环孢素滴眼液稳定性的长期试验考察

0.05%环孢素滴眼液稳定性的长期试验考察

1.前言

环孢素（Cyclosporine，CS）是一种真菌源性、由11个氨基酸组成的亲脂性环状多肽类物质，也是一种高效免疫抑制剂。它广泛地应用于器官移植和多种自身免疫性疾病的治疗中[1]，也是国际上认可的可以治疗干眼症的处方药[2]。其药理作用主要通过选择性、可逆性地抑制T淋巴细胞而实现，通过转导作用，作用于T细胞活化过程中信号，抑制神经钙蛋白，进而抑制T细胞增长与分化[3]，最终达到免疫抑制效果。在临床上多用于治疗器官移植后的免疫排斥反应、类风湿性关节炎[4]等自身免疫疾病，并且可提高存活率。环孢素用于眼表疾病也具有显著的疗效。其在眼科的应用分为全身用药和局部用药两种方式。然而全身用药受到血-眼屏障等因素不易进入眼内，并且会带来严重的不良反应[5]，因此多为眼局部用药。

角膜移植排斥反应是由供体角膜的特殊抗原引起的一种炎性反应。环孢素作为一种强效免疫抑制剂，可有效抑制角膜移植后的免疫排斥反应[6]，在临床的治疗方面仍以糖皮质激素和环孢素为主，但是长时间应用激素会产生多种不良反应。环孢素抑制T细胞由G0期向G1期转变，从而抑制T淋巴细胞的抗原呈递并抑制白介素2和γ-干扰素的产生，减轻术后的排斥反应[7]。

蚕蚀性角膜溃疡又名Mooren＇s溃疡，是一种慢性、进行性、疼痛性角膜溃疡，初发于角膜周边部位，沿角膜周边部延伸，并向角膜中央匍行发展，最终累及全角膜。术后常规应用激素和环孢素滴眼液及环磷酰胺等免疫抑制剂药物治疗。该术后药物维持治疗研究结果[8]证明局部环孢素滴眼液单独或联合板层角膜移植术可以有效治疗难治性蚕蚀性角膜溃疡。

腺病毒感染引起的流行性角膜结膜炎（Epidemic

keratitis

conjunctivitis，EKC）是一种世界性广泛流行的眼部传染病，但可通过自身免疫系统的建立，很快自愈。其临床特点是急性滤泡性或假膜性结膜炎，伴有角膜上皮下浸润，常由免疫反应所引起。通常需要历时一定时间才会吸收，长达数月、甚至数年溃疡不会形成[9]，如果瞳孔区发生了病变，定会对该病人的视力造成的伤害较为严重。Jeng[10]等报道应用环孢素联合糖皮质激素点眼对其进行治疗较为理想，应用环孢素进行治疗会显得更加有效、安全、无副作用。

此外，环孢素多用于治疗临床中常见的干眼症(DES)[11]，干眼症多为种复杂原因所致泪液质和量及动力学的异常从而导致泪膜不稳定性和或眼表面异常、并伴有眼部不适症状的一类疾病。在临床方面用药效果较好，可以有效缓解干眼等不适症状，且不良反应小，可以长期使用。干眼症又名角结膜干燥症(KCS)，是因为眼表泪液减少、黏液分泌异常等原因引发的泪液蒸发较多，分布异常的综合征。其大致可分为四种类型：①由于泪腺功能低下所致的水样夜缺乏性干眼病；②由于沙眼、化学伤所致的黏性蛋白缺乏性干眼病；③由于眼睑缺损、配带角膜接触镜等导致泪液分布不均匀而引起泪液动力学异常；④由于睑板腺功能障碍引起脂质缺乏性干眼症；在普通人群中的发病率为0.3%[12]，干眼症的治疗应着手于去除病因，减少眼表和泪腺的炎症，改善泪膜的结构和功能。

