浪费）：
1、大量元素(10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。
KNO
395 g NH4NO3
82.5 g KH2PO
48.5 g MgSO4•7H2O
18.5 g CaCl2•2H2O
22.0 g 注意事项：
（1）配置母液前要仔细清洗存储容器
（2）应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；（3）溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；
（4）夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成；
（5）沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的浑浊型沉淀，所以配置时一定不要急；二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。
2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)温水依次加入下列药品，每加一种药品后搅拌溶解，最后定容到1L：
KI
0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O
0.86 g NaMoO4*2H2O
0.025 g CuSO4*5H2O
0.0025 g CoCl2*6H2O
0.0025 g
MnSO4*4H2O
2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。配制过程中产生沉淀的原因有：1.前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2.蒸馏水pH 值过高，可加几滴盐酸校正。
3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：
甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L
4、铁盐的配制（100倍液）：
称取EDTA 3.73 g，FeSO4·7H2O 2.78 g，分别溶解后混合定容到1L，放入棕色细口瓶中，室温放置10 h以上（防止结晶沉淀），然后放入4℃冰箱。
5、维生素B的配制（100倍液）：
VB组分 VB1(盐酸硫氨素)VB6(盐酸吡哆素)VB5(烟
酸)
改良MT 1g 1g 0.5g
MS 10 mg 50 mg 50 mg 分别称取顺序溶解在温热的蒸馏水中，定容到1L。
注: 需要溶解完一个再加另一个；VB5不易溶解，需要搅拌，必要时可以加热。
6、Vc的配制（100倍液）：
称取Vc 0.5g 溶解在蒸馏水中，定容到1L即可。
7、其它溶液配制：
BA，NAA，IBA，GA3等激素类试剂可先用少量1N NaOH彻底溶解，再加水定容。配好后室温放置一段时间，再放入冰箱中冷藏保存。有些试剂在乙醇或盐酸中也可溶解，但比较而言，用碱溶解比较稳定，不易产生沉淀。
注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一部分到小的细口瓶中，在制作培养基时使用。这样不容易产生沉淀。
（二）培养基配制
母液配好后，按以下体种（或质量）量取，最后用蒸馏水定溶到1L,调节pH至5.8，用塑料烧杯放入微波炉中充分溶解后分装灭菌。
大量元素(10倍液)
ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)
ml 铁盐（100倍）
ml 维生素B（100倍）ml Vc（100倍）
ml 蔗糖
g 琼脂
7.5 g
（三）接种与培养
在超净台上接种后，用记号笔做好标签，放置到光照培养室中进行培养。
五、实验注意事项
1、实验中涉及到酒精及砷汞等危险品，注意人身安全的环境安全，废液不要随意乱倒。
2、外植体消毒及接种操作要规范，注意超净台的卫生，养成良好的实验习惯。
六、实验结果处理
一星期后，统计污染率，并对未污染材料的生长状况进行观察，并分析产生污染的可能原因。
七、思考题
影响植物组织培养的因素有哪些？
主要参考文献
1.张娅，曾君祉，周志勇，陈毓荃，黄华樑。胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立。植物学通报,2005，22:37-42。
2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。实验三 植物DNA的提取、纯化及检测
一、实验目的
DNA 提取是开展分子生物学的重要前提之一，高质量的DNA直接关系到分子标记、基因克隆、图谱构建及功能基因组研究等工作的成败。通过本实验应了解常用DNA提取方法的原理和技术，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA检测技术，为将来从事园艺植物生物技术研究奠定基础。
二、实验原理
植物的遗传物质是DNA，植物细胞内含有丰富的遗传物质。在机械研磨、高温和去污剂的共同作用下，植物细胞破裂，DNA从细胞核释放到提取缓冲液中。经蛋白质强变性剂处理结合离心，除去蛋白质和色素等杂质，再用乙醇沉淀便可获得高纯度的DNA。
DNA电泳是依据DNA带负电荷，而不同浓度的琼脂糖凝胶孔径大小不同，在外加电场的作用下DNA由负极向正极移动，分子量小的移动快而分子量大的移动慢，最终达到不同分子量大小的DNA分离的目的。
三、主要仪器及试材
水浴锅、离心机、移液枪、研钵、离心管、核酸电泳系统等；新鲜健康植物叶片，液氮、及DNA提取有关试剂。
四、实验方法与步骤 1.药品的配制: CTAB提取液：
(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少许(1)加到(2)中，搅拌成糊状,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解备用。使用前要在65℃温浴一会儿，然后加入1-4%巯基乙醇，混均匀。苯酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）：
重蒸酚65℃水浴溶解，在烧杯中加入80ml温热的蒸馏水，加入少许8-羟基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：异戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力搅拌器上搅拌1.5 h左右至停止搅拌后很快分层，然后装入棕色瓶中，4℃冰箱中储存备用。2.DNA的粗提
在装有叶片的离心管中加入石英砂少许（约0.07克），用尖头玻棒将材料研细后加入600 ul CTAB提取液，再继续研磨一会儿使其悬浮均匀，然后在65℃水浴锅中温浴60分钟，隔15分钟取出上下轻轻颠倒几次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下晃动10分钟以上，其间置于37℃水浴锅中温浴一会（冬季），使之充分混匀，然后10000-12000 rpm离心5-10分钟，吸取上清液转至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰冻无水乙醇1 ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA，然后8000-10000 rpm离心5分钟，弃上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，8000 rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。3.DNA的纯化：
