第一篇：课程大纲-微生物限度检查
《微生物限度检查》课程教学大纲
学分：8学分
学时：144学时
适用专业：应用生物技术、生物化工等
一、课程性质和任务
1、课程性质：本课程是应用生物技术专业的必修课程。
2、课程任务：通过本课程的学习，使学员具备药品生物制品、食品和化妆品等相关企业产品日常卫生微生物限度检查的基本知识和技能，为产品常规卫生微生物检验把好质量关。
二、课程基本要求
1、了解生物制品、药品、食品和化妆品等各种产品卫生标准；
2、熟悉各种检品微生物限度检查项目；
3、能独立完成各种检品处理和梯度稀释，并按标准规定项目进行常规微生物限度检查；
4、能按菌数报告规则、控制菌形态特征等判定限度检查结果，并及时正确填写检验记录和报告。
5、能以积极心态养成安全、文明、无菌洁净操作习惯，树立强烈的责任心和质量无差错意识,保证检验结果真实可信。
三、教学条件
1、师资：具有药品、生物制品、食品和化妆品等卫生微生物检验工作经验的教师2人；
2、场地：项目一体化教学所需基本的实训室和设备如下：
六、教学说明
微生物限度检查属于微生物检定工中级工段的课程，适用于相关专业全体制和培训教学，教学采取一体化项目教学，教学过程学生2人一组互相配合；10个教学项目有三个层次，项目1-6注重不同的检测内容的能力培养，项目7-9注重产品卫生微生物检验多种内容的同步操作，项目10注重检验全过程系统化，同时将相关微生物的知识、不同检品的取样和样品处理、常见设备的使用分解到各个项目之中，与项目有机结合，实现了知识目标和能力目标的系统化。
考核方式：职业素质占20%，课程结束由学生、实训室管理人员和教师分别评分汇总；专业能力和创新能力占80%，分项目考核，项目1-9主要由教师对过程、结果和记录完成情况进行考核，前面注重过程，后边注重结果；项目10小组自选，完成结果全班交流，学生现场互评和教师评分结合。
七、教材和参考书
自编讲义《微生物限度检查》
参考书：《中华人民共和国药典》2010年版（现行版本）
《中国药品检验标准规范》2010年版（现行版本）
第二篇：微生物限度检查法标准操作规程
微生物限度检查法标准操作规程
一、目的：建立微生物限度检查的基本操作规程，为微生物检查人员提供正确的操作规程。
二、适用范围：适用于品管化验室的微生物限度检查。
三、职责：品管微生物检验员对本标准的实施负责。
四、正文： 定义：微生物限度检查法：系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。2 实验用具：
电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（365nm 波长）。3 培养基：
3.1 营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、乳糖胆盐培养基、蛋白胨水培养基。
3.2 培养基的管理、配制应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配制规程。试液：甲基红试液、a-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液。供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入试管中，加入适量的稀释剂制成1：10 浓度的供试品溶液。对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）441022]。取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1 白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18-20 小时，稀释至1：106，对照菌的加入量为50-100 个。8 检查法：
8.1 除另有规定外，细菌的培养温度为30-35℃，霉菌的培养温度为25-28℃，控制菌的培养温度为35±1℃。8.2 细菌、霉菌计数：
8.2.1平皿菌落计数法取均匀供试液，进一步稀释成1：102、1：103 等适宜的稀释级。分别取连续三级10 倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm 的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，等凝固后，倒置培养，每个稀释级应作2~3 个平皿。
营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。8.2.2 菌数测定阴性对照试验取供试验用的稀释剂各1ml，置4 个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。
8.2.3 细菌培养时间为48 小时，分别在24 小时及48 小时点计菌落数，一般以48 小时菌落数为准，霉菌培养时间为72 小时，分别在48 小时及72 小时点计菌落数，一般以72 小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。
8.2.4 点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
8.2.5 菌数报告规则：细菌宜选取平均菌落数在30-300 之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30-100 之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。如只有1 个稀释级菌落数在30-300（30-100）
之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有两个稀释级在30-300（30-100）之间时，按下式计算两级比值。比值=低稀释级平均菌落数稀释倍数
高稀释级平均菌落数稀释倍数
