研究人员揭开艾滋病毒如何“劫持”人体免疫细胞

第一篇：研究人员揭开艾滋病毒如何“劫持”人体免疫细胞

研究人员揭开艾滋病毒如何“劫持”人体免疫细胞

更多相关新闻时间:2014-3-26 9:50:49,点击:111

哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授课题组，在世界上首次揭示了艾滋病病毒毒力因子（Vif）的结构，阐明了Vif如何“劫持”人免疫细胞的分子机制，为研制全新艾滋病药物提供了结构基础。相关论文日前在《自然》杂志上在线发表。

艾滋病病毒犹如一把锁，其内部结构如何，始终困扰着广大学者。在艾滋病病毒的9大基因中，Vif是其毒力因子，可以视为针对人类进化而生的，作用就是在人体免疫细胞内进行病毒生成和复制。30多年来，人类对艾滋病一直缺少有效疗法，关键在于Vif自身或其功能性复合物的原子水平结构图未被解析和绘出。“换句话解释，艾滋病病毒Vif通过‘劫持’人免疫细胞内蛋白降解系统来弱化人免疫细胞，从而逃避免疫细胞对艾滋病病毒的识别和防御。”黄志伟说。

黄志伟课题组的研究自2012年7月开始，在1年多的时间里，他们弄清了Vif五元复合物结构，显示出Vif结构自身形成与目前所有已知蛋白结构不一样的折叠，同时揭示了Vif如何“劫持”人CBF-β以及CUL5 E3连接酶复合物的分子机制。

黄志伟说，揭示Vif的结构为未来艾滋病治疗从鸡尾酒式的混合用药方式，转向研制靶向治疗药物提供了一个新思路。目前，黄志伟课题组正在和国内相关高校实验室密切合作，进行艾滋病新药的研发和攻关。

第二篇：人体免疫细胞阅读答案

阅读短文，完成7～8题。（共4分）

人体免疫细胞能发现并杀死被感染的细胞而不伤害健康的细胞，其机理一直困惑着人们。科学家最近初步揭开了其中的奥秘，原来被感染的细胞能发出信号向免疫细胞求救。

美国马里兰大学的一个科研小组最近在英国《自然》杂志上发表论文指出，人体细胞中大都含有肽，它是细胞健康状态的标志物。细菌或病毒侵入细胞后会破坏该细胞，同时自己也分解繁殖。这时肽分子就会与细菌或病毒碎片结合。这样，附近的免疫细胞就得到该细胞受感染的信号，然后通知其他免疫细胞一同将受感染的细胞及其中的感染物杀死。

该科研小组是利用X射线晶体分析法发现这一奥秘的。他们选用了能诱发某些白血病的HTLV病毒作为研究对象，并在免疫细胞T细胞中发现了这一病毒的受体。当肽分子与该病毒残片结合后，就会激发附近的T细胞上该病毒的受体，从而使T细胞发挥作用。科学家说，T细胞上含有上百万个不同的受体，利用它可发现大量细菌或病毒并将受其感染的细包杀死。

