瘦肉精的检测步骤

第一篇：瘦肉精的检测步骤

瘦肉精快速检测卡操作步骤

一、【检测原理】

本试纸采用竞争抑制免疫层析技术的原理来测定动物尿液、组织和饲料中的盐酸克仑特罗。试剂含有被预先固定于膜上检测带（T）的盐酸克仑特罗偶联物和被胶体金标记的抗盐酸克仑特罗单克隆抗体。检测时样品和标记抗体竞争结合偶联物。检测限为3ng/ml（3ppb）。

二、【样品制备】

肉：装入大约4克碎的肉样本（肉泥）于离心管中（酱猪牛肉加2ml水或PBS），盖紧管盖，在80℃左右的水浴锅中水浴10 分钟；吸取煮出的溶液到1.5ml的离心管中。如有明显黄色浑浊请离心（3000rpm,5min），取上清检测。如果检测牛肉请吸出肉汤离心(3000rpm,5min)，取上清检测。

三、【操作步骤】

1.在进行测试前先仔细阅读使用说明书，使用前将本品和待检样本溶液恢复至室温。

2.从原包装中取出试剂，打开后平放在桌面上，请在1小时内尽快使用。

3.吸取待检样品溶液，缓慢滴加80~100μl(约2~3滴）于加样孔中，加样后开始计时。

4.在5分钟内读取结果，超过5分钟的结果判读无效。

四、【结果判定】

阳性：位置C显示出红色条带，位置T无条带或颜色非常模糊时判为阳性。阴性：位置C显示出红色条带，位置T同时出现红色条带时，判为阴性。无效：位置C不显示出红色条带，则无论位置T显示出红色条带与否，该试纸卡均判为无效。

【贮存及有效期】

冷藏，忌冷冻，有效期12个月。

【注意事项】

1.请按照操作步骤进行测试，操作时请勿触摸试纸显示区。

2.如购买时发现过期，破损，污染，无效的产品，请到购买处更换。

3.本品为一次性产品，请勿重复使用。

4.出现阳性结果，建议用本卡复查一次。

5.自来水、蒸馏水或去离子水不能作为阴性对照。

6.由于样品（尿和饲料）的差异，有的检测线可能偏淡或偏暗，但只要出现条带，就可判定为阴性结果。

7.若需直接检测标准品，请用PBS或阴性样品配制。

第二篇：瘦肉精检测原理及操作步骤

瘦肉精检测原理及操作步骤？

时间：2011-03-22 来源： 作者：

一、测定原理

“瘦肉精”克仑特罗竞争酶标免疫检测方法快速测定的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体（第二抗体）。加入兔抗克仑特罗特异性抗体（第一抗体）与第二抗体结合而被固定，洗涤后加入标准液或样品溶液与酶结合物（酶标记抗原），标准液或样品中的游离抗原与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原，加入酶基质（过氧化脲）和发色剂（四甲基联苯胺）并孵育，结合到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。在单波长450 nm处测吸光度，吸收光强度与样品中的克仑特罗浓度成反比。

二、试剂盒的组成

每个盒中（包括标准分析孔）材料如下：

（1）1×96孔板（12排×8孔），包被有第二抗体（兔IgG抗体）；（2）6个标准液（300ul/瓶）为克仑特罗水溶液。浓度分别为0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg；（3）1个克仑特罗过氧物酶标记物浓缩液12 ml（红色帽）；（4）1个克仑特罗抗体浓缩液12 ml（黑色帽）；（5）1个酶基质/发色剂11 ml（蓝色帽）；（6）1个反应停止液，1 mol/L硫酸14 ml（黄色帽）；（7）1个缓冲液25 ml，酶标记物及抗体浓缩液稀释用。

三、试验材料

1、设备

微孔板酶标仪（450 nm）、均质器、冷冻离心机、离心管（50 ml）、微量可调移液器（单道、八道）、RIDAC18柱、滤纸（0.45μm）。

2、试剂

甲醇（分析纯、100%）、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0）、500 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0）、1 mol/LNaOH。

四、储存条件

试剂盒保存于2-8℃，不要冷冻。不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与干燥剂一起重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，避免直接暴露在光线下。

