环境微生物学

第一篇：环境微生物学

一．绪论

1）微生物：微生物是肉眼看不见的，必须在电子显微镜或光学显微镜下才能看见的所有微小生物的总称。

2）微生物的特点：1个体极小2分布广种类繁多3繁殖快4易变异 3）原核微生物与真核微生物区别：真核微生物有发育完好的细胞核，原核微生物只有拟核。第一章

4）病毒：病毒是没有细胞结构，专性寄生在活的敏感宿主体内的超微小生物。

5）病毒的特点：只能在电子显微镜下看见。没有核糖体，没有酶系统，不具备代谢能力，必须专性寄生在活的敏感宿主细胞内。

6）病毒的分类：按专性宿主分类：动物病毒，植物病毒，细菌病毒，放线菌病毒，藻类病毒，真菌病毒。按核算分类：DNA病毒，RNA病毒。7）类病毒：类病毒是比病毒更加小的致病感染因子。

8）朊病毒：朊病毒是一种引起牛，羊疾病的感染因子（蛋白质感染颗粒）。9）病毒的繁殖过程：1吸附2侵入3复制与聚集4宿主细胞裂解和成熟噬菌体粒子的释放。10）噬菌体的溶原性：毒性噬菌体，侵入宿主细胞后，随即引起宿主细胞裂解的噬菌体。温和噬菌体，侵入宿主细胞后，其核算附着并整合在宿主染色体上，和宿主的核酸同步复制，宿主细胞不裂解而继续生长，不引起宿主细胞裂解。含有温和噬菌体宿主细胞被称作溶原细胞。溶原细胞内的温和噬菌体核酸，称为原噬菌体。

11）噬菌体：噬菌体是感染细菌，真菌，放线菌或螺旋体微生物的病毒。第二章

12）细菌的形态：球状，杆状，螺旋状和丝状。分别称为球菌，杆菌，螺旋菌和丝状菌。13）细菌：一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区的裸露DNA的原始单细胞生物。14）细菌的结构：细菌为单细胞结构，所有的细菌均有如下结构：细胞壁，细胞质膜，细胞质及其内含物，拟核。部分细菌有特殊结构：芽孢，鞭毛，荚膜，黏液层，衣鞘及光合作用片等。

15）细胞壁：细胞壁是包围在细菌体表最外层的，坚韧而有弹性的薄膜。16）原生质体：原生质体包括细胞质膜，细胞质及其内含物，拟核。

17）细胞质膜：细胞质膜是紧贴在细胞壁的内侧而包围细胞质的一层柔软而富有弹性的膜。（半渗透膜），含有蛋白质，脂质和多糖。脂质是由磷脂，甘油，脂肪酸和含氮碱组成。18）细胞质膜的生理功能：1,维持渗透压的梯度和溶质的转移2，膜上含有合成细胞壁和形成横膈膜组分的膜，故在膜的外表面合成细胞壁3，膜内的中间体含有细胞色素，参与呼吸作用。4，细胞质膜上含有酶，进行物质代谢和能量代谢5，细胞质膜上有鞭毛基粒，鞭毛由此长出，为鞭毛提供附着点。19）核糖体;合成蛋白质

20）拟核：细胞的核因没有核膜和核仁，故称为原始核或拟核。21）鞭毛：有细胞质膜上的鞭毛基粒长出穿过细胞壁伸向体外的一条纤细的波浪状的丝状物叫鞭毛。

22）细菌的染色方法简单染色法和复合染色法 23）革兰氏染色法：步骤1在无菌的条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。2用草酸铵结晶紫染色1MIN，水洗去掉浮色。3用碘-碘化钾溶液媒染1MIN，倾去多余染液。4用中性脱色剂如乙醇或丙醇脱色，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。5，用番红溶液复染1MIN，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。24）革兰氏染色的机制：1）革兰氏染色与细菌等电点有关系：革兰氏阳性菌的等电点比革兰氏阴性菌的等电点低，说明革兰氏阳性菌带的负电荷比革兰氏阴性菌多。革兰氏阳性菌的等电点低，与草酸铵结晶紫结合的牢固，对乙醇脱色抵抗力强，所以革兰氏阳性菌呈紫色。2，革兰氏染色与细胞壁有关：革兰氏阳性菌的脂质的含量很低，肽聚糖含量高，革兰氏阴性菌则相反，因此用乙醇脱色时革兰氏阴性菌的脂质被乙醇溶解，增加细菌细胞壁的孔径和通透性，乙醇很易进入细胞内将结晶紫和碘-碘化钾复合物提取出来，噬菌体呈现无色。3,*革兰氏阳性菌含特殊的RNA-Mg2+盐与革兰氏染色有关。25）放线菌：放线菌因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。分为三类营养菌丝，气生菌丝，孢子丝。

26）放线菌的结构：放线菌的菌体由纤细的，长短不一的菌丝组成，菌丝分枝，为单细胞，在菌丝生长过程中，核物质不断复制分裂，然后细胞不形成横膈膜，也不分裂，而是无数分枝的菌丝组成很细密的菌丝体。第三章

27）原生动物：原生动物是动物中最原始，最低等，结构最简单的单细胞动物。28）原生动物的营养类型：1全动性营养2植物性营养3腐生性营养

29）原生动物的繁殖：有性生殖和无性生殖（二分裂发，多分裂法，纵分裂或横分裂）30）原生动物的作用：所有原生动物在污水生物处理过程中都起着指示生物的作用。31）主要的原生动物：P71 32）微型后生动物：原生动物以外的多细胞动物叫后生动物。因有些后生动物体型微小，要借助光学显微镜方可看得清楚，故叫微型后生动物。33）藻类的繁殖;有性生殖和无性生殖。P84 34）真菌：真菌属低等生物，种类繁多，形态，大小各异，包括酵母菌，霉菌及各种伞菌。真菌属真核微生物，有单细胞和多细胞之分。