7．第二段中,它（肽）是细胞健康状态的标志物的意思是（▲）（2分）

A．人体细胞在健康状态下，其中才会有肽分子存在。

B.肽在细菌或病毒入侵后能发生求救信号，维护人体健康。

C．人体在健康的状态下，细胞内含有的肽相对较多。

D．肽分子能将入侵的细菌或病毒分解并与其碎片结合。

8．下列说法不符合原文意思的一项是（▲）（2分）

A．向免疫细胞发生求救信号的是人体细胞中的肽分子。

B．肽分子与细菌或病毒的碎片结合后，会激发T细胞内肽的受体。

C．最终杀死细菌或病毒的是T细胞中的细菌或病毒的受体。

D．T细胞中的受体，不仅杀死了细菌或病毒，还杀死了受感染的细胞。

参考答案：

7、B [解题思路］

它（肽）是细胞健康状态的标志物的意思是肽在细菌或病毒入侵后能发出求救信号，维护人体健康。

A项把因果关系倒转了。是肽维护人体健康，而不是在健康状态下才会有肽分子存在。

C项也是犯了同样的错误，应是有肽在，人体才会健康，而不是相反。

D项是从肽分子的功能方面说的，不是对题目中那句话的直接的解释。

8、B项肽分子与细菌或病毒的碎片结合后，激发的是T细胞内病毒的受体，而非肽的受体。

第三篇：人体免疫教案

七年级生物下册《人体免疫》教案北师大版 “人体免疫”一节的教学设计 1教材分析

“人体免疫”是北师大版七年级下册第四单元第13章第3节“人体免疫”第二节的内容。学生通过第13章1、2节的学习养成健康的生活习惯，拒绝吸烟、酗酒、吸毒，为人类创建健康的生活环境，以及预防传染病等的知识，本节课的知识比较抽象，而且“抗原”、“抗体”、“特异性免疫”、“非特异性免疫”的概念都比较难理解，我们从人健康的生活、学习开始，结合人们身边存在传染病的实际例子，从学生自己曾经患过的病或家里人患的病等，让学生亲身体验，激发学生的学习兴趣和求知欲，同时，结合前面11章学习过的皮肤以及在第9章学习过的血液，使得我们更直观地认识特异性免疫与非特异性免疫，使我们更容易进入“人体的免疫”的学习。

本节课内容不多，所以安排了一个课时。2 教学目标 【知识目标】：

（1）描述人体的免疫功能。

（2）理解特异性免疫对人体的主要作用。（3）区别特异性免疫和非特异性免疫（4）说出计划免疫的意义。【能力目标】：

（1）通过收集资料，培养收集信息以及分析判断的思维能力。（2）通过交流,增强团结协作的能力。

（3）通过对知识的归纳提高自我总结的能力。【情感态度与价值观】：

（1）结合自身打预防针的亲身经历，深刻认识到党和国家关心下一代健康成长，为提高人口素质所进行的计划免疫的重要性，特别是改革开放20年来我国在医药卫生事业和传染病的预防方面所取得的伟大成就，增强爱国精神。（2）培养关爱生命的情感，并提高学习关注社会生活的主人翁意识及理论联系实际的情感。3教学重点和难点： 重点：特异性免疫与非特异性免疫的区别是本节课的重点。因为主要内容是特异性免疫和非特异性免疫，而且特异性免疫与非特异性免疫之间有联系又有区别，学生不容易区分，因此将特异性免疫与非特异性免疫确定为本节课重点。

难点：非特异性免疫的概念以及非特异性免疫所涉及的抗体、抗原的概念都比较抽象，是本节课的难点七年级生物下册《人体免疫》教案北师大版七年级生物下册《人体免疫》教案北师大版。

我会采用生活实例与教材紧密结合，合理运用挂图、课件和课本上水痘的例子让抽象知识具体化。4 学情分析

学生通过第13章1、2节的学习养成健康的生活习惯，拒绝吸烟、酗酒、吸毒，为人类创建健康的生活环境，以及预防传染病等的知识。同时，也在前面第九章、第十一章学习过了白细胞、皮肤，为这节人体免疫的学习打下了基础。学生从幼儿起已经接种疫苗，学生对打预防针有一定的了解，学生学习积极性高，他们非常希望学习人体免疫的知识。通过调察、比较、讨论和总结等学习方法，可以比较轻松地完成学习目标。5 教学过程

5.0课前准备：教师准备---皮肤挂图、白细胞吞噬病毒挂图、小肠上皮粘膜的挂图。学生准备---做好老师布置的调查表 流感水痘其他 爸爸 妈妈 自己

5.1情境导入（2min）

1、现在准备进入秋天时，正是感冒流行的季节，有的人始终很健康的生活，工作，学习，而有的人却未能幸免？

2、同学们是否还记得打预防针的经历，这些事实与人体的什么功能有关？

3、请大家拿出课前做的调查表，讨论和交流一下。

设计意图：通过情境导入，设置悬念，激发学生的学习兴趣，让大家思考而且学生在课前经过一次自己的小小调查，更能吸引学生对本节课的学习兴趣，让大家带着兴趣，进而更深入了解，进入课堂正题。

5.2非特异性免疫(15min)采用“科学探究模式”，具体步骤：准备——初探——交流——总结。课前老师将学生分成几个小组，结合教材，进行讨论，得出问题答案，每当一个小组说完后，教师都会提问：“还有无其他小组有其他答案？”让学生各抒己见，再向全班同学交流，得出正确结论。