五、试剂变质的迹象

发色剂有任何颜色表明已变质，应当弃之。0标准的吸光值小于0.6时，表示试剂可能变质。

六、样品处理

1、尿样

尿样一般不用处理，取20清亮尿样直接测定。如果尿样混浊要过滤或离心至得到清亮尿样。

2、肝脏、肉样

粉碎的5g样品与25ml50 mmol/L HCL混合，振荡1.5 h，以达到均质的目的。称6g均质物（相当于1 g肝脏），加入离心管中。10-15℃条件下（非常重要）4000转/min或更高的转速离心15 min。转移上清液到另一个离心管中，加300μl 1mol/L NaOH混合15 min。加入4 ml 500 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0），简单混合并在4℃保存至少1.5 h或过夜（非常重要）。10-15℃条件下（非常重要）4000转/min或更高的转速离心15 min。分离全部上清液（应是清亮的，非常重要），使其升至室温（20-24℃），然后用RIDAC18柱纯化。

RIDAC18柱纯化样品必须在室温条件下（20-24℃），并严格控制过柱时流速。用3 ml甲醇洗涤柱子，控制流速为1滴/s。用2ml洗涤液（50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0），洗涤柱子。肝脏、肉样的全部上清液进柱，控制流速为1滴/4s。用2 ml洗涤液（50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0），洗涤柱子，流速为1滴/s。用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹2 min，干燥柱子。用1 ml甲醇洗脱样品，控制流速1滴/4s。在50-60℃并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶剂。用1 ml蒸馏水溶解干燥的残留物，取20μl进行分析。

3、饲料

取10ｇ饲料样品，用10 mmol/LHCL溶解，连续震荡10 min，用滤纸过滤，在滤液中加入120μl 1mol/L NaOH进行中和，检查pH，用NaOH控制PH值在6.5-7.5之间，取上清液20μl进行分析。稀释倍数为25（即含有0.04 g饲料样品/ml）。

七、测定步骤

第一步：所有试剂及样品在开始检测前必须回升至室温（20-24℃），测定操作在20-24℃下进行。

第二步：用盒中缓冲液以体积1﹕10的比例稀释实际用量的克仑特罗抗体浓缩液（黑色盖），稀释前轻轻混均抗体，不要猛烈振荡。

第三步：取出实验需要数量的微孔板条，足够标准和样品所用的数量，标准和样品做两个平行试验，记录标准和样品的位置。剩余的微孔板条放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，置于2-8℃冷藏。

第四步：每个微孔中底部加100μl稀释后的抗体溶液，室温（20-24℃）孵育微孔板15 min，避免光线照射。

第五步：孵育的同时进行酶标记物的稀释，用盒中缓冲液以体积1﹕10的比例稀释实际用量的克仑特罗酶标记物浓缩液（红色盖），稀释前轻轻混均抗体，不要猛烈振荡，避光放置。

第六步：洗板，甩出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打，直到纸上无明显水迹（拍打3次），以保证完全除去孔中的液体。用250μl蒸馏水充入孔中，再次甩掉微孔中液体，并在吸水纸上拍打，重复操作两次。加洗涤水的移液器管尖必须置于微孔上方约0.5 cm处打出洗涤水，避免将板孔中的游离抗体带入洗涤水中。洗板后立即进行下一步操作，不要让板孔干燥。

第七步：加入20μl标准或处理好的样品到各自的微孔底部，标准和样品做两个平行实验。

第八步：加入100μl稀释了的酶标记物至微孔底部，轻轻震荡微孔析并在桌面上作圆周运动以混匀。移液器管尖不要接触到孔中的混合物，避免交叉污染。

第九步：室温孵育微孔板30 min，避免放置，尽可能每隔10 min轻轻振荡1次，准备好酶基质/发色剂，并注意避光放置。

第十步：洗板，同第六步。在洗板过程中加洗涤水的移液器置于微孔板上方0.5 cm处打出洗涤水，避免将板孔中的游离酶标记物带入洗涤水中。

第十一步：不要让板孔干燥，迅速加入100μl酶基质/发色剂到每个孔中，步骤操作要迅速，避免头尾反应时间相差过长，轻轻振荡板并在桌面上作圆周运动以混匀。移液器管尖不要接触微孔中的混合物，避免交叉污染。

第十二步：室温暗处孵育微孔板15 min，暗处避光放置，同时准备好反应停止液。

第十三步：每孔加入100μl反应停止液，混匀，60 min内用酶标仪测量450 nm处波长吸光度值。

八、结果

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，并且以百分比的形式给出吸光度值。

吸光度值（％）＝ ×100

计算的标准值（吸光度值）绘成一个对应克仑特罗浓度（mg/kg）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在200-2000 ng/kg范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度（ng/kg）可以从校正曲线上读出