DES的发病率与多种因素有关，其中50岁以上女性患病率约为男性的2倍。

在某些疾病中，其发病率更高，如在糖尿病患者和风湿性关节炎患者中分别为54.3%和46.7%[13]。环孢素滴眼液疗效好，且无全身性不良反应，近年来在欧美国家临床得到了广泛应用。对于斯耶格伦氏综合征(Sjorgren＇s

syndrome)这类与炎症相关的干眼症，可使用环孢素等消炎药进行治疗[14]。各类临床试验也证明，使用环孢素滴眼液能增加患者眼泪量。环孢素较人造眼泪的疗效要好，某些患者经人造眼泪治疗数月无效，但使用环孢素后效果显著，且增强了患者角膜及结膜知觉的敏感度[15]。患有家族性淀粉样多发性神经病变的患者，通过环孢素治疗后干眼症状明显减轻，且无任何不良反应[16]。环孢素的作用是有效缓解慢性干眼症潜在的炎症过程，局部应用环孢素能阻止某些患者干眼进程，对治疗干眼症有良好的疗效。

滴眼剂是眼病治疗常用途径。环孢素具有脂溶性，易溶于植物油中，现如今环孢素的眼用剂型为普通乳剂型滴眼剂。由于环孢素的相对分子质量大且呈疏水性，眼内通透性差，难以达到治疗水平，影响疗效。

微乳（microemulsion,ME）系指粒径为10～100nm的乳滴分散在另一种液体介质形成的热力学稳定的胶体溶液。微乳一般在一定条件下可自发（或轻度振摇）形成，其乳滴多为大小比较均匀的球形，呈透明或半透明状。微乳是由油相、表面活性剂（SF）、助表面活性剂（CoSF）以及水相组成的，在一定温度长时间放置或离心(1300

r/min，30min)均较稳定。

我们按照《中国药典》关于溶液颜色检查法的方法、澄清度检查法以及制剂稳定性指导原则的要求对该制剂的稳定性进行长期试验考察。按药物制剂稳定性重点考察项目，考察滴眼液性状、可见异物、含量、PH值、有关物质及无菌情况。为0.05%环孢素滴眼液的生产、包装、贮存、使用条件提供科学依据。

仪器与试药

2.1

仪器

数显无极恒速搅拌器

（巩义市英峪予华仪器厂）

日本岛津产LC-10AVP型高效液相色谱仪

SPD-10AVP型紫外检测器

LC-10AVP泵

CTO-10AVP柱温箱

Class-up工作站

Shim-packvp-ODS色谱柱（150mm*4.6mm）

日本岛津产紫外分光光度计UV-2450

隔膜真空泵GM-0.33

(天津市津腾实验设备有限公司）

电子分析天平AG135

(梅特勒-托利多仪器有限公司）

实验室pH计FE20

(梅特勒-托利多仪器有限公司）

Model

C3860A超声仪

(CBL

Photoelectron

Technology

Co．Lid．)

渗透压摩尔浓度测定仪SMC

30B

(天河医疗仪器有限公司）

针头式微孔滤膜过滤器

(天津市双

吉色谱仪器经营部）

一次性使用无菌注射器

(浙江京环医疗用品有限公司）

灯检装置

A．带有遮光板的日光灯光源

B．不反光的黑色背景；

C．不反光的白色背景和底部

D．反光的白色背景（指遮光板内侧）。

药品光照试验箱

温度

XMTA908

光照强度XMTA808

（重庆汉瞻仪器有限公司）

调温调湿箱

（天津天宇机电有限公司）

2.2

试药

环孢素

(福建科瑞药业有限公司，批号：140201（N）)

环孢素对照品

（中国药品生物制品鉴定所，含量为98.8%）

大豆油

(新兴（铁岭）药业有限公司，批号：15050106-2-01)

