第一篇：微生物实验
微生物区系分析方法
分别在茯茶“发花”不同阶段取样，采用稀释涂布平板法，对样品中的微生物进行分离、纯化和计数。
1.1 分离培养基
细菌分离：
采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、蒸馏水lO00mL。将上述成分溶解定容，调pH7.2～7.4，分装，12l℃灭菌20min。倒平板前按50μg/ml的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用）。酵母菌分离: 采用YPD培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏10g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH自然，113℃灭菌30min。霉菌分离：
采用PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤，定容至1000mL，添加20g葡萄糖和17-20g琼脂并定容至1000mL，121℃灭菌20min。等降温至55℃左右时，加入氨苄青霉素（或链霉素）50μg/ml(真菌分离计数时用以抑制细菌的生长)。或者加入氯霉素或庆大霉素灭菌之前加入。放线菌分离：
采用高氏一号培养基：可溶性淀粉20g、氯化钠0.5g、硝酸钾lg、磷酸氢二钾 0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂18～20g、蒸馏水1000ml、pH7.2～7.4，121℃灭菌20min。可在盛无菌水的三角瓶中加10滴100g/l的石炭酸（苯酚）溶液和50μg/ml的制霉菌素以抑制细菌和霉菌的生长。
察氏培养基(1L)：葡萄糖30g；MgSO4·7H2O 0.5g；NaNO3 3.0g；KCl 0.5g；FeSO4·7H2O 0.01g；K2HPO4 1.0g；琼脂20g(观察霉菌形态用)，如要分离用需要灭菌后加30U/mL链霉素)。
其他鉴定用培养基成分及配方参照周德庆《微生物学实验手册》 1.2 计数方法
计数方法参照GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》的测定方法 1.3 取样：每隔2天取一次样，每个样至少做1次重复，总共取7次样，为了减少误差，尽量取同一批样。尽量保证茯砖茶中微生物种类和数量不发生较大变化，样品取回后立即进行微生物分离计数。在取样时要测定发花环境（烘房）里的温度、湿度，取回样品后，要测定茶样的含水量和pH值。其余不做微生物分析的茶样应立即放在-20℃的冰箱里低温保存。
pH值的测定：准确称取2.00g茶样，加50ml蒸馏水，置于150ml三角瓶中，在振荡器上振荡浸提20分钟，过滤，滤液置于100毫升烧杯中，然后用通过标准pH溶液校正后的Backman电子酸度计，测定浸提液的pH值，每个试样重复两次。
1.4 分离、纯化茯砖茶中的微生物
菌种分离：以无菌操作分别称取试样25克，投入盛有玻璃珠及225ml灭菌生理盐水的500ml三角瓶内，振荡20min，用无菌移液管吸取1ml菌悬液，加到9ml的无菌水中，然后依次制成10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8等7个浓度梯度的菌悬液，用无菌移液管吸取1ml缓缓注入平板培养基内, 稀释涂布平板培养微生物, 密封置于28 ℃条件下培养, 4～5 d 后菌落长满整个平板。
菌种纯化：根据初分菌落的形态特征, 用接种针挑取各菌落的少量菌丝体, 接种在事先准备好的PDA 琼脂培养基上(每平板内接种3个菌落),进行划线平板培养，菌丝体生长1周后, 根据长出的各菌落特点进行筛选和纯化, 如此反复, 直至菌落的生长状态和形态特征均表现一致时视为单一菌种的菌落。
1.5 鉴定微生物的种类
借助菌落结构和显微镜观察初步判断微生物的种类，如要进一步鉴定，可通过微生物的生理生化反应和分子生物学深入鉴定。微生物的分类检索鉴定方法
2.1 细菌鉴定
细菌鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)、《一般细菌常用鉴定方法》、《常用细菌鉴定手册》作形态观察和相关的生理生化试验。(1)形态观察：
个体形态观察：在显微镜下观察细胞形态、大小；
菌落形态观察：观察菌落形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度及培养基的颜色等。，(2)染色：革兰氏染色法、芽孢染色法等。(3)生理生化及生态特征鉴定；
