第一篇：与耐药机制有关药敏试验的规范化.精讲
与耐药机制有关药敏试验的规范化
与耐药机制有关的药敏试验的规范化操作。
前言，细菌耐药已成为一个全球性的问题，已对人类健康构成严重的威胁。耐药细菌感染导致病人住院时间延长、费用增加、死亡率增高，同时也给临床医生抗感染治疗带来困难。因此，检测细菌耐药机制是当今细菌学的一个重要课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。
在细菌耐药机制检测方面，包括分子生物学等许多实验方法被广泛运用。但这些方法的技术要求普遍较高，大多数被用于基础研究。真正应用到临床微生物实验室的试验方法，要求操作简便、重复性好，结果准确、可靠，试验成本不能太高。
我国卫生部于1998年规定：我国药敏试验暂按CLSI历年颁布的所有微生物药敏试验文件作为部颁标准，此决定至今未改变。本节所讲内容，主要是CLSI（M100-S22）文件推荐的临床微生物实验室常规检测方法。也是我们从事临床微生物检验技术人员必须掌握的内容。
包括两个内容，第一个就是革兰阳性球菌耐药机制的实验室检测项目。第二个内容是革兰氏阴性发酵细菌以及其他细菌的耐药机制。
首先介绍青霉素酶的检测。检测青霉素酶的方法有碘量法、酸量法和显色头孢菌素法等，临床应用较多的是显色头孢菌素法。其原理是将受菌株与头孢硝噻吩作用一段时间后，如受试菌株产生青霉素酶，则可水解头孢硝噻吩的 β-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。头孢硝噻吩法是目前检测嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌属产生 β-内酰胺酶的最好方法，具有快速、灵敏和简便的特点，但价格相对较昂贵。
方法，检测时用1滴无菌水将Nitrocefin纸片湿润，将受试菌直接涂抹于湿润后的Nitrocefin纸片上，即可观察颜色的反应，产生红色者为产酶阳性。质控菌株，阴性株为金黄色葡萄球菌ATCC25923；阳性株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。注意事项，目前实验室多采用BD公司生产的非头孢硝噻吩显色头孢菌素纸片，这个纸片进行 β-内酰胺酶测试，效果稍好于头孢硝噻吩，可降低金黄色葡萄球菌阳性结果的反应时间。
葡萄球菌可诱导 β —内酰胺酶的检测。这项内容呢是 CLSIM100 — S21。方法，如果青霉素对葡萄球菌的MIC值小于等于0.12每毫升微克的时候 或者抑菌环直径大于等于 29毫米 的时候，应该对其进行可诱导 β-内酰胺酶的检测。将待检菌株传代到血琼脂平板或者是MHA琼脂平板上，用苯唑西林纸片或者是头孢西丁纸片作为诱导剂，具体方法可参照纸片扩散法药敏试验，大气环境孵育16到18小时后，检测抑菌圈周边细菌的产酶情况。可诱导 β-内酰胺酶检测阳性的菌株，应报告对不耐酶青霉素耐药。质控菌株，阴性株用金黄色葡萄球菌 ATCC25923；阳性株用金黄色葡萄球菌 ATCC29213。
CXIM100 — S22 文件中增加了用10单位青霉素纸片作为诱导剂检测葡萄球菌可诱导 β —内酰胺酶的方法，具体方法同苯唑西林和头孢西丁纸片法。
第二个内容介绍甲氧西林耐药葡萄球菌，也就是MRS检测。检测mecA基因和其表达的青霉素结合蛋白 2a，是预报葡萄球菌对甲氧西林耐药最准确的方法，它也被用于证实从严重感染病人分离的葡萄球菌纸片扩散法药敏试验结果。携带mecA 基因或者是产PBP 2a 的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林耐药。不携带mecA或不产PBP 2a 菌株应报告对苯唑西林敏感。由于罕见的非mecA基因介导的苯唑西林耐药机制，在纸片扩散法确定为苯唑西林耐药时，应加测苯唑西林MIC，若MIC值大于等于4个每毫升微克，即使mecA基因和PBP 2a 检测为阴性，也应报告苯唑西林耐药。可用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。
苯唑西林纸片扩散法筛选试验，方法，使用含1个微克的苯唑西林纸片，而不是甲氧西林或萘夫西林来检测金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。用直接菌落悬液法制备接种物，配成0.5麦氏比浊浓度菌液，接种MH琼脂平板，待琼脂表面的水份干后，贴苯唑西林纸片，于33至35度，大气环境孵育24小时，检测抑菌圈直径。结果判断，按CLSI解释标准判断结果。金黄色葡萄球菌抑菌圈直径小于等于10个毫米为耐药，大于 13毫米 为敏感。质控菌株用金黄色葡萄球菌ATCC25923。
注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；孵育时间不能少于24小时；在透射光下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌圈内有没有细小菌落或者轻微弥漫生长，如果有生长提示苯唑西林耐药；如果金黄色葡萄球菌纸片扩散法结果中，结果为中介时也就是直径在11到 12毫米 时，或者 MIC 为0.5到2个每毫升微克的表皮葡萄球菌以外的其他凝固酶阴性葡萄球菌引起严重感染时，必须进行mecA基因或者是PBP 2a 测定，或者是头孢西丁纸片试验、苯唑西林MIC试验或者是苯唑西林盐琼脂筛选试验，来确定是否为MRS菌株，选择其中一种试验结果进行报告。
苯唑西林盐琼脂筛选试验，试验用的MH琼脂中含苯唑西林每毫升6个微克，并添加有4%的氯化钠，或者是每毫升0.68摩尔。方法，直接菌落悬浮液获得0.5麦氏单位浓度。进行试验时，使用1微升接种环蘸取菌液，在平板上涂成直径10到 15毫米 斑点。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成类似大小斑点或划满四分之一区域。将琼脂平板置33到35度，大气环境孵育24小时后用透射光检查有无细菌生长，任何生长都表示对苯唑西林耐药。注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；为从凝固酶阴性葡萄球菌中检测出甲氧西林耐药菌株，需将琼脂平板孵育48小时。质控菌株，敏感株ATCC29213；耐药株ATCC43300。
头孢西丁纸片法。方法，应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含30微克头孢西丁纸片，33到35度大气环境孵育。金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌孵育16到18小时报告结果，凝固酶阴性葡萄球菌除路邓葡萄球菌以外要孵育24小时，如耐药则在孵育18小时后可报告结果。使用反射光阅读头孢西丁纸片试验结果。结果判读，头孢西丁对金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径小于等于 21毫米 时，应报告对苯唑西林耐药，大于等于 22毫米 应报告对苯唑西林敏感。除路邓葡萄球菌外其他凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径小于等于 24毫米 时，应报告对苯唑西林耐药，大于等于 25毫米 应报告对苯唑西林敏感。注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；检测凝固酶阴性葡萄球菌对苯唑西林的耐药性，头孢西丁纸片试验是首选方法，因为头孢西丁较苯唑西林的敏感性高。