聚乙二醇PEG400

（江西益普生药业有限公司，批号：20141001）

聚山梨酯80

（四川金山制药有限公司，批号：150502）

羟苯乙酯

（广州市广谱医药有限公司，批号：141102）

甲醇

（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）

乙腈

（特级品，天津市康科德科技有限公司）

磷酸

（化学纯，石家庄市试剂厂冀都化学试剂有限公司）

水为纯化水

三乙胺为分析纯

0.05%环孢素滴眼液

（自制三批：160203,160204,160205）

色谱用试剂为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为注射用水。

方法

3.1

样品的制备：

取羟苯乙酯0.3g加入700ml纯化水，加热使之溶解，加入60ml聚乙二醇-400，搅拌，混匀；取0.5g环孢素至乳钵中，加10

ml大豆油，80

ml聚山梨酯80，充分研磨，倒入上述溶液中，快速搅拌，加纯化水至1000ml，混匀，0.45µm微孔滤膜过滤，无菌分装，即得。

3.2

色谱条件及方法学研究：

3.2.1色谱条件：

色谱柱：

Shim-packvp-ODS色谱柱（150mm*4.6mm）

流动相：

乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：0.5），用磷酸调pH到2.93

检验波长：

210nm

柱温：

°C

流速：

1.2

ml/min

进流量：

饱和进样

进样量：

20μL

3.2.2样品预处理：

取C18固相萃取小柱两个，串联使用并将其活化（活化顺序为：甲醇-水-水-甲醇，每次各5ml），用5ml的移液管精密吸取样品5ml至小烧杯中，用注射器全部吸取并缓慢打入小柱，收集滤液，用注射器二次吸取完全，再次通过小柱，弃去滤液，后用5ml纯化水冲洗杂质，再用乙腈、水的混合液（1：1）洗脱样品于10ml的容量瓶中定容，混匀。过滤（孔径0.45µm），作为供试品。

3.2.3系统适应性实验：

用移液管精密量取该样品5ml，按照3.2.2的处理方法操作，再3.2.1的色谱条件下进样，记录色谱图，计算理论塔板数,分离度。比较标准品、样品和空白微乳的色谱图。

3.2.4标准曲线的绘制：

精密称取环孢素对照品25mg于50ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度使成储备液。再分别精密移取储备液3，4，5，6，7ml于10ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配成0.15,0.2,0.25,0.3,0.35µg/ml的溶液，并按上述色谱条件分别进样，记录对应的峰面积。以峰面积（Y）与对照品浓度（X）回归，观察其是否呈良好的线性关系，计算其回归方程。

3.3

制剂稳定性的长期试验考察：

3.3.1溶液的性状：

本品为淡黄色澄明液体。照《中国药典》溶液颜色检查法，配制黄绿色调标准比色液。分别取6℃±2℃条件下，于0月，1月，2月，3月的环孢素滴眼液样品直接与标准比色液比较，样品与标准色体积相等，同置白色背景前，平视观察。

3.3.2鉴别

在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间与对照品主峰的保留时间分别一致。

3.3.3无菌情况的检测：

取本品0.05%环孢素滴眼液，采用薄膜过滤法处理，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗（每膜不少于100ml）,以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依照法检查（中国药典），应符合规定。

3.3.4pH和渗透压的检查：

本品pH值应在5.0～6.5之间，渗透压摩尔浓度应在290～430mOsmol/kg范围内。分别取6℃±2℃条件下0月，1月，2月，3月的0.05%环孢素滴眼液样品适量，测定其pH值、渗透压并观察制剂理化性质是否稳定。

3.3.5可见异物检查：

分别取6℃±2℃条件下0月，1月，2月，3月的环孢素滴眼液样品20支，去除容器标签，把容器外壁清洁干净，调节光照度至2000~3000lx，将供试品置于遮光板边缘处，并在人眼的清晰观测距离内（约为25cm），分别置于黑色和白色背景下，手持供试品颈部轻轻旋转和翻转容器使药液中可能存在的可见异物悬浮（但应避免产生气泡），轻轻翻摇后即用目检视，重复3次，总时限为20秒。

样品制剂在静置一定时间后轻轻旋转时应无烟雾、状微粒柱，且没有检出金属屑、玻璃屑、长度或最大粒径超过2mm的纤维和块状物等明显可见异物；也没有检查出微细可见异物（如点状物、2mm以下的短纤维和块状物等）。根据检测结果，观察该0.05%环孢素滴眼液样品的可见异物检查是否符合标准。

