哺乳动物细胞核移植教案（最终版）

第一篇：哺乳动物细胞核移植教案（最终版）

哺乳动物细胞核移植教案

Chapter One Nuclear Transplantation of Mammalian cells

cartoonyang（中国生命科学论坛动物科学与动物医学 第1版主）

摘要：本文综述了近年来哺乳动物细胞核移植的相关进展。关键词：哺乳动物 细胞 核移植 进展 Introduction The merge of a sperm and an ovum(fertilization)recovers the diploid cell marking the beginning of the individual development.In the embryonic development, various types of cells are originated from the zygot such as muscle fibers, neurons and hemocytes etc.A question has been asked if the differentiated cells in the development could resume the initiation status or pluripotent stage under proper circumstances which could give rise to other tissues and even the body as a whole.Is the process irreversible? To answer the question, the famous German embryologist Spemman brought out the idea to transplant the nuclei of cells in the anaphase of development to denucleated ova restarting the process in 1938.The aim of the experiment is to testify the totipotency of partially or completely differentiated cells.In 1952, Briggs and King conducted the first nuclear transplantation in tadpoles.1n 1962, the nuclei transplant of gastrula endoblast bred fertile xenopus, which demonstrated the cells post gastrula stage do not undergo irreversible change.All these experiments show the inferior creatures like amphibian possess at least part of differentiated somatic cells could recover their totipotency to develop to adult stage with the effect of oocyte cytoplasma and this has laid the foundation for mammalian nuclear transplantation.引言

一个精子和一个卵子的结合（即受精），恢复二倍体，从而开始了一个个体的发育。在胚胎发育过程中，很多不同类型的细胞都是由受精卵发育开始的。它们有一些专门发育为肌肉细胞，有一些发育为神经细胞，还有发育为血细胞等。从这里就引出了一个问题：在哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分化，但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新恢复到发育的起始状态，再重新发育成其它类型细胞组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能性呢？细胞的分化是不是发生了不可逆的变化？为了回答这个问题，早在1938年，德国著名胚胎学家Spemann提出了将发育后期的胚胎核移到无核的卵子中使其重新发育的设想，实验的目的就是为了检验部分分化或完全分化细胞的全能性。他通过头发结扎将蝾螈的受精卵一分为二，有核部分可正常发育和卵裂，并发育到16细胞期，无核部分当移入另一个卵裂球的细胞核时，也能发育成为正常的幼虫，证实了蝾螈未分化的卵裂球具有发育的全能性。1952年，Briggs和King等将已发生了分化的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚，最后发育出了完整的蝌蚪。这是首次进行的细胞核移植尝试获得成功。Gurdon等（1962）利用原肠期内胚层细胞进行核移植，分别产下可育爪蟾。由此证明：自原肠胚以后的细胞仍然没有发生不可逆的改变，可以支持核移植胚发育到成体。这些实验结果证实，两栖类等低等动物至少有部分已分化的体细胞在卵母细胞质的作用下，可以恢复其全能性而重新发育到成体。这也为哺乳动物核移植奠定了基础。1哺乳类动物细胞核移植研究进展 1.1哺乳类动物胚胎细胞核移植研究进展

哺乳动物核移植研究始于1975年，研究远远晚于两栖类动物，其主要原因是由于哺乳动物的受精在体内发生，而且哺乳动物早期胚胎的体外培养（In Vitro Culture, IVC）技术和早期胚胎显微操作技术在当时没有建立起来。牛津大学Bromhall（1975）将兔子的胚胎细胞核移植到未受精的卵母细胞内，部分可发育到囊胚阶段，但成功率相当低。由于不能进行染色体和供体特异性标记分析，因而这些发育的胚胎来源是否是注入的细胞核，或者是胚胎自身的细胞核都不能作一清楚的解释。鉴于当时的哺乳动物核移植理论和技术都尚未完善，人们大多将研究的重点放在了卵裂球的分离和胚胎切割上。然而，由于胚胎分割和卵裂球分离技术本身的局限性，动物克隆的数量非常有限，未能达到人们所希望的预期效果，于是人们一直也在探索动物核移植的克隆方法。在1981年，Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的内细胞团（Inner Cell Mass, ICM）的细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆的小鼠。这是世界上首次获得哺乳动物克隆成功的报道，但是其实验未被其他的研究人员所重复，人们仍对核移植技术仍缺乏信心。直到1983年这种局面才被Mcgrath和Solter打破，他们首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高，人们对核移植技术的应用前景看到了希望。随着核移植技术程序的建立，哺乳动物细胞核移植的研究发展很快。1986年，Willadsen等用绵羊早期胚胎的卵裂球作供体，用去核的第二次减数分裂中期（Second Meiotic Metaphase, MII）卵母细胞作受体，并用电融合的方法代替了仙苔病毒诱导供体卵裂球与去核卵母细胞融合，研究发现电融合方法比病毒融合法更有效，核移植胚胎的体外发育能力更强，重组胚移植后获得了核移植后代，这是首次在家畜上获得了成功。他们的实验阐明了哺乳动物胚胎细胞核移植中两个全新的观念：（1）作为核受体，卵母细胞比受精卵有更大的优越性；（2）绵羊桑椹胚的细胞核具有发育的全能性，并建立了以早期胚胎卵裂球为供体，MII期卵母细胞为受体胞质以及用电融合方法诱导供体细胞核和受体胞质融合这一整套技术。该技术极大推动了核移植技术的发展，并成功运用于其它动物，获得了胚胎克隆牛（Prather et al, 1987）、兔（Stice & robl, 1988）、猪（Prather et al, 1989），和猴（Meng et al, 1997）等。虽然胚胎细胞核移技术的发展总体相似，但是各动物胚胎细胞核移植的发展过程是有所不同的，下面将分别对各种哺乳动物的胚胎细胞核移植技术研究进展作一简单的概述。1.1.1小鼠

小鼠的胚胎细胞核移植的研究开展较早，也是最早获得了核移植后代。1981年，Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的ICM细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆小鼠。1983年，Mcgrath和Solter首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高。除了这些取得突破的研究外，Hoppe和Illmensee（1981）的研究证明了孤雌生殖胚胎的ICM细胞含有发育个体所需的所有基因，这些细胞具有发育的全能性。在细胞周期的调整和核质互作上，Cheong等（1993）发现细胞周期早期的胚胎细胞核在受体细胞质中可以发生发育程序的重排，核移植胚胎的发育率明显提高，并获得了核移植后代。1996年，Kwon和Kono等通过改进方法，获得了4个和6个遗传上完全相同的继代核移植后代。另外有研究表明，小鼠囊胚期的滋养层细胞与ICM细胞一样具有发育的全能性（Tsunda & Kato, 1997;Sotomaru et al., 1999）。1.1.2 牛

实验动物中的胚胎细胞核移植研究为家畜的核移植研究奠定了扎实的技术基础。而在家畜中，牛的胚胎细胞核移植研究的历史较为久远，研究的投入是最大的，也取得了丰硕的成果。1987年，Robl等首次进行牛的核移植研究，他们将1-8细胞期胚胎的细胞核移到去核的合子内，结果1-细胞期胚胎的细胞核移植后构成的重组胚可以发育到出生，而处于其它细胞期的胚胎细胞核移植后均不能支持重组胚发育超过4-细胞期。同年，Prather等（1987）用Willadsen相同的核移植技术程序（Willadsen, 1986），将16-32细胞期胚胎的卵裂球移入去核的体内或体外成熟卵母细胞内，最后出生了1头核移植牛犊，其成功率为1%。Bondioli等（1990）用16-64细胞期胚胎作核移植供体，获得了7头来自同一核供体胚胎表现型的牛犊，移植的成功率达20%。Stice和Keefer（1993）获得了54枚来自同一供体胚胎的克隆胚胎，其第一、二、三代克隆胚胎移植后均产下了牛犊。Ector等（1995）克隆与再克隆囊胚发育率（12.9%与14.9%）和妊娠率（35.7%与33.3%）没有差异性。而Heyman等（1995）用体外受精（In Vitro Fertilization, IVF）胚胎作为核移植供体，核移植胚胎的囊胚发育率达到了22.6%，这与体内胚胎作为核移植供体核的囊胚发育率相似（30.2%）。而在国内这方面的研究也取得了进展，李雪峰等（1996）成功的获得了我国第一头胚胎克隆牛。1.1.3猪