过氧化氢酶的测定、氧化酶的测定、好氧性测定、糖或醇类发酵试验、葡萄糖酸盐的氧化试验、V.P试验(乙酰甲基甲醇试验)、淀粉水解试验、明胶水解试验、硝酸盐还原试验、产生吲哚试验、H2S产生试验、石蕊牛奶试验、酪氨酸水解试验、精氨酸利用实验、柠檬酸盐或丙酸盐的利用试验、pH生长试验、生长温度的测定以及耐盐性试验等。2.2 酵母菌鉴定
酵母菌鉴定参照《酵母菌的特征与鉴定手册》和《微生物学实验手册》对分离得到的酵母菌进行形态观察和相关的生理生化试验。(1)形态观察：
个体形态观察：无丝营养细胞的显微镜观察、掷孢子的形成和形态观察、子囊孢子的显微镜观察。菌落形态观察。
（2）染色：美兰染色法。
（3）生理生化及生态特征鉴定：碳源同化试验、氮源同化试验、糖类发酵试验、产生类淀粉化合物的测定、在60﹪(w/w)葡萄糖-酵母膏中生长测试、在37℃下做生长温度的测定、脲酶试验等。2.3 霉菌鉴定
参照《真菌的形态与分类》和《真菌鉴定手册》等相关文献，做相关的生理生化试验和形态观察。形态观察包括：
（1）菌落形态观察：颜色、大小、表明特征、质地等。（2）个体形态观察：菌丝、子实体、孢子的形态等。2.3 放线菌鉴定
参照《放线菌鉴定手册》等相关文献，做相关的生理生化试验和形态观察。参考文献
[1]（美）杰伊(James M．Jay)．现代食品微生物学(第五版)[M]．北京：中国轻工业出版社，2001：178-155 [2]
贾英民主编．食品微生物学[M]．北京：中国轻工业出版社，200l：346，364 [3] 周德庆．微生物学实验手册[M]。上海：上海科学技术出版社，1986，12 [4] 中华人民共和国国家标准GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验验菌落总数测定》 [5] 布坎南等．伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)[M]。北京：科学出版社，1984，12 [6] 中国科学院微生物研究所细菌分类组．一般细菌常用鉴定方法[M]．北京：科学出舨社，1978 [7] 东秀珠，蔡妙英。《常用细菌鉴定手册》。北京；科学出版社，2001 [8](英)J．A．巴尼特等．酵母菌的特征与鉴定手册[M]．青岛：青岛海洋大学出版社，1992 [9] 戴芳澜．真菌的形态和分类[M]．北京：科学出版社，1987，3 [10] 魏景超．真菌鉴定手册[M]．上海：上海科学技术出版社，1979 [11] 阎逊初．放线菌的分类和鉴定[M]．北京：科学出版社，1992
第二篇：微生物,真菌实验（范文模版）
青 岛 农 业 大 学
兽医微生物学课程论文
题 目：姓 名：学 院：专 业：班 级：学 号：指导教师：
病原真菌的分离鉴定
动物科技学院 动物医学
2014年月 13 日
病原真菌的分离鉴定
动医1205
李春成20121450 摘要：制作固体培养基，将A、B、D三种真菌接种到培养基和盖玻片上进行3-5d的培养（温度为28℃，观察真菌在固体培养基上的生长表现，在显微镜下观察小培养中的真菌形态，用美蓝染色液染酵母菌，进一步观察其形态。关键词：真菌；分离；形态；接种 引言：
真菌在自然界分布广、数量大、种类多。有些真菌可引起人和畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接的危害人类和动物健康。了解真菌的培养方法，认识其形态十分重要。
真菌中的酵母菌是单细胞微生物，细胞核和细胞质有明显的分化，个体直径比真菌大10倍左右，多为圆形或卵圆形。酵母菌无性繁殖主要是出芽生殖，在特殊的情况下能形成假菌丝，有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。用美蓝染色液制成水浸片，不仅可以观察其外形，还可以区分死活细胞。
霉菌的营养体是分支的丝状体，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝又分化出繁殖菌丝，不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。
霉菌的菌丝较大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以指标本是常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长的时间，溶液本身呈蓝色，有一定的染色效果。
利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态。
制作霉菌封闭标本，一般用石炭酸棉染色液封片，其中含有甘油，不易干燥，石炭酸有防腐作用，棉蓝有一定的染色作用，便于观察。1材料和方法 1.1材料
待鉴定的三种真菌A、B、D
1.1.1培养基 PDA培养基 1.1.2仪器
悬液、载玻片、盖玻片、无菌培养皿、湿盒，1mL无菌注射器、生理盐水、酒精灯等 1.2方法