35）酵母菌：酵母菌是单细胞真菌。分发酵型和氧化型两种。氧化型的酵母菌则是无发酵能力或发酵能力弱而氧化能力强的酵母菌。球拟酵母菌，白色假丝酵母菌，类酵母的阿氏囊霉属，短梗霉属在石油加工业中起积极作用，如石油脱蜡，降低石油的凝固点等。处理废水及用酵母菌检测重金属。

36）酵母菌的繁殖：有性生殖和无性生殖（芽生殖和裂殖)37）霉菌：分为腐生和寄生

38）霉菌的繁殖：有性孢子和无性孢子繁殖，也可借助菌丝的片段繁殖。39）伞菌：无毒的有机废水可用于培养食用菌的菌丝体。40）酶：酶是由细胞产生的，能在体内或体外起催化作用的一类具有活性中心和特殊构想的生物大分子。

41）酶的分类：化学组分；单成分酶（只含有蛋白质）和全酶（蛋白质及辅基或辅酶的热稳定的非蛋白质小分子有机物或金属离子，全酶要在酶蛋白和辅酶同时存在起作用）

42）全酶的分类：1酶蛋白+非蛋白质小分子有机物2酶蛋白+非蛋白质小分子有机物+金属离子3酶蛋白+金属离子

43）酶的分类：六类，氧化还原酶，转移酶，水解酶类，裂解酶类，异构酶类和合成（连接）酶类。

44）酶的反应通式：氧化还原酶类：AH2+B=A+BH2

转移酶类：AR+B=A+BR

水解酶类：AB+H2O=AOH+BH

裂解酶类：AB=A+B

异构酶：---------葡萄糖=果糖（例）

合成酶：A+B+ATP=AB+ADP+Pi

或

A+B+ATP=AB+AMP+Pii 45）酶的特性：1酶具有一般催化剂的共性2酶的催化作用具有高度的专一性（只作用一种或以类物质）3酶的催化反应条件温和4酶对环境条件的变化极为敏感5酶的催化效率极高

46）酶促反应的动力学方程式：

E酶S底物ES中间产物P最终产物

47）酶的浓度对酶促反应速率的影响：下图

48)底物浓度对酶促反应速率的影响：P116 49)温度对酶促反应速率的影响：上图 50)PH对酶促反应速率的影响：P117 51)激活剂对酶促反应速率的影响：凡能激活酶的物质称酶的激活剂。分为无机离子激活剂和有机化合物两类。

52)抑制剂对酶促反应速率的影响：引起抑制作用的物质称为酶的抑制剂。抑制作用是指由于某些物质与酶的活性部位结合。分为不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用。

53)培养基;根据各种微生物对营养的需要，包括水，碳源，能源，氮源，无机盐及生长因子等按一定的比例配置而成的，用以培养微生物的基质，称为培养基。

54)培养基配制的原则：1不同微生物，不同培养基2各种营养物的浓度及配比3调PH值4考虑加生长因子5培养基物美价廉

55)培养基的种类：按培养基组成物的性质分类：合成培养基，天然培养基（天然有机物配制而成的培养基），复合培养基。按物理性质分为;液体培养基，半固体培养基，固体培养基。根据培养基对微生物的功能和用途不同：选择培养基，鉴别培养基，加富培养基。56)营养物质进入微生物细胞的方式：单纯扩散，促进扩散，主动运输，基团转位

57)单纯扩散：单纯扩散是物理过程，不包括细胞的主动代谢。杂乱运动的，水溶性的溶质分子（水，无机盐，O2，CO2）通过细胞质膜中含水的小孔从高浓度区向低浓度区扩散，不与膜上的分子发生反应，这种扩散是非特异的，扩散速度慢。

58)促进扩散：细胞膜上的载体蛋白分子有和被运输物质特异结合的位置，这样载体在膜的外表面能够和物质结合，形成的底物-载体蛋白复合体，便从高浓度向低浓度区域扩散或越膜。由于被运输物质的浓度在膜的内表面较低，所以复合体倾向解离，被运输的物质就留在细胞内，而载体回到膜的外表面，只要存在需要运输物质的越膜浓度梯度，这个过程就将继续进行，从而加快了物质的运输速度。不消耗能量。

59)主动运输：当微生物细胞内积累的营养物质浓度高于细胞外的浓度时，营养物质就不能按浓度梯度扩散到细胞内，而是逆浓度梯度被“抽”进细胞内。这一过程需要渗透酶和消耗能量。渗透酶在此过程中起改变平衡点的作用，这种需要能量和渗透酶的逆浓度梯度积累营养物质的过程。60)基团转位：基团转位是存在于某些原核生物中的一种物质运输方式。与主动运输相比，有一个复杂的运输系统，被运输的物质发生了化学变化，主要用于糖的运输，运输总效果与主动运输相似，可以逆浓度梯度将营养物质移向细胞内，结果使细胞内结构发生变化的物质浓度大大超过未改变结构的同类物质的浓度。需要代谢能量。61)微生物的能量代谢：P135-P150

62）微生物的生长：微生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。正常情况下，同化作用大于异化作用，微生物的细胞质量不断迅速增长，称为生长。