mecA基因及PBP 2a 检测，方法，可采用乳胶凝集或分子生物学等方法进行检测。结果判断，mecA基因或PBP 2a 检测阳性的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林和甲氧西林耐药。不携带mecA基因或不产PBP 2a 菌株应报告对苯唑西林和甲氧西林敏感。质控菌株，mecA阴性用ATCC29213；mecA阳性用ATCC43300。苯唑西林MIC试验方法，可采用琼脂稀释法、肉汤稀释法或Etest等方法进行检测。结果判读，若苯唑西林MIC值大于等于每毫升4个微克，即使mecA基因和PBP 2a 检测为阴性，也应报苯唑西林耐药。可同时用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。注意事项，一，试验温度超过35度不能检测出MRS；二，孵育时间不能少于24小时；三，在透射光下观察琼脂上有无细小菌落或轻微弥漫生长，如果有生长提示苯唑西林耐药。质控菌株，敏感株ATCC29213；耐药株 A TCC43300。
MRS的临床报告，对于甲氧西林耐药的葡萄球菌即 M RS，应报告对所有 β-内酰胺类药物耐药，而不考虑这些药物的体外试验结果是否敏感。因为大多数文献报告了MRS感染对 β-内酰胺类治疗反应差或者没有令人信服的临床数据证实这些药的临床效果。
万古霉素耐药葡萄球菌的筛选试验，一，纸片筛选法；方法，应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含30微克万古霉素纸片，35度加减2度，大气环境孵育24小时。结果判断，CLSI M100-S19中已经取消了万古霉素对葡萄球菌的纸片扩散法判断折点。纸片扩散法只能检测VanA基因型的万古霉素耐药金黄色葡萄球菌，这种菌株无抑菌圈，应确认该菌株的鉴定结果。对未测定万古霉素MIC，而万古霉素抑菌圈直径大于等于 7毫米 的葡萄球菌，不能报告其对万古霉素敏感。
注意事项，纸片扩散法检测万古霉素结果不可靠。纸片扩散法不能区分万古霉素敏感，也就是MIC范围在0.5至2个微克每毫升和万古霉素敏感性减低的菌株，也就是MIC值在4到8每毫升微克。万古霉素耐药金黄色葡萄球菌MIC大于16每毫升微克，在万古霉素纸片周围仅见轻微生长。因此，用含每毫升6个微克万古霉素的BHI 琼脂平板筛选平板，可提高检测万古霉素中介和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的敏感性。
琼脂筛选法，用含每毫升6个微克万古霉素脑心浸液琼脂对耐万古霉素金黄色葡萄球菌进行筛选试验。方法，直接菌落悬液获得0.5 麦氏浊度，使用微量吸管吸取菌液10个微升，点种琼脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，挤去多余的菌液，在平板上涂成直径10 到 15毫米 斑点或在部分区域划线接种，35加减2度，大气环境孵育24小时，观察结果。结果判断，在透射光下仔细观察，如果点种位置出现1个以上菌落，推测菌株对万古霉素敏感性减低。注意事项，用含每毫升6个微克万古霉素BHI琼脂筛选平板，可提高检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的敏感性。但琼脂筛选法不能可靠检测VISA，这是葡萄球菌对万古霉素中介的菌株，MIC值等于4个每毫升微克菌株不生长。质控，敏感株 ATCC29212；耐药株 ATCC51299。
万古霉素MIC确认试验。方法，可采用琼脂或肉汤稀释法或Etest等方法进行检测。结果判断，金黄色葡萄球菌MIC值小于等于每毫升2个微克为敏感，MIC值在4到8每毫升微克为敏感性降低，MIC值大于16每毫升微克为耐药；凝固酶阴性葡萄球菌MIC值小于等于每毫升4个微克为敏感，MIC值在4到16每毫升微克为敏感性降低，MIC值大于等于32每毫升微克为耐药。注意事项，检测到万古霉素MIC值大于等于每毫升8个微克的金黄色葡萄球菌，或者是MIC值大于等于每毫升32微克的凝固酶阴性葡萄球菌，应送参考实验室进一步确认。
诱导性克林霉素耐药试验检测，耐药机制，对大环内酯耐药的葡萄球菌或者是 β-溶血链球菌，可能存在有结构性或者是诱导性对克林霉素的耐药，或者只对大环内酯类耐药。检测方法，诱导克林霉素耐药试验又称“D”抑菌环试验。配养基，用 MH 琼脂，加或不加5%的绵羊血。接种物，直接菌悬液法，相当于0.5麦氏标准浓度。孵育，35度加减2度，大气环境16到18小时。方法，贴红霉素纸片和克林霉素纸片，纸片间距离15至26毫米。结果判断，若靠近红霉素纸片一侧克林霉素的抑菌环出现“截平”现象，也就是称为“D”抑菌环，则菌株存在克林霉素诱导耐药，应报告对“克林霉素耐药”。在报告单中可注明“经诱导克林霉素耐药试验推测此菌株对克林霉素耐药，在某些病人中克林霉素可能仍有效”。若无“截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。
质控菌株，阴性对照，金黄色葡萄球菌 ATCC 25923或者是金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-976。阳性对照，金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-977。
金黄色葡萄球菌，高水平莫匹罗星耐药性检测。纸片扩散法，方法，用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含200微克莫匹罗星纸片，35度加减2度，大气环境孵育24小时。在透射光下仔细观察纸片周围抑菌圈内有无细小菌落或轻微弥漫生长，如果有生长提示莫匹罗星耐药。结果判读，无抑菌圈等于高水平莫匹罗星耐药； 有抑菌圈等于非高水平莫匹罗星耐药。质控菌株，ATCC25923莫匹罗星抑菌圈直径在29至38毫米；ATCC BAA1708无抑菌圈。
肉汤微量稀释法，用调节阳离子M-H肉汤配成单一的莫匹罗星，也就是每毫升256微克试验孔。方法，应用标准的肉汤微量稀释法试验条件进行接种，在35加减2度，大气环境孵育24小时。结果判读，在透射光下进行判读。如果有生长等于高水平莫匹罗星耐药；无生长等于非高水平莫匹罗星耐药。质控菌株ATCC 29213，MIC 值应该在0.06至0.5每毫升微克；ATCC 29212 MIC 值应该在16到128每毫升微克；ATCC BAA1708应该在256每毫升微克生长。解释，尽管CLSI M100-S22中未提供莫匹罗星的折点，但纸片扩散法和MIC筛选试验能识别出莫匹罗星MIC值大于512每毫升微克的菌株即高水平耐药株。