1、探究一：看看下图，结合课本P112第一段话，思考以下问题：

(1)人体完整的皮肤为什么有保护和屏障的作用？为什么擦破了的皮肤又会发炎呢？

(2)我们在呼吸时难免会吸进细菌或尘埃，为什么大部分吸进的细菌或尘埃不能对人体构成伤害呢？(3)总结（1）（2）问题的答案说说人体第一道防线有什么？

学生活动一：4个同学为一个小组，结合图片与课本讨论老师提出的问题。然后小组代表回答问题。

（1）完整的皮肤组织细胞相连在一起，使细胞无法逾越。细菌侵入擦破了的皮肤导致感染（2）呼吸道粘膜上有纤毛，有清扫异物的作用。（3）人体第一道防线包括皮肤和粘膜

2、探究二：看看下图，结合课本P112第二段话，思考以下问题：

(1)感染后的皮肤为什么会出现红肿现象，有时还会化脓，为什么有时自己会痊愈？(2)人体的口腔有很多细菌，口腔上皮受伤后很快愈合，人体的唾液是否有杀菌作用？(3)总结（1）（2）问题答案说说人体第二道防线包括了什么？

学生活动二：4个同学为一个小组，结合图片与课本讨论老师提出的问题。然后小组代表回答问题。

（1）体液中的杀菌物质和吞噬细胞能杀死细菌，消除炎症（2）唾液有溶菌酶具有杀菌作用。

（3）人体第二道防线包括了白细胞的吞噬作用和唾液中的溶菌酶的杀菌作用。

教师总结：总结这两道防线在人体中的作用特：人人天生就有的，对多数病菌起作用的，而不是病原体侵染后才产生的，它的作用没有特异性七年级生物下册《人体免疫》教案北师大版学习总结。包括了皮肤和粘膜的屏障作用、白细胞的吞噬作用、唾液中溶菌酶的杀菌作用。这就是非特异性免疫5.3特异性免疫（15min）教师以情境导入到方式进入特异性免疫的教学。

教师：小时候大人跟我们说，不要和得了腮腺炎或得了水痘的人玩，但是，如果得了一次以后就再也不会得了。那时，我就天天盼着自己得腮腺炎，因为得了以后就再也不会得了。这是为什么呢？ 学生：有免疫力了。学生：抵抗力增强 学生：„„

教师：人体除了非特异性免疫外，还有更重要的特异性免疫。教师：患过水痘的人体内能产生一种特殊的蛋白—抗体，这种抗体具有抵抗水痘病毒的能力，使人不再患水痘。而引起人体产生抗体的物质叫做抗原。老师先播放感染水痘病毒的动画，让学生有一个感性的认识。

然后，教师再展示感染水痘病毒示意图，并分步详细解说产生抗体的过程。促进 结合 病原体（抗原）刺激吞噬细胞 淋巴细胞

使抗原失去致病性 抗体 产生

教师：有些同学会混淆了抗原与抗体的概念，大家可以通过抗原一般是病原体，病原体有一个原字，所以就是抗原，抗体一般在我们身体体内，所以，为我们人体排除和消灭病原微生物，维护人体健康的就是抗体。

教师：特异性免疫是后天获得的，专一的，免疫系统接受抗原刺激后产生抗体，抗体被清除后身体仍

保持产生相应抗体的能力。当同样的抗原再次侵入人体，人体就会产生大量抗体。这种免疫就是特异性免疫七年级生物下册《人体免疫》教案北师大版七年级生物下册《人体免疫》教案北师大版。

教师：非特异性免疫和特异性免疫都是排除和消灭人体的病原微生物，维护人体的健康。免疫还能及时清除体内衰老的、死亡的损伤的细胞；随时识别和清除体内产生的异常细胞（如肿瘤细胞）。

设计意图：利用水痘等生活中的实例，启发学生思考特异性免疫的过程，并结合图片，教师一步一步演示病毒侵入人体的过程，运用动画的形式，让抽象的知识直观化，形象化。5.4特异性免疫与非特异性免疫的区别（5min）