.当比值≤2 时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2 时以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有3 个稀释级的平均菌落数均在30-300（30-100）之间时，以后两个稀释级计算级间比值，如各稀释级的平均菌落数均不在30-300（30-100）之间，以最接近30 或300 的稀释级平均菌数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均小于30 时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如当1：10（1： 100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1：10）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。8.2.6 培养基稀释法：取供试液（原液或1：10 供试液）3 份，每份各1ml，分别注入5 个平皿内（每皿各0.2ml）每个平皿中倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后倒置培养，计数，每1ml 注入的5 个平板点计的菌落数之和即为每1ml 的菌落数，共得3 组数据，以3 份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1 时，则报告菌数为小于10 个。
8.3 控制菌检查除另有规定外，取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、cm2），直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验等项检查。8.3.1 大肠菌群：
8.3.1.1 检样稀释及培养
① 以无菌操作，将检样25g（ml）放于含有225ml 灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇或研磨做成1：10 的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好在均质器中以8000—10000r/min 的速度处理1min，作成1：10 的均匀稀释液。
② 用1ml 灭菌吸管吸取1：10 稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖不要接触管内稀释液），混合均匀，做成1：100 的稀释液。
③ 另取1ml 灭菌吸管，按上述操作顺序，做10 倍递增稀释液。如此每次递增稀释一次，即换用一支1ml 灭菌吸管。
④ 根据食品卫生标准要求或标本污染情况的估计，选择3 个合适的稀释度，每个稀释度接种三管。8.3.1.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml 以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml 及1ml 以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。8.3.1.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18~24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
8.3.1.4 证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1~2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
8.3.1.5 报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN 检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN 值。9 结果判断：
9.1 细菌菌落数、霉菌菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下的规定，应判为供试品符合规定；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不符合规定。
9.2 细菌菌落数、霉菌菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。
9.3 如营养琼脂培养基平板上生长霉菌菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，经复试2 次，如3 次结果平均值仍超过规定，应判为供试品不符合规定。9.4 各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按第一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不符合规定。
第三篇：上海师范大学环境微生物课程大纲（模版）
※≈70-75% ※+*≈90%
环境微生物学教学大纲（应化专业）
绪论
*微生物的概念
※微生物的分类(简单划分、三域系统、六界系统)细菌、古菌和真核生物的系统发育图 ※微生物的分类单位 *微生物的命名(双名法)※原核微生物和真核微生物各自的含义、区别 *微生物的特点
第一章
非细胞结构的超微生物——病毒 ※病毒的一般特征 *病毒的分类 病毒的构型
噬菌体、烟草花叶病毒、SARS的构型 *病毒的一般大小
最大病毒和最小病毒举例 ※病毒的化学组成
※病毒的结构及相关表述
*大肠杆菌T系噬菌体的繁殖过程
细菌/病毒的溶原性、溶原性细菌的特征 病毒的培养特征、病毒的培养基 病毒的培养（如何分离培养噬菌体）
第二章原核微生物
※本章提到的各种代表微生物（课件中提到的微生物）※古菌(Archaea)的一般特点