肠球菌对青霉素或者氨苄西林耐药性检测。肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药是因为产生了低亲和力的青霉素结合蛋白，个别菌株是产生 β-内酰胺酶。纸片扩散法药敏试验可准确测定PBP改变的菌株，但对产 β-内酰胺酶的菌株结果不可靠。此类菌株应检测 β-内酰胺酶。
高水平氨基糖苷类耐药肠球菌的检测。方法，用高浓度庆大霉素也就是每片120微克，或者是链霉素每片300微克纸片可以筛选出此类耐药性。结果判断，无抑菌圈为耐药，抑菌圈直径大于等于 10毫米 时表示为非高水平耐药。抑菌圈直径在7到 9毫米 的菌株应使用稀释筛选试验进行检测。对于庆大霉素，稀释法的MIC值大于每毫升500微克即为耐药。对于链霉素，微量肉汤稀释法的MIC值大于每毫升1000微克，琼脂稀释法的MIC值大于每毫升2000微克，即为耐药。
HLAR的临床意义：对高浓度氨基糖苷类敏感，表示氨基糖苷类与作用于细胞壁的抗菌药物联合用药时对该肠球菌菌株将具有协同作用，也是敏感的。对氨基糖苷类高水平耐药，表示当青霉素或糖肽类与一种氨基糖苷类抗生素联合用药时对该肠球菌菌株不会产生协同效果。
万古霉素耐药肠球菌的检测。要想使用纸片扩散法准确检测出耐万古霉素肠球菌，需要将平板孵育满24小时而不是16到18小时,借透射光仔细检查抑菌圈内有无细小菌落或弥漫生长。纸片扩散法结果为中介度也就是在8到 16毫米 时应选MIC值。可采用琼脂稀释法、肉汤稀释法或Etest等方法进行MIC值的检测。
筛选试验，用每毫升6个微克万古霉素的脑心浸液琼脂筛选试验，35加减2度，大气环境孵育24小时，点种位置出现1个以上菌落，推测菌株对万古霉素敏感性减低。
青霉素耐药肺炎链球菌的检测。一，肺炎链球菌的耐药机制，青霉素耐药肺炎链球菌的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白发生改变，改变后使PBP与青霉素的结合力下降，因而导致耐药。
二，纸片扩散法检测。方法，使用含1个微克的苯唑西林纸片而不是青霉素纸片，来检测肺炎链球菌对青霉素的耐药性。培养基用 MH 琼脂加5%绵羊血。接种物，使用绵羊血琼脂平板上过夜生长的菌落制备接种物，采用直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育，35加减2度，在5%二氧化碳环境，孵育20到24小时。结果判读，苯唑西林大于等于 20毫米 对青霉素敏感，苯唑西林小于等于 19毫米 时，应测定青霉素、头孢噻肟、头孢曲松和美罗培南的MIC值。质控菌株用肺炎链球菌 ATCC 49619。
结果报告，当苯唑西林抑菌圈大于等于 20毫米 时可报告肺炎球菌对青霉素敏感，并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林加克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感，而不需要再检测这些药物的敏感性。当苯唑西林的抑菌圈直径小于等于 19毫米 的菌株应当检测青霉素、头孢噻肟或头孢曲松及美罗培南的MIC值，因为抑菌环直径小于等于 19毫米 时，可以发生在青霉素耐药、中介或敏感的某些菌株中，不能仅仅根据苯唑西林的抑菌环直径小于等于 19毫米，就报告对青霉素耐药或中介。
肉汤稀释法检测。方法，用加2%到5%融血马血的调节阳离子M-H肉汤做肺炎链球菌的稀释法药敏试验，35加减2度，大气环境孵育20到24小时，琼脂稀释法应放在二氧化碳环境下孵育。结果判读，一，口服青霉素V，青霉素MIC值小于等于0.06每毫升微克时为敏感，MIC 值大于等于每毫升2个微克为耐药。二，青霉素注射液，脑脊液分离株，青霉素MIC值小于等于0.06每毫升微克为敏感，MIC 值大于等于0.12每毫升微克为耐药。非脑脊液分离株，青霉素MIC值小于等于每毫升2个微克为敏感，MIC值大于等于每毫升8个微克为耐药。质控菌株，肺炎链球菌ATCC 49619。
第二部分，β-内酰胺酶介导的革兰阴性发酵细菌的耐药机制检测。革兰阴性发酵细菌对 β-内酰胺类抗生素的主要耐药机制，一，产生 β-内酰胺酶水解灭活药物；二，细菌外膜通透性下降；三，主动泵出药物。其中产生 β-内酰胺酶是革兰阴性发酵细菌对 β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。
临床上重要的 β-内酰胺酶有以下几种：一，超广谱 β-内酰胺酶，也就是ESB L ；二，头孢菌素酶，也就是AmpC酶；三，碳青霉烯酶，主要包括KPC酶。
超广谱 β-内酰胺酶的检测。CLSI根据PK-PD性能评价和有限的临床资料，首次于2010年1月也就是 CLSI M100-S20文件修订了头孢菌素和氨曲南的解释标准。因此，在使用新修订的解释标准时不需要常规检测ESBL，除非是在使用旧的解释标准或者是为了流行病学调查以及感染控制的目的仍需要检测ESBL。初筛试验，按常规的标准呢纸片扩散法进行操作对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌，如果下列纸片抑菌圈直径，提示菌株可能产生 ESBL。对奇异变形杆菌抑菌圈直径和上述菌有所不同。
按常规的标准肉汤稀释法进行操作。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌判断标准：头孢他啶、氨曲南、头孢曲松或头孢噻肟任何一种药物对的MIC值大于等于每毫升2个微克，头孢泊肟 MIC 值大于每毫升8个微克，提示菌株可能产生 ESBL。奇异变形杆菌判断标准：头孢泊肟、头孢他啶或头孢噻肟MIC值大于每毫升2个微克，提示菌株可能产生ESBL。
双纸片协同法。按照常规的纸片扩散法在MH琼脂上涂布好受试菌，先在琼脂平板中心贴上阿莫西林加克拉维酸纸片，然后在其上下左右贴上头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南纸片，各纸片中心距复合纸片中心距离为20到 30毫米，35加减2度，大气环境孵育16到18小时。结果解释，如周围4个药物纸片，其中任何一个抑菌圈在靠近复合剂纸片一侧的边缘出现扩大或加强，说明该菌株产ESBL。
扩散法质控，ESBL阴性质控用大肠埃希菌ATCC 25922。ESBL阳性质控肺炎克雷伯菌ATCC 700603。
微量肉汤稀释法初筛试验。方法用调节阳离子M-H肉汤，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌选用，头孢他啶每毫升1个微克，氨曲南每毫升1个微克，头孢曲松每毫升1个微克或头孢噻肟每毫升1个微克。奇异变形杆菌选用头孢泊肟每毫升1个微克或头孢他啶每毫升1个微克或头孢噻肟每毫升1个微克。35加减2度，大气环境孵育16到20小时。结果判断如果生长提示菌株产ESBL。注意事项，使用一种以上的药物进行检测可提高检测的敏感性。质控菌株，ATCC 25922不太明显；肺炎克雷伯菌ATCC 700603的生长平等。