1989年Prather等利用合子间的原核交换，并利用电脉冲使供体原核和去核合子融合，得到了7头仔猪，而利用2-8细胞期胚胎的核融合去核的MII期卵母细胞，体内移植后形成11%的桑椹胚，移植88枚核移植胚胎至受体母猪仅生下了1头仔猪，成功率不到1%。因此后来的研究也着重转向影响猪胚胎细胞核移植的因素。同牛一样，猪的核受体卵母细胞既可用体内成熟的也可用体外成熟的（Prather et al., 1991）。但由于当时卵母细胞的体外成熟培养系统还不够完善，使得体外成熟卵母细胞质量较差而不能完成胚胎的体外发育全过程（Nagashima et al., 1992）。Prather等（1990）在研究发现，猪核移植胚发生了发育程序的重排，出现供体核膨胀，并认为核的膨胀程度与卵裂球的发育时期无关。在猪卵母细胞激活上，研究表明：采用合适的场强1次电脉冲就足以激活猪卵母细胞，增加脉冲次数并不能提高激活率（Prather et al., 1989;Prochazka et al., 1992;Nagashima et al., 1992;赵浩斌等, 1999）。而在胚胎发育的早期阶段基因表达和蛋白质合成研究中，也有了初步的成果。Schoenbeck等（1992）研究表明猪胚胎基因组从4细胞期的16h开始控制发育，Prather 和 Rickords（1992）的研究发现RNA的合成与加工始于4细胞期的24h，并认为卵母细胞质对核的重排不受母体-合子转变（Maternal to zygota transition, MZT）的影响。Parry和Prather等（1995）将8-细胞期胚胎的卵裂球融合于去核MII期卵母细胞内，发现在核移植胚胎上发现有51KD的蛋白质带，并证明了蛋白质是由胚胎卵裂球带入的RNA所合成的。

我国窦忠英（1997）和赵浩斌等（1997）用与Prather等（1989）相同的方法得到了克隆猪。1.1.4 兔

兔子胚胎细胞核移植研究起始于1975年，Bromhall等首次将兔桑椹胚的卵裂球细胞注入到成熟后激活的卵母细胞内，得到了发育的囊胚。Stice和Robl（1988）用电融合方法将8-细胞期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内，获得了世界首批6只基因型完全相同的核移植兔。随后Collas和Robl（1990）改进电激活和电融合技术，以16-细胞期胚胎细胞核为供体核，230枚重组胚移植后有23只仔兔出生，这是到目前为止效率最高的报道。Collas和Robl在兔的细胞核移植上的贡献特别大。他们的研究为以后的体细胞核移植奠定了基础。他们在兔核移植胚胎细胞核质同步对核移植的影响以及供体核形态结构变化上进行了详细的研究，得出了如下的研究成果：随着供体胚胎的发育，胚胎卵裂球构建的重组胚发育力下降，囊胚期ICM细胞构建的重组胚仍可发育到囊胚，而滋养层细胞构建的重组胚发育阻滞于8-细胞前，供体细胞核的形态重塑对核移胚的发育有利（Collas & Robl, 1991）。G1期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内时，重组胚发生早熟性染色体凝集（Premature Chromosome Condensation, PCC），中期染色体和纺锤体形态正常，核移植胚的囊胚率发育率也高，而早S期和晚S期的卵裂球移入MII期去核卵母细胞时，中期染色体和纺锤体出现异常，核移植胚胎的发育率降低（Collas et al，1992a, b）。在Collas和Robl（1991）的研究理论指导下，Yang等(1992b)将采集的8-细胞期胚胎经体外培养20～24h发育到32-64细胞期后的卵裂球再用作核移植的供体细胞核，获得了8只仔兔，证明了体外培养到32-64细胞期的胚胎仍具有发育的全能性。黄少华等（1993）首次实验证明，兔冷冻-解冻胚胎也能进行核移植，其结果与新鲜胚胎的的核移植胚在激活率、融合率及分裂率上无显著差异。之后，我国科学家王斌等（1995），周琪等（1996, 1999）也获得了胚胎细胞核移植兔。在兔核移植研究中一般体内成熟的卵母细胞作为受体胞质，Park等（1998）尝试了用体外成熟14h的卵母细胞进行核移植，发现用兔体外成熟卵母细胞同样可以获得核移植后代。关于兔继代核移植报道较少。1995年，周琪等获得了第三代继代核移植兔胚。1998年，Rao等尝试用冷冻保存的兔核移植胚胎进行继代核移植，得到了继代核移植囊胚，但未得到后代。Piotrowska等（2000）用兔8细胞胚胎卵裂球进行继代核移植，发现重组胚的发育率无影响，将第三代继代核移植重组胚移入受体后获得了克隆个体。1.1.5羊

绵羊是继小鼠后第二个获得核移植后代的哺乳动物，也是最早获得核移植后代的家畜。早在1986年，Willadsen用8-16细胞期的胚胎作为核移植供体，首次用去核的MII期卵母细胞作为核移植受体，并用电融合方法代替仙苔病毒来诱导供体卵裂球细胞与受体胞质相融合，获得了核移植后代。该方法成为以后核移植的常规方法，为以后其它家畜胚胎细胞核移植和体细胞核移植的成功奠定了技术基础。随后Smith和Wilmut（1989）用绵羊16-细胞和ICM作为核移植供体，采用该方法进行核移植，都得到了活的后代，该研究首次证明了绵羊ICM细胞仍具有发育的全能性。Pugh等（1992）的研究表明，绵羊体外成熟卵母细胞可用于构建核移植胚胎。1997年，Liu等在研究供体细胞与卵母细胞周期的协调性对核移植胚胎体外发育的影响发现，M期卵裂球移入MII期卵母细胞可以提高核移植胚胎的发育率（Liu et al., 1997）。

在国内，山羊的胚胎细胞核移植在国际上一直处于领先地位。1991年，张涌等利用4-32细胞胚胎卵裂球作为核移植供体，去核的MII期卵母细胞作受体，构建的重组胚胎移植后出生了世界首批核移植山羊5只，这是我国在哺乳动物细胞核移植上的首次获得成功。1995年，邹贤刚等通过胚胎继代核移植的方法获得了山羊4只。1.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展

Gurdon等（1962;1975）用爪蟾，Diberardino & Orr（1992）用蛙分化的细胞进行核移植都得到了蝌蚪，证实了在两栖动物上至少部分已分化的细胞具有发育的全能性，细胞分化后在基因组上没有发生不可逆的改变，基因组上存在重新启动发育所需的所有基因，这一理论为哺乳动物体细胞核移植研究奠定了理论基础。Czolouska等（1984）的研究表明已分化的小鼠胎儿胸腺细胞移植到激活的卵母细胞后可以发生形态重塑，形成原核样结构，推测体细胞能够支持胚胎的发育。后来，Kono等（1991）报道了用小鼠胸腺细胞核移植后得到了发育的囊胚，但移植后未获得分娩的核移植小鼠。由于当时普遍认为哺乳动物的细胞分化在遗传结构上发生了不可逆的改变，部分基因发生缺失，进而失去了发育的全能性，这些研究结果未引起人们的重视。直到1997年，Wilmut等得到了举世瞩目的第一只成年体细胞核移植绵羊—Dolly后，体细胞核移植才受到广泛的关注，人们才开始重新认识细胞分化的本质以及细胞分化的理论基础。当然，人们对―Dolly‖羊也提出了置疑，但DNA指纹分析证明了Dolly的确来自成年绵羊乳腺上皮细胞（Ashworth et al., 1998;Signer et al., 1998），后来众多的体细胞核移植的成功充分肯定了该研究的结果（Schnieke et al., 1997;Wakayama et al., 1998;Bulter et al., 1998;Shiga et al., 1999;Lanza et al., 2000b）。Dolly的出生，使哺乳动物核移植研究进入了一个崭新的阶段，Wilmut等建立的一整套绵羊体细胞核移植程序，如恢复体细胞核全能性的―血清饥饿法‖，体细胞传代阶段确定以及体细胞克隆后代与亲本核供体间的DNA微卫星分析技术成为全世界同行公认的哺乳动物体细胞核移植技术的基本程序。

在短短的几年里，核移植研究从胚胎细胞核移植转入了体细胞核移植研究阶段，世界各地的科学家对各种类型的体细胞核移植进行了有意义的尝试。用胎儿细胞和成年动物体细胞进行核移植的研究进展迅速，所使用的供体细胞也越来越来广泛，并取得了重大进展。迄今为止，已有下面9种供核类型的体细胞核移植后代产生。

（1）胎儿成纤维细胞：Cibelli 等（1998）采取34日龄牛胎儿成纤维细胞产下了后代。之后Vignon 等（1999）重复了此实验，也获得产仔的结果。后来相继得到了克隆山羊（Baguisi et al., 1999;Keefer et al., 2002），克隆猪（Onishi et al., 2000）和克隆兔（Chesne et al., 2002）。（2）成体乳腺细胞：Wilmut等（1997）从妊娠母羊乳腺中采取细胞，重复Campbell等（1996）的实验方法，成功获得了世界首例成年绵羊体细胞核移植后代—Dolly。之后，Zakhartchenko等（1999a）用1 头3岁的牛乳腺上皮细胞核移植得到了克隆牛。

（3）卵丘/颗粒细胞：Wakayama 等（1998）分离卵母细胞周围的卵丘细胞作为核供体细胞，不经培养直接作核移植，获得50多只克隆小鼠。这是继―多利‖后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。之后也相继研究成功克隆牛（Kato et al., 1999;Wells et al., 1999）、克隆山羊（Baguisi & Overstron, 2000）和克隆猪（Polejavea et al., 2000;Cabot et al., 2001）。

（4）卵管/子宫上皮细胞：Kato 等（1998）进行了输卵管上皮细胞核移植实验，核移植后共获得94枚融合胚，其中24枚发育到囊胚阶段，移植4枚胚胎，最后产下3头牛犊。