向风干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分钟至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小时，然后加入700 µl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管约10分钟，至充分混匀，10000-12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入700 µl氯仿：异戊醇（24：1），颠倒10分钟（方法同上），10000 –12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入60 µl 5M NaCl，再加入1 ml冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒，然后在-20℃冰箱中置30分钟沉淀DNA，8000-10000 rpm离心2-3分钟，使DNA分散状紧贴在管壁上，弃酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小时后换一次，后浸泡过夜，8000 rpm离心3分钟后弃酒精，风干，加50-100 µl TE充分溶解备用。
4、DNA检测
（1）取DNA原液15 µl稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高质量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7 （3）向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR I至4-5 U/µg DNA，37℃消化过夜，用0.5×TBE，0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。 五、实验注意事项 1、实验中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危险或有毒物质，操作时要戴手套，并在专门区域操作。 2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。 六、思考题 简述DAN提取的步骤及主要试剂的作用。 主要参考文献 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。实验四 质粒DNA的提取、纯化及检测 一、实验目的 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取时最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例介绍质粒的抽提过程，应掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 二、实验原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 三、主要仪器及试材 含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液及离心机、移液枪、离心管及质粒DNA提取有关试剂。 液氮、及DNA提取有关试剂。 四、实验方法与步骤 （一）试剂配制: 1、LB培养基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分装至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高压灭菌15min，室温贮存。 2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。 3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后-20℃保存。 4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。 5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。 6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配制。 7、溶液III:醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（视冰醋酸情况，也可按6:3:1配制），贮存于4℃。 8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。 9、苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。 10、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。 12、溴化乙锭（EB）：10mg/ml 13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装贮存于-20℃。14、6×loading buffer（上样缓冲液）:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖与三角烧瓶中，加100ml 1×TBE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TBE），即可上样。 （二）实验步骤 1、取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB固体培养基上划线37℃过夜培养。 2、用无菌牙签或枪头挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床-250r/min过夜培养。 3、吸取1.5ml菌液，12000g离心1min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净。 4、加入200ul预冷的溶液I，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底混匀沉淀或碎块）。 5、加入400ul新配置的溶液II，轻柔颠倒混匀（不可剧烈震荡），并将离心管置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 6、加入300ul预冷的溶液III，温和颠倒混匀，见白色絮状沉淀，置于冰上3-5min，使杂质充分沉淀（溶液III为中和液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀）。 7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇或2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g ×15min。 