1.2.1划线分离：将接种环经火焰灭菌冷却后，取待测的真菌，按照细菌的平板划线分离法进行平板划线，即用接种环从待测培养基上蘸取菌种在平板上划1/5-1/4，划毕灼烧灭菌接种环，待冷却后，于第二段处再做划线，且从第一段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。冷却后，于第三段再做划线，且从第二段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。冷却后，于第四段再做划线，且从第三段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。
1.2.2小培养：用注射器吸取液体培养基于载玻片上，将接种环在火焰下灭菌，挑取待检菌放于液体培养基上，待液体培养基将要凝固，但仍有部分呈液体状时，盖上盖玻片，标记好菌种。
1.2.3酵母菌水浸片的制备：先取干净的载玻片滴上生理盐水1-2滴，将接种环在火焰下灭菌，挑取酵母菌少许，均匀涂在液滴中，再将美蓝染色液滴于载玻片上，染色2-3min后加盖玻片。（注意切勿产生气泡）然后低倍镜和高倍镜观察其细胞形态、芽殖方式。2.结果与分析 2.1观察三个培养基：A菌在固体培养基上菌落呈油脂状，表面光滑、湿润、粘稠，颜色呈黄色。B菌在固体培养基上菌落为毡状，颜色是绿色，具有典型的放射状皱纹。D菌在固体培养基上菌落密集，最初呈白色，孢子呈黑色。
2.2实验现象
2.2.1小培养形态鉴定现象
前三图均在40X下观察）
A菌体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。光镜下可见细胞质所在范围及细胞壁的影子，高倍镜中可现细胞核。B菌菌丝呈无色，有分隔，其分生孢子梗经过多次分支，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为扫帚体。D菌菌丝无隔，有匍匐菌丝和假根，假根着生处有直立向上孢子囊梗，其顶端彭大成孢子囊，孢子囊底部有半球形囊轴。
2.2.2美兰染色现象
显微镜下看到的是单细胞, 不形成菌落的真菌，无色细胞为活酵母菌细胞，蓝色细胞为已死的酵母菌细胞。
3.讨论
本次试验做的还可以，试验结果都能看到，现象比较明显，不过，显微镜聚焦不是很好，看的不是很清楚，现象也不太明显，在做小培养时充分发挥了团队合作精神，使得试验做的很快（因为做小培养时，液体培养基温度不那么高了，凝固时间很快），做美兰染色时，也很注意没有弄进气泡，不影响观察。4.结果
经以上试验可得出，A为酵母菌；B为青霉菌；D为根霉菌。
4.参考文献
兽医微生物实验教程
胡贵学
2006
第三篇：微生物实验教案
《微生物学》实验教学教案[实验项目] 实验一 微生物学试验常用玻璃仪器洗涤及干热灭菌 [教学时数]
3学时 [实验目的与要求]
1．认识微生物实验所需要的各种器皿，了解常用工具和仪器的名称、用途。2．掌握对玻璃器皿的清洗、包扎方法与干热灭菌的操作过程。[实验原理]
微生物学实验要求较高的无菌状态，因此，实验所用的器皿，大多数要进行消毒、灭菌从而用以培养微生物，所以对其质量、规格、洗涤和包扎方法均有一定要求。
清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌。
干热灭菌的原理，空的玻璃器皿一般用干热灭菌。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。[实验材料与设备]
1．培养皿、大试管、三角瓶6只、烧杯（500ml）2只、烧杯（1000ml）1只、小试管6只、吸管（0.2ml 2支，0.5ml 2支，1ml 2支，5ml 2支）共8支。2．去污粉、肥皂、清洗剂、毛刷。3．棉花、扎绳、包扎纸。[实验步骤]
（一）学习下列常用仪器的种类、规格和应用范围 1.培养皿
由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90 mm，高15mm,皿底皿盖均为玻璃制成。制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。2.试管
(1)大试管(约18mm×180mm): 可装倒平板用的培养基，可作制备斜面用（需要大量菌体时用），装液体培养基用于微生物的振荡培养。
(2)中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 装液体培养基培养细菌或做斜面用，用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。
(3)小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。3.三角瓶 规格有100mL、250mL、500mL和1000 mL用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。4.烧杯