ESBL表型确证试验。纸片扩散法，使用每片含30微克的头孢他啶、头孢噻肟和头孢他啶加克拉维酸、头孢噻肟加克拉维酸的复合剂纸片进行试验，当任何一种复合纸片抑菌圈直径大于或等于其单独药敏纸片抑菌圈直径 5毫米，可确认该菌株产ESBL。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922小于等于2个毫米，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，头孢他啶加克拉维酸大于等于 5毫米，头孢噻肟加克拉维酸大于等于 3毫米。
表型确认试验。琼脂稀释法：使用头孢他啶 MIC 范围在0.25到128每毫升微克、头孢他啶加克拉维酸范围在0.25到4，128到4每毫升微克、头孢噻肟和头孢噻肟加克拉维酸进行MIC测试，当与克拉维酸联合用药，MIC小于或等于单独用药药物MIC 3个倍比稀释度，也就是8倍浓度，可确认该菌株产ESBL。
稀释法质控，ESBL阴性质控，大肠埃希菌ATCC25922；ESBL阳性质控，肺炎克雷伯菌ATCC700603。
头孢菌素酶检测，对于头孢菌素酶，CLSI酶目前还没有可供推荐的方法进行检测，也没有相应的判断标准。目前用于头孢菌素酶定性的检测方法很多，主要有以下几种。一，单纸片扩散法；二，双纸片协同法；三，双纸片增效试验；四，三维试验法。
碳青霉烯酶的测定。碳青霉烯酶定义，指所有能水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类 β 内酰胺酶，分别属于Ambler分类A类、B类、D类酶，包括KPC β 内酰胺酶和金属酶。CL SI目前还没有可提供推荐用于临床实验室检测金属酶的方法，但是2009年的CLSI M100-S19文件中增加了对KPC β 内酰胺酶的检测方法，即改良的三维方法，即改良的测序试验。
KPC酶检测。2001年首次报道从肺炎克雷伯中分离到KPC-1，它属于Bush分类法中的Ⅱ类 2f 组，Ambler分子分类中的属于A类,克拉维酸对其活性有抑制作用。KPC β 内酰胺酶目前已有10种亚型，包括KPC-1至KPC-10，他们之间只有个别氨基酸发生了突变。在多个菌属中都有报道。主要为质粒介导，但在阴沟肠杆菌中可由染色体介导。国外报道，产KPC β 内酰胺酶菌株即可表现为对碳氢霉烯类抗生素耐药，也可表现为中介或敏感，并存在接种效应，这就增加了对其识别的难度。
用于KPC酶定性的检测方法主要有以下几种：一，3-氨基苯硼酸双纸片协同及增效试验；二，改良三维试验法；三，分子生物学方法。
纸片筛选法，选用厄他培南、美罗培南，亚胺培南不作为碳青霉烯酶筛选用药物。一，3-氨基苯硼酸双纸片协同及增效试验。方法，将0.5麦氏单位的浓度待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，琼脂稍干后，把含每片600微克的3-氨基苯硼酸纸片贴于MH平板中间，于纸片周围分别贴上含厄他培南和美罗培南纸片，纸片中心距离为 20毫米，置35加减2度，大气环境孵育16到18小时，有协同现象出现为MBL阳性。
改良的Hodge试验。改良 Hodge 试验是碳青霉烯酶表型检测方法，用于检测KPC的敏感性以及特异性均大于90%，但检测其他碳青霉烯酶时，敏感性及特异性变化较大。方法，将0.5麦氏标准浓度的大肠埃希菌ATCC 25922菌液经1:10稀释后涂抹于MH琼脂平板上，待琼脂稍干后，贴一片厄他培南或美罗培南纸片于平板中央，直径为 90毫米平板可贴1张纸片，直径为 150毫米平板可以贴4张，用接种环刮取待检菌沿底物纸片边缘向外划直线接种，每张底物纸片可测试1株待检菌株和2株质控菌株，划线至少20到 25毫米 长，置35加减2度，大气环境孵育16到18小时。出现失状菌苔者为阳性，反之为阴性。
质量控制，每次试验需检测阳性和阴性质控菌株；阳性菌株用肺炎克雷伯菌 ATCC BAA —1705，阴性菌用 ATCC BAA —1706。
根据CLSI于2010年6月也就是M100-S20-U文件首次公布的新的碳青霉烯类解释标准，常规试验不再需要初筛试验和确认试验，为了流行病学调查或感染控制目的测试菌株可使用MHT，但对于MHT阳性菌株不需要更改碳青霉烯类敏感试验结果的解释。
金属 β —内酰胺酶的测定。定义，活性部位带金属离子的酶称为金属 β-内酰胺酶，这类酶不仅能水解碳青霉烯类而且能够水解其他 β —内酰胺类抗生素。巯基化合物对金属 β-内酰胺酶的抑制作用强于EDTA，但其毒性作用较强，因此用EDTA进行检测更安全。
用于金属酶定性的试验方法主要有以下几种：一，EDTA双纸片协同及增效试验；二，三维试验法；三，分子生物学方法。
BLNAR流感嗜血杆菌的检测。定义，BLNAR取字头，意为 β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药。流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药主要机制是产生 β-内酰胺酶，以质粒介导的TEM-1型酶为主，少部分产ROB-1型酶。B LNAR流感嗜血杆菌的耐药机制主要是由于染色体介导的青霉素结合蛋白的改变和外膜蛋白通透性下降所致。
对于这类菌株的检测，常规实验室一般采用氨苄西林和阿莫西林加克拉维酸双纸片结合的方法，如果K-B药敏结果显示氨苄西林和阿莫西林加克拉维酸均耐药，提示该菌可能为BLNAR流感嗜血杆菌菌株。国外学者研究发现，相对于常规检测方法，低浓度含量的氨苄西林和阿莫西林加克拉维酸纸片检测此类菌株，效果可能会更好。B LNAR流感嗜血杆菌被认为对阿莫西林加克拉维酸、氨苄西林加舒巴坦、头孢克罗、头孢他美、头孢尼西、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢孟多、氯碳头孢和哌拉西林加他唑巴坦耐药，即使某些BLNAR菌株对上述药物体外实验显示敏感。
第二篇：体外肿瘤药敏试验方法研究进展
体外肿瘤药敏试验方法研究进展
甘萍
治疗肿瘤的方法主要有3种，包括肿瘤化疗、放疗、手术。其中肿瘤化疗在消灭微小肿瘤转移灶和手术切除后的残留肿瘤细胞治疗中有着手术与放疗无法达到的显著优势，但肿瘤化疗中仍有许多问题：①肿瘤病人个体间对化疗药物敏感性差异大；②肿瘤对化疗药物有耐药性；③化疗药物对许多类型的肿瘤特别是实体瘤的有效率不高；④化疗药物的选择性差，毒性大，杀伤癌细胞的同时也杀伤正常细胞，给病人机体造成较大的损害。对于上述出现各种问题在临床上经验的化疗用药是无法保证肿瘤患者的个体有效性，因此个体化化疗在临床肿瘤化疗中就显得尤为重要。目前公认的较好的方法就是做肿瘤化疗药物敏感性试验(简称肿瘤药敏)，该方法的特点是直接从患者体内获取新鲜的肿瘤组织进行首次培养，由于肿瘤细胞刚刚离体，生物学性状尚未发生大的变化，能较真实地反映整个肿瘤细胞群体的特性及不同供体的个体差异，能够比较确切地代表体内状态，为不同的病人准确筛选敏感的化疗药物,并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药，以提高化疗的靶向性，减少化疗药物的不良反应，降低细胞耐药性，成为肿瘤治疗中迫切需要解决的问题。