探究三：结合刚刚学过的知识和课本上P112-P113上的内容，填写下表 特异性免疫非特异性免疫 不同点范围 特性 形成 作用 相同点：

学生活动：独立完成表格，并派9位同学到黑板上完成表格。特异性免疫非特异性免疫

不同点范围对体外异物都有反应只对一种异物有反应 特性非专一性专一性

形成先天形成的后天形成的 作用弱强

相同点排除和消灭人体的病原微生物，维护人体的健康 讨论：运用本节课知识讨论刚刚在情境导入时提出的问题。5.5计划免疫和课堂拓展（3min）5.51教师设疑：（1）什么叫计划免疫，计划免疫有什么意义？

（2）给刚出生的婴儿接种卡介苗的目的是什么？接种百日破联合疫苗的目的是什么？（3）你有打过预防针吗？打过哪些？是预防什么病的？ 学生结合课本，得出正确结论。学生活动：（1）计划免疫是依据国家对消灭传染病的要求，在易感人群中，有计划地进行预防接种。意义：能有效地增强人体的免疫了。

（2）接种卡介苗的目的是预防结核病，接种百日破联合疫苗的目的是预防百日咳、白喉、破伤风。5.52课堂拓展

（1）免疫功能是不是越强越好呢？过强的免疫会导致什么结果呢？

不是，过强的免疫会导致过敏现象（2）医生给病人移植别人的肝脏，结果这肝脏没成活，为什么呢？ 人体的排异作用

（3）课本P114人接痘

（4）艾滋病 人体免疫 6 教学反思：

通过教学使学生认识到人体的保护功能是人体的免疫，其中非特异性免疫是人体的屏障，认识到皮肤损伤感染后自然痊愈的道理，人体的重要保护功能之一是特异性免疫，理解计划免疫的重要意义。学生在课堂上通过挂图、图片、动画演示等，充分认识到免疫的重要性。

本节课教学内容抽象，如抗体―抗原、特异性免疫的基本过程，学生学习后还是有一部分难理解，教材提供的实物资料少。在计划免疫这部分，学生虽然对预防接种有比较直观的认识，但是认识还是停留在表面现象。我认为，本节课的教学在预习时让学生从家长处了解预防接种的基本情况，如果有多媒体，教学效果会更好。