63）微生物的发育：从生长到繁殖这个由量变到质变的过程叫发育 64）代时：细菌两次细胞分裂之时的时间。65）生长曲线：

66)微生物的生存因子：微生物除了需要营养外，还需要环境中合适的生存因子，例如：温度，PH，氧化还原电位，溶解氧，太阳辐射，活度与渗透压，表面张力等。

67)根据微生物对温度的最适生长需求，可将微生物分为4大类：嗜冷菌，嗜中温菌，嗜热菌及嗜超热菌。

68)大多数细菌，藻类和原生动物的最适PH为6.5-7.5，他们对PH的适应范围为4-10。69)任何两种浓度的溶液被半渗透膜隔开，均会产生渗透压。

70)微生物之间的关系：微生物之间的关系有种内的关系和种间的关系。相同种内的关系有竞争和互助。不同种间关系有6种，竞争关系，原始合作关系，共生关系，偏害关系，捕食关系，寄生关系。

71)竞争关系：竞争关系是指不同的微生物种群在同一环境中，对食物等营养，溶解氧，空间和其他共同要求的物质互相竞争，互相收到不利影响。

72)原始合作关系：原始合作关系是指两种可以单独生活的生物共存于同一环境中，相互提供营养及其他生活条件，双方互为有利，相互受益。当两者分开时各自可单独生存。

73)共生关系：共生关系是指两种不能单独生活的微生物共同生活于同一环境中，各自执行优势的生理功能，在营养上互为有利而所组成的共生体，这两者之间的关系就叫共生关系。74)偏害关系：共存于同一环境的两种微生物，甲方对乙方有害，乙方对甲方无任何影响。一种微生物在代谢过程中产生一些代谢产物，其中有的产物对一种（或一类）微生物生长不利，或者抑制或者杀死对方。上述这种微生物与微生物之间的对抗关系叫偏害关系。分非特异性偏害和特异性偏害。

75)捕食关系：有的微生物不是通过代谢产物对抗对方，而是吞食对方，这种关系称为捕食关系。

76)寄生关系：一种生物需要在另一种生物体内生活，从中社区营养才得以生长繁殖，这种关系成为寄生关系。77)微生物在土壤中的分布：土壤中微生物的类群、数量与分布，由于土壤质地发育母质、发育历史、肥力、季节、作物种植状况、土壤深度和层次等等不同而有很大差异。土壤微生物中细菌最多，作用强度和影响最大，放线菌和真菌类次之，藻类和原生动物等数 量较少，影响也小。土壤中微生物的水平分布取决于碳源。土壤中微生物的垂直分布与紫外辐射的照射，营养，水，温度等因素有关。78)遗传和变异是一切生物最本质的属性。

79)遗传有保守性，是微生物在它的系统发育过程中形成的系统。80)遗传可改变的一面是变异

81)遗传是相对的，变异是绝对的。82)遗传和变异的物质基础DNA：P203 83)基因突变：基因突变即微生物的DNA被某种因素引起碱基的缺失，置换或插入，改变了基因内部原有的碱基排列顺序，从而引起其后代表现型的改变。当后代突然变现和亲代显然不同的，能遗传的性状时，就称为突变。

84)自发突变：自发突变是指某种微生物的自然条件下，没有人工参与而发生的基因突变。原因有多因素低剂量的诱变效应，互变异构效应。

85)诱发突变：诱发突变是利用物理或化学的因素处理微生物群体，促使少数个体细胞的DNA分子结构发生变化，在基因内部碱基配对发生错差，引起微生物的遗传性状发生突变。分物理诱变，化学诱变，复合处理及其协同效应，定向培育和驯化。

86)基因重组：两个不同形状个体细胞的DNA融合，使基因重新组合，从而发生遗传变异，产生新品种，此过程称为基因重组。

87)杂交;杂交是通过双亲细胞的融合，使整套染色体的基因重组；或者是通过双亲细胞的沟通，使部分染色体基因重组。

88)转化：受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并把它整合到自己的基因组里，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象，成为转化。

89)转导;通过温和噬菌体的媒介作用，把供体细胞内特定的基因携带至受体细胞中，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。

90)质粒：质粒在原核微生物中除有染色体外，还含有另一种较小的，携带少量遗传基因的环状DNA分子，称为质粒，也叫染色体外DNA。质粒在基因工程中常被用作基因转移的运载工具-载体。

91)基因工程：基因工程是指在基因水平上的遗传工程，又叫基因剪接或核酸体外重组。基因工程是用人工方法把所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在离体的条件下用限制性内切酶将离体DNA切割成带有目的的基因的DNA片段，每一段平均长度有几千个核苷酸，用DNA连接酶把它和质粒的DNA分子在体外连接成重组DNA分子，然后将重组体导入某一受体细胞中，以便外来的遗传物质在其中进行复制，扩增和表达，再进行重组体克隆的筛选和鉴定；最后对外源基因表达产物进行分离提纯，从而获得新品种。92)基因工程操作分5步：1先从供体细胞中选择获取带有目的基因的DNA片段（基因分离）； 2将目的DNA的片段和质粒在体外重组；（体外重组）3将重组体转入受体细胞（载体传递）；4重组体克隆的筛选与鉴定（复制表达）；5外源基因表达产物的分离与提纯（筛选，繁殖）

93）天然淡水水体是人类生活和工业生产用水的水源，也是水生动物和植物生长繁殖的场所。

94）水体自净过程;1有机污染物排入水体后被水体稀释，有机和无机固体物沉降至河底。2水体中好氧细菌利用溶解氧把有机物分解为简单有机物和无机物，并用以组成自身有机体，水中溶解氧急速下降至零，此时鱼类绝迹，原生动物，轮虫，浮游甲壳动物死亡，厌氧细菌大量繁殖，对有机物进行厌氧分解。3水体中溶解氧在异样菌分解有机物时被消耗，大气中的氧刚溶于水就被迅速用掉，尽管水中藻类在白天进行光合作用放出氧气，但复氧速率小于耗氧速率，氧垂曲线下降。在最缺氧点，有机物的耗氧速率等于河流的复氧速率。再往下游的有机物减少，复氧速率大于耗氧速率，氧垂1曲线上升。如果河流不再被有机物污染，河水中溶解氧恢复到原来的水平，甚至达到饱和。4随着水体的自净，有机物缺乏和其他原因（例如阳光照射，温度，PH变化，毒物及生物的抗洁作用等）使细菌死亡。据测定，细菌死亡数大约为80%-90%.95）碳循环：