※古菌、细菌在六界和三域系统内所在的地位 细菌的形态 细菌的大小
※细菌的一般结构和特殊结构 ※细菌细胞壁结构（G+、G-）、组成与功能 *革兰氏染色法 *细胞膜的结构 细胞膜的功能 ※核糖体的作用
其他细胞质中的内含物 *拟核的概念及特点 芽孢的概念与作用
细菌的培养特征（如何通过培养判断细胞的运动性*）※细菌的电荷和等电点、革兰氏染色机理
*蓝细菌的主要特点蓝细菌的代谢（光合作用）蓝细菌的二纲及代表种属 蓝细菌与人类及环境的关系 *放线菌的定义、放线菌菌丝的形态、功能
*放线菌的繁殖方式、链霉菌的生活史 放线菌的菌落特征
*蓝细菌、放线菌、螺旋体、立克次体、支原体、衣原体的分类归属 ※名词术语：荚膜、菌胶团、菌落、菌苔
第三章真核微生物
※原生动物的一般特征、分类归属
一、原生动物的一般特征
（一）原生动物的概念、细胞结构和功能
原生动物是动物中最原始、最低等、结构最简单的单细胞动物；在活性污泥法废水处理中原生动物以吞食细菌为生，对净化污水起到一定作用, , 在污水处理中起指示作用；
*三类原生动物（肉足纲、鞭毛纲、纤毛纲）的代表种属 不同种类原生动物的主要习性及意义 原生动物的胞囊及意义
原生动物在废水净化中的作用
*微型后生动物的分类归属、代表种属 不同种类后生动物的主要习性及意义
※藻类的分类归属、营养类型
藻类的代表种属及环境意义（水体富营养化）
※真菌的分类归属、代表种属 ※酵母菌的概念
酵母菌特征、不同类型的细胞结构 *酵母菌的芽殖
*霉菌菌丝体结构、菌落特征 霉菌的类型
第四章微生物的生理
生物酶的概念、分类、作用 *NADH的功能
※酶蛋白的本质、酶的活性中心 酶的系统分类法、系统命名及编号
*酶催化特性、诱导契合假说、作用机理 *碳源的概念、作用 ※微生物的营养类型 *氮源的概念、作用 固氮微生物的概念 几种主要的无机盐所含元素的功能 *生长因子的概念
活性污泥所需的碳氮磷比 ※培养基的概念、种类
※营养物质进入微生物细胞的方式、各自的特征、异同
＋＋初级主动运输、次级主动运输及钠钾泵（Na-K－ATP酶）主动运输的运行机制 供氢体、受氢体概念
※ATP的概念及3种生成方式
*产能代谢的类型（3种）及其定义、比较 *发酵、好氧呼吸步骤
※EMP途经、三羧酸循环概念
发酵、好氧呼吸产能量、能量利用率 ※三大有机物有氧呼吸代谢途径
※电子传递体系概念、功能、细胞定位 电子传递体的组成第五章微生物的生长繁殖与生存因子
*世代时间、世代数的概念及计算
※生长曲线及各个时期特征
*间歇培养、连续培养的概念
※常规活性污泥法采用哪个生长时期的微生物? 测定微生物总数的方法有哪些？ *什么是CFU计数法? 废水处理中影响pH的因素
*根据微生物与氧的关系对微生物进行分类 *巴斯德效应
紫外线杀菌的原理 *消毒、灭菌的概念 重金属的杀菌机制
※微生物之间的关系及典型举例。
第六章遗传变异的物质基础
证明遗传物质是核酸的三个经典实验。核酸的组成 ※基因的定义
基因按功能分类(3种)※乳糖操纵子的功能 *中心法则的内容
*DNA的复制方式（半保留复制）原核生物和真核生物DNA复制的特点
*RNA的种类和功能（rRNA、mRNA、tRNA）*DNA的变性和复性 *遗传密码的涵义、数量，有意义密码子、无意义密码子的涵义 ※DNA如何指导蛋白质合成 ※驯化
*杂交、转化、转导的机制和过程 基因工程的定义 什么是超级细菌？
*什么是PCR技术？操作步骤?
第七章微生物的生态 *生态系统的功能； 种群、群落的概念 土壤微生物的特点 *土壤自净
空气微生物特点
空气微生物的测定：平皿落菌法； 贫营养湖、富营养湖概念
※水体自净及过程
*氧垂曲线
排污点下游污化带特征 *细菌菌落总数
*大肠菌群被选作致病菌指示菌的原因 ※水体富营养化
第八章微生物在环境物质循环中的作用 碳循环中心 植物残体成分
※纤维素的构成及转化 半纤维素的构成 木质素的结构
*淀粉的结构及转化 ※脂肪的结构及转化 ※氮的形态及氮循环
※氨化作用、硝化作用、反硝化作用 *固氮作用 硫的形态
*硫循环、硫化作用、反硫化作用
第九章水环境污染控制与治理的生态工程及微生物学原理 好氧活性污泥组成
*两种基本的反应器形式及特点（推流/全混）、※好氧活性污泥性质、功能中心、主体细菌、净化机理； 菌胶团（概念）及其作用 *氧化塘概念、生态特点； 原生动物、后生动物的作用； ※生物膜法（概念）； 生物膜结构 *生物膜法特点 厌氧消化概念
※厌氧发酵四个阶段；
第十章污、废水深度处理和微污染源水预处理的微生物学原理 *生物脱氮原理、脱氮微生物 ※脱氮工艺(传统A/O法)*硝化段、反硝化段运行操作关键点 水消毒的方法 ※氯的杀菌机制 *出厂水加氯的原则 不同形态氯消毒的特点
考试: 填空40分,专业名词解释(5个), 15分,问答45分
第四篇：微生物限度检验人员考试试题
2012年微生物限度检查基础知识考试试题 姓名： 分数：
一、填空题（1×35=35分）
1．微生物限度检查和无菌检查应在环境洁净度 级的局部洁净度 级的单向流空气区域内进行。
2.除另有规定外，微生物限度检查法中，细菌培养温度为，培养时间为 ；霉菌、酵母菌培养温度为，培养时间为 ；控制菌培养温度为，培养时间为。
3.除另有规定外，一般供试品检验量为 或 ；膜剂为 ；、的检验量可以酌减。其中沙门菌的检验量为 或。
4.检验时应从 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂不得少于 片；一般应 抽取不少于检验用量 倍量的供试品。
5.试验用菌株的传代次数不得超过 代。从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为 代。菌液制备后若在室温下放置，应在 小时内使用，若保存在，可在24小时内使用。
6.消除供试品抑菌活性的方法有、、、。
7.薄膜过滤法所用滤膜孔径应不大于 um，直径一般为50mm。若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为。总冲洗量不得超过。8.培养基配制的分装量不得超过容器的，以免灭菌时溢出；配制后应在 内灭菌，避免细菌繁殖。