第四篇：细胞免疫疗法最新调研

细胞免疫疗法最新调研

一、以下为调研查到的确定开展细胞免疫疗法的医院（1）对细胞免疫疗法极力推荐的三甲医院：

1、广州复大肿瘤医院

 国内首批开展生物治疗卫生机构  国内率先开展联合免疫疗法治疗方案医院  同时开展T-plus肿瘤免疫治疗的研究与治疗  作术后及放化疗后的配合使用细胞免疫治疗

 多应用于：胰腺癌，肝癌，肺癌，食管癌，胃癌，乳腺癌

2、广州医学院附属肿瘤医院  国内首批开展生物治疗的卫生机构  研究：DC-CIK疗法  多应用于：肝癌、胃癌  应用病例已达几千余例（保留）

3、北京武警总队第二医院

 中华医学会肿瘤生物治疗课题定点医院  国内首家多细胞免疫治疗医院

 研究：CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞  多应用于：食道癌、肺癌、乳腺癌

 应用超过3000例

4、解放军458医院（广州） 细胞治疗作为放化疗的支持治疗  多应用于：肺癌、乳腺癌、肝癌  研究：DC细胞、CIK细胞、CAPRI细胞

5、天津医科大学附属肿瘤医院

 到2008年9月，应用CIK细胞对肿瘤患者实施免疫治疗，已进行300余例肺癌患者的治疗。

6、解放军第123医院（安徽） 安徽领先的肿瘤治疗医院  研究：DC-CIK疗法

 多应用：肝癌、食道癌、肺癌

7、漳州市医院（福建）

 生物免疫治疗中心：一天接待不超过5名患者

8、解放军第454医院（南京） 研究：DC-CIK疗法  多应用：食道癌、胆癌

9、吉林省人民医院

 吉林省生物免疫治疗最高可报90%  肺癌、胃癌

10、天津市人民医院

 多应用：黑色素瘤、食道癌

 研究：DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞、γδT细胞

11、辽宁省人民医院

 多应用：直肠癌、宫颈癌、乳腺癌  研究：CIK细胞

12、上海仁济医院

 应用：乳腺癌、肺癌

13、遵义医学院附属医院  多应用：鼻咽癌、乳腺癌

14、海口市人民医院

 海南生物诊疗报销比例可达90%  研究：DC-CIK疗法

 应用：胃癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌

15、洛阳市中心医院

 研究：NK细胞、T细胞（CLS生物疗法）

16、哈尔滨医科大学附属第四医院

 应用：肝癌、胃癌

 生物治疗中心每日限制最多6人就诊

17、解放军漳州175医院

18、武警山东省总队医院

 应用：肺癌、胃癌、肾癌、黑色素瘤

19、重庆市肿瘤医院

 研究：DC-CIK疗法

 应用：肺癌，曾应用于左腮腺米库林氏病

20、山西医科大学第二医院

（2）简单提及有开展细胞免疫治疗的医院

1、中山大学附属第一医院：简单提及

2、广州市第一人民医院：生物免疫治疗，“近期开展”。

3、广东省第二人民医院：免疫细胞治疗，肿瘤二科。

4、广州市红十字会医院：详细提及，肿瘤生物治疗。

5、广州军区总医院：生物治疗

6、中山大学肿瘤医院：简单提及。

7、南方医院：有生物治疗中心

8、广东药学院附属第一医院：自体细胞免疫治疗技术取得实质性进展

9、粤北人民医院：提及生物治疗。

10、深圳市人民医院：拥有生物治疗室。

11、佛山市第一人民医院：晚期肺癌和晚期胃肠癌的细胞免疫治疗。

12、中国医科院肿瘤医院（北京）

13、第二军医大学东方肝胆外科医院（上海）

（3）全国肿瘤排名较前并开展了细胞免疫治疗的医院：

1、中山大学肿瘤医院（排名第一）

2、中国医学科学院肿瘤医院（排名第二）

3、天津市肿瘤医院（排名第三）

4、第二军医大学东方肝胆外科医院（排名第五）

5、南方医院（排名第八）

——相信还有很多已开展了细胞免疫疗法，而未在官网或其他渠道宣传的三甲医院。

二、估算：

1、细胞免疫治疗现行应用较多的肿瘤类型为：肺癌、胃癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、乳腺癌。相关规定，三甲医院才能资格开展细胞免疫疗法。

2、开展生物细胞免疫治疗的三甲医院的比例：以广东65家三甲医院（2011年），可查的在官方网站记载有生物免疫疗法的，共有13家，比例达到20%，若按照这个比例，全国共有超过1000家三甲医院，则大约有200家三甲在开展生物细胞免疫治疗肿瘤。

3、治疗费用：综合几家明确给出价格参考的医院为依据，有治疗胃癌在2.5至5万一个疗程，肝癌在3万/疗程，另有2.6万/疗程。我们保守估计以2.5万/疗程作为参考值。

4、疗程的时间：可查的细胞免疫治疗过程为：采血、培养、回输三大块，送GMP实验室进行体外诱导6-7天，然后分5-6天，每天2次回输，约2周一个疗程。

5、市场容量的估算：以现时细胞免疫疗法的普及程度，按保守每家医院5例/月，广东省13家三甲1年约780例：2.5万/疗程* 780例=1950万左右；全国约12000例，市场容量在2.7亿到3亿间。

第五篇：免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术

用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。

一、白细胞的分离

（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。

本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。

（二）聚合物加速沉淀法

本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。

二、外周血单个核细胞的分离

外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。

（一）Ficoll分层液法

主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076～1.090之间。而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（图20-1）。

红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。

（二）Percoll分层液法

这是一种连续密度梯度离心分离法。Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。用Percoll原液(密度1.135)与约等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合，高速离心后，使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上，低速离心后，便得四个细胞层。表层为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单个核细胞(75％)，下层富含淋巴细胞(98％)(图-2)。该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各较好的方法，但操作流程较长，手续较多。

图-2 连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图

三、淋巴细胞及其亚群的分离

为研究免疫细胞的功能，常需高纯度的淋巴细胞或其亚群，分离方法介绍如下。

（一）、纯淋巴细胞群的采集

通常利用单核细胞在37℃和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞群。

（1）粘附贴壁法

将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。

（2）吸附柱过滤法

将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。

（3）磁铁吸引法

利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。

（二）、淋巴细胞亚群的分离

分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术。其原则是根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法；而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞是为阴性选择。常用以下几种方法：