3.3.6样品含量的测定：

取0.05%环孢素滴眼液样品，按照3.2.2样品预处理方法项下操作，供试品20µl进样，使用外标法根据峰面积计算样品的含量。要求该制剂含环孢素（C62H111N11O12）的含量应在90%～110%的范围内。

3.3.7有关物质检测：

分别取6℃±2℃条件下0月，1月，2月，3月的0.05%环孢素滴眼液样品适量，进行精密称定。按照3.2.2的操作步骤完成样品预处理后，然后用乙腈定容，制成每1ml中含0.25mg的溶液，作为供试品溶液；同理制成每1ml中约有2.5µg的溶液，作为对照液。照含量测定项下的色谱条件，取对照液20µl注入液相色谱仪，调节灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20µl，分别进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液色谱图中，单个杂质峰面积不得大于对照液主峰面积的7/10

(0.7%)，测得的各个杂质峰面积之和不得大于对照液主峰面积的1.5倍（1.5%），按照处方制备的要求制作出不含环孢素的空白微乳，做为对照空白；供试品溶液中和空白对照重合的峰应被扣除。

结果与分析

4.1

系统适应性试验结果：

经证明，在此实验条件下能达到环孢素与制剂中其他组分的的分离，按环孢素主峰的保留时间及峰宽计算出理论塔板数n=2328.30>600，分离度R=3.018>1.5,均符合药典要求。如图4-1、4-2、4-3

图4-1

环孢素色谱图

图4-2

空白色谱图

图4-3

标准品色谱图

4.2

标准曲线绘制：如图4-4

图4-4标准曲线图

以峰面积（Y）与对照品浓度（X）回归,在0.15-0.35µg范围内，呈良好的线性关系。回归方程为Y=2×107x+201893.5(r2=0.9996)。

4.3稳定性考察结果：

取3批环孢素滴眼液，置于6℃±2℃环境中放置，分别于第0，1，2，3月取样检测，考察性状、可见异物、无菌情况、pH、渗透压、及药物含量等指标。

结果表明，3批样品在6℃±2℃环境中放置，分别于第0，1，2，3月取样检测，各指标均符合规定，如表4-6稳定性考察结果：

表4-6稳定性考察结果

4.4

样品含量测定

表4-6中数据显示，三批样品的标示量百分含量分别均在90.0%～110.0%的范围之内，该制剂含量符合相关规定。

4.5

有关物质的检查：

在6℃±2℃条件下0月，1月，2月，3月自制0.05%环孢素滴眼液的有关物质测定结果：如表4-6。经过长期的试验观察，测得的单个杂质峰面积均小于对照液主峰面积的7/10，各杂质峰面积的和均小于对照液主峰面积的1.5倍，符合规定。

表4-7

有关物质测定结果

综上试验结果表明：0.05%环孢素滴眼液在6℃±2℃的储存条件下，经过0月，1月，2月，3月的稳定性考察其性状，pH值、渗透压、有关物质、含量等理化性质均合格，符合《中国药典》标准。

讨论

5.1

微乳型制剂确定：

眼部生理结构复杂，具有高度的敏感性和独特的保护屏障，因此眼部给药存在较大的差异，眼部药物传递系统的设计存在很大的困难。微乳乳滴由油相、SF、CoSF和水相组成，适合作为水中溶解度较小的药物的载体，其界面膜具有两亲性，有利于药物穿过角膜屏障进入眼内，提高药物在眼部的生物利用度。环孢素眼用制剂在临床上通常使用0.05%的浓度，且低浓度环孢素对眼部的刺激很小，患者的耐受性较佳。微乳是一种安全、稳定、刺激性小的新型给药系统，且兼具制备方便、易于灭菌、生产成本低等优势，正在被科研工作者投以越来越多的关注。