（5）肌肉组织的细胞：法国科学家Bulter等（1998）、Vignon 等（1998）报道了用胎儿肌肉细胞作供体得到了核移植牛。而Shiga 等（1999）采取2岁公牛肌肉细胞，传代培养至少4代，经血清饥饿法或不经血清饥饿法培养均产出牛犊。

（6）成体耳部成纤维细胞: Kubota等（2000）用1头17岁老牛的耳缘皮肤成纤维培养传代至15代，用于核移植，得到了6头核移植牛犊。之后，Park等（2002）采用成体耳部成纤维细胞也获得了克隆猪。

（7）睾丸支持细胞：Ogura等（2000a）采用未成熟的小鼠睾丸支持细胞进行体细胞核移植而获得了克隆小鼠。

（8）小鼠尾尖细胞：Wakayama和Yanagimachi（1999）采用成年小鼠的尾尖细胞得到了核移植后代。接着Kato等（1999）和Ogura等（2000b）也分别得到了来自小鼠尾尖细胞的克隆小鼠。

（9）初乳的乳腺上皮细胞：Kishi等（2000）用从初乳中分离出的乳腺上皮细胞作核移植获得了2只克隆牛。

综上所述，自体细胞核移植绵羊成功后，体细胞核移植后代已在牛（Kato et al., 1998）、小鼠（Wakayama et al., 1998）、山羊（Bagsuisi et al., 1999）和猪（Polejaeva et al., 2000;Onishi et al., 2000）等动物上获得了成功，下面将对各动物种类的研究进展进行综述。1.2.1小鼠

小鼠体细胞核移植研究所采用的方法与其它动物有所不同，在其它动物中所采用的方法是电融合法，小鼠上常用的方法是细胞质内注射法，即通过显微操作将供体细胞直接注入去核卵母细胞内。1989年，Tsunoda等尝试将雄性小鼠的胎儿原始生殖嵴细胞移入去核的合子内，构建的重组胚大多未发育到囊胚。1995年，Kato和Tsunoda的研究证明了胎儿生殖细胞具有发育的全能性或多能性。接着Kimura和Yanagimachi（1995）和Sasagawa等（1998）的研究证明成熟个体的生殖细胞（初级、次级精母细胞）具有发育的全能性，其中Sasagawa等（1998）的移植胚胎经移植后出生了2只小鼠。

1998年，Wakayama等（1998）采用不经过培养的小鼠卵丘细胞作为核供体，直接注射给去核的卵母细胞，得到了10只可育的小鼠，这也是继―多莉‖后第二批哺乳动物体细胞核移植后代，它的成功有力地支持Wilmut等（1997）的试验结果。Wakayama等（1998）同时还进行了公鼠睾丸支持细胞和雌鼠神经细胞的核移植实验并获得了附植的结果，但均中途流产。但是Ogura等（2000a）用来源于未成熟的睾丸支持细胞作供核进行细胞质内注射，获得了后代。用小鼠尾尖细胞作供核，也获得了克隆小鼠（Wakayama & Yanagimachi, 1999;Kato et al., 1999;Ogura et al., 2000b）。其中值得一提的是，这次Ogura等（2000b）采用的是电融合方法获得克隆小鼠的。1.2.2牛 在哺乳动物的体细胞核移植研究中，牛的核移植研究是当今的热点，并取得了重大进展。早1995年，Delhaise等就用核移植方法证明来自牛雄性胎儿的原生殖嵴细胞在受体胞质内可以发生发育程序的重编，核移植胚可发育到囊胚。1997年，Lavior等以牛新鲜和冷冻的卵原细胞，早期卵裂球和颗粒细胞为供体构建重组胚，结果重组胚在融合后40h的卵裂率无明显差异，且由这些供体构建的重组胚有部分可以发育到囊胚期，当来自卵原细胞的桑椹胚和囊胚移植到受体后，重组胚可以发育为胎儿和胚外组织。这些都为体细胞克隆牛奠定了基础。Kato等（1998）和Cibelli等（1998）分别用成年牛的卵丘细胞、输卵管上皮细胞和转染的胎儿成纤维细胞作为供体得到了体细胞核移植牛犊。几乎同时，法国科学家也报道了用胎儿肌肉细胞经过培养传代后作供体得到了核移植牛（Bulter et al., 1998;Vignon et al., 1998）。而Shiga 等（1999）采取2岁公牛肌肉细胞，传代培养至少4代，经血清饥饿法或不经血清饥饿法培养均产出牛犊。Hill等（2000a）用血清饥饿法处理牛胎儿成纤维细胞后在进行核移植，可显著提高重组胚的囊胚形成率，而血清饥饿法处理对成体成纤维细胞的核移植胚胎的发育没有影响。Wells等（1999）从活体牛卵巢内采集得到颗粒细胞作为核供体，获得了10头核移植牛，成功率达到10%。杨向中实验室于2000年3月公布了用17岁龄公牛的耳部成纤维细胞，成功得生下了6头克隆牛（Kubota et al., 2000）。Oikawa等（2000）从一头20岁的日本黑牛获得了颗粒细胞，经传代培养（5代）和血清饥饿培养后，核移植后获得了2头牛犊。由此可见，核移植技术可为濒危动物拯救开辟了一条新的途径。1.2.3猪

相对于其它动物而言，猪的体细胞克隆研究困难较大，进展很慢。在1995年，Liu等就将猪原始生殖细胞（Primordial Germ Cells, PGCs）移植到兔卵母细胞质内，核移植胚胎卵裂并发育到4-细胞期。Tao等（1999）和Prather等（1999a）在完善猪卵母细胞体外成熟和胚胎体外培养技术后，用体外培养的卵母细胞和胎儿成纤维细胞获得了发育到囊胚期的核移植胚胎12枚，从这些结果也可以发现猪胎儿成纤维细胞在去核的卵母细胞内同样可以发生发育程序的重编，预示着猪体细胞核移植即将获得成功。接着Ott 等（2000）、Uhm 等（2000a）、Verma 等（2000）和Koo 等（2001）等利用胎儿成纤维细胞和卵丘细胞与体外培养卵母细胞构建重组胚都发育到了囊胚阶段。Kim 等（2000）的研究发现，用胎儿成纤维细胞进行核移植所构建的重组胚的转录和DNA合成发生在24h。2000年3月，PPL公司宣布通过体细胞核移植技术获得5头世界上的第一批体细胞克隆猪（Dave, 2000）。2000年8月，Onishi等将胎儿成纤维细胞直接注入体内成熟去核的卵母细胞内，得到了1头雌性仔猪。同年，Polejaeva等（2000）改进核移植方法，先将颗粒细胞与去核卵母细胞融合，当核移植胚胎发育到原核期后再进行核移植，将核移植胚的原核与体内受精的原核期受精卵的原核进行交换，胚胎移植后由185枚胚胎获得了5头白色的仔猪，核移植效率达到1.2%（Polejaeva et al., 2000）。Betthauser等（2000）也报道了体细胞核移植的4头健康的雄性仔猪。随着猪体细胞核移植技术的发展，人们在研究如何提高核移植胚胎体外发育率（Betthauser et al., 2001;Klocke et al., 2001;Kuhholzer et al., 2001a, b）和利用皮肤成纤维细胞进行核移植的同时（Roh et al., 2001），逐步将研究重点转向转基因克隆猪的研究（Park et al., 2001;Uhm et al., 2000b;Koo et al., 2001）。2001年 4月，PPL公司宣布他们在去年得到体细胞核移植猪后，又通过体细胞核移植的方法得到了5头带有人类基因的转基因猪，这些猪可望减小与人体器官的免疫排斥反应，为人类提供可移植的器官（网上新闻报道，见PPL公司主页www.xiexiebang.com）。正因为转基因猪具有如此巨大的商业价值，利用体细胞核移植技术生产转基因猪是未来猪体细胞核移植的主要方向。1.2.4兔

兔的体细胞核移植的研究进展相对较慢。Moens等（1996）将妊娠18-20天的兔胎儿生殖细胞与去核卵母细胞融合，来自雄性和雌性性腺细胞的重组胚卵裂率相同（均为37%），而用培养4天后雄性性腺细胞构建的重组胚囊胚发育率（16%）明显高于雌性的（4%），表明了雄性和雌性二倍体生殖细胞在去核卵母细胞的发育程序重编潜力不同。Yin等（2000）将卵丘细胞经传代培养3-5代后，与去核卵母细胞融合，用电脉冲和6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）结合激活重组胚，其卵裂率和囊胚率发育率分别为66%和23%，174枚重组胚移植到8只受体后，在其中3只受体上观察到3个植入位点，但未发现胎儿。Dinnyes等（2001a）以兔耳部成纤维细胞为供体构建重组胚，得到与Yin等（2000）相近的卵裂率和囊胚发育率。我国的李光鹏（2000）用肌纤维细胞为供体，重组胚囊胚发育率为37.1%。Chensne等（2001）发现卵丘细胞构建的重组胚的囊胚发育率（46.7%）明显高于胎儿成纤维细胞（3.6%），但后者则获得了产兔的结果（Chesne et.al., 2002）。1.2.5羊