（1）E花环沉降法

本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。

（2）尼龙毛分离法

本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1～2h。用预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞纯度可达80％。

（3）亲和板结合分离法

利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取（图-3）。同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。如要分离CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。用抗Ig抗体则可分离B细胞。同样，用活化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞。

图-3 亲和分离法图解

（4）荧光激活细胞分离仪分离法

荧光激活细胞分离仪（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）主要由4部分组成：①细胞流动系统及气压流速控制系统，②激光系统，③检测与讯号处理系统，④细胞分选系统。其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个/s），每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管（图-4）。用FACS分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行，但仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段。

图-4 荧光激活细胞分离仪简图

四、吞噬细胞的分离和收集

人外周血中单核－巨噬细胞可通过Pecoll密度梯度分离法获取，但数量较少，用血量多。用斑蝥敷贴法可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞，不需作进一步体外分离，细胞量损失较少。该法是用滤纸蘸取10％中药斑蝥酒精浸出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4～5h后皮肤局部充血，48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，内含巨噬细胞。但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染，应慎用。

欲获取小鼠、大鼠、豚鼠等小动物的巨噬细胞，可经腹腔内注入少许石蜡油，3～4天后冲洗出腹腔渗出液，所得细胞悬液中70％～80％为巨噬细胞。

五、淋巴细胞的保存和活力测定

（一）、分离细胞的保存

在某些情况下，分离所得细胞需要加以保存，否则活力迅速下降，甚至死亡。

（1）短期保存技术

将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。所用培养液要求等渗，具缓冲作用，并对细胞无毒性。通常置4℃保存较好，可减低细胞代谢活动。要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。

（2）长期冷冻保存技术

利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞，是当前世界上通用的细胞长期保存技术。其原理在于深低温环境可中断细胞的代谢，但在降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变均可导致细胞的损伤和部分死亡，所以在冷冻过程中一定要加用冷冻保护剂，常用的保护剂为二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。条件合适时，冻存细胞一旦复苏，恢复37℃培养，其形态和代谢活动均可恢复正常。操作的原则是先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含10％二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内，速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细胞的损伤。继而进行降温冷冻，目前常用两步降温法，即迅速降温至一选择好的临界温作为过渡站，如－80℃低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空间放置片刻，然后再放入液氮中。如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的活力，要求在20s以内完全融化。将冻存管自液氮中取出，立即放入40℃温水中，融化后即从水中取出，吸出细胞悬液，加入10倍的培养液中混匀，继而低速离心，尽快洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力，然后置37℃培养箱内培养。

（二）、细胞活力测定

细胞活力常用百分比表示，活力的大小对试验结果有很大影响。细胞活力的测定有许多方法，最简便常用的方法是台盼蓝（trypanblue）染色法。台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。免疫检测试剂中常用的防腐剂有硫柳汞、叠氮钠、抗生素等。

1.叠氮钠是HRP的抑制剂，凡是和HRP接触的试剂，一定不能用；

2.硫柳汞在ELISA试剂中可普遍使用，但因其有毒，较少使用；

3.市面许多试剂盒产品，用抗生素做防腐剂较多，如庆大。

4.如果试剂仅在实验室短期使用，其实并不需加防腐剂，常规试剂放4度冰箱，抗体、酶等加甘油分装冻存即可。

5.梅里埃生产的HIV诊断试剂中提到：对照血清的防腐用0.1g/L硫酸庆大霉素和0.2ml/L肉桂醛。

6.防污染可添加0.02%的叠氮钠，或0.01%的硫柳汞。叠氮钠在多数情况下有用且有效，但在有些实验中却不合适，因为它能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒医学 教育网 搜 集整理性，因此不能用于活体实验；因为含有氨基而能干扰许多标记方法；不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体。而硫柳汞不含氨基，不影响基质的稳定性。如果将抗体应用于生物活性检测、体内实验，一般不使用任何防腐剂，这些实验用的抗体应少量分装冷存，切忌反复冻融。

7.吐温-20是作为稳定剂，可减少非特异性黏合。甘油是防止冻融过程中的固-液相变而引起蛋白变性，能有效地增强蛋白质的稳定性，-20度冻存时甘油的浓度可以在20~30%。