9.供试液制备若需水浴加温时，温度不应超过 ℃，供试液自制备至加入培养基不得超过 小时。
10.洁净区测定沉降菌时，注入培养基的平皿应放置 分钟。
二、单项选择题（2×10=20分）
1.热力灭菌法分干热和湿热灭菌两类，并在同一温度下湿热灭菌效力较干热灭菌效力要强这是因为（）
A、可迅速提高温度 B、湿热有一定潜热、穿透力大，促进菌体蛋白凝固
C、迅速破坏细菌的酶系统 D、使细菌迅速失活 2.生物安全柜主要原理（）
A、干燥 B、空气经滤膜除菌后定向流动 C、空气定向流动 D、通风
3.培养基加入有供试品的平皿时的温度不宜超过（）A、45℃ B、50℃ C、48℃ D、60℃
4.药品微生物实验室所检测微生物的生物危害等级大部分为生物安全（）A、一级 B、二级 C、三级 D、四级
5.洁净实验室内的温度应控制在（），相对湿度最好控制在（）A、20～25℃，40～60% B、10～30℃，50～70% C、15～25℃，50～70% D、18～26℃，40～60% 6.操作间或净化工作台的洁净空气对环境的相对正压为（），操作间与缓冲间的相对正压为（）
A、不低于10帕，不高于5帕 B、不高于10帕，不低于5帕 C、不低于10帕，不低于5帕 D、不低于5帕，不低于10帕
7．检查结果如各稀释级的平板均无菌落生长或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，应报告（）A、0个 B、＜1 cfu C、0cfu D、＜1乘以最低稀释倍数的值
8.微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括（）检查
A、细菌数和霉菌数 B、细菌数、霉菌数及酵母菌数 C、细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌 D、细菌数、霉菌数、控制菌数 9.微生物限度检查验证试验至少应进行（）次独立的平行试验，各试验菌每次试验的回收率应不低于（）
A、3，70% B、2，80% C、3，80% D、2，70% 10.细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证时试验菌加入量规定为（）cfu，控制
菌计数方法验证时试验菌加入量规定为（）cfu。A、50～100,50～100 B、10～100,10～100 C、10～100,50～100 D、50～100,10～100
三、多项选择题（3×5=15分）
1.常用的清毒剂的种类有：（）A.75%乙醇 B.甲醛 C.碘酊 D.0.1%新洁尔灭 E.乳酸
2.下列（）不是无菌操作法的特点
A.无菌操作法是一个杀菌的过程 B无菌操作法是一个抑菌的过程 C.无菌操作法是一个消毒的过程 D.无菌操作法只能保持原有的无菌度 E.无菌操作的目的仅是为了防止待检品被环境中的微生物污染
3.2010版药典附录微生物限度检查法中，可选用的稀释液有（）A.pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液 B.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 C.pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 D.0.9%无菌氯化钠溶液 E.pH7.0无菌磷酸盐缓冲液 4.供试液的制备方法有（）A、匀浆法 B、研钵法 C、保温振摇法 D、振摇法
5.以下哪些是影响集菌培养效果的因素（）
A.温度和培养基 B.氧气和光 C.抗生素 D.渗透压 E、PH值和氧化还原电位
二、判断题（2×10=20分）
1．融化培养基可以选择用水浴或电炉直接加热，一次未用完的封存好可以再次使用。（）
2．培养时每垛最多堆放6个平板，以保证各个平板的受热均匀。（）3.配制培养基时若出现沉淀属正常现象，无需过滤，可以直接使用。（）
4.湿热灭菌条件就是指121℃15分钟。（）
5.从事药品微生物试验工作的人员只要具备微生物学或相近专业知识的教育背景就可以直接上岗。（）
6.若同一稀释级的两个平板的菌落数小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。（）
7.若营养琼脂培养基上长有霉菌、酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计菌落数，合并计算后报告菌数。（）
8.对供试品进行微生物限度检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物生长的存活无影响。（）9.平皿法操作时应先注入培养基，再加入1ml供试液。（）10.MUG阳性，靛基质阴性，判断未检出大肠埃希菌。（）
三、简答题（2×5=10分）
1.简述药品染菌的可能原因。
2.列举不少于五种的灭菌消毒方式。
一
1.1000、100
2.30～35℃，3天∕72h；23～28℃，5天∕120h；30～35℃，2天∕48h 3．10g，10ml，100cm；贵重药品、微量包装药品；20g、20ml 4.2，4；随机，3 5.5；0；2；2～8℃
6.培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法 7.0.45；100ml；1000ml 8.2／3，2h 9.45℃；1 10．30min
2二
BBABD
CDCAD 三
3.ABCDE;2.ABCE;3.ABCD;4.ABCD;5.ABCDE 四
×√×××
××√×× 五
1.一、二、三、四、2.水系统的内外部污染；
无菌室密封性差；环境卫生、个人卫生达不到要求； 设备和配件消毒不符合要求、物料物品消毒不彻底 生产中操作不当
1.湿热灭菌 2.干热灭菌 3.辐射灭菌 4.气体灭菌 5.消毒剂灭菌 6.紫外照射灭菌
7.过滤灭菌
第五篇：复方甲苯咪唑乳膏微生物限度检查方法的研究