Ledda等（1996a）将羊PGCs植到去核的卵母细胞内，重组胚在体外可以发育，但移植后未出生后代。1997年，Wilmut等用成年绵羊乳腺上皮细胞克隆出了世界上第一头首例体细胞核移植羊，这也是人们在长期进行体细胞核移植研究所获得的突破性成果。Wells等（1997）采用与Wilmut等（1997）相似的方法，从一枚8天的羊雄性囊胚的ICM获得了细胞，体外培养后建立细胞系，用低浓度血清诱导G0期，分别移植到去核体内、外成熟的卵母细胞内，最后获得了3只雄性羔羊。克隆羊克隆牛的技术程序相似，但克隆绵羊大多采用体内成熟的卵母细胞作受体胞质。克隆羊的效率也和所报道的克隆牛的效率相似（Colman, 2000）。转基因克隆羊的研究也取得了重大突破，已相继研究成功转基因克隆绵羊（Schnieke et al., 1997;McCreath et al., 2000）和克隆山羊（Keefer et al., 2001）。

我国克隆羊的研究进展很快，郭继彤等（2000）用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作为核移供体，将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内，获得了两只遗传上相同的体细胞核移植山羊，这也是世界上首批成年体细胞克隆山羊。在转基因克隆羊的研究上，也取得了一定的成绩。安晓荣等（2001）报道用体细胞克隆出了绵羊转基因囊胚。成勇等（2002）以转基因山羊体细胞为供体细胞克隆出转基因山羊。1.3胚胎干细胞核移植研究进展

胚胎干（Embryonic Stem, ES）细胞是早期胚胎细胞或囊胚ICM细胞经抑制分化后培养而筛选出来的一类全能性细胞，这种细胞具有正常的二倍体核型，它既可以在特定条件下进行无限增殖而不发生分化，又可以在特定条件下分化为包括生殖系在内的各种细胞和组织（Evans & Kaufman, 1981）。此外，将从胎儿的原生殖嵴分离出来的PGCs进行培养，也可以形成在功能和形态上与ES细胞相似的细胞系。ES细胞具有体外发育的全能性，并且可以在体外无限传代，因此，它是动物克隆的理想供体细胞。ES细胞作为核移植供体细胞与体细胞的制备方法类似，亦需进行细胞周期的调控。

迄今为止，只有在小鼠和人已培养建立ES系，而牛、兔、羊、猪仅获得了拟干细胞，因此用真正的ES细胞进行核移植只有小鼠是获得了成功（Wakayama et al., 1999b）。

在研究早期，Tsunda和Kato等（1993）将小鼠的ES细胞移入去核卵母细胞内，核移植胚胎体外发育到桑椹胚和囊胚期，移植到受体后也发现有植入位点，但未获得核移植后代。Sims和First（1994）将培养的ICM注入到去核卵母细胞，获得4头牛犊。Campbell等（1995）将山羊第三代的ES样细胞进行核移植，获得了活的核移植羔羊。猪的ES样细胞，在核移植后可以指导胚胎发育到囊胚阶段，目前仍没有活的后代出生（Chen et al., 1999）。虽然牛ES样细胞经过核移植后，出生的后代在生后不久死亡，但也证明了牛ES样细胞可以参与胎儿的发育，具有发育的全能性（Iwasaki et al., 2000）。Wakayama等（1999b）在继小鼠的体细胞核移植成功后，又利用相同的技术对小鼠ES细胞进行核移植，得到了核移植小鼠31只。该研究证明了用ES细胞进行核移植产生后代的可能性。由于ES细胞在体外具有无限增殖而不发生分化的特性，故可以在体外更方便地对ES细胞进行基因改造，通过基因―敲除‖和―插入‖来研究基因的功能，Sato等（2000）用小鼠的ES细胞系TT2的细胞直接注射入去核的卵母细胞内，核移植胚胎可发育到妊娠14天，但未能出生小鼠。已报道利用小鼠ES细胞可以定向分化为造血细胞（Perkins, 1998），而利用人ES细胞可以在体外分化如分化为分泌胰岛素的胰岛素样细胞（Odorico et al., 2001）等多种细胞。最近，Wakayama等（2001）报道将个体细胞核移植后得到了sntES细胞（具有ES细胞的特性）移植到去核卵母细胞胞质内，获得了20只小鼠，其中11只小鼠发育正常并具繁殖能力。由此表明，sntES细胞器具有发育全能性，可以建立成年动物自身的干细胞系，这些干细胞可以分化产生各种细胞、组织和器官，用于进行自身疾病的细胞治疗。因此对人类体细胞核移植和干细胞的研究与应用有深远的影响。目前，利用ES细胞进行核移植的主要研究方向是利用这些细胞生产转基因动物，并利用核移植建立成年动物体细胞核移植ES细胞系。1.4转基因克隆动物研究进展

随着哺乳动体细胞核移植技术的发展，以及人和家畜基因组计划的完成，转基因技术的研究走出了20世纪90年代徘徊不前的局面，进入了新的发展时期，即转基因克隆动物时期。转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆技术的有机结合，它是以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。PPL公司Schnieka等（1997）率先克隆出了转基因动物。他们是从35日龄胎儿分离的体细胞，经传代培养后和基因转移后，将转染了新霉素抗性（Neomycin）基因和人凝血因子（IX）基因的体细胞移植到受体卵母细胞内，出生了带有IX基因的转基因羊。Cibelli等（1998）用一个55日龄的雄性牛胎儿分离得到成纤维细胞，体外培养后转代两次，用标记ß-gal/neo对细胞进行转染，转染的细胞用新霉素筛选两周之后，得到5个抗性细胞克隆，经PCR分析，发现它们都是转基因细胞，而且表明了标记基因，选择其中一个细胞为核移植供体，通过核移植得到重组胚276个，其中33个（1%）发育到囊胚，经移植到11头同期化的受体母牛体内后，出生了4头小牛，经过分析检测，发现这4头小牛都在同一个染色体位点整合了外源基因，说明了它们来源于同一个体细胞克隆，而实验中的转基因效率达到了1.4%。1999年，Baguisi等克隆出来的5只转基因山羊中，其中的1只羊在奶中表达了高水平的抗凝血因子III。2000年，McCreath等用基因打靶后的绵羊体细胞生产了转基因绵羊。随后转基因山羊（Keefer et al., 2001）和转基因猪（Lai et al., 2002）也相继获得成功。

我国的转基因克隆技术也取得了一定的成绩。安晓荣等（2001）报道用绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因，用绵羊的转基因颗粒细胞进行核移植，得到了发育的绵羊转基因囊胚。成勇等（2002）以转基因山羊体细胞为供体细胞克隆出转基因山羊。1.5种间细胞核移植研究进展

细胞核移植作为一种重要的科学研究方法，随着这项技术的不断成熟，它也成为挽救濒危动物的一个重要手段，由于濒危动物的卵母细胞来源较少，进行体细胞核移植的难度增大，人们就希望通过种间核移植技术来达到这个目的。但在这方面的研究进展是较为缓慢。

De Roeper 等（1977）将Hela移入非洲爪蟾卵内，结果发现Hela细胞在爪蟾内能够发生染色体扩散和DNA合成，表明爪蟾卵母细胞内有能够激活哺乳动物体细胞的因子，这种激活因子无特异性。McGrath和Solter（1986）利用他们在小鼠胚胎细胞核移植上的方法进行小鼠不同种间原核交换研究，结果获得的种间核移植胚仅出现有限次数的卵裂。梅琪等（1993）进行的鼠-兔种间核移植研究，结果重组胚胎有43.1%分裂率，5.4%发育到囊胚。谭世俭等（2001）作的水牛-黄牛种间胚胎细胞核移植研究，获得了发育的种间核移植囊胚。李光鹏（1998）将小鼠8-细胞胚的卵裂球移入猪去核卵后，重组胚可卵裂至8细胞期。Dominko等（1999）等以牛、猪、羊、大鼠和猴的皮肤成纤维细胞为核供体，牛卵母细胞为核受体，探索牛卵母细胞在已分化体细胞核指导下的有丝分裂能力及用牛卵母细胞作为受体胞质的可能性。结果表明，除了大鼠-牛杂种胚外，其余都发育到囊胚阶段，但是杂种胚移植到受体后没有出生后代。然而，就种间核移植胚发育到囊胚而言，牛卵母细胞维持发育的能力没有因供核动物的物种，染色体数目和年龄的不同而表现出差异，表明哺乳动物保留着调节早期胚胎发育的机制，牛卵母细胞的胞质能支持具有不同染色体种类和数目的异种核发育。Lanza等（1999a, b）把人的体细胞核移植到牛的去核卵母细胞，得到的一些类似核移植胚胎也都发育到较高级阶段。近年来，人们尝试了黄牛-水牛（Kitiyanant et al., 2000;Nguyen et al., 2000），小鼠-猪（Lee et al., 2001），小鼠-牛（Arat et al., 2001;Liu et al., 2001），以及猪-牛（Yoon et al., 2001）等动物种间体细胞核移植的研究，都分别得到了体外发育的胚胎。目前，Lanza等（2000b）的研究获得了令人振奋的结果。他们把一种野牛的皮肤成纤维细胞核移植到家牛的去核卵母细胞中，发育到了妊娠晚期并已分化成复杂的组织和器官的野牛胎儿。接着，Vogel（2001）报道将印度野牛的体细胞作供核移植到去核的家牛卵母细胞内，最后出生了1头发育正常的野牛，但出生后2天就死了，但这一结果无疑证明哺乳动物体细胞可以在异种卵母细胞内完成核发育程序重编，使已分化的体细胞发生去分化并完成整个发育过程。也预示着我国在体细胞克隆大熊猫、猕猴及比格犬上有可能成功。虽然我国科学家陈大元等（1999）把大熊猫的体细胞核移到兔卵母细胞中，重组胚能发育到囊胚阶段，但目前未能获得的后代。这一事实说明，种间核移植确有一定的难度，只有在诸如核发育程序重排程度和可靠性、供体细胞胞质和受体胞质（例如线粒体DNA）之间的相容性等问题弄清后，才有可能实现种间核移植。