规格有50mL、100mL、250mL、500mL和1000mL 用来配制培养基与各种溶液等。5.吸管 规格有0.1mL、1mL、2mL、5mL、10mL用来量取转移各种溶液等。6.量筒 规格有50mL、100mL、250mL、500mL。
（二）学习玻璃器皿的洗涤方法 1.新玻璃器皿的洗涤
在2%的盐酸溶液中浸泡数小时，用自来水冲洗干净。2.旧玻璃器皿的洗涤
（1）试管、培养皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自来水冲洗 A 装有固体培养基：刮掉，洗涤
B 带菌的器皿：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24小时或煮沸0.5小时，然后洗涤 C 带病原菌培养物的器皿：先高压蒸汽灭菌，倒去培养物（2）玻璃吸管：吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，反复冲洗
A 吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自来水的容器中浸泡，实验后集中冲洗。B 塞有棉花的吸管：用水将棉花冲出，然后冲洗
C 吸过含有微生物培养物的吸管：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24小时然后洗 D 吸管内壁有油垢：洗涤液中浸泡数小时，再冲洗
(三)学习各种器皿的包扎
1.培养皿的包扎：牛皮纸或旧报纸包紧，一般以5～8套培养皿包成1包 2.吸管的包扎：
在上端约0.5cm处，塞入一小段1.5 cm长的棉花（勿用脱脂棉），目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入管内，或不慎将菌液吸出管外。用4～5 cm宽的长纸条卷起来3.试管和三角瓶等的包扎：用橡皮塞和牛皮纸。(四)干热灭菌 1．装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品（培养皿、吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。物品不要摆太挤，以免妨碍空气流通；不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。
2．升温 接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。3．恒温 当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。干热火菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。
4．降温 切断电源、自然降温。
5．开箱取物 待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。[指导与训练方案]
1.通过本次实验你认识了微生物学实验常用的哪些器皿？ 2.简述玻璃器皿洗涤的基本要求。3.简述干热灭菌的操作步骤。[实验项目]
实验二 培养基的制备与灭菌 [教学时数]
4学时[实验目的与要求]1．了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤。2．了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。[实验原理]
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制 方法。
从培养基的组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
2.半合成培养基：一部分纯化学物质和一部分天然物质配制而成。3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。
从培养基的物理状态可分为: 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状
态的培养基或农副产品培养基。3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。察氏一号培养基是一种应用最广泛和最普通的霉菌培养基。
高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。当蒸汽压达到1.055kg/cm2时，锅内温度可达到121℃，一般维持20min,即可杀死一切微生物的营养体或芽孢，而达到灭菌目的。[实验材料与设备]