第三篇：瘦肉精检测

通许县动物卫生监督所关于

外销生猪“瘦肉精”检测的报告

开封市动物卫生监督所：

为了保证畜产品质量安全，保障人民身体健康，全面推进和谐社会的创建，2010年6月21日，通许县畜牧局下发文件开展世博会期间整顿生猪经营处等检疫秩序活动，特别是重点开展 “瘦肉精”的检测工作，坚决杜绝在饲料中使用莱克多巴胺及克伦特罗等违禁药物，整顿和规范饲料、兽药市场，严厉打击假冒伪劣产品，实现全县生猪生产的安全无污染，确保外销到市场的是“放心猪”。

通许县动物卫生监督所认真学习贯彻了县局文件精神，开展以“瘦肉精”和重大动物疫病为主的检测检验；加大对使用“瘦肉精”的打击力度，建立生猪疫病防治体系，确保生猪及其加工产品的质量安全。对检测出“瘦肉精”的生猪产地在3个月内禁止外销，经检测合格后重新申请进入市场。逐步推行生猪产品市场准入制度、“一猪一标一码”标识管理制度。对生猪“瘦肉精”进行重点抽检，检验中凡发现有“瘦肉精”的生猪均进行销毁，并向产地通报和封停该地生猪进入市场。

据汇总统计，2010年6月至8月份我县共外销生猪8603头。分批次发往浙江省慈溪市、江苏省无锡市、安徽省和县、浙江省宁波市、江苏省常州市、广东省湛江市、安徽省合肥市、安徽省淮南市、安徽蒙城县等九个城市和地区。“瘦肉精”检测全部呈现阴性。其中6月份外销生猪2053头，抽检生猪尿样110多个，检测结果全部呈现阴性，合格率达到100%。7月份外销生猪3190头，抽检生猪尿样160多个，检测结果全部呈现阴性，合格率达到100%。8月份外销生猪3360头，抽检生猪尿样170多个，检测结果全部呈现阴性，合格率达到100%。

二○一○年九月八日

主题词：瘦肉精 抽检 报告

通许县动物卫生监督所二○一○年九月八日印

第四篇：(瘦肉精)检测制度

第十节

屠宰企业违禁药物（瘦肉精）检测制度

（适用实行瘦肉精企业自检的地区）

一、为规范生猪定点屠宰厂（场）待宰生猪尿样违禁药物“瘦肉精”的日常检验工作，制定本制度。

二、定点屠宰厂（场）必须有满足日常检测需要的工作场所及实验室，并应保持光线充足，通风良好，室内环境整洁，基本设施齐全。

实验室必须配备能满足检测工作需要的检测人员和审核人员。

三、检测人员必须经过有关单位的培训，能独立操作，包括样本的采取和检测。

四、定点屠宰厂（场）必须建立瘦肉精检测台帐，并建立人员岗位责任制，所有检测设施、器材、记录等都要专人妥善保管。

五、严格执行省政府的有关要求，生猪宰前必须进行瘦肉精检测，并实行每批必检制度（一个检疫证号为一批）。

六、检测结果应在屠宰厂（场）内固定场所以醒目方式对外公示。

七、若检测出现阳性结果，屠宰厂（场）必须将检测结果立即报送当地动物防疫监督机构处理。

八、检测方法按照《动物组织中盐酸克伦特罗的测定 气相色谱/质谱法》NY/T 468-2006的规定执行。

九、屠宰厂（场）应自觉接受屠宰管理机构和动物防疫监督机构对检测工作开展监督检查、指导。

第五篇：瘦肉精检测方法

目前，检测瘦肉精的方法主要有四种，即高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱一质谱法（GC－MS）、毛细管区带电泳法（CE）和免疫分析技术（IA）。而我国结合自己的实际情况，2001年农业部首先组织制定了饲料中盐酸克伦特罗的测定标淮。该标准选择确定了两种：即高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱一质谱法（GC－MS）。其中将HPLC法作为检测瘦肉精的半确证性方法，其最低检测限为 0．05μg/kg，优点是检测精确度高，而且假阳性率低；缺点是检测过程烦琐、检测时间长，需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。而GC一MS法优点是能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析。GC－MS法与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低，已将GC－MS法定为检测瘦肉精的确证性方法。GC－MS法的缺点同HPLC相似。

(1)试剂和材料 以下所有试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB／T6682规定的二级水。