微乳与传统的滴眼液相比具有显著的优点。传统眼用制剂目前在市场上应用虽然广泛，但是这些传统剂型的主要缺点是眼部的生物利用度很低。在眼球运动和鼻泪系统的作用下会导致药物在角膜前停留时间变短,药物的跨角膜转运也会因药物自身的理化性质和角膜的屏障作用而受到影响。一般情况下只有小于5%的药物才可以进入眼睛的前房组织。患者使用滴眼液要重复多次给药,对于术后的患者应用更为不便。因此，研究新型眼部药物载体来促进眼部的吸收、提高眼部的生物利用度是相当重要的。本制剂0.05%环孢素滴眼液用油性基质制成微乳型滴眼液，具有安全、缓释、稳定、刺激性低的优点。

5.2

样品的预处理原因：

本试验的样品为水包油型微乳，加之大量辅料，不能直接进样，必须通过破乳或者固相萃取小柱，使药物暴露出来才能进行检测。本实验曾试过用乙腈破乳，破乳效果良好，但由于辅料聚山梨酯80与药物溶解性相似，不易分离，且聚山梨酯80的含量远远大于药物环孢素，聚山梨酯80对药物的检测有很大的影响。后使用固相萃取小柱，水洗时可将大部分的辅料和聚山梨酯80洗去，大大降低了聚山梨酯80的干扰。为了防止萃取小柱本身对样品的吸附，减少检测过程中所造成的干扰，需对萃取小柱进行活化，即用5ml甲醇和5ml纯化水分别通过萃取小柱，并吹干。通过活化过的C18固相萃取小柱，先用水将大部分辅料和聚山梨酯80洗去，再用乙腈将药物洗脱出来进样，这样可以减少杂质造成的干扰。

5.3

流动相的配比：

本实验曾试过的流动相有乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：1.0）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（180：620：200：1.0）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（220：580：200：1.0）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：620：180：0.5）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：580：220：0.5）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（220：600：180：0.5）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（180：600：120：0.5）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：0.25）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：1.0）；等等。多组流动相的配比，最终考虑基线，保留时间，峰形等各个方面的因素，选择

乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：0.5），用磷酸调流动相的pH到2-3之间。

5.4

柱温的确定

本实验的柱温定为65

℃，有充分的理论与实践意义。若柱温过高，会使仪器的稳定性降低，产生基线的漂移；若柱温过低，则会严重影响到峰形以及出峰时间。由于环孢素相对分子质量大，脂溶性高，采用色谱柱分离时需用较高的柱温才能使其有效分离，否则峰形很宽，呈丘陵状。本实验分别尝试使用了55，60，65，70，75

℃的柱温，发现随着柱温升高，峰宽逐步减小，峰形改善明显，考虑到柱温太高会影响色谱柱寿命，故最终确定柱温为65

℃。因此，经试验证实，65

℃为本实验的最佳柱温。

5.5

流速的选择

流速主要决定出峰的时间，该实验过程中进行了三个流速的测定，分别为1.0

ml/min、1.2

ml/min、1.5

ml/min。在流速低的情况下，会出现出峰时间拖后的现象；若是流速较高的话，分离度则会受到影响。出峰时间最好控制在10-20

min之间，综合考虑，最终决定使用流速为1.2

ml/min。

5.6

药物制剂稳定性的意义

药物制剂稳定性是指药物制剂从制备到使用期间质量发生变化的速度和程度，是评价药物制剂质量的重要指标之一。药物制剂的稳定性通过进行实验来观察药物的理化性质，对药品在制备过程中及保存期间可能发生的物理化学变化进行相关考察，探讨其影响因素，寻找避免或延缓药物降解、增加药物制剂稳定性各种措施，预测制剂在贮存期间质量标准的最长时间。药物制剂稳定性研究的意义在于保证药品的质量，作到安全、有效、稳定。还可以用于指导新药及其剂型的研制和开发，在某种定程度上也可以减少经济损失。因此，药物制剂的稳定性研究对于保证产品质量以及安全疗效方面具有重要意义。对药物制剂稳定性的研究是为了提高药品的内在质量，应全面地考虑各种因素对药物制剂稳定性所产生的影响，从而筛选出最佳处方为临床提供安全，稳定，有效的药物制剂。