目前，预测肿瘤药敏的方法已发展为体内和体外两大系列20多种药敏试验，并不断地朝着简单、快速、敏感、筛选作用方式不同的药物与临床有良好的相关性的方向迈进。而本文针对体外肿瘤药敏试验方法进行综述。人体肿瘤细胞集落测定(HTCA)它是利用肿瘤细胞悬液，置于双层琼脂中培养，通过选择性加入化疗药物培养后，计数细胞繁殖形成的集落数目，再评估肿瘤细胞对该药的敏感性。该法的优点：敏感、直接评价细胞增殖死亡。缺点：用于临床标本检测率低、周期长、集落计数繁琐。放射性标记代谢物前体掺入法(3H-Tdr assay)该法利用氚标记的胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶作为核酸代谢物前体，测定一定时间内放射性标记的代谢物前体掺入的多少来判断药物对细胞增殖活性的抑制作用。该法的优点：操作简便、所需时间短、灵敏度高、重复性好，临床相关性与集落形成法相近，可适用于绝大多数恶性肿瘤。缺点：存在放射性污染，只能用于标记指数>5%的样品，显然无法测出药物对G0期细胞的杀灭作用，而且胸腺嘧啶池的大小也可影响结果，故标记指数的变化不一定系抗癌药所致。此外，同位素的放射性也限制了它的应用。快速荧光分析法(FMCA)它是采用一些特殊的荧光染料(荧光素二乙酸酯)对细胞的特定成分进行染色或标记，或者通过细胞酶使无荧光性的材料分解或换成荧光材料，通过测定荧光强度而测出活细胞数量。活细胞中水解酶可将双醋酸根荧光素水解为荧光素发出荧光，测定荧光的强度可反映培养体系中活细胞的数目。该方法的优点在于：成功率为80%~95%。细胞用量小，半自动的终点测定法利于多种药物不同浓度的检测，尤其对于乳腺癌及易污染的胃肠道癌症的体外药敏成功率高；测定范围宽，细胞数在102～105之间时，荧光强度(F1)与活细胞数都能呈很好的线性关系；荧光分析法毒性低，能重复测定并可区分恶性肿瘤细胞和正常细胞，使临床抗肿瘤药物得以定量监测；荧光分析法重现性好，此法所依赖的水解酶一般比较稳定。缺点是：仪器要求高，且需专业人员操作；由于荧光猝灭现象存在，使测定过程变得复杂。MTT比色法
四甲基偶氮唑盐(methyl-thiazolyl tetrazolium，MTT)可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色的甲臜(formazan)，甲臜的形成量与细胞的活力成正比，用比色法测定甲臜的量以判断药物对肿瘤细胞的杀伤程度。该法特点：①简便；②快捷，1周内可完成；③经济，临床应用广；④测定结果反映了所有的肿瘤细胞(增殖期及静止期)，适用于所有肿瘤类型；⑤与临床相关性好；⑥所需样本量适中(1×105～5×105个细胞/孔)；⑦为肿瘤药敏的常规方法。缺点：甲臜结晶的溶解度差。且检测到的是活细胞，不能区分正常细胞和肿瘤细胞，因此当应用于高度不均一的临床肿瘤组织时，难以准确反映药敏结果；所需细胞数较多，所测数据变异较大(抑制率分析变异系数在23 % ～30 %)，结果不稳定。三磷酸腺苷法(ATP)三磷酸腺苷(ATP)是活细胞代谢的主要能量来源，细胞死亡时，ATP在酶的作用下迅速水解，因此活细胞中ATP含量较死亡细胞含量高，通过测定癌细胞内ATP水平，了解抗癌药物敏感度。优点：重复性好，成功率可达90%~96%。ATP法能体现药物对整个肿瘤细胞群的杀伤作用，试验周期较短，所需细胞数量少、快速、简便，是一种很有前景的体外药敏试验。同时也适用于G0期细胞药敏分析。缺点：测定仪器昂贵(约15万元)、无法排除非癌细胞干扰等。染料排斥法(又名：区别染色细胞法differential staining cytotoxicity assay, DISC)该法利用快绿使短期培养(4 d)的死细胞着色，同时加入鸭红细胞作为内计数标准，以药物处理组与对照组残存肿瘤细胞的比值作为评价药物敏感性的指标，以残存肿瘤细胞小于50 %作为体外敏感的界限。该法最大优点：所需时间短(5 d)，易被临床所接受。另外，细胞用量少，有利于悬浮细胞存活率的测定。缺点：细胞计数繁琐，有些淡染细胞不易区分死活，染色时间要求准确，稍长则活细胞也染色，故敏感性较差。胶原凝胶液滴植入培养法(collagen dropletem bedded drug sensitivity test, CD-DST)本法是将癌细胞包埋于人工的细胞外基质即胶原凝胶滴中进行三维立体培养，使其在接近人体生理状态的环境中对抗癌药物的敏感性进行定量分析。该法优点：所需样本量小，癌细胞培养成功率高、药敏试验结果准确、可以除去混入的成纤维细胞的影响及可反映患者对不同抗肿瘤药物敏感性的差异，对抗肿瘤药物的体外筛选和对个体化治疗具有实际应用价值。缺点：该法价格较贵，目前仅在日本广泛应用。流式细胞仪法
其原理：利用流式细胞术检测发生细胞凋亡的细胞数以及逃脱凋亡细胞中DNA损伤的程度。该法通过检测出细胞经药物作用后良好线性的剂量-效应关系，可以测得药物的协同作用，被认为能用于白血病和淋巴瘤的药敏试验中。优点：该法迅速简便，所需细胞数较少。缺点：仪器昂贵，技术要求较高，使其临床应用受到一定限制，临床应用报道不多。细胞凋亡法(TUNEL)
其原理为化疗药物对卵巢癌细胞的作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的，通过计数细胞凋亡数目，判断肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度。邱潮林等用细胞凋亡法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)和MTT法在体外对白血病细胞株细胞、肝癌腹水中肿瘤细胞及实体瘤中分离出的肿瘤细胞对8种化疗药物的敏感性进行了检测。TUNEL和MTT法对白血病细胞株所测得的结果高度一致；对肝癌腹水中肿瘤细胞的药敏两法所得结果基本一致，而对实体瘤中分离出的肿瘤细胞同时用两法检测药敏的实验结果有较大差异，统计分析表明TUNEL优于MTT法。提示在细胞高度均一时(如白血病细胞株细胞)，TUNEL和MTT法均可准确反映药敏情况，而随着所分离的肿瘤细胞纯度降低，MTT法难以准确反映药敏实验结果。表明TUNEL法由于可直接在荧光显微镜下观察发生凋亡的肿瘤细胞，所以可减少混杂的组织细胞对结果的干扰。嗜银蛋白染色法