复方甲苯咪唑乳膏微生物限度检查方法的研究
【摘 要】 目的：建立复方甲苯咪唑乳膏的微生物限度检查方法。方法：按《中国药典》2015年版第三部通则非无菌微生物限度检查法规定的常规法进行验证。结果：铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以常规法验证回收率均大于70%，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌菌液对照组和试验组生长良好。结论：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数采用常规的平皿倾注法，控制菌的检查采用常规法。
【关键词】 复方甲苯咪唑乳膏；微生物限度检验法；药品检验
【中图分类号】R286.0 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）11-0012-02
复方甲苯咪唑乳膏用于驱除蛔虫、蛲虫，其主要成分为盐酸左旋咪唑和甲苯咪唑。为了保证所采用的检验方法适合于该药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数以及控制菌的检查，确认供试液制备、测定方法及检测系统适用于该药品的检验。研究参照《中国药典》[1]2015年版第三部通则“1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”以及“1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、《中国药品检验标准操作规范》[2]，建立复方甲苯咪唑乳膏微生物限度检验方法，并进行方法适用性试验，现报道如下。仪器与材料
1.1 试验环境 根据2015年版《中国药典》第三部“9203药品微生物质量管理原则”[3]规定，试验在环境洁净度B级、局部洁净度A级的单向流空气的无菌室进行，阳性菌操作在符合国家Ⅱ级生物安全标准的生物安全柜内进行。
1.2 仪器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（苏州苏净仪器自控设备有限公司）；GHP-9162型电热恒温培养箱（上海金慧科电子有限公司）；MJX-160B-Z型微电脑霉菌培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海市博讯实业有限公司医疗设备厂）；TZQ-Ⅱ型匀质器型号（天津市津德实验仪器技术开发中心）。
1.3 材料 复方甲苯咪唑乳膏（批号：160101、160102、160103，宿州亿帆药业有限公司），0.1%无菌吐温溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（自配），胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号：20151210-00）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号：20160111-00）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号：20151110-00）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：20150716-00）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：20151026-00）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB，批号：20151112-00）等均由杭州微生物试剂有限公司提供。
1.4 试验菌种 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]等由中国医学菌种保藏中心和中国药品生物制品检定所提供，试验用菌株的传代次数为3代。方法与结果
2.1 菌悬液的制备及菌悬液菌落数的检查
2.1.1 菌悬液的制备 取经35℃培养18～24h的铜绿假单胞菌的TSB培养物1ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-6备用，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌用同样方法分别稀释至10-5和10-8备用，取经25℃培养2～3天的白色念珠菌的SDB培养物1ml，用上述方法稀释至10-5，备用；取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加4mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-6，备用。
2.1.2 菌悬液中菌落数的检查 取“2.1.1”铜绿假单胞菌10-6级菌悬液、枯草芽孢杆菌10-5级菌悬液、金黄色葡萄球菌10-8级菌悬液各0.1ml，分别用已灭菌的45℃胰酪大豆胨琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿；取2.1.3白色念珠菌10-5级菌悬液、黑曲霉10-6孢子菌悬液各0.1ml，分别用已灭菌的45℃胰酪大豆胨琼脂培养基和已灭菌的45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，按《中国药典》2015年版规定温度培养一定时间，计数，均应不大于100cfu/ml；实测结果见表1，符合要求。
2.2 供试液制备 取本品最小包装两支（10g/支），按微生物限度检查法规定称取10g，加40℃无菌0.1%吐温溶液至100ml，匀浆仪2000转/min，3min混匀，即为1∶[KG-*2]10的供试品溶液。
2.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验