1.器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。2.试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 [实验步骤] 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物
3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 关键步骤及注意事项1.要严格按配方配制。2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。
5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。[指导与训练方案]
1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? [实验项目]
实验三 环境和人体微生物的检测及无菌操作技术[教学时数]3学时 [实验目的与要求]
1.通过检测环境和人体中微生物的存在，体会微生物分布的广泛性。
2.学习无菌操作的技术，掌握利用稀释涂布平板法从土壤中分离微生物的方法。[实验原理] 自然环境中和人及动物的体表、体内都存在大量的微生物，它们一遇到适合的条件就会大量繁殖。当把取自不同来源的含菌样品接种于含有生长发育需要的各种营养成分的固体培养基时，就会形成肉眼可见的微生物集体群落-菌落。每种微生物菌落都有其独有的特点，如大小、颜色、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑、边缘整齐或不整齐等。因此，可以通过平板培养来检测不同环境下微生物的数量、种类和特点。[实验材料与设备] 1.恒温培养箱、磁力搅拌器、移液枪
2.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、察氏一号培养基；地面以下5-10cm的土壤； 3.酒精灯、无菌棉棒、无菌生理盐水、涂布棒、记号笔、培养皿、吸管、试管、三角瓶 [实验步骤] 1.无菌操作技术 在酒精灯火焰旁操作，将融化并冷却至不烫手的灭菌固体培养基倒入无菌的培养皿，倒量为容积的1/3~1/2或者覆盖皿底5毫米左右，然后平放到桌面待其凝固即为无菌平板。
2.土样的稀释分离
制备土样悬浊液：称取土样1g，迅速倒入盛有99ml无菌水和玻璃球的三角瓶中，置入磁力棒，搅拌10-15min，使土样充分打散，即成10-2的土壤悬浊液。稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-6的稀释液。(注意：操作时每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。)3.环境及人体各部位取菌样 4.标记、培养
标记： A-Ⅰ-1-10-5姓名
按培养基类别：细菌培养基--A，霉菌培养基--B 按3个大组：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、按4个中组：1-4 按样品类别：10-
5、10-
6、口腔--a、鼻腔--b、头发--c、空气--d按个人标记：姓名
培养：将接种的平板分别放入细菌和霉菌培养箱中培养。霉菌保持25-27℃，3-5天；细菌35-37℃，1-2天。
[指导与训练方案]
1、无菌倒平板时注意的事项有哪些？
2、平板接种后为什么要倒置培养？
3、通过本次试验你学到了什么？有什么体会？ [实验项目]
实验六 细菌的单染色与革兰氏染色 [教学时数] 3学时
[实验目的与要求]
1.学习对细菌的涂片、染色和无菌操作技术。
2.了解染色原理、学习并掌握单染色和革兰氏染色技术。[实验原理] 细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，染色后，菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
微生物学中常用的是单染色法和革兰氏染色法。染色部位分芽孢、鞭毛、荚膜染色
其机理主要是由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同。G+菌，肽聚糖多，脂质少，酒精不易进入； G-菌，肽聚糖少，脂质多，酒精易进入 [实验材料与设备] 1.菌种：E.coli（大肠杆菌）、B.subtilis（枯草芽孢杆菌）、玉米细菌等
2.试剂：石炭酸复红染色液、革兰氏染色液(草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄染色液）3.其他：显微镜、载玻片、生理盐水、酒精灯、接种环、吸水纸、擦镜纸等 [实验步骤]
