真菌的分子鉴定

第一篇：真菌的分子鉴定

真菌的分子鉴定

内生真菌(Endophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌，真菌的分子鉴定。近年来的研究表明，内生真菌可以产生与宿主相同或相似的代谢产物，对相应的内生真菌及其代谢产物的研究已经成为寻找药物来源的一种新途经。本文以我国特有药用植物——喜树(CamptothecaacuminataDecne.)为实验材料，对喜树内生真菌的组织分布及分离方法进行初步研究。实验结果表明，内生真菌分离的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞结合的方法较好。对喜树的根部和茎部的升汞消毒时间以4～5min为宜，喜树叶子的升汞消毒时间应控制在2min左右。在所试条件下共计分离得到70株内生真菌，主要分布在树叶(42.9%)和皮部(35.7%)，根部(14.3%)和种子(7.1%)中的内生真菌数目较少，在木质部未分离到内生真菌。采用形态学和分子生物学结合的方法对所得菌株进行鉴定。应用形态学方法共鉴定出6株内生真菌，分布于6属。按照培养特征，把所得内生真菌归为27个形态类群。选取不同形态类群中的代表菌株，扩增并测定其rDNAITS区段的DNA序列，结合内生真菌与GenBank中参考菌株碱基序列相似性和系统发育关系分析，确定其分类地位，鉴定材料《真菌的分子鉴定》。共获得18株内生真菌的ITS序列，分析结果表明，这18株内生真菌分属于2个亚门，4纲，8目，8科，14属;形态学鉴定与分子生物学鉴定结果一致。鉴定结果在一定程度上反应了喜树生态系内生真菌的生物多样性。在本研究中，共分离得到18株拟茎点霉属(phomopsis)菌株，占25.7%，为优势菌群，对其进行了基于ITS区段的系统发育分析。本文采用薄层层析TLC方法与高效液相色谱HpLC法，从3株内生真菌CZ-

14、CZ-

17、CZ-18的发酵产物中检出喜树碱，含量为0.03-0.04mg/g。发酵产物是以喜树种子煎汁液体培养基培养。

内生真菌(Endophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。近年来的研究表明，内生真菌可以产生与宿主相同或相似的代谢产物，对相应的内生真菌及其代谢产物的研究已经成为寻找药物来源的一种新途经。本文以我国特有药用植物——喜树(CamptothecaacuminataDecne.)为实验材料，对喜树内生真菌的组织分布及分离方法进行初步研究。实验结果表明，内生真菌分离的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞结合的方法较好。对喜树的根部和茎部的升汞消毒时间以4～5min为宜，喜树叶子的升汞消毒时间应控制在2min左右。在所试条件下共计分离得到70株内生真菌，主要分布在树叶(42.9%)和皮部(35.7%)，根部(14.3%)和种子(7.1%)中的内生真菌数目较少，在木质部未分离到内生真菌。采用形态学和分子生物学结合的方法对所得菌株进行鉴定。应用形态学方法共鉴定出6株内生真菌，分布于6属。按照培养特征，把所得内生真菌归为27个形态类群。选取不同形态类群中的代表菌株，扩增并测定其rDNAITS区段的DNA序列，结合内生真菌与GenBank中参考菌株碱基序列相似性和系统发育关系分析，确定其分类地位。共获得18株内生真菌的ITS序列，分析结果表明，这18株内生真菌分属于2个亚门，4纲，8目，8科，14属;形态学鉴定与分子生物学鉴定结果一致。鉴定结果在一定程度上反应了喜树生态系内生真菌的生物多样性。在本研究中，共分离得到18株拟茎点霉属(phomopsis)菌株，占25.7%，为优势菌群，对其进行了基于ITS区段的系统发育分析。本文采用薄层层析TLC方法与高效液相色谱HpLC法，从3株内生真菌CZ-

14、CZ-

17、CZ-18的发酵产物中检出喜树碱，含量为0.03-0.04mg/g。发酵产物是以喜树种子煎汁液体培养基培养。

第二篇：真菌鉴定方法

真菌鉴定方法

一般常用的有：

1、直接鉴定法

2、通过筛子检验

3、比重检验法

4、染色检验法

5、洗涤检验法

6、保湿萌芽检验

7、分离培养检验

真菌主要是酵母，霉菌和大型真菌三种，最常用的鉴定方法就是表形观察，霉菌和大型真菌可以通过菌丝的颜色，孢子的形态进行区分，辅以23srRNA就基本ok，酵母可以通过发酵代谢观察辅以23rRNA进行鉴定，真菌鉴定方法。

真菌是细菌的一种吗?