96）脂质的转化：P274 97）氮循环：P278 98）显微镜的分辨率：指显微镜能分辨出物体两点间的最小距离

分辨力=0.61xλ/N.A.计算题

采用目镜为16X，物镜为40/0.65的光学系统，直径为0.3μm的微生物在显微镜下是否可分辨 解：

分辨率=0.61xλ/N.A.由题目知：N.A.=0.65

λ=0.55

分辨率=0.61x（0.55/0.65）=0.516μm>0.3μm

不可分辨

第二篇：环境微生物学总结。

古细菌：无胞壁酸。真细菌：有胞壁酸。G+G-。真核生物：几丁质

细菌包括不变部分、可变部分 细菌细胞壁：肽聚糖 细胞壁功能：○维持保护细胞形状 ○细胞壁化学成分的差异可使不同的细菌具有抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性 ○细胞壁有通道可以允许水和空气、小分子化学物质进入，大分子不能进入 ○细胞壁是鞭毛运动的力学支点

革兰氏染色法

G+（深紫色）细胞壁：磷壁酸 1234状态时开启操纵子的表达。基因突变：由于DNA链上的1对或少数几对碱基被另1个或少数碱基对取代发生改变的突变类型。

突变类型：形态突变型、生化突变型（营养缺陷型、抗性突变型、抗原突变型）、致死突变型，条件致死突变型。

基因突变的机理：1.自发突变：不对应性、自发性、稀有性、独立性、诱变性、稳定性、可逆性；2.诱发突变：碱基置换、移码突变、染色体畸变。的生化过程，但影响该过程是否产生及其活性强度。

芳香族化合物降解基因的遗传定位有3种类型：1.质粒编码降解途径的一部分，染色体编码剩余部分2.质粒与染色体分别编码不同途径的酶3.某些特殊无知的讲解由质粒编码，另一些菌种同样的降解途径则由染色体编码。

一般微生物位于染色体上的性状比较稳定，而位于质粒上的性状则很容易在不同的菌之间进行水平转移，使得降解基因在不同菌株之间扩散，有G-（红色）

内壁层、外壁层（脂多糖、脂蛋白）

原因：细菌细胞壁的肽聚糖结构和厚度不同，染色剂通透性和抗脱色能力不同

细胞壁缺陷型细菌：用溶菌酶处理,在培养基中加入青霉素阻止其细胞壁形成。

原生质体：在G+加入溶菌酶、青霉素组织其细胞壁合成

原生质球：G-加入溶菌酶、青霉素 细菌L-型：基因突变产生的无壁类型

周质空间：细胞壁与细胞膜之间的空间，内含质外酶

中间体：类似于真核生物的线粒体 芽孢：度过不良环境的休眠体

伴孢晶体：在形成芽孢的同时，产生一颗菱形双锥形的碱性蛋白晶体 细菌的繁殖：裂殖

酵母菌的繁殖：出芽繁殖

放线菌包括：基内菌丝、气生菌丝、孢子丝。放线菌的繁殖主要通过无性菌丝和菌丝片段进行繁殖，分生孢子为主

蓝细菌：芽生方式繁殖G-铁细菌：铁质水管的腐蚀和堵塞引起的

极端嗜盐高细菌群的条件：G-,T在35~50°，ph 5.5~8.5 极端嗜热高细菌群的条件：T 45~110°,ph 1~3 真菌的繁殖与繁殖体：既有有性繁殖，又有无性繁殖（主要）

无性繁殖：○1菌丝体的断裂片段可以产生新个体○2裂殖○3出芽繁殖○4孢子繁殖

无性孢子的类型：游动孢子、孢囊孢子、分生孢子、节孢子、厚垣孢子、芽孢子。

担子菌纲：主要产生担孢子，菌丝可分为初生菌体、次生菌体和三生菌丝

原生动物异氧型生活，以吞食细菌、真菌、藻类等有机体为食。

原生动物有无性繁殖和有性繁殖。无性繁殖一般为二分裂。

亚病毒包括拟病毒、类病毒、朊病毒。朊病毒只含有蛋白质。

烈性噬菌体：凡侵入宿主细胞进行复制增值，导致宿主细胞裂解的噬菌体。

烈性噬菌体的过程：吸附、侵入、复制、装配、释放。

温和噬菌体：侵入宿主细胞后随宿主细胞的生长繁殖而传代下去，一般不引起宿主细胞裂解的噬菌体。

微生物菌种保藏的原理：将微生物的菌种保存于不良环境中，是微生物的代谢速率极为缓慢或处于休眠状态。而一旦恢复所保存菌种生长的正常环境和营养条件，即可获得具有高生理活性和保持原种优良性状的菌种培养物。

保藏方法：培养物传代保藏法、干燥保藏法、低温保藏法。

微生物的营养类型：光能自养型（藻类、蓝细菌）、光能异养型（紫色与绿色非硫细菌）、化能自养型、化能异养型。EMP：糖酵解 PP：磷酸戊糖 TCA：三羧酸循环

能量转换：底物水平磷酸化、氧化磷酸化、光合磷酸化。

采用厌氧消化法处理高浓度有机废水的原因：进行发酵作用的厌氧微生物，需要大量的基质才能满足其生命活动所需要的能量，因而其对基质的转化率较呼吸作用高。

微生物合成作用必须的三要素：小分子的前体物质、能量、还原力。

分批培养的阶段：迟缓期、对数期、稳定期（出现芽孢）、衰亡期。

稳定期特点：细胞增殖率与死亡率平衡、细胞总数不再增加、单位体积中细菌数目达到最高。连续培养：如果在细菌进入对数期以一定得速度不断补充营养物质，同时以同样的速度排出培养物，就可以延长对数期的培养方法。