一、单染色法： 滴无菌水→ 涂片→自然干燥→ 固定→染色→水洗→干燥→镜检（高倍镜、油镜）
二、革兰氏（Gram）染色法
1.涂片
2.初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-1.5分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面14.脱色：除去残水后，滴加
95%酒精进行脱色约
分钟，后水洗。
秒，后立即用流水冲洗。
5.复染：滴加番红染色液，染1-1.5分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。[指导与训练方案]
1.革兰氏染色过程中大肠杆菌、枯草杆菌、玉米细菌、金黄葡萄球菌等分别被染成什么色，分别为革兰氏反应的什么菌 ？
2.涂片用的玻璃片为什么不得有油污？为什么涂片要求菌膜要均匀、薄？ 3.革兰氏染色的原理 4.染色注意事项有哪些？ [实验项目]
实验七 微生物的显微镜计数、大小测量和酵母菌的死活鉴别 [教学时数] 5学时
[实验目的与要求]
1.学习并掌握利用显微镜直接计数的基本方法。2.了解并掌握酵母菌的死活鉴别染色的原理和技术 [实验原理] 1.两种常用计数方法，即直接计数法（血球计数板计数法）和间接计数法（平板菌落计数法）。本实验是利用血球计数板进行直接计数。
2.利用血球计数板，在显微镜下进行计数，由于计数室的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。3.美兰（氧化型呈蓝色，还原型呈无色），活的酵母菌具有将氧化型美兰还原成还原型的能力，故染色后是透明的，而死的酵母菌则被染成了蓝色。
计数方法：计数时，通常数五个（或四个）中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。设被选作计数的中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）如果是16个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/4×16×104×B=40000A·B（个）[实验材料与设备] 酵母菌悬液（市售的干酵母粉）血球计数板、盖玻片、吸水纸显微镜、接种环、分类计数器 0.1%的美蓝染色液 [实验步骤] 1 制备菌悬液、染色 用吸管吸取菌悬液（1滴）加入试管，用生理盐水（8滴）进行稀释，滴加（1滴）美兰染色液。加菌悬液样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液（注意一定不要有溢出和产生气泡）。3 显微镜计数 加样后静止1 min，先用低倍镜然后换成高倍镜，计数时，对位于线上酵母菌，一般只数上方和左边线上的，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。清洗血球计数板 计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。5.计算 ：利用相应公式进行计算（见前面公式或者课本公式），并将实验结果填入作业中的表格内。实验注意事项
1.要正确使用显微镜，光线亮度要调的合适。
2.菌液制备要精准，稀释倍数要合适。如果浓度过大就再稀释，如果过小再重做。3.计上不计下，计左不计右。出芽计一半
4.浓度稀释标准：以每小方格内含有5-10个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即可。5.计数室内一定不要有溢出和产生气泡。
6.其他微生物孢子技术与酵母菌类似，基本操作一样。7.确保血球计数板清洗干净。[指导与训练方案] 1.使用血球计数板计数时，应注意什么？ 2.将计数结果填入表格中。
3.简单说明酵母菌死活染色的原理。[实验项目]
实验八 微生物细胞大小的测定 [教学时数] 3学时
[实验目的与要求]
1.了解测微尺的构造和使用，学习并掌握测定微生物细胞大小的方法。[实验原理] 微生物细胞的大小的测量是在显微镜下用目镜测微尺来进行的，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同放大倍率下每格实际代表的长度也随之变化，因此，需用物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的实际长度。
物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1 mm等分为100格，每格长0．01mm，即10 um，它不直接用于测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺的每格的相对长度。