核仁组织区嗜银染色技术(silver-staining nucleolar organizer regions, AgNOR)，多用于肿瘤病理学的诊断和研究，但近年来，已有应用AgNOR研究肿瘤细胞对抗癌药物敏感性的预测。AgNOR是通过形态学方法来反映细胞增殖活跃情况，化疗药物的作用机制是通过多种途径作用于恶性肿瘤细胞，最终达到抑制癌细胞分裂增殖的目的，所以对抗癌药物敏感的肿瘤细胞AgNOR颗粒数应减少。AgNOR所得结果与MTT法所得结果得符合率为89%。张丽萍等应用人肺腺癌细胞(human lung adenocarcinoma cells, SPC-A1)等3株人体肿瘤细胞株，以MTT法及嗜银蛋白染色法，对长春新碱等6种化疗药物的敏感性进行了研究。结果发现两种方法有良好的符合率，且后一种方法经济、简便，可排除非肿瘤细胞的干扰，弥补了前一方法之不足。乳酸脱氢酶检测
抗癌药物与肿瘤细胞作用后，可使肿瘤细胞死亡溶解，细胞溶解以后，将释放一些释放物可使患者造成外周血中乳酸脱氢酶明显增高，所以乳酸脱氢酶可作为肿瘤化疗敏感指标。丘仑兴等用集落形成试验、MTT吸收光度法和乳酸脱氢酶测定3种方法检测5种常用抗肿瘤药物：多柔比星、氟尿嘧啶、丝裂霉素、长春新碱和甲氨蝶呤对人宫颈癌HeLa细胞系的细胞毒作用。显示3种方法的检测结果有良好的相关性，均以多柔比星和丝裂霉素最有效。在这3种方法中，以集落形成试验最敏感；MTT法成功率高，适用于临床选择有效的化疗药物；而用药后乳酸脱氢酶值的升高则是化疗有效的可靠指标。端粒酶活性法
端粒酶是目前已知的最为广谱的恶性肿瘤分子标志物，几乎在各种人类恶性肿瘤中均有不同程度的表达，而在正常细胞中基本无表达，Kim等创立了聚合酶链反应-端粒酶重复扩增法，能在大量正常细胞中探及1～10个恶性肿瘤细胞的端粒酶活性，并证实了恶性肿瘤细胞在一定数量范围内与端粒酶活性呈线性关系。据上述事实可以设想，可通过检测恶性肿瘤细胞体外经抗癌药物治疗后残留的端粒酶活性，作为判断肿瘤药敏的新的指标。
1999年，Faraon首先用聚合酶链反应-端粒重复扩增法测定50例恶性肿瘤标本对抗癌药的体外敏感试验，证实此方法有较高的敏感性和重复性，由于只能检测出恶性肿瘤细胞活性，故从理论角度来说较大地提高了测定结果的准确性。但需长时间聚丙烯凝胶电泳，放射自显影后进行扫描的方式分析显示扩增的6 bp梯度条带，故定量困难、检测时间长、需要同位素。目前改良的聚合酶链反应-端粒重复扩增-酶联免疫吸附(PCR-TRAP-ELISA)法测定肿瘤药敏可克服这些缺点，简称此方法为端粒酶活性法。翟晓波等提出端粒酶活性法敏感度远高于MTT法。优点：可以区分正常细胞和肿瘤细胞；灵敏度极高，可以检测出1～10个肿瘤细胞；可以应用于穿刺、活检标本,适应临床需要。缺点：成本高，技术要求高，结果不稳定(PCR扩增容易出现假阳性)，目前报道较少，缺乏大量临床验证。TECIA法
本法由江苏先声药物研究院首创，采用体外肿瘤组织块培养，通过分析给药前和给药后肿瘤组织面积的改变，获得多种单药或联合用药的肿瘤生长抑制率，从而为临床确定用药方案提供参考依据，TECIA法是在最接近在体状态的体外药敏试验。国内学者报道，与传统的单细胞培养MTT肿瘤药敏试验法相比，TECIA法具有简单易行、标本需量少、成功率和临床符合率高的优点。总蛋白染色法(sulforhodamine B potein stain assay，SRB法)SRB是一种蛋白质染料，可与经三氯乙酸固定后的细胞蛋白的碱性氨基酸作用而显粉红色，在515nm的吸收读数与细胞数呈良好的线性关系。1990年由Philup Skehan创立此法，随后即被美国癌症研究所列为常规抗肿瘤药物的筛选方法；1997年Papaazisis对此稍作改动，使其变异系数小，线性增强。有研究认为该法比MTT法更灵敏(每孔仅150个细胞)，培养时间更短。慧星试验(comet assay)Ostling利用DNA的碱基对可被强碱破坏，DNA的损坏表现为电泳条带的不连续性的原理于1984年建立该方法，被广泛应用于基因毒理学。本法快速、敏感，血液学肿瘤成功率为85%，固体肿瘤的成功率为60%，但不适用于破坏DNA的药物。二甲氧唑黄比色法(XTT colorimetric assay, XTT)
MTT法形成的甲臜产物不溶于水，为使其溶解所加的有机溶剂因具有挥发性，可对实验者及设备产生损害。Paull等在1988年合成出可产生水溶性甲的化合物XTT。XTT是一种与MTT类似的四氮唑衍生物，操作方法基本相同，不同的是加XTT的同时，需加电子耦合剂酚嗪硫酸甲酯，这样才能产生足够的水溶性甲物质，并且要现配现用。
吴楠等采用XTT体外细胞增殖和药敏检测，所得出的细胞生长曲线与MTT法结果相似，实验结果显示XTT产生的甲臜物质高于MTT，并且实验时间短，步骤简便，认为XTT法优于MTT法。细胞团法
经机械的和酶消化后的细胞团仍能保留其体内主要结构和某些功能，在一定的条件下具有与其体内相近的增殖特征。当化疗药物暴露于瘤细胞团块培养后48 h，通过检测细胞的形态学来反映药物敏感性。三维立体组织培养法(histoculture drug response assay, HDRA)
由Hoffman在1991年建立。该方法的基本原理是将肿瘤以组织块的形式在体外培养并加入化疗药物，观察组织块对不同化疗药物的敏感性。此方法的建立基于以下观点：单层的平面生长不利于细胞形态的展现，影响了细胞结构的完整性；结构完整性的丧失，又影响了瘤细胞的一些特异性表达；体外药敏试验缺乏体内的代谢环境；缺乏体内瘤细胞之间的相互联系。因此，将单层细胞培养改为组织块或多细胞球体培养，能够保持实体瘤在体内的三维生长方式、组织结构、细胞异质性等多种特性，模拟体内实体瘤内细胞的环境，会更加接近体内组织情况，与临床实际情况更为接近。
较早是采用3H-thymidine渗入法，现多采用MTT法观察组织块对化疗药物的敏感度。并引入计算机图像分析技术，形成组织块培养-终点染色-计算机图像分析法(tissue culture-end point staining-computer image analysis, TECIA)，进一步简化了实验步骤。优点：操作简便；成本低；可以模拟体内实体瘤环境；非常适用于临床应用。缺点：不同肿瘤细胞的选择性培养有困难。极端耐药试验(extreme drug resistance assay, EDR assay)