环境对微生物的影响：好氧微生物生长的适宜的氧化还原电位值为0.3~0.4V，在0.1V以上即能生长。厌氧微生物只能在0.1V以下甚至为负值时才能生长。兼性厌氧微生物在0.1V以上时有氧呼吸，0.1V以下时无氧呼吸或发酵作用。

真核微生物含细胞器：叶绿体、线粒体、中心粒、毛基体。原核微生物含有质粒（DNA）。

质粒特性：可转移性、可整合性、可重组性、可消除性。

根据酶量的转录水平调控机制分为正转录调控和负转录调控。负转录是当调节蛋白处于激活状态时关闭操纵子的表达；正转录是当调节处于激活细菌接合：通过供体菌和受体菌完整细胞间性菌毛的直接接触而传递大段DNA的过程。

转导：通过缺陷型噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带带到受体细胞中，从而是后者获得前者部分遗传性状的现象。转化：受体菌接受供体菌的DNA片段，经过交换将它组合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象。准性生殖（半知菌）：是同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。基因工程：用人工方法取得供体菌DNA上的目标基因，加以改造，在体外重组于载体DNA上，再导入宿主细胞内，使其转录、翻译表达和复制，获得供体基因的性状，从而获得大量的基因产物或使受体生物表现出新的表型。

基因工程的步骤：取得目的基因、选择载体、目的基因与载体DNA的体外重组、重组载体引入受体细胞。根土比：是反映根圈效应的重要指标，一般在5~20之间。

水中细菌90%为革兰氏阴性菌。（假单胞菌）嗜热微生物分为：耐热菌（45~55）、兼性嗜热菌（50~65）、专心嗜热菌（65~70）、极端嗜热菌（70+）、超嗜热菌（80~110）

嗜冷微生物分为：专性（不超过20）和兼性两类。嗜酸微生物（PH 3~3.5）嗜碱微生物（PH>9）嗜盐微生物（大多数海洋生物类别）

互生关系举例：分解纤维素的细菌与固氮菌 共生关系举例：地衣。

寄生关系举例：噬菌体的寄生。拮抗关系举例：毛霉抑制黑青霉。

微生物转化氮素的一般途径：

1、绿色植物和微生物的生命活动过程中，吸收硝态氮和铵态氮，组成蛋白质、核酸等 含氮有机物质，使无态氮同化为有机态氮；

2、动植物和微生物遗体中的有机氮化物，经微生物的分解作用，使无机质化为氨态氮（NH4-N）；

3、氨态氮在有氧条件下，经硝化细菌的作 用氧化成硝态氮；

4、硝酸盐由于反硝化细菌的作用，还原为 分子态氮，逸散到大气中；

5、空气中的分子态氮，通过固氮微生物的 作用，还原为氨，进而合成有机氮化物。

1、氨化作用：有机氮化物在微生物的分解作用中释放出氨的过程；

2、硝化作用：氨经过微生物作用氧化成亚硝酸，再进一步氧化成硝酸的过程；

3、反硝化作用：硝酸盐在通气不良情况下经微生物作用而还原的过程。

参与尿素分解的微生物有脲芽孢八叠球菌。

各种固氮微生物，在长期进化过程中均形成一种防氧保护机制。（根瘤菌在根瘤中被富含豆血红蛋白的类菌体周膜所包围，豆血红蛋白课发挥氧气缓冲剂的作用；有的固氮蓝细菌能形成不能放氧气的异形胞，固氮作用在其中进行。）

生物转化：通过微生物代谢导致有机或无机化合物的分子结构发生某种改变、生成新化合物的过程。

基质的生化呼吸曲线：表示投加基质后微生物的耗氧状况，投加基质后的耗氧量或耗氧速度随时间变化关系的基质呼吸线。

内源呼吸线：不投加基质的条件下，微生物处于内源呼吸状态是利用自体细胞物质作为呼吸基质，其耗氧量随时间变化而变化绘制的曲线。由于在此情况下微生物的耗氧速度恒定不变，所以内源呼吸线的耗氧量与时间呈直线关系。

微生物降解实验：土壤消毒实验，培养液中降解实验。

矿化作用：指有机污染物在一种或多种微生物的作用下彻底分解为H2O,CO2和简单无机化合物如含氮化合物、含磷化合物、含硫化合物和含氯化合物等的过程。

共代谢作用：一些难降解的有机化合物不能直接作为碳源或能源物质被微生物利用，当环境中存在其他可利用的碳源或能源时，难降解有机化合物才能被利用。

共代谢作用发生的情况：1.靠降解其他有机物提供能源2.靠其他微生物协同作用3,先经别的物质诱导。

微生物对石油的降解能力：烯烃最易分解，烷烃次之，芳烃难，多环芳烃更难，脂环烃类对微生物作用最不敏感。

共代谢作用及抑减效应：有的烃类单独存在时不能降解，但在石油混合物中则由于微生物利用其他烃类生长而使该难降解烃在酶作用下降解。相反，也有抑减效应存在，如醋酸盐存在可抑制对十六烷的降解；十六烷存在时可抑减朴日斯烷的降解作用，其机理未明，此种效应并不改变降解

利于微生物对不利环境的适应。

微生物对农药的降解：有些微生物可以农药作为唯一碳源、能源，直接利用或通过产生诱导酶进行降解；许多微生物通过共代谢作用使农药降解，结构复杂的农药多靠此得以转化消失。