2.1受核细胞的准备

2.1.1成熟卵母细胞的获得

成熟卵母细胞的获得的途径也有两种：体外成熟和体内成熟。体内成熟是用超排的方法获得，在牛上很少使用。体外成熟培养既方便又利于大量获得。

体外培养的卵母细胞又有几个来源：①直接由卵巢上有腔卵泡抽取或剥离；②由腔前卵泡培养获得，③冷冻保存的卵母细胞。目前广泛使用的是前者。而后两者则为卵母细胞提供了更为广阔的来源。

2.1.1.1卵巢的采集及卵母细胞得分离

目前卵巢主要来自大型屠宰场，用加双抗的生理盐水保存卵巢，温度在30-38℃之间，也有采用25~37℃的。卵巢的保存温度和时间在不同程度上影响IVF/IVC的囊胚发育率，卵巢在33~35℃保存8小时以内并不会减弱卵母细胞的体外成熟能力。

有认认为卵巢以20~25℃至少可以保存6小时而不影响IVM/IVF效果及随后的胚胎发育。试验证明卵巢以24~33℃保存4小时以内最为理想。卵丘卵母细胞复合物（COC）有剥离法和抽取法两种分离方法，有人认为剥离法对COC损伤较小，更有利于提高卵母细胞的成熟率，但是，此方法太过于复杂，不如抽取法快，故而后者应用较多。

采集卵巢前应先将无菌生理盐水加热到稍高于预定温度（如38~39℃），在出发前倒入预先灭菌的保温瓶中，加入一定浓度的双抗。采集卵巢时要尽量减少对卵巢的污染，动作要快，放入保温瓶前先用温生理盐水冲洗。带回实验室后，用灭菌温生理盐水或PBS冲洗，然后在无菌室内分离卵母细胞。

用抽取法时，选择12号灭菌针头，抽取前先吸一些卵母细胞洗涤液于注射器中，抽取液注入洁净无菌离心管中。在整个过程中要保温，尽量减小温度变化。卵巢的采集及卵母细胞得分离过程最容易受到污染，所以应尽量保证操作过程中的无菌性。2.1..1.2 卵母细胞的成熟培养

将抽取液倒入平皿中检卵，检出符合要求的卵丘卵母细胞复合物。

用培养液洗涤几次后，于CO2培养箱内，5%CO2浓度，38.5℃培养18-24小时，检查成熟率。影响卵母细胞成熟率的因素很多，但主要还是培养液成分。内刘泽隆等

认

为，TCM199+

体

积

分

数

10%~15%的FCS+1~2mg•L-117β–E2+10mg•L-1FSH+20~50mg•L-1LH是牛卵母细胞成熟培养的理想培养系统，且成熟率达90%以上。过高浓度庆大霉素会抑制卵母细胞中先粒体的有丝分裂增殖，但如果不能保证无菌操作，还是应该添加。雷安民等的研究中使用丙酮酸钠、庆大霉素和NCS(ECS),并证明单独添加发情牛血清即可满足成熟的要求，为防止污染而使用的庆大霉在40mg/L的添加剂量下对牛卵母细胞的成熟率没有显著影响。卵丘细胞发散呈放射状是卵母细胞成熟的一个标志，用吸管吹打去卵丘细胞，然后在显微镜下观察极体排出情况。2.1.2成熟卵母细胞去核

卵母细胞成熟后要去掉原有细胞核或使其丧失功能，分去核和灭能两种方法，实践中多采用显微去核。

成熟卵母细胞去核是核移植技术中的一个重要环节，要求去的干净，又尽可能的减少对细胞质的损伤。

目前使用的去核方法有以下几种：

1.挤压法，于近第一极体（PB1）处的透明带作一切口，用移核管挤压卵母细胞，使PB1和附近1/3的胞质挤出透明带。此法与细胞分裂相有关，必须在恰当的时间进行，否则不能将染色质去净。

2.改进的点击去核法，该法与前者相比对胞质损伤小，但技巧性较高。

3.负压吸取法，据报道在微分干涉差倒置显微镜的高分辨率视野下是卵母细胞轻微旋转，当纺锤体与焦平面垂直时核区与胞质的折光率略有差别，可准确吸出细胞核和少量细胞质，去核率可达100%。

4.半卵法，切开透明带，将一半细胞质吸出并移入另一个空透明带中，然后用荧光染料检查染色质在哪一半中。2.2供核细胞的准备

现在已经成功使用的供核细胞有胚胎细胞、胎儿成纤维细胞、成年和老年转基因成纤维细胞、乳腺上皮细胞、卵丘细胞、颗粒细胞、尾部细胞及耳细胞等。

核移植前必须对这些细胞进行同期化处理，实践证明GO、期G1期是最佳时期。诱导分化细胞进入静止期是克隆成功的关键。

对供核细胞进行同期化处理常用方法是血清讥饿法，血清浓度和饥饿时间也有一定的要求。其他方法还有：秋水仙胺塞氨酯哒唑诱导M期同步化、用阿菲迪霉素诱导G1期同步化期、用环己酰胺诱导G2同步化。

也有通过选择细胞类型来获得的，原理是不同类型的细胞在细胞周期不同阶段上得数目相差很大，如刚排出的卵母细胞周围的卵丘细胞90%以上处于G0或G1期。2.3移核

移核有两种方式：把细胞核移入去核卵母细胞和把体细胞移入去核卵母细胞。在体细胞核移植中多用后者，移入后进行融合与激活。按移入位置也可分为两种：移入卵周间隙和直接移入细胞质内。移核时需要借助显微操作系统进行，用固定吸管固定去核卵母细胞，调节注射吸管，使之处于同一焦平面上，移动注射吸管慢慢沿去核时的切口将供核体注入卵周间隙。

2.4融合与激活

融合方法分化学法和电融合法。但通常使用的是电融合法，需要在专门的融合仪器上进行，往往通过增加电刺激数来提高激活率，另外还可以通过化学试剂（如乙醇、钙离子载体、锶等）处理以提高核移植的效率。关于电融合的研究很多，从融合时间到电压、频率都有较详细的论述。目前，一般采用交流电场排细胞的方向即交流定位，常用的频率为600~1000kHz，电压为5~6V，持续时间约5~10秒钟。常用的直流电融合条件为1.0~2.0KV/CM的场强M，30~60ì¾的持续时间。

2.5重构胚的培养

重构胚经激活处理后，需要培养一段时间，待发育至桑椹胚或囊胚期时再移植给受体母牛。重构胚的培养有体外和体内两种培养方式，实践中主要用前者。胚胎体外培养是影响克隆成功率的一个重要环节，也是克隆胚生产工厂化的一个前提。目前有关胚胎体外培养系统的研究很多，但最热的时共培养系统。

体外培养哺乳动物胚胎的主要障碍是发育阻滞，但不同的动物出现再不同的时期。研究表明，胚胎发育阻滞与基因组激活关系密切，多发生在胚胎卵源性基因调控向胚源性基因调控转化，即胚源性基因激活时期，因此推测发育阻滞可能与胚源性基因激活激活不全或激活失败有关。体细胞共培养系统能在一定程度上克服胚胎发育阻滞可能在于体细胞能：产生促有丝分裂因子；产生细胞外基质成分，促进胚胎细胞分化；可代谢或除去培养液中的胚胎毒性因子

不同类型的体细胞的共培养效果是不一样的，一般采用输卵管上皮细胞和颗粒细胞。桑润滋等在研究兔的核移植时认为，在基础培养液相同的条件下，与胎儿成纤维细胞饲养层共培养，尤其是与同源胎儿成纤维细胞饲养层共培养，有利于重构胚的发育，尤其是有利于提高桑椹胚和囊胚的发育率。培养液主要有TCM-199和CR1aa等，在基础液的基础上再加其他因子。2.6克隆胚移植

胚胎培养至桑椹胚或囊胚期时，需要移植到同期假孕母牛体内，使其继续发育。受体母牛可选自然发情的，也可进行人工同期化处理，但受体母牛必须有明显的黄体。为了维持妊娠，可移入多枚胚胎或施以外源激素。3.核移植技术已取得的成就

在供核细胞受核细胞的选择上，以大量的实践证明MⅡ期的成熟卵母细胞是最佳受核细胞 卵母细胞体培养技术与超数排卵技术已经相当成熟，培养系统不断完善，不但效率上有所提高，简化的培养系统也有报道