[实验材料与设备] 酵母菌悬液（市售的干酵母粉）或者制作的霉菌装片
目镜测微尺，物镜测微尺、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、0.1%的美蓝染色液 [实验步骤]（—）装目镜测微尺
（二）校正目镜测微尺
1.将物镜测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上
2.先用低倍镜观察，将目镜测微尺刻度与物镜测微尺的刻度平行。使两尺的第一条刻度线相重合，再寻找两尺的另 10 一条重合的刻度线，分别记录两重合线之间物镜测微尺和目镜测微尺所占的格数，由公式计算出目镜测微尺每格所代表的长度。
3.用同样的方法换成高倍镜进行校正，记录并计算在每种倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。
（三）酵母细胞大小的测定
制备菌悬液、染色： 用吸管吸取菌悬液（1滴）加入试管，用生理盐水（8滴）进行稀释，滴加（1滴）美兰染色液。
制片： 用吸管吸取1滴上述菌悬液滴加到干净的载玻片上，盖上盖玻片（注意一定不要有溢出和产生气泡），将多余菌液用吸水纸吸干。
显微镜下观察、测量：在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。[指导与训练方案] 1.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正? 2.如何校正目镜测微尺？ ３．如何测定细菌的大小？
[实验项目1]实验1 常用玻璃仪器包扎及干热灭菌；培养基的制备（口述）与高压蒸汽灭菌（操作-必做）1.1 培养皿、试管、吸管的洗涤包扎及干热灭菌（操作-必做）1.2 培养基分装到三角瓶和试管与高压蒸汽灭菌（操作）[实验项目2 实验2 无菌操作技术，倒平板和接种（操作-必做）1.倒平板，以清水代替；试管接试管；试管接培养皿 [实验项目3] 实验3 细菌的革兰氏染色（操作-必做）1.枯草杆菌 [实验项目4] 实验4 微生物的显微镜计数（操作-必做）
酵母菌[实验项目5]实验5 微生物细胞大小的测定（操作）会校正和测量酵母菌或真菌菌丝
第四篇：微生物实验总结
微生物实验总结
姓名:赵叶锋班级：食品科学113学号：2011013522
大三的第二学期块结束了，这个学期操作了四个微生物实验，以及一个自主设计性实验。通过前阶段对四个实验的操作和认知的基础上，展开第五个实验的自主设计。实验分别是菌落总数测定，霉菌和酵母的检查和计数，乳酸菌的检验，微生物药敏试验以及探讨环境因素对微生物生长的影响。
这学期的微生物实验是在上学期微生物实验的基础上的累积和扩展延伸：以培养基的制备与灭菌，玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌，微生物接种技术和细菌的革兰氏染色为技术基础进行的，以加强学生基础理论知识和基本技能的培养为目的。
下面我来谈谈我在实验中的心得体会。
第一个实验是菌落总数测定。让我重新认识了一下这个名词：菌落形成单位，我现在的理解就是：1ml或者1g待测样品中菌落的个数，一定要注意的是单位是CFU/ml或CFU/g。还有就是要掌握好对高压蒸汽灭菌锅的操作。实验之前要充分做好预习工作，以便实验的进行。由于是测定微生物实验，就要尤其小心其他杂菌的混入影响实验结果。因此要做好实验仪器和各种试剂的灭菌，有培养皿，试管，移液枪头（装在盒子中），按要求配置好的琼脂培养基和生理盐水，按各自要求用纱布和报纸包扎好，送入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。玻璃仪器在包扎前要进行清洗，并烘干，以免水分沾湿报纸。灭完菌后取出物品进入超净工作台，超近工作台的紫外灯在进入20分钟前开启，并在进入时关闭，以免影响人体。要对台面进行消毒处理，用酒精擦拭。可以在等待琼脂培养基冷却到50摄氏度左右前对待测样品进行10倍系列稀释至需要的浓度。要注意的是一定要标记好浓度或者按顺序排列在试管架上以免弄混，同一个试管里吸取样品才能用同一个枪头进行移液。再进行平板接种。待琼脂培养基冷却好后，用右手打开纱布并将锥形瓶拿住，将瓶口靠近酒精灯再进行灭菌，左手拿培养皿用大拇指和食指稍微打开培养皿盖，将琼脂培养基倒入培养皿中心内，不用倒很多，使琼脂培养基没过培养皿表面即可。培养皿一定是平拿在手上的，倒好后轻轻盖上培养皿盖，缓慢地平方在超净工作台台面边缘处，再推至中间。再用移液枪取1ml样品快速打入培养皿中央，盖上培养皿盖，然后用手轻轻摇晃，千外不要太大力。然后贴上标签记号，静置。如此依次操作下去。静置一段时间待培养基凝固后倒置放入恒温培养箱培养一段时间再取出进行观察计数。