肿瘤药敏试验结果的阳性预测值往往远低于其预测耐药的准确性，通过体外药敏试验辨别不敏感的化疗药物，可以减少不必要的毒性反应、避免耐药性的产生。EDR assay是将肿瘤细胞植入软琼脂中培养，并长时间暴露于高浓度的化疗药物[血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)为体内的5～80倍]。通过与阴性对照组比较，计算出个体的肿瘤细胞抑制百分率(percentage cell inhibition, PCI)。基于既往的耐药性检测结果，得出各化疗药物人群PCI的中位数(M)和标准差(SD)。按个体肿瘤细胞的PCI>M、PCI介于M与M-1SD之间和PCI 体外培养的活肿瘤细胞贴壁生长，受药物作用后凋亡或死细胞由于细胞挛缩、细胞膜完整性破坏而从培养基上脱落。基于上述原理，Precision Therapeutics公司于1996年开发出用于预测肿瘤化疗敏感度的Chem oFx assay。该试验通过将组织块在体外原代培养后获得足够数量的肿瘤细胞，经胰蛋白酶作用后，将特定数量的肿瘤细胞种入微孔板中培育，细胞贴壁生长。加入6种不同浓度的化疗药物作用一定的时间后，经冲洗、固定，移去死亡、不贴壁的细胞。贴壁留下的活细胞经核荧光染色后，通过自动显微镜图像分析系统计数，得出每种药物不同浓度的细胞存活率，并设阴性对照。数据汇总后，得出每种药物的剂量-反应曲线。Chem oFx assay的特点是(1)检验所需样本量小：实体肿瘤仅需35 mg组织，液体标本仅需40 mL，可用于穿刺活检及恶性胸腔积液和腹水等标本的检验。(2)检验药物的范围广，还可用于生物制剂的检验。(3)可对单药或最高三药联合的方案进行检验。(4)该检验中所使用的不同的药物浓度包括了体内肿瘤细胞暴露的药物浓度，检验结果对临床药物使用更具有指导意义。目前，Chem oFx assay可用于各种实体肿瘤的化疗敏感度检验,但尚未应用于血液肿瘤及淋巴瘤的检验。Mi等报道，Chem oFx assay对乳腺癌患者检测的成功率83.9%，可重复性高(变异系数<3%)；药敏试验中多西紫杉醇、卡培他滨的敏感性与临床疗效相关，预测乳腺癌新辅助化疗达到病理完全缓解的准确率为75%。一项对192例卵巢癌的研究提示，Chem oFx assay检测铂敏感性与总生存显著相关：铂敏感、中度敏感、不敏感的总生存期分别是72.5、48.6和28.2个月(P=0.03)。目前正在卵巢癌、乳腺癌患者中进行关于Chem oFx assay检验准确性的前瞻性临床试验。琥珀酸脱氢酶抑制法(Succinate Dehydrogenase Inhibition Test, SDI)该法细胞内三竣酸循环中有关合成ATP的重要酶类之一。1960年DalIner等人首次应用琥珀酸脱氢酶活性指标作为判断肿瘤细胞活性，当时酶活性测定使用氯化三苯四氮唑(TTC)作显色剂，寻敏度不高。1980年日本学者齐藤等人改用3(4,5-二甲-2-唾哇)-2,5-二苯一溴化四氮唑(MTT)，灵敏度提高了10倍。目前所用的即为改良SDI法。MTT无色，当接受唬拍酸脱下的氢后，即还原成紫红色的甲臜(formazan)，甲臜的生成量与活细胞数成正比，加入三氯醋酸溶剂停止反应，并溶出甲臜用分光光度计测定光密度，可用颜色深浅反映活细胞的多少。癌细胞受药物抑制则SD活性降低，紫红色较浅。 该法特点：试验简单、快速、灵敏、取材少、半自动、重复性好，是一种很有发展前途的体外恶性肿瘤药敏试验方法。且SDI试验不仅用于单个药物的敏感性测定，而且可用于不同稀释度化疗药物混合后同一条件下培养的联合使用及不同疗法的敏感性侧定。梯度离心法 梯度离心法是分离细胞常用的方法。其基本的原理：细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。梯度离心法本身不需要复杂的仪器设备，操作简单、可靠。Patient-Derived Xeugraft(PDX)法 鉴于目前广泛采用的实验动物细胞接种模拟肿瘤在体实验方法，美国西北医院Wenan Qiang ph.D 提出PDX肿瘤药效评价方法，并在课题组中的药物开发与肿瘤治疗研究中得到应用。出于现行细胞接种方法的弊端：细胞在体成瘤后（实验动物）的药敏结果并不等价于药物对患者有效，致使不少临床前有较好药效的药物惨遭临床淘汰原代培养的肿瘤细胞传代后大多数被淘汰，致使细胞的代表性减弱，PDX法采用患者肿瘤直接取样接种于实验动物体内，模拟人体实验环境（如，卵巢癌组织接种于实验动物卵巢膜下），培养观察，再通过实验动物实体瘤传代扩大培养用于药敏实验，实验结果更具代表性，对于患者能提供更直接的药效结果，便于临床治疗。但该法目前未广泛采用，技术难度较大成本相对较高。总结 综上所述，其中有些方法由于存在明显缺点，目前已很少使用。如放射性标记核酸前体掺入法需要使用放射性同位素，无法测出药物对G0期细胞的杀灭作用(G0期细胞不进行DNA合成)；集落形成法需要细胞量大、试验周期长、工作量大、成功率低；荧光细胞印迹法技术难度大，难于推广；核形法需要有经验的病理学家判断结果，而且费时耗力、指标不够客观等。另外一些方法文献报道极少，难以判断其优劣。且由于肿瘤的恶性性质及目前肿瘤治疗的现状，医生和病人均希望有能够准确预测化疗药物敏感性的方法，能否与临床实际相符合是医生考虑的首要因素，价格、操作难易程度、需要的时间也在考虑范围之内。有少数文章对其中某些方法进行了比较，总体说来，后建立的方法优于早期方法(三维组织培养、ATP-TCA法优于MTT法，MTT法优于其他更早期的方法)，肿瘤药敏测定正在不断完善与提高。随着人民生活水平的提高，及对癌症治疗的要求越来越高，肿瘤药敏测定将有着良好的临床应用前景。 细菌耐药监测及预警机制 按照《抗菌药物临床应用指导原则》要求，加强临床微生物检测与细菌耐药监测工作，并建立细菌耐药预警机制。 （一）对接受抗菌药物治疗者，微生物检验样本送检率不得低于30%。 （二）微生物室每季度分析我院细菌耐药情况，对耐多药细菌、泛耐药细菌的出现及时向感染管理科报告。第三篇：细菌耐药监测及预警机制
（三）感染管理科每季度向感染管理委员会公布本院医院感染细菌的构成及耐药情况：
1、对主要目标细菌耐药率超过30%的抗菌药物，应及时将预警信息通报本院医护人员。
2、对主要目标细菌耐药率超过40%的抗菌药物，应慎重经验用药。
3、对主要目标细菌耐药率超过50%的抗菌药物，应参照药敏试验结果选用抗生素。
4、对主要目标细菌耐药率超过75%的抗菌药物，应暂停该类抗菌药物的临床应用，根据耐药监测结果，再决定是否恢复其临床应用。
细菌耐药预警机制流程图
主要目标细菌监测
耐药率≥30%
耐药率≥40%
耐药率≥50%
耐药率≥75%
及时通报本
院医务人员
医务人员慎
重经验用药
按药敏结果用药
医院领导汇报
药事委员会汇报
暂停临床应用
定期监测再决定
是否恢复使用
第四篇：多耐药菌的合作机制
多部门共同参与多重耐药菌管理合作机制
多重耐药菌管理多学科协作机制(4.20.5.2)为了加强我院多重耐药菌医院感染的预防管理，根据卫办医政发（2011）5号“多重耐药菌医院感染预防与控制技术指南（试行）”的通知，制定多学科协作机制如下：
一、临床科室：
1、加强医务人员手卫生。严格执行《医务人员手卫生规范》，医务人员在直接接触患者前后、进行无菌技术操作和侵入性操作前，接触患者使用的物品或处理其分泌物、排泄物后，必须洗手或使用速干手消毒剂进行手消毒。
2、在标准预防的基础上，严格实施隔离措施，预防多重耐药菌传播。尽量选择单间隔离，也可以将同类多重耐药菌感染患者或定植患者安置在同一房间。隔离房间或床头应当有隔离标识（蓝色），在患者的医嘱中也注明多重耐药菌，提高医务人员的警惕性。
3、与患者直接接触的相关医疗器械、器具及物品如听诊器、血压计、体温表、输液架等要专人专用，并及时消毒处理。轮椅、担架、床旁心电图机等不能专人专用的医疗器械、器具及物品要在每次使用后擦拭消毒。
4、医务人员对患者实施诊疗护理操作时，应当将高度疑似或确诊多重耐药菌感染患者或定植患者安排在最后进行。
5、严格执行无菌技术操作和标准操作规程，避免污染，有效预防多重耐药菌感染。