腔前卵母细胞的体外培养及卵巢、卵母细胞的冷冻保存为卵母细胞提供了更为广阔的来源。体细胞的体外培养技术也已经比较成熟，体细胞的冷冻保存与体外成功传代同样为大量克隆提供可能。

核移植技术已经在多种动物上获得成功，而且用多种类型的细胞获得克隆后代，以事实证明了克隆技术的可行性。

核移植技术在理论上也已取得了巨大成就。

4.现有技术的不足

哺乳动物核移植技术虽然在多种动物上获得成功，但技术仍然不成熟，仍没有走出实验室。①受核细胞的来源问题还没有真正解决，实践证明卵母细胞是目前的最佳选择，体外成熟培养技术也已经比较成熟，但是来源仍受到限制。从屠宰场采集的新鲜卵巢上抽取，一是容易受到污染，二是对试验造成了巨大的限制。现在卵巢及卵母细胞的冷冻保存以及腔前卵泡的体外培养已取得了一定的进展，但仍有大量的工作要做。

②供核细胞的来源也仍未解决，现在的研究还没有证明是否所有的体细胞都适合。某些类型的体细胞在化过程中基因可能发生了不可逆的转变，以至丧失再程序化的可能。③去核技术还不过关，目前使用的主要是显微操作去核，怎样既去的干净又尽量减少对细胞质的损伤仍是目前要解决的问题。④重构胚的融合与激活技术还有待于进一步研究，融合与激活是关系到重构胚能否发育的重要一步。

⑤重构胚的培养技术也还在研究中，有效的培养技术是提高重构胚发育率的必不可少的条件。⑥细胞核再程序化机制仍不清楚，如果能解决这一问题，将会给动物克隆带来具有划时代的意义的变化。⑦对动物克隆过程中出现的问题还没有找到确切的原因。如：Kruip等和Garry 等对利用核移植技术培养的克隆牛后代分析表明，克隆动物在妊娠时间及出生 重等方面远远超过对照组个体但没有找到确切的原因。

5.核移植技术的前景

5.1核移植技术在普通畜牧生产上的意义 哺乳动物克隆技术在畜牧生产上的应用将带来划时代的意义。首先，在迅速扩大优秀个体数量，提高畜产品数量和质量上有重要意义。在已优秀个体的生产性能之后，利用体细胞核移植技术，可以迅速复制出大量与其遗传基础完全相同的个体来，以便于迅速提高产品数量。如果采用传统的方式进行改良，则需要很长的时间才能满足需要，即便是用胚胎细胞克隆，也远不如体细胞核移植技术优越。

另外，随着核移植技术的不断完善，将真正实现胚胎的工厂化生，从而大大降低胚胎及畜牧生产成本，不需要进行生产目的的育种工作。其次，核移植技术还是动物育种的新途径。传统的育种方法不仅费时费力、效率低、耗资巨大，而且由于遗传漂变，往往很难达到预期目的；而核移植技术则不同，与胚胎移植相结合，则能迅速提高优良基因及其组合在群体中的频率，加速育种进程，提高育种效率。

最后，核移植技术还是动物保种的有效措施。现在，许多家畜品种濒临灭绝，而传统的保种方法则要建立保种群，代价既高，有难以防止近交衰退，很难起到保种效果；建立精子、卵子及胚胎库保种虽然已经比较有效，但仍某些缺陷，如果结合核移植技术则将更加完善。

5.2核移植技术再生产转基因动物上的意义

细胞核移植技术与转基因相结合是当今研究的一个热点，它有医学上和畜牧生产上的巨大的价值。生产转基因动物是提高畜产品质量和数量的现代手段。知道基因与功能的对应关系之后，我们就可以挑选出需要的基因，然后生产转基因动物，从而优化动物的性状以满足我们的物质需求。在医学上，我们一方面可以利用转基因动物生产移植器官，另一方面制作乳腺反应器生产药物。有些药物依靠传统的提取方法获得，成本是很高的，而且也很不安全，通过转基因从动物获得已成为必然。目前外源DNA导入方法有显微注射法、电穿孔法、胚胎干细胞法、精子载体法、逆转录病毒转染法，但自1985年显微注射技术问世以来，对受精卵细胞的原核进行DNA显微注射一直是获得转基因家畜的唯一实用手段。

但该方法基因整合率低，是其最大的缺点，只有0.5—3%的显微注射受精卵可以产生转基因后代，对大动物 则更低。转基因随机组合造成的―位置效应‖所引起的表达结果的不稳定性，除了采用基因座控制区、核基质结合区序列或将完整的基因座导入动物的基因组等方法消除位置效应外还需要从大量的转基因动物中筛选出高效表达的动物。

Capeddhi(1998)报道用显微注射法可得到很高的转染率，占接受外源DNA细胞的10—20%，但一次只能注射一个细胞；电穿孔法可以同时使许多细胞得到转染，Mansour（1988）研究发现电穿孔可使1%ES细胞稳定转染。但是，如果与核移植技术结合，就可以进行大量克隆。体细胞数量远比受精卵多，对体细胞进行基因打靶，筛选已经转染的细胞，然后进行核移植，这样不仅可降低成本还，能提高转基因效率。6.核移植技术的负面效应

核移植技术虽然回给人们带来巨大的方便和经济利益，但也有其副效应。克隆作为一种无性繁殖手段，没有双亲的基因组合，其性状上不会超过供体，更谈不上进化，这无疑是违背生物进化规律的，必将导致物种退化；

转基因克隆虽然改变了其基因型，但这种认为的改变会带来什么样的后果还在未可知之列；动物所有体细胞是否具有完全相同得基因型还并不清楚，核移植中带入的染色质会有什么影响也不清楚；转基因产品对人是否有不良影响也尚未知道；用转基因动物生产移植器官更是件冒险的事，这种移植可能使人对某些病毒敏感