5.7

pH的稳定性观察

正常泪液的pH值在7.2～7.4之间（患眼病时有所改变）。滴眼液的pH过低会因刺激而大量分泌泪液，从而稀释药液并将药物冲出结膜囊，影响药物作用效果。同时，过于偏酸的药液可凝固眼黏膜，造成损害；pH值过高可使眼黏膜上皮细胞硬化或膨胀，导致组织坏死。所以在配置滴眼液时，常加入缓冲物质以调节溶液pH值，使其与泪液大体相近，减少刺激性。正常人眼可耐受的pH值范围为5.0～9.0之间。通过对0.05%环孢素滴眼液pH值的稳定性观察，发现其pH值均在5.0～6.5范围内，在实验观察过程中无明显变化，符合眼用制剂的要求。

5.8

渗透压稳定性观察

在涉及溶质的扩散或通过生物膜生物膜的液体转运各种生物过程中，渗透压都起着极其重要的作用。因此，在制备眼用液体制剂等药物制剂时，需要观察其渗透压的稳定性。溶液的渗透压，依赖于溶液中溶质粒子的数量，是溶液的依数性之一通常以渗透压摩尔浓度来表示。本实验使用SMC

30B渗透压摩尔浓度测定仪对0.05%环孢素滴眼液的进行渗透压稳定性观察，对6℃±2℃条件下的0月，1月，2月，3月的0.05%环孢素滴眼液分别进行测定，其结果显示渗透压摩尔浓度值均在290~430

mOsmol/kg范围内，达到了滴眼剂的质量标准，且多次测量渗透压值保持稳定，长期放置该药物稳定性较好。

5.9

高效液相色谱法测定药物含量

高效液相色谱法测定药物含量准确性高，重现性好，近年来多种眼科制剂均采用此种方法测定其含量。多次实验证明，该方法科学有效，测定结果稳定。高效液相色谱法通常用来测定0.05%环孢素滴眼液的含量，通过高效液相色谱法测定，0.05%环孢素滴眼液制剂样品含量等指标均合乎医院制剂的质量标准，其各项理化性质检测指标均令人满意。

5.10

有关物质的考察

有关物质考察中，首先将制剂样品环孢素按照3.2.2的处理方法操作作为供试品，但同上述方法所制成的对照品溶液的浓度应低于最低检测限（0.01

mg/ml）。因此，我们采用10倍浓度的环孢素样品按照3.2.2的处理方法操作作为供试品，能更好的检测出环孢素滴眼剂产生的杂峰。

在1月、2月、3月后的考察中出现了1-2个杂峰，说明环孢素滴眼剂有降解物。据文献报道环孢素含有的杂质有：环孢素C、环孢素B、环孢素G、环孢素H、异环孢素H和异环孢素A，其中环孢素H、异环孢素H、异环孢素A均可为降解产物，但通过计算有关杂质含量符合药典规定标准。

小结

干眼症是眼科门诊的常见病和多发病，临床上可用0.05%环孢素滴眼液对其进行治疗。0.05%环孢素滴眼液能够有效缓解干眼症的症状,提高患者的生活质量，而且对多种眼表疾病的治疗也具有较好的治疗效果。

本试验通过对0.05%环孢素滴眼液的稳定性进行了长期的试验考察，在6℃±2℃储存条件下，通过0月，1月，2月，3月的稳定性考察其性状，pH值、渗透压、有关物质、含量等理化性质均合格，全都符合《中国药典》的标准，充分说明了0.05%环孢素滴眼液的稳定性较好，参数指标合格，为0.05%环孢素滴眼液的生产、包装、贮存、使用条件提供科学依据。

总之,环孢素滴眼液是是眼科医生治疗干眼症的一种较为安全、有效的药物。