①盐酸克伦特罗对照品：含盐酸克伦特罗不得少于98．5％

②盐酸

③无水甲醇

④氢氧化钠

⑤磷酸二氢钾

⑥磷酸

⑦盐酸溶液 取盐酸4．2ml，加水至1000ml，即得。

⑧o．5mol／L磷酸二氢钾溶液 取磷酸二氢钾68g，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．O，用水稀释至1000ml，即得。

⑨0．05mol几磷酸二氢钾溶液 取磷酸二氢钾6．88，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．0，用水稀释至1000mi，即得。

a．氢氧化钠溶液 取氢氧化钠48，加水使溶解成100mi，即得。

b．盐酸克伦特罗对照品储备液(1mg／mi)准确称取28．3mg盐酸克伦特罗对照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。

⑩盐酸克伦特罗对照品工作液(10ttg／mi)取lmg／mi储备液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。

⑾盐酸克伦特罗对照溶液(100ng／m1)取1(ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。

⑿盐酸克伦特罗检测试剂盒(2～8~C冰箱中保存)

⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％

(2)仪器和设备

①酶联免疫反应读数仪

②分析天平精度0．00001g

③天平精度0．01g

④冷冻离心机

⑤50mi具塞离心管

⑥匀浆机

⑦微型振荡器

⑧回旋振荡器

⑨微量移液器 单道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL，⑩干热浓缩器

①空气压缩机

(3)测定步骤

①试料的制备(尿)

取供试尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为供试试料，直接供酶联免疫测定法测定。

取空白尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为空白试料，直接供酶联免疫测定法测定。

取空白尿2ml，于3000r／min离心l0min，上清液1.0ml添加l00ug／L的克伦特罗对照溶液20／H。作为2ug/l空白添加试料，直接供酶联免疫测定法测定。

②试料的制备(肝)

取约l00g新鲜或冷冻后融化的空白或供试猪肝,用匀浆机以10000r／rain匀浆1-2min，使均匀呈糊状，一20~C以下冰箱中贮存备用。

取均浆后的供试肝样，作为供试试料。

取均浆后的空白肝样，作为空白试料。

取均浆后的空白肝样(1土0．05)e添加l00ng／m1的克伦特罗对照溶液20tzL作为2ng／g空白添加试料。

a：提取(肝)取(1士o．05)z试料，置50ml离心管中；加盐酸溶液5.0mi，旋涡混匀，中速振荡1．5h；在10—15~C下以4000r／mill以上速度离心15min；上清液移人另一50ml离心管中，加入氢氧化钠溶液300gL，混匀，振荡15min；加0.5mol／l磷酸二氢钾溶液4。0ml，混匀，2—8~C放置过夜；取上述溶液于10～15~C以4000r／111113以上的速度离心15min，上清液备用。

b．净化(肝)C，固相萃取柱依次用无水甲醇3mi、0.05mol／L磷酸二氢钾溶液2mi预洗，不使柱床干涸；将备用上清液全部过柱；用0.05mol／L磷酸二氢钾溶液2ml淋洗，挤干，弃去所有淋洗液；用无水甲醇2mi洗脱，流速控制在0.5ml／mm以下，挤干，收集洗脱液；于50～60~C下用氮气或空气缓缓吹干洗脱液；残余物用水1.0ml溶解，以4000r／mill以上的速度离心15rain，清液作为试样溶液供酶联免疫测定法测定。

③测定

a．室温应控制在19～30~C。

b．取在19—30~C放置1—2h的试剂盒，按每个标准溶液和试样溶液至少两孔计算所需酶联板条的数量，插入框架。每个微孔加入用缓冲溶液100倍稀释的抗体100~tL，封口膜封板，室温孵育30min。

c倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。用多道移液器加水250pL到酶联板的微?L内，稍后倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，如此重复操作洗板3次。

d．分别吸取标准溶液、空白试料、空白添加试料和供试试料各20uL，分别放入不同微孔底中央，并在每孔内加入用缓冲溶液100倍稀释的酶结合物100~I。，在微型振荡器上混匀，用封口膜封好，室温孵育30min。

e．倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，重复洗板3次。

f．用多道移液器加入用底物缓冲溶液10倍稀释的底物100uL，室温避光孵育15min。

g．用多道移液器每孔加终止液100uL。

h．在1h内将酶联板放于酶标仪内，于450nm波长处测定吸光度值。

(4)计算 用数据分析软件对结果进行分析，绘出标准曲线，并得出试料中克伦特罗的含量。

(5)灵敏度和回收率

本方法的平均检测下限为0.1mg／Kg。

本方法在1ug／kg添加浓度水平上猪尿回收率范围为60％一120％，猪肝回收率范围为40％～120％。