第二篇：动物细胞.教案doc

动物细胞【教案】

一、课型：新授课。

二、教学目标：

1、知识与技能目标（1）认识动物细胞的结构，并能说明动、植物细胞基本结构的异同；

（2）制作人的口腔上皮细胞临时装片，并使用显微镜观察；

2、过程与方法目标

通过探究法、讲授法、讨论交流法、演示法、多媒体辅助教学等多种方法相结合，以激发学生主动学习为主，提高学生学习的兴趣，引导学生发现问题、分析问题、解决问题。

3、情感态度与价值观目标

（1）体验科学探究的艰辛与喜悦，培养学生严谨认真、团结合作的精神。

三、教学重难点

1、教学重点：（1）动物细胞的基本结构。

（2）制作人的口腔上皮细胞临时装片，并使用显微镜观察

2、教学难点：（1）制作人的口腔上皮细胞临时装片

四、教具准备

1、PPT课件。

2、器材：消毒牙签、滤纸、0.9%的生理盐水、稀碘液、载玻片、盖玻片、滴管、纱布、镊子、显微镜。

五、课时安排：1课时

六、教学方法：

讲授法、探究法、讨论交流、练习法、问答法、演示法、多媒体辅助教学法等。

七、教学过程： 新课导入

【老师】同学们，上课了。首先，我们来回顾一下上节课所学的植物细胞的基本结构； 【师生互动】

【设问】我们已经知道了植物细胞的结构，那么动物细胞是什么样的呢？想看看自己身上的细胞吗？ 【学生】回答

【老师】今天我们就来通过观察自己的口腔上皮细胞，来认识动物细胞；

【板书】动物细胞 讲授新课

【板书】

一、制作人的口腔上皮细胞临时装片

【老师】首先，用洁净的纱布将载玻片擦拭干净。【演示】 【板书】擦

【老师】接着，在载玻片中央滴一滴生理盐水。【演示】

【板书】滴

【老师】接着漱口，因为口腔上皮脱落的细胞较少，而且有很多食物残渣，所以采前必须漱口。【演示】 【板书】漱

【老师】漱完口，我们用消毒的牙签在口腔内壁上轻轻刮几下，注意：不要用力太猛，以免刮伤自己哦。【板书】刮

【老师】把牙签附有碎屑的一端放在载玻片上的生理盐水中，轻轻涂几下。【演示】 【板书】涂

【老师】再用镊子夹起盖玻片，先让它的一端接触载玻片的水滴，再缓缓地放平。注意避免盖玻片下出现气泡。【演示】 【板书】盖

【老师】再在盖玻片的一侧滴加几滴稀碘液，用吸水纸在盖玻片的另一侧吸引，使碘液浸润标本的全部。【演示】 【板书】染——吸

【老师】装片做好后，我们就可以用显微镜观察了。【提问】显微镜的使用步骤是怎样的？ 【学生】回答

【讲解】取——取出显微镜，安——安装显微镜，对——对光，放——放置装片，调——调节焦距，最后观察。

【老师】下面大家就观察一下我们自己的口腔上皮细胞，并画出

生物简图。【学生】学生活动

【老师】你们观察到的细胞是不是和老师这张图片类似呢? 【学生】回答：是

【讲解】这就是人的口腔上皮细胞。

【老师】和我们之前所学的植物细胞的结构进行对比一下，你们觉得动物细胞都有哪些基本结构呢？ 【板书】

二、动物细胞 【学生】回答

【讲解】最外面的这一层叫——细胞膜，颜色最深的这块叫——细胞核，那细胞膜和细胞核之间的叫什么呀？ 【学生】回答：细胞质

【老师】对!人和动物细胞的结构就是这样的，有细胞膜、细胞核、细胞质，当然，还有线粒体。它们的功能和植物细胞中的都是差不多的。【板书】

1、基本结构

【提问】细胞膜有什么功能啊？ 【学生】保护细胞并控制物质进出 【提问】细胞核呢？

【学生】是储存遗传物质的主要场所 【提问】细胞质呢？

【学生】是细胞生命活动的主要场所 【提问】那线粒体呢？

【学生】为细胞的生活提供动力

【老师】看来大家对之前所学的掌握的不错，掌声鼓励下自己。【老师】动物细胞的形态也是多种多样的。看，这是我们的红细胞、肌肉细胞、骨细胞、神经细胞。【板书】

2、形态：多种多样 课堂小结

【老师】下面，我们一起来回顾一下本节课所学的内容。我们首先学习了口腔上皮细胞临时装片的制作，步骤是怎样的？ 【学生】擦、滴、漱、刮、涂、盖、染——吸

【老师】这里的滴，滴的是什么呀? 【学生】生理盐水

【老师】我们做植物细胞时，滴的是什么呀？ 【学生】清水

【提问】为什么我们在观察植物细胞和动物细胞时要分别滴上清水和生理盐水呢？我们把这儿的生理盐水换成清水行不行呢？为什么？

【学生】思考回答

【讲解】因为动物细胞没有细胞壁，使用清水会使细胞吸水而破裂，而生理盐水可以保持人体细胞的生活状态。所以，不能将生理盐水换成清水。

【老师】接着，我们通过观察，认识了动物细胞的基本结构，都有哪些呢？ 【学生】回答

课堂练习

【老师】下面我们就将植物细胞和动物细胞进行对比，来填一填这个表格

【师生互动】完成表格

【老师】下面就请同学们迅速的把课后第一题做一做。【老师】老师这里有两张细胞模式图，你们能区分出谁是植物细胞谁是动物细胞吗？ 【学生】 资料阅读

【老师】下面我们来阅读下书上49页，科学家的故事。【学生】活动

【老师】读完这个故事，你有什么启发呢？ 【学生】回答 课后作业

【老师】好，今天的课就上到这，下来请同学们根据动物细胞的结构，发挥自己的想象力，制作出动物细胞模型

八、板书设计

动物细胞

一、制作人口腔上皮细胞临时装片 步骤：擦、滴、漱、刮、涂、盖、染——吸

二、动物细胞

1、基本结构

2、形态：多种多样

第三篇：观察动物细胞教案

第三节 观察动物细胞

教学目标 ：

①进一步熟练制作临时装片和使用显微镜观察细胞，说明人口腔上皮细胞的基本结构，区别动植物细胞结构的主要不同点。

②提高制作以及观察临时装片的技能。

③设计实验、改革实验，开发自己的创新潜能，以此来体会科学探索的思想和方法是不断发展的；继续形成“胆大心细”的心理素 质；在“模拟制作”活动中，提高学习生物学的兴趣。重点和难点

重点：说明人口腔上皮细胞的基本结构，比较动植物细胞的相同点和不同点；提高实验能力和观察能力。

难点：制作临时装片过程中的刮取（首次观察自己身体上的细胞，学生感到既新鲜又好奇，取材关系到实验效果）

细胞结构的观察（与植物细胞相比不易观察，略有难度）； 设计实验（应用以往的学习经验，是较高层次的学习）。

课前准备

学生：预习；3H铅笔，绘图纸；各种各样的果冻，彩色糖粒，果脯，小塑料食品袋，线等物品；上课前漱口。

教师：生理盐水，稀碘液，高锰酸钾溶液（质量分数为1％～5％），消毒牙签，滴管，纱布，镊子，吸水纸，载玻片，盖玻片，显微镜，清水，琼脂。人口腔上皮细胞的结构挂图，不同种类的人体、动物体细胞挂图或投影片、投影仪或多媒体设备（若条件许可），提前制作临时装片、摆放示范镜。教学设计

一、引入新课

复习：临时装片的制作方法；植物细胞的基本结构。实验题目：观察人的口腔上皮细胞 温故知新 提出问题：

①想看看自己身上的细胞吗？

②人的细胞与植物细胞有什么相同和不同之处？ 激起疑惑：口腔上皮细胞在哪儿？怎样获得？ 解决心中的疑惑 承前启后，知识导入。

引导学生联系自身，提出问题，创设学习情境。出示题目，交流：“看到题目，你有何疑问？ 示范取材部位。材料用具

提出疑问：生理盐水有什么作用？ 引导、分析方法步骤

二、制作人口腔上皮细胞临时装片

①设计：根据已有的经验，设计实验方案（注意取村、方法、染色剂的变化）；

②制作：同组同学尽量选择不同的方案制作临时装片，增加对比性。参与 引导、帮助

调查

二、用显微镜观察人的口腔上皮细胞

观察自己制作的临时装片，然后同学间交换观察。借鉴老师摆放的示范镜。

发现由于取材、染色的不同而出现的不同效果。巡视、提示 参与观察

绘制细胞的基本结构图：

细胞膜、细胞质、细胞核、动、植物细胞的异同感知动物（人）细胞的形态结构，注意绘图要领、互评、展示。讨论、归纳

总结：比较、归纳、描述、指导、提示、评价

出示挂图或媒体演示（投影展示）不同种类的动物细胞 引导、总结 模拟制作

策略①：按照书中方法分组制作。

策略②：改进。利用现成的果冻，将一枚糖粒放入其中表示细胞核，果冻表示细胞质，包装果冻的塑料壳表示细胞膜。

第四篇：《动物细胞》教案一范文

动物细胞

九江市都昌县北炎中学

艾冰华

一、教学分析 1.教材分析

本节内容是“植物细胞”内容的自然延续。本节的实验活动也是以上一节的实验知识与技能作为铺垫。学生在了解植物细胞的基本结构之后，自然就想知道动物细胞的基本结构。这两类细胞有哪些共同的特点？又有哪些不同之处？“想一想，议一议”活动安排的内容，就是依据这种想法进行设计的。这体现了教材在帮助学生建构概念时，利用了学生已有的一些前概念的思想。

本节中的实验活动，因为有了制作植物细胞临时装片的经验，因此，实验活动的难度不大。但需要教师理解的是，教材选择的材料是人的口腔上皮细胞，一方面因为材料取自学生自身，可以有效地激发学生的好奇心，保证学生顺利地观察到人的口腔上皮细胞；另一方面，由于口腔内壁上脱落的细胞较少，而且有不少是食物残渣，因此，采用人的口腔上皮细胞，无形地增加了学生操作的难度。教师需要在教会学生取材以及后期染色方面多加指导。

关于动物细胞的结构，同上一节一样，引导学生通过实验观察、归纳、总结后获得相关知识。在具体的操作层面上，制作人的口腔上皮细胞临时装片的步骤中，强调要将上皮细胞放置在质量分数为0.9%的生理盐水中，其目的是保持细胞的正常形态，滴加碘液的目的是便于观察细胞，特别是观察到细胞核。

在讲述植物细胞和动物细胞基本结构的基础上，教材在正文中总结出“细胞是构成生物体的基本单位”这一重要概念。从教材呈现这一重要概念的位置来看，教材是非常重视帮助学生逐步形成概念的，概念的形成是有事实性材料来支撑的。不仅如此，教材还在“科学家的故事”栏目中，介绍了施莱登和施旺建立细胞学说的过程和成功的原因，以及细胞学说建立的重要意义，让学生全面理解“细胞是构成生物体的基本单位”这一概念的重要意义。

“制作动物细胞模型”的活动，一方面通过学生的动手动脑活动，进一步巩固加深动物细胞基本结构的知识；另一方面，制作模型的材料成本并不高，如果注意卫生是完全可以食用的，这也无形地激发了学生动手的兴趣。

2.学情分析

学生经过了前面的学习，知道了植物细胞的基本结构，初步学会了制作植物细胞临时装片的基本方法。很自然会想知道动物细胞结构和人（自己）细胞结构的冲动和极大的兴致和好奇心。所以，同样会出现操作的盲目性，以及在操作过程中因为找不到细胞而出现心理波动，这些教师一定要注意。比较植物细胞和动物细胞的结构和“细胞是构成生物体的基本单位”概念的形成是这节课另一个重点和难点，学生子在教师的引导学生通过实验观察、归纳、总结后可获得相关知识。