6、加强多重耐药菌感染患者或定植患者诊疗环境的清洁、消毒工作。
7、严格执行抗菌药物临床使用的基本原则，切实落实抗菌药物的分级管理，严格执行围术期抗菌药物预防性使用的相关规定，避免因抗菌药物使用不当导致细菌耐药的发生。
8、患者隔离期间要定期监测多重耐药菌感染情况，直至临床感染症状好转或治愈方可解除隔离。
9、各科室院感管理小组每月对存在问题或缺陷进行分析讨论，制定整改措施，有落实情况记录，体现持续改进。
二、药剂科：
1、有抗菌药物合理使用管理组织与制度；有分级管理制度及具体措施。
2、定期向临床医师提供最新的抗菌药物敏感性总结报告和趋势分析，正确指导临床合理使用抗菌药物，提高抗菌药物处方水平。
3、有临床治疗性使用抗菌药物的微生物送检率统计分析（细菌室协助完成）。
4、有临床治疗性使用抗菌药物种类与微生物检测种类统计分析（细菌室协助完成）。
5、各种形式的抗菌药物合理使用及分级使用相关知识培训和考核，记录详实。
6、每季度公布各科室使用抗菌药物情况，并有促进抗菌药物合理使用的考核机制。
7、有围手术期抗菌药物的预防性使用规定并落实；有I类手术预防性抗菌药物使用规范。
8、每季度对各科室抗菌药物使用中存在问题或缺陷进行分析讨论，对落实情况体现持续改进。
三、细菌室：
1、发现多重耐药菌感染患者和定植患者后，应当在第一时间报告相关临床科室（并有记录），以便采取有效的治疗和感染控制措施。
2、有细菌耐药监测机制和预警机制，每季度向全院公布一次临床常见分离细菌菌株及其药敏情况，包括全院和重点部门多重耐药菌的检出变化情况和感染趋势。
3、每季度公布ICU、呼吸科、儿科、血液病学组等重点科室前五位的医院感染病原微生物名称和耐药率。
4、每季度对各科室微生物送检情况及细菌耐药检测中存在问题或缺陷进行分析讨论，对落实情况体现持续改进。
5、每季度有细菌耐药监测变化趋势图和抗菌药物敏感性报告。
四、医院感染管理科：
1、每天到细菌室获取准确的各科室患者耐药菌感染情况（应用院感软件后将适时监控），并每天随机到科室督查耐药菌感染控制制度落实情况。
2、对存在问题及时指出甚至处罚，对改进情况进行跟踪、督查，落实，体现持续改进。
3、每季度对各科室抗菌药物合理使用（包括围手术期）、微生物送检情况及细菌耐药检测中存在问题或缺陷进行分析总结，对落实情况体现持续改进。
4、制定培训计划，并不定期以各种形式对全院医护人员和微生物检验人员进行预防多重耐药菌危险因素、流行病学及控制措
施进行培训，并对培训效果有追踪总结，通过耐药菌感染率体现防控的有效性，资料详实。
第五篇：多重耐药菌管理合作机制
ⅹⅹ医院多重耐药菌管理合作机制
为加强我院多重耐药菌医院感染的预防管理，根据《多重耐药菌医院感染预防与控制技术指南（试行）》，特制定多部门共同参与的多重耐药菌管理合作机制：
微生物室检测到多重耐药菌，及时报告临床科室和医院感染管理科；医院感染管理科接到报告后立即到临床科室指导多重耐药菌感染病人消毒隔离措施；并通知临床药师到该病人所在科室进行会诊，指导临床医师合理应用抗菌药物。微生物室每季度将耐药情况汇总公布，并将相关耐药情况上报药剂科；药剂科根据抗菌药物耐药情况提交药事管理委员会讨论要暂时停用的抗菌药物。
一、临床科室：
（一）加强医务人员手卫生，严格执行《医务人员手卫生规范》，医务人员在直接接触患者前后、进行无菌技术操作和侵入性操作前，接触患者使用的物品或处理其分泌物、排泄物后，必须洗手或使用速干手消毒剂进行手消毒。
（二）在标准预防的基础上，严格执行隔离措施，预防多重耐药菌传播。尽量选择单间隔离，也可以将同类多重耐药菌感染患者或定植患者安置在同一间病房。病历夹上、隔离病房或床头应当有隔离标识（蓝色），提高医务人员的警惕性。
（三）与患者直接接触的相关医疗器械、器具及物品如听诊器、血压计、体温表、输液架等要专人专用，并及时消毒处理。轮椅、担架、床旁心电图机等不能专人专用的医疗器械、器具及物品要在每次 使用后擦拭消毒。
（四）医务人员对患者实施诊疗护理操作时，应当将高度疑似或确诊多重耐药菌感染患者或定植患者安排在最后进行。
（五）严格执行无菌技术操作和标准操作规程，避免污染，有效预防多重耐药菌感染。
（六）加强多重耐药菌感染患者或定植患者诊疗环境的清洁、消毒工作。
（七）严格执行抗菌药物临床使用的基本原则，切实落实抗菌药物的分级管理，严格执行围术期抗菌药物预防性使用的相关规定，避免因抗菌药物使用不当导致细菌耐药的发生。
（八）患者隔离期间要定期监测多重耐药菌感染情况，直至临床感染症状好转或治愈方可解除隔离。
（九）各科室院感管理小组每月对存在问题或缺陷进行分析讨论，制定整改措施，有落实情况记录，体现持续改进。
二、药剂科：
（一）接到感染管理科的通知后，立即安排临床药师到该病人所在科室进行会诊，并指导临床医师合理应用抗菌药物。
（二）有抗菌药物合理使用管理组织与制度；有分级管理制度及具体措施。
（三）定期向临床医师提供最新的抗菌药物敏感性总结报告和趋势分析，正确指导临床合理使用抗菌药物，提高抗菌药物处方水平。
（四）有临床治疗性使用抗菌药物的微生物送检率统计分析（细菌室协助完成）。
（五）有临床治疗性使用抗菌药物种类与微生物检测种类统计分析（细菌室协助完成）。
（六）各种形式的抗菌药物合理使用及分级使用相关知识培训和考核，记录详实。
（七）每季度公布各科室使用抗菌药物情况，并有促进抗菌药物合理使用的考核机制。
（八）有围手术期抗菌药物的预防性使用规定并落实；有I类手术预防性抗菌药物使用规范。
（九）每季度对各科室抗菌药物使用中存在问题或缺陷进行分析讨论，对落实情况体现持续改进。
三、细菌室：
（一）发现多重耐药菌感染患者和定植患者后，应当在第一时间报告相关临床科室和感染管理科（并有记录），以便采取有效的治疗和感染控制措施。
（二）有细菌耐药监测机制和预警机制，每季度向全院公布一次临床常见分离细菌菌株及其药敏情况，包括全院和重点部门多重耐药菌的检出变化情况和感染趋势。
（三）每季度公布ICU、呼吸科、儿科等重点科室前五位的医院感染病原微生物名称和耐药率。
（四）每季度对各科室微生物送检情况及细菌耐药检测中存在问题或缺陷进行分析讨论，对落实情况体现持续改进。
（五）每季度有细菌耐药监测变化趋势图和抗菌药物敏感性报告。
四、医院感染管理科：
（一）每天到细菌室获取准确的各科室患者耐药菌感染情况（应用院感软件后将适时监控），并每天随机到科室督查耐药菌感染控制制度落实情况。
（二）对存在问题及时指出甚至处罚，对改进情况进行跟踪、督查，落实，体现持续改进。
（三）每季度对各科室抗菌药物合理使用（包括围手术期）、微生物送检情况及细菌耐药检测中存在问题或缺陷进行分析总结，对落实情况体现持续改进。
（四）制定培训计划，并不定期以各种形式对全院医护人员和微生物检验人员进行预防多重耐药菌危险因素、流行病学及控制措施进行培训，并对培训效果有追踪总结，通过耐药菌感染率体现防控的有效性，资料详实。
医院感染管理科 二0一三年一月
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