我们组的实验结果不甚理想，培养皿中的微生物都是连成一片的，或者是培养皿壁上也都长着，主要是由于待测样品打入培养皿后，摇晃不均匀或者太大力了，以至于菌液没分散开来或是跑到培养皿壁上去了。
第五个实验是自主设计实验环境因素对微生物生长的影响。选取3个环境因素物理、化学和生物因素均可进行设计。根据前四个实验的基础，通过小组探讨和交流设计出实验方案。并加以验证。通过自主设计实验可以结合小组的智慧，加强团队协作精神和创新思维，通过实验可以验证理论，增加感性认识，培养独立工作能力和思考能力，并使具有过硬的专业技术水平。
通过这次的实验，我明白了任何事情丢不是一蹴而就的，而是一个慢慢积累的过程。虽然实验结果不是很理想，但是我参与了过程，通过小组讨论我们也分析了失败的原因，找到了解决的方法，避免了下一次失误。并且从中理解了团队讨论和合作的重要性。以上即是我的全部感想。
第五篇：微生物实验心得体会
微生物实验心得
姓名：关琦琦
学号：09070401048 班级：生物科学09-2班
指导老师：吾尔恩 微生物实验心得
本学期已临近尾声，我们即将告别微生物实验这门课程，在这一学期，八个微生物实验中，我们学到了许多知识，这些知识将会陪伴我们一生，下面我们就来通过一些实验来回顾一下本学期的微生物实验。
我选取的实验是《环境因素对微生物的影响》，之所以选择这则实验是因为这则实验比较简单，而且涉及面非常多。首先我们来分析一下这则实验所涉及到的知识面。环境对微生物生长影响主要分以下几种
温度：通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构入细胞膜的流动性及完整性来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度。
PH: H+影响菌体细胞质膜上电荷性质，微生物吸收物质变化，影响代谢，高浓度H+或引起菌体表而蛋白质和核酸水解以及影响酶和活性.渗透压：微生物在等渗溶液中可正常生长繁殖；在高渗溶液中细胞失水，生长受到抑制；在低渗溶液中，细胞吸水膨胀，因为大多数微生物具有较为坚韧的细胞壁，细胞一般不会裂解，可以正常生长，但低渗溶液中溶质含量低，在某些情况下也会影响微生物的生长。
抗生素：在自然界中普遍存在微生物间的拮抗作用，许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。
微生物的实验其实简单来说步骤几乎相同：制作培养基、倒平板、接种微生物、培养、观察菌种生长情况从而得出结论。本次实验也是这样首先制作培养基，在进行倒平板步骤时，对平板环境进行区分，然后进行接种。
在进行倒平板的时候，要注意在无菌条件下进行倒置，同时也要保持平板的厚度均匀。
在进行菌种接种的时候，选择合适的划线方式，一般是选择Z字形划线法，注意不要把平板弄破，等到平板凝固后才可以进行接种。接种时也要注意在无菌条件下接种。经过培养后，再观察最后得出结论。
通过一学期的实验，我越发的明白实验操作对于结果的重要性。实的基础。实验操作可以说是实验成 功与否的关键部分，可是马虎不得。对于需要团队合作的实验，个人 认为要有强势的人员搭档，不说是精通实验操作规程，最少也得知道实验的基本操作，掌握要做实验的操作方法，这对于后续的实验无疑 是与决定性作用的。对于个人的实验能力，关键还是要看平时的积累，有些实验操作繁琐复杂，需要极大的耐心，这些都应该是逐渐培养起 来的。最后，简单谈一下自己在微生物实验室做实验的心得体会。刚开始的时候，最令我头痛的就是培养基的配制、消毒灭菌，培养基的配制和消毒与灭菌两个实验可以说是微生物实验的最近本课程，内容有配制培养基、分装培养基、为下次试验准备菌种及无菌器材等，内容显得非常繁多紧凑，需要准备的器材、药品及用具较多、较杂、较细。最后只能是提前参照微生物实验教材，将实验过程中所涉及到的药品、器材及仪器等统统罗列出来，计算出实验时大小材料需用的数量，这样，一方面可以有效避免在实验准备时遗忘相关物品，另一方面也可为以后同一实验的准备工作提供依据，使实验准备工作逐步趋于程序化，从而在有效低实验准备工作量的同时，最大限度地提高准备效率。还有一点很重要，在科研型实验室里就不能不说导师和师兄师姐，其实他们才是最具价值的“活文献”，他们就是实验室里的参考文献，活参考书。生物就是一门实验的科学，其中科研经验的积累就是一个非常重要的组成部分，导师和师兄师姐的一句话往往可以事半功倍，大幅提高实验的成功率和效率。总之，为了保证实验过程高质高量完成，除了实验准备及实验过 程外，还要求实验技术人员必须具备相应的素质，实验操作人员必须 具备较扎实的专业基础、熟练的实验技能及高度的责任心，在工作中要善于总结，同时还要和理论课老师积极沟通，这样才能够真正的学好微生物实验这门课程。
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