有机磷农药较之有机氯农药容易降解得多。微生物降解这些杀虫剂的最常见反应机制是脂酶水解过程。

拟除虫菊酯类农药在环境中的降解方式有：水降解、光降解、生物降解。

塑料可被微生物作用，但分解速度极慢，属于极难生物降解的顽固化合物。微生物主要是作用于塑料制品种所含的增塑剂。由于增塑剂代谢变化而使塑料物理性质发生变化，但组成塑料聚合物的组分本身的化学性质却无改变。POPs：持久性污染物

污水一级处理：主要通过过滤、沉淀等物理方法去除污水中粗大固形物及部分悬浮物。二级处理：去除水中有机物。

三级处理：使各种有机和无机污染物去除率达98%以上

生物絮凝作用：在活性污泥形成初期，细菌多以游离态存在，随着活性污泥成熟，细菌增多而聚集成菌胶团，进而形成活性污泥絮状体。絮凝作用：形成活性污泥絮状体的过程。

普通活性污泥发的工艺流程：污水→初沉池→曝气池→二沉池→处理后出水

污泥沉降比：混合水样静置30min后，污泥体积占混合水样体积的百分数。

生物修复：利用微生物将存在于土壤、地下水和海洋等环境中的有毒、有害污染物降解为二氧化碳和水，或转化为无害物质。从而使污染生态环境修复为正常生态环境的工程技术体系。

革兰氏染色机制:革兰氏染色结果的差异主要基于细菌细胞壁的构造和化学组分不同。通过初染和媒染，在细菌细胞膜或原生质体上染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。G+ 细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高,故用乙醇洗脱时，肽聚糖层网孔会因脱水而收缩，再加上的G+ 细菌细胞壁基本上不含类脂，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞壁内，使其呈现蓝紫色。G-细菌因其细胞壁薄、肽聚糖含量低，故遇乙醇后，肽聚糖层网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇将类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝，这样结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞壁。因此，通过乙醇脱色，细胞又呈现无色。这时，再经番红等红色染料复染，使G-细菌变成红色，而G+ 细菌则仍呈蓝紫色。

为什么说炎症既是一种病理过程又是一种防御病原体入侵的积极的免疫反应？

1、通过炎症反应可以聚集大量的吞噬细胞聚集在炎症部位；

2、血流的加速使得血液中的抗菌因子以及抗体发生局部浓缩；

3、死亡的宿主细胞聚集可以释放一部分抗菌物质；

4、炎症部位的盐氧浓度下降和乳酸浓度提高，可以抑制多种病原体的生长

5、炎症部位的温度升高可以降低某些病原体的繁殖速度。

蓝细菌固氮酶的抗氧保护机制

蓝细菌光照下会因光合作用放出的氧而使细胞内氧浓度急剧增高

⑴分化出特殊的还原性异形胞:缺乏产氧光合系统Ⅱ,脱氢酶和氢化酶的活性高,维持很强的还原态;SOD活性高,解除氧的毒害;呼吸强度高,可消耗过多的氧.⑵非异形胞蓝细菌固氮酶的保护: 能通过将固氮作用与光合作用进行时间上的分隔来达到;通过束状群体中央处于厌氧环境下的细胞失去能产氧的光合系统 II,以便于进行固氮反应;通过提高过氧化物酶和SOD的活性来除去有毒过氧化合物.

第三篇：学习《环境微生物学》感受

学习《环境微生物学》后的感受

在大三上学期我有机会学习了《环境微生物学》，在此期间我们在老师的带领下学习了微生物学的前七章的内容，在学习的过程中我逐渐详细的学到什么是微生物，微生物是怎样存在我们周围的，微生物是怎么进行新陈代谢作用的，以及微生物跟我们的生活和环境的紧密联系等，虽然他们一直都环绕在我们的身边。认识到哪些微生物对我们的生活有利，哪些微生物是对我们有害的，哪些微生物我们可以加以利用，哪些我们要进行预防和自我保护、、、、、、学到了怎样去分更好地养成良好的生活习惯，给自己和周围的人打造一个健康、安全的生活环境。

但是在学习的过程中我也遇到过问题，比如说，环境中微生物之间有没有像植物之间的竞争关系，下互利共生关系等，这个我也没有想明白和看到过哪有资料来清楚的讲解。还有在之前我也一直想到过这样一个问题的，地球上为什么会先形成了微生物，那是必然吗？我当时想通过学这本课程的找到答案，但学完后也没有实质的进展。感觉自己学习微生物学时没有很大的主动性，遇到了问题也只是抱着遇到了机会就会解决的态度，没有主动的去查找资料，因而到了学完这门课当初那些想到的没有解决的问题还是在那里。这点我想在以后的学习中要学着去主动，才能更好地学到更多的知识。

老师给我们上这门课的方式还是很好的，刚开始那种在每节课的开始能抽些同学来温习下上次课所学的东西，我觉得这种方法是很好的，能很好地帮助我们巩固学到的知识。但老师不应该就因为一些同学的话就放弃了这种方法的。同时我们学完这门课程也没有用到足够的课时，虽然是由于特殊的原因，但我们还是希望我们该学的东西还是能有足够的时间保证来完成的。我认为微生物学是一门很有趣的学科的，老师在教我们时候没有能很有重点的教给我们当前微生在实际中的重要应用，而是把主要经历放在了完成教学任务上了，这与最后让我们分成小组来完成一片类似于论文的作业是有点不符的，我们在完成作业刚开始根本就看不懂这个题目该往哪个方向来写，没有实际的应用接触和了解，后来花了不少的功夫才找到了一点眉目的。

总的来说这次微生物学的学习虽然显的有些短暂，但是我还是从中真正学到了东西的，也发现了自己的一些缺点，我觉得这也是一个很大的收获。

第四篇：环境微生物学课程总结(修改)