制作模型是学生感兴趣的事情，在小组合作的情况下，制作成功的可能性很高。正好可以锻炼学生的动手能力。

二、教学目标 知识与技能

1.认识动物细胞的基本结构。

2.说明动物细胞和植物细胞基本结构的异同点。3.建立“细胞是构成生物体的基本单位”概念。过程与方法

1.制作人的口腔上皮细胞临时装片，并用显微镜观察。2.尝试制作动物细胞模型。情感态度与价值观

1.认同细胞学说史19世纪自然科学的三大发现之一。2.认同“细胞是构成生物体的基本单位”。

三、教学难点重点

1.说明人口腔上皮细胞的基本结构，比较动植物细胞的相同点和不同点。2.动物细胞临时装片的制作和观察。

四、课前准备 多媒体、实验材料用具

五、课时安排 1课时

六、教学策略

创设情境——导入新课——实验分析——教师实验演示——组织学生实验——学生汇总实验结果并分析——总结比较植物细胞和动物细胞结构——模拟制作进一步巩固

七、教学建议

本节教学旨在引导学生通过观察人的口腔上皮细胞和绘制动物细胞结构简图，将进一步掌握制作、观察临时装片和绘制生物图的技能；通过观察总结概括动物细胞的基本结构，并经过比较知道动植物细胞结构的相同点和不同点，认同细胞是构成生物体的基本单位。因此，建议采用边讨论边实验的方式进行教学活动。

八、学法建议

联系前边植物细胞的相关知识，延伸到本节课，进一步联系装片的制作和观察，同时注意操作的区别。在讨论后进行植物细胞和动物细胞的比较。最后动手制作模型，进一步认识动物细胞结构。

九、教学过程

一、复习旧课

投影：植物细胞的结构模式图。

复习：1．制作植物细胞临时装片的“七字步骤”。2．植物细胞的基本结构和功能。

二、导入新课 情境导入：

投影：各种不同细胞的形状。

问：大家想看看自己身上的细胞吗？它和植物细胞一样吗？（非常想）那么要怎么做呢？（设计意图：创设情境，导入新课）授新课：

1.制作人的口腔上皮细胞临时装片 投影视频：观察人的口腔上皮细胞

引导学生观看视频并阅读课本观察人的口腔上皮细胞实验，并组织学生自主制作装片 提示学生实验中的注意事项、规范操作。在学生实验过程中，提示学生思考：（投影）（1）为什么要用生理盐水而不用清水？（2）怎样提取口腔上皮细胞

（3）动物细胞的临时装片制作过程和植物细胞临时装片制作过程有什么不同？

（设计意图：学生自己动手，进一步熟练操作，体验自主实验的成功，并且提高学会分析问题的能力）2.观察人的口腔上皮细胞

提示学生观察要按照规范的操作步骤：安放-对光-放置装片-调焦-观察； 在观察的过程中分析思考：（投影）（1）口腔上皮细胞的形态结构是什么样的？（2）与植物细胞比较有哪些不同之处？

（3）用不同的染料进行染色是否看到的效果一样？ 观察过程中提示学生：（1）如果在低倍镜下观察，见到口腔上皮细胞或成群或分散或呈现重叠状态是，应移动载玻片，选择单个、完整的细胞进行观察。

（2）使用高锰酸钾溶液染色的结果较有层次：细胞核呈棕色，细胞质呈紫红色，细胞膜无色，效果不错。

（3）在取样很少的情况下，不容易找到细胞，可以自上到下，从左到右认真寻找，不要轻易放弃。（设计意图：相互交流经验，相互促进，发现细节，促进提高）3.绘图：绘制人的口腔上皮细胞图

学生依照已有的经验绘制自己观察到的细胞图，实事求是画一个口腔上皮细胞图，（再次提醒，绘图要求）最后较好的绘图在全班展示。

让我们再来认识人体或动物体一些其他的细胞。媒体演示（投影片或多媒体）。这些细胞和口腔上皮细胞比较在结构上有什么相同之处吗？

投影：动物细胞模式图。

学生讨论归纳总结：人体或动物体的各种细胞的形态虽然不同，但是基本结构却是一样的，都有细胞膜、细胞质、细胞核。

问：我们实际观察上能看见线粒体吗？（不能，在光学显微镜下无法看到）问：动物细胞仅仅只有这些结构吗？还有没有其他结构呢？ 投影：动物细胞还有哪些结构？ 学生观看并总结。

我们已经知道了植物和动物都是由细胞构成的，那么除此之外的其他生物呢，是不是也是有细胞构成的呢？

投影：细菌、真菌和各种动植物细胞。

同时指导学生阅读科学家的故事，得出：细胞是构成生物体的结构和功能的基本单位（设计意图：自主探究，讨论比较中得到结论）4.课外活动

制作动物细胞的模型。

模拟制作，可以在教师帮助下按照书中的方法制作，也可以在不用琼脂的情况下，利用现成的果冻加入一枚彩色糖粒示意细胞核，果冻即细胞质，包装果冻的塑料壳即细胞膜，能够达到效果，比较方便、卫生，不足之处是学生动手的成分要少一些。鼓励学生发掘更好的材料和办法，同时还可以制作植物细胞模型，各小组之间进行交流评比。

（设计意图：充分发掘学生的兴趣，延伸到课外，给学生充分发挥自我想象动手能力）

十、教学反思

本节课依然是以学生动手为主，有前面观察植物细胞的学习基础，所以本节课的教学目标的完成难度较小，但是可能由于教学设备的局限，会造成课堂混乱，特别是在取人的口腔上皮细胞的时候会出现学生之间相互取材打闹的情况。同时实验的操作规范和细节依然会影响学生顺利完成实验。

十一、板书设计

动物细胞

方法步骤——制作人口腔上皮细胞临时装片： 擦、滴、刮、涂、盖、染、吸 动物细胞的结构 细胞膜、细胞质、细胞核 比较植物细胞与动物细胞的异同点

植物细胞有而动物细胞没有的结构：细胞壁、液泡、叶绿体

十二、关键词

动物细胞

人的口腔上皮细胞

细胞是生物结构和功能的基本单位

第五篇：2.1.3观察动物细胞 教案

第三节 观察动物细胞 教学设计

教学目标

①进一步熟练制作临时装片和使用显微镜观察细胞，说明人口腔上皮细胞的基本结构，区别动植物细胞结构的主要不同点。

②提高制作以及观察临时装片的技能。

③设计实验、改革实验，开发自己的创新潜能，以此来体会科学探索的思想和方法是不断发展的；继续形成“胆大心细”的心理素质；在“模拟制作”活动中，提高学习生物学的兴趣。

重点和难点

重点：说明人口腔上皮细胞的基本结构，比较动植物细胞的相同点和不同点；提高实验能力和观察能力。

难点：制作临时装片过程中的刮取（首次观察自己身体上的细胞，学生感到既新鲜又好奇，取材关系到实验效果）

细胞结构的观察（与植物细胞相比不易观察，略有难度）；

设计实验（应用以往的学习经验，是较高层次的学习）。

课前准备

学生：预习；3H铅笔，绘图纸；各种各样的果冻，彩色糖粒，果脯，小塑料食品袋，线等物品；上课前漱口。

教师：生理盐水，稀碘液，高锰酸钾溶液（质量分数为1％～5％），消毒牙签，滴管，纱布，镊子，吸水纸，载玻片，盖玻片，显微镜，清水，琼脂。人口腔上皮细胞的结构挂图，不同种类的人体、动物体细胞挂图或投影片、投影仪或多媒体设备（若条件许可），提前制作临时装片、摆放示范镜。

教学设计

复习：临时装片的制作方法；植物细胞的基本结构。

实验题目：观察人的口腔上皮细胞

温故知新 提出问题：

①想看看自己身上的细胞吗？

②人的细胞与植物细胞有什么相同和不同之处？

激起疑惑：口腔上皮细胞在哪儿？怎样获得？

解决心中的疑惑 承前启后，知识导入。引导学生联系自身，提出问题，创设学习情境。

出示题目，交流：“看到题目，你有何疑问？

示范取材部位。材料用具

提出疑问：生理盐水有什么作用？

引导、分析方法步骤

一、制作人口腔上皮细胞临时装片

①设计：根据已有的经验，设计实验方案（注意取村、方法、染色剂的变化）；

②制作：同组同学尽量选择不同的方案制作临时装片，增加对比性。参与 引导、帮助

调查

二、用显微镜观察人的口腔上皮细胞

观察自己制作的临时装片，然后同学间交换观察。

借鉴老师摆放的示范镜。

发现由于取材、染色的不同而出现的不同效果。巡视、提示 参与观察

绘制细胞的基本结构图：

细胞膜、细胞质、细胞核、动、植物细胞的异同感知动物（人）细胞的形态结构，注意绘图要领、互评、展示。

讨论、归纳

总结：比较、归纳、描述、指导、提示、评价

出示挂图或媒体演示（投影展示）不同种类的动物细胞

引导、总结

模拟制作

策略①：按照书中方法分组制作。

策略②：改进。利用现成的果冻，将一枚糖粒放入其中表示细胞核，果冻表示细胞质，包装果冻的塑料壳表示细胞膜。

教学反思：

因为有了上一节课的植物细胞的实验，这一实验学生比较容易操作，但有的学生觉得在口腔里面取细胞很恶心，要教育他们科学精神。对于口腔里面的上皮细胞，压片时并没有植物那样容易，可以老师先做好一片示范的在讲台，让学生先了解这些上皮细胞成什么形态后再自己观察，这样易于学生找到细胞，而且也不用老师逐个指导。