2.3.1 采用常规法（即平皿倾注法）进行3次独立的平行试验。
2.3.1.1 试验组 取5支装有1∶[KG-*2]10供试液的试管，分别加“2.1.1”试验菌液0.1ml，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu，分别取上述试验液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，立即注入20ml温度不超过45℃熔化的无菌胰酪大豆胨琼脂培养基或无菌沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5d，逐日观察结果并记录。
2.3.1.2 菌液对照组 取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作。
2.3.1.3 供试品对照组 取“2.2”制备好的供试液，以无菌0.1%吐温溶液代替菌液同试验组操作。
2.3.1.4 阴性对照 取无菌0.1%吐温溶液1ml置90mm的无菌平皿中，立即注入20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5d，逐日观察结果并记录。
从表
2、表3可知，3次平行试验，试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值与菌液对照组平均菌落数的比值均在0.5～2范围内。
2.4 控制菌检查方法的适用性试验 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的适用性试验：按常规法进行三次平行试验。
2.4.1 试验组 分别取“2.2”中1∶[KG-*2]10供试液10ml及上述不大于100cfu/ml的铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌1ml，分别接种置90ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置35℃培养18～24h，按相应的控制菌的检查法检查。
2.4.2 菌液对照组 取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，同试验组操作。
2.4.3 供试品对照组 取1∶[KG-*2]10供试液10ml，以0.1%无菌吐温溶液代替菌液同试验组操作。
2.4.4 阴性对照组 取无菌0.1%吐温溶液11ml，接种置90ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置35℃培养18～24h，按相应的控制菌的检查法检查。
由表4方法验证结果可以看出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌菌液对照组、试验组生长良好，说明复方甲苯咪唑乳膏对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌无抑菌作用或抑菌作用较弱。讨论
3.1 由上述验证结果可知，三批复方甲苯咪唑乳膏在需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数检查的方法适用性试验中，平皿法对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌的回收试验均符合要求；从表4可知，控制菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查可采用常规法检查。
3.2 培养基影响 本次验证所用培养基均由杭州微生物试剂有限公司提供，在验证前每批培养基均应进行无菌及性能检查，符合2015版《中国药典》要求方可用于微生物方法验证。
3.3 菌种及菌液影响因素 《中国药典》2015年版要求选用标准菌株，实验所用黑曲霉菌株由中国药品生物制品检定所提供，其他菌株由中国医学菌种保藏中心提供，均选用第3代为试验菌，符合《中国药典》2015版实验菌株不得超过5代的标准。菌悬液制备完成后立即使用，未超过《中国药典》2015年版规定的“菌液制备后室温下放置，应在2h内使用”的要求。
3.4 培养条件影响因素 《中国药典》2015年版规定需氧菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30℃～35℃，培养时间不得超过3d，实验取33℃，培养3d，符合要求。霉菌和酵母菌采用沙氏葡萄糖琼脂培养基，20℃～25℃培养时间不超过5d，本实验采用25℃培养5d，符合要求。
3.5 稀释剂的影响 因乳膏供试品不易混和均匀，故实验过程中采用0.1%无菌吐温溶液溶解供试品，再用匀浆仪进行搅拌混合。然后用pH7.0无菌氯化钠未检出蛋白胨缓冲液（自配）稀释到合适稀释级，符合《中国药典》2015年版油脂类供试品处理要求。
3.6 菌落计数是方法验证实验过程中极为重要的一步，实验采用含菌量不大于100cfu/ml菌悬液，计数时应仔观察，必要时可借助放大镜、两人复核等方法，减少操作误差。
参考文献
[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（三部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：80-90.[2]中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[S].北京：中国医药科技出版社，2010：351-369.[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（三部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：220-221.（收稿日期：2016.04.11）
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