环境微生物学课程小结

名词解释

1． 细菌：是一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。

2． 革兰氏染色：微生物学中最重要的染色方法，主要根据细菌细胞壁化学成分的差异而引起物理特性（脱色能力）的不同，决定最终染色反应的不同的染色法。3． 鞭毛：生长在某些细菌表面的长丝状、波曲的蛋白质附属物。

4． 芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠构造。

5． 裂殖：指一个细胞通过分裂而形成两个子细胞的过程。

6． 芽殖：指在母细胞表面（尤其在其一端）先形成一个小突起，待其长大到与母细胞相彷后再相互分离并独立生活的一种繁殖方式。

7． 菌落：就是在固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆内眼可见的，有一定形态构造等特征的子细胞集团。

8． 病毒：一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子，它们能以感染态和非感染太两种状态存在。9． 噬菌体：感染原核生物的病毒。10． 异养微生物：必须利用有机碳源的微生物。11． 自养微生物：以无机碳源作主要碳源的微生物。12． 生长因子：一类调节微生物正常代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的有机物。13． 营养类型：指根据微生物生长所需要的主要营养要素的不同而划分的微生物类型。14． 单纯扩散：指疏水性双分子层细胞膜在无载体蛋白参与下，单纯依靠物理扩散让许多小分子、非电离分子尤其是亲水性分子被动通过的一种物质运送方式。15． 促进扩散：指溶质在运送过程中须借助于细胞膜上的底物特异载体蛋白的协助，但不消耗能量的一类扩散性运送方式。16． 主动运送：指一类须提供能量并通过细胞膜上特异载体蛋白构象的变化，而使膜外环境中低浓度的溶质运入膜内的运送方式。17． 基因移位：指一类既需特异载体蛋白的参与，又需耗能的物质运送方式，其特点是溶质在运送前后会发生分子结构的变化。18． 选择性培养基：一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。19． 水活度（aw）：是指在一定的温度和压力条件下，溶液的蒸气压力与同样条件下纯水蒸气压力之比。表示能被微生物利用的实际含水量。20． 灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。21． 富营养化：指水体中因氮、磷等元素含量过高而引起水体表层的蓝细菌和藻类过度生长繁殖的现象。22． 富营养水体：指富含有机物的水体，该类水体中化能异养型微生物数量较大。23． 自净容量：水体单位时间内通过正常生物循环中能够同化有机污染物的最大数量 24． BIP指数：BIP =（无叶绿素的微生物数量）/（全部微生物数量）≈H/（P+H）×100%

25． 活性污泥法：是以废水中的有机污染物为培养基，在人工曝气充氧条件下对各种微生物群体进行混合连续培养，使之形成活性污泥。利用活性污泥在水中的凝聚、吸附、氧化、分解和沉淀作用，去除有机废水中的污染物的处理方法

26． 生物膜法：使指废水流过生长在固定支撑物表面的生物膜，并通过生物氧化和各相之间的物质交换作用，去除废水中的有机污染物的处理方法

27． 厌氧生物处理法：是在厌氧条件或缺氧条件下，利用厌氧性微生物分解污水中的有机物的方法。28． MPN细菌计数法：(最大可能数法)是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。它利用微生物在平行样本中培养所表现出生理生化现象的差异（数字表现），通过标准数值表的查对，估算细菌浓度。

29．指示微生物：常规环境监测中，用以指示环境样品污染性质与程度，并评价环境卫生状况的具有代表性的微生物。

认识和掌握

1． 裂殖的方式：二分裂、三分裂和复分裂 2． G+和G-细菌细胞壁的差异（结构和成分）：

3． 四大类微生物（细菌、放线菌、酵母菌、霉菌）的菌落特征：

单细胞微生物 细菌： 湿、小突或平坦、透明有异味；

酵母菌： 较湿、大突、稍透明有醇香味；

菌丝状微生物 放线菌： 干躁、小而密、不透明有腥味；

霉菌： 干躁、大而疏、不透明有霉味。

4． 病毒的形态及代表：病毒的基本形态为三种：杆状(烟草病毒)、球状（腺病毒）和这两种形态结合的复合型（噬菌体）。病毒粒子通常形成螺旋对称、二十面体对称和复合对称（前二种接合）。

5． 微生物对生长因子需求的分类：生长因子自养型微生物、生长因子异养型微生物、生长因子过量合成微生物。

6． 微生物的营养类型及举例：光能无机营养型（蓝细菌）；光能有机营养型（紫色无硫细菌）；化能无机营养型（硝化细菌）；化能有机营养型（绝大多数细菌和全部真核微生物）。7． 营养物质进入细胞的方式：。单纯扩散、促进扩散、主动运送、基团移位、膜泡运输 8． 培养基种类：按成分（天然、组合、半组合）；按物理状态（液体、固体、半固体、脱水）；按功能（选择性、鉴别性）。

9． 微生物可利用的能源：有机物 日光 还原态无机物 10． 单细胞微生物的典型生长曲线：

11． 影响指数期微生物代时长短的因素：细菌种类、营养成分和浓度、温度 12． 影响微生物生长的主要因素：温度、氧气、PH、水活度。13． 控制有害菌的措施：杀灭法——灭菌（彻底杀灭：杀菌和溶菌）和消毒（部分杀灭：仅杀灭病原菌）；抑制法——防腐（抑制霉腐微生物）和化疗（抑制宿主体内的病原菌）。14． 物理灭菌的方法：温度、渗透压、干燥、pH的影响、辐射、超声波、压力