8、倒尽上清，加75%乙醇浸洗沉淀除盐1-2次，4℃离心 10000g×10min，弃上清，将沉淀在室温或超净工作台上风干。 9、将沉淀溶于40ul 灭菌超纯水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存备用。 10、取制备的质粒DNA 1-2ul，加适当loading buffer混匀上样，1%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳1h进行检测。 五、实验注意事项 1、实验中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物质，操作时应注意防护，尽量减少台面污染。 2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。 3、质粒电泳检测一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 六、思考题 简述质粒DAN提取的步骤。 主要参考文献 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。 实验五 PCR技术 一、实验目的 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。通过本实验应掌握PCR原理，学习PCR操作过程。 二、实验原理 PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在环境下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。 三、主要仪器及试材 含有外源cDNA片段的质粒或转基因苹果、番茄叶片总DNA；外源基因的特异引物及PCR仪与相关试剂。 四、实验方法与步骤 1、调整模板浓度至5ng/ul。 2、按下列体系配制反应混合液，混匀，离心5秒（注意加1滴矿物油覆盖PCR管）。 Template DNA 2ul（20ng）10×buffer 2.0ul MgCl2（25mM） 1.5ul Primer F（10uM） 0.2ul Primer R（10uM） 0.2ul dNTPs（2mM） 2.0ul Taq（5U/ul） 0.2ul Add ddH2O to 20ul 3、PCR反应循环条件设置： 95℃ 3min 1cycle 94℃ 1min 55℃ 1min 72℃ 90s 35cycles 72℃ 10min 1cycle 4℃ forever 4、检测：加2ul溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15ul反应产物点样电泳 5、在1%琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。 五、实验注意事项 1、引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次； 2、PCR反应的各种成分不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作； 3、根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件； 4、注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。 六、思考题 简述PCR技术的原理和步骤。 主要参考文献 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料 实验六 PCR产物的TA克隆 一、实验目的 采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果树上常用的分子克隆方法。相对于粘性末端来说，克隆具有平末端的双链PCR产物效率较低。目前，有两种方法可以采用，一种是在特异引物设计时引入酶切位点，另一种是TA克隆。通过本实验应掌握PCR产物TA克隆的原理，学习PCR产物纯化及回收，以及PCR产物与TA克隆载体的连接。 二、实验原理 TA克隆是利用耐热聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端转移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校准活性，即在PCR产物的两个3’末端加上未配对的单一A凸出尾，质粒载体提供线性3’末端单一的T凸出尾，使该载体能够直接与PCR产物高效连接。TA克隆技术比其它PCR克隆方法有更高的重组效率。 三、主要仪器及试材 PCR扩增产物、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Promega公司）、pMD18-T载体（TaKaRa公司）以及感受态大肠杆菌、高速冷冻离心机、移液枪、琼脂糖凝胶电泳等相关仪器及试剂。 四、实验方法与步骤 1、PCR扩增片段纯化回收 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒收集PCR扩增产物，具体操作步骤参考试剂盒说明书进行。 2、连接反应 反应体系组成 pMD18-T 0.5-1.0 ul PCR fragment 1.0-4.5 ul ddH2O 0-3.0 ul Ligation Solution I 5.0 ul 混合后，置于室温下放置数小时或过夜连接。 3、重组子转化（热激法） 1）在含适当浓度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上； 2）冰上冷冻新灭菌的1.5 ml 离心管； 3）取出感受态大肠杆菌，冰上放置冻融； 4）取新灭菌的1.5 ml 离心管，加入50 ul感受态细胞和10 ul连接反应液，用移液枪轻轻吸打均匀，在冰上放置30 min； 5）热激：将离心管在42 ℃下水浴90秒钟。请勿摇动离心管； 6）冰镇：快速将离心管转移至冰浴，1-2分钟； 7）复苏：每管加400 ul液体LB培养基，在37 ℃摇床温和摇动45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均匀涂布于“1）”已制备好的LB平板上； 9）培养：在37 ℃下倒置培养12-16 h，即可观察到蓝白相间的菌落。白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色是载体自连的转化子。转化子可以在4 ℃下保持1个月； 10）单菌落培养：用灭菌的牙签，挑选白色的单菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液体LB培养基的50 ml离心管中，在37 ℃摇床上培养过夜（12-16 h）。 4、质粒DNA的分离 参考有关文献。 5、检测 采用相同的引物对进行PCR再扩增，或质粒上根据插入片段两端的酶切位点而进行限制性酶切，通过电泳可以检测出片段是否克隆成功。 五、实验注意事项 1、连接温度不宜太高，连接温度过高（>28℃）可使背景增加，使重组克隆菌减少。降低连接温度可以提高白斑率； 2、热激过程注意勿摇动离心管。 六、思考题 简述PCR产物TA克隆的原理和步骤。 主要参考文献 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料。
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