15． 化学灭菌的方法：

无机药剂---重金属、氧化剂、酸碱

有机药剂----醇、甲醛、表面活性剂（酚类、合成洗涤剂、染料）、抗生素 16． 不同水域中微生物的分布：

17． 微生物与物质循环：碳、氮、磷、硫、铁循环（图示）18． 富营养化发生条件：（1）总磷、总氮等营养盐相对比较充足；（2）缓慢的水流流态；（3）适宜的温度条件；只有在三方面条件都比较适宜的情况下，才会出现某种优势藻类“疯”长现象，爆发富营养化。19． 赤潮对海洋渔业和水产资源的破坏： 1.破坏渔场的铒料基础，造成渔业减产。

2.赤潮生物的异常发制繁殖，可引起鱼、虾、贝等经济生物瓣机械堵塞，造成这些生物窒息而死。

3.赤潮后期，赤潮生物大量死亡，在细菌分解作用下，可造成环境严重缺氧或者产生硫化氢等有害物质，使海洋生物缺氧或中毒死亡。

4.有些赤潮的体内或代谢产物中含有生物毒素，能直接毒死鱼、虾、贝类等生物。20． 衡量河段水体污染与自净所处阶段的表现指标：水体外观、化学指标、生物种类、数量及比例关系、溶解氧等的变化 21． 活性污泥法、生物膜法、厌氧生物处理法的基本流程： 22． 环境生物修复的方式和方法： 环境生物修复的方式：

（１）原位方式即是在污染环境原地进行技术性生物治理，不需将污染的土壤或水体转移。（２）异位方式是将污染土壤或水体转移至指定地点进行集中处理。生物修复的基本方法：

（1）.生物扩增：即种植或接种具有降解和富集功能的植物或微生物；

（2）生物性刺激：即施加生物活性物质，刺激和促进土著微生物的生长和增殖，发挥其分解作用。23． 微生物检测环境污染的四种方法（发光细菌、硝化细菌、单细胞藻类、微型生物群落）的原理和方法： 24． 划平板的程序： 25． 革兰氏染色流程： 26． 悬滴法的实验流程： 27． 水域环境细菌种类测定的实验方案 28． 水域环境细菌总数测定的实验方案 29． 生活饮用水卫生细菌学检测的原理和主要方法

考试题型

1.名词解释（每题4分，共20分）2.选择题（每题 1 分，共10分）3.判断题（每题1分，共20分）4.填空题（每题 1分，共10分）5.论述题（每题10分，共40分）

第五篇：微生物学实验

细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

一 显微镜直接计数法

（一）目的要求

1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

（二）基本原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图l5-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图15—2)；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。

图15—1 血细胞计数板构造

（一）图15—2 血细胞计数板构造

（二）A.正面图；B.纵切面图； 放大后的方格网，中间大方格为计数室

1.血细胞计数板；2.盖玻片；3.计数室

计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。

设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则

1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）

同理，如果是16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个）

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母

2．仪器或其他用具 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。

（四）操作步骤

l．菌悬液制备

以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。

2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。

4．显微镜计数

加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

5．清洗血细胞计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

（五）实验报告

l．结果

将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。

各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml

12345

第一室

第二室

2．思考题

(1)根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差．力求准确?

(2)某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。

二平板菌落计数法

（一）目的要求

学习习近平板菌落计数的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。

（三）器材

1．菌种 大肠杆菌菌悬液。

2．培养基 牛肉膏蛋白陈培养基。

3．仪器或其他用具lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。

（四）操作步骤

l．编号

取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-

4、10-

5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀释

用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10?1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推，整个过程如图15-3所示。

放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。

3，取样

用三支1mL无菌吸管分别吸取10-

4、10-5和10-6。的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

图15—3平板菌落计数操作步骤

4．倒平板．

尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。

待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

5．计数

培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-

4、10-

5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。

涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。

五、实验报告

1．结果

2．将培养后菌落计数结果填入下表

稀释度10-410-510-6

Cfu数/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考题

(1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么?

(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。

(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?

三 光电比浊计数法

一、目的要求

1．了解光电比浊计数法的原理。

2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。

二、基本原理

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图15-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。

光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。

图15—4 比浊法测定细胞浓度的原理

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母培养液

2．仪器或其他用具 721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。

（四）操作步骤

1．标准曲线制作

（1）编号 取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。

（2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。

（3）测OD值 将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入下表

管号12345678

细胞数106/ml

光密度（OD）

每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定

(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定

将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。

各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。

3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。

（五）实验报告

l．结果

每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×稀释倍数

2．思考题

(1)光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点?

(2)光电比浊计数在生产实践中有何应用价值?

(3)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度?如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?

四 大肠杆菌生长曲线的测定

(一)目的要求

1．通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。

2．复习光电比浊法测量细菌数量的方法。

(二)基本原理

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。

用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶(图15-5)测定“klett units”值的光度计。如图15—6所示，只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式1 klett units=OD/0.002换算出所测菌悬液的OD值。

图15—5 带侧臂试管的三角烧瓶

(三)器材

1．菌种 大肠杆菌

2．培养基 LB液体培养基70ml，分装2支大试管(5ml/支)，剩余60ml装入250ml的三角瓶。

3．仪器或其他用具 722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

图15—6 直接用试管测OD值

(四)操作步骤

1．标记

取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接种

分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

3．培养

将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4．比浊测定

用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。

本操作步骤也可用简便的方法代替：

1．用1ml无菌吸管取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有3~5ml LB液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有LB液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的OD值。测定完毕后，取出试管置37℃继续振荡培养。

2．分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培养物试管按上述方法测定OD值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。

(五)实验报告

1．结果

(1)将测定的OD600值填入下表：

培养时间对照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)绘制大肠杆菌的生长曲线。

2．思考题

(1)如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点？

(2)细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为103/ml，培养4.5h后，其密度高达2×108/ml，计计算出其代时。

(3)次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？

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