随着生活水平的逐渐提高，人们的卫生防病意识也在不断加强。大多数人知道细菌可以导致疾病，并习惯用“有病菌”或“有细菌”来形容一个脏的环境或物品。那么，真菌又是怎么回事，是细菌的一种吗?的确，真菌也很微小，也能使人生病，但它和细菌有着本质的区别。

我们知道，植物和动物都是由细胞组成的，细胞内都有细胞核，鉴定材料《真菌鉴定方法》。而微生物中只有真菌具有真正的细胞核和完整的细胞器，故又称真核细胞型微生物;细菌仅有原始核结构，无核膜和核仁，细胞器很少，属于原核细胞型微生物;而病毒则没有细胞结构，属于原生微生物。

真菌在自然界中分布极广，有十万多种，其中能引起人或动物感染的仅占极少部分，约300种。很多真菌对人类是有益的，如面粉发酵，做酱油、醋、酒和霉豆腐等都要用真菌来发酵。工业上许多酶制剂、农业上的饲料发酵都离不开真菌。许多真菌还可食用，如蘑菇、银耳、香菇、木耳等。真菌还是医药事业中的宝贵资源，有的可以用于生产抗生素和维生素以及酶类;有的本身就可以入药用于医治疾病，如中药马勃、茯苓、冬虫夏草等。

真菌还可引起动、植物和人类的多种疾病，在人类主要有三种类型：①真菌感染;②变-态反应性疾病;③中毒性疾玻

霉菌

亦称“丝状菌”。属真菌。体呈丝状，丛生，可产生多种形式的孢子。多腐生。种类很多，常见的有根霉、毛霉、曲霉和青霉等。霉菌可用以生产工业原料(柠檬酸、甲烯琥珀酸等)，进行食品加工(酿造酱油等)，制造抗菌素(如青霉素、灰黄霉素)和生产农药(如“920”、白僵菌)等。但也能引起工业原料和产品以及农林产品发霉变质。另有一小部分霉菌可引起人与动植物的病害，如头癣、脚癣及番薯腐烂病等。

酵母菌

属真菌。体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。通常以出芽繁殖;有的能进行二等分分-裂;有的种类能产生子囊孢子。广泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各种果品和蔬菜上更多。是重要的发酵素，能分解碳水化合物产生酒精和二氧化碳等。生产上常用的有面包酵母、饲料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。有些能合成纤维素供医药使用，也有用于石油发酵的。

啤酒酵母(Saccharomyces)

属酵母菌属。细胞呈圆形、卵形或椭圆形。以出芽繁殖，能形成子囊孢子。在发酵工业上，可用来发酵生产酒精或药用酵母，也可通过菌体的综合利用提取凝血质、麦角固醇、卵磷脂、辅酶甲与细胞色素丙等产品。

红曲霉素(Monascuspurpureus)属于囊菌纲，曲霉科。菌丝体紫红色。无性生殖时，茵丝分枝顶端形成单独的或一小串球形或梨形的分生抱子。有性生殖时，产生球形、橙红色的闭囊果，内生含有八个子囊孢子的子囊。红曲霉可制红曲、酿制红乳腐和生产糖化酶等

第三篇：真菌培养及鉴定

真菌培养及鉴定

、真菌培养及鉴定

1.采集标本 体表真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒，真菌培养及鉴定。深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴-道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本应注意无菌操作。

2.培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(Sabouraud agar)上，置室温或37℃培养1～3周。必要时可行小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断。对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。

真菌培养的方法与直接镜检法相比较而言，更能对大部分真菌感染的灰指甲作出准确的鉴定，也是诊断灰指甲的一个很重要的手段。下面我们就从培养基的选择、培养时间、菌种鉴定三方面来了解一下灰指甲的真菌培养法。

1.培养基的选择

通常培养真菌会同时选用两种培养基，如果单用一种培养基，则容易忽略其它种类的真菌诊断。常见的两种培养基，一种为沙氏葡萄糖琼脂培养基中加抗菌剂，常为氯霉素和放线菌酮;另一种是沙氏葡萄糖琼脂培养基中仅加氯霉素，不加放线菌酮。

2.培养时间

各种真菌的生长速度不同，所以报告的时间也不同。一般皮肤癣菌生长较缓慢，在26℃-28℃的环境下需要培养2-4周才能发报告，但是，皮肤癣菌含盖的菌种较多也需要区别对待;酵母菌生长较快，通常2-3就可以发报告，如果为阴性则需要观察1周;霉菌生长也比较快，一般2-4天就可以发报告。

3.菌种鉴定

(1)丝状真菌：包括皮肤癣菌和霉菌，根据菌落形成所需要的时间，在不同条件下生长的情况，菌落表面及背面的形态、色素，培养基中有无色素，培养物用乳酚棉蓝染色后镜检找特征性标志结构。(2)酵母菌：分为形态学鉴定及生化试验，鉴定材料《真菌培养及鉴定》。形态学鉴定主要观察有无假菌丝产生，如有则为念珠菌属，如无则为念珠菌以外的酵母菌;生化试验最为常用的是ApI系统，用此法鉴定准确，但价格较贵。)丝状真菌：主要是形态学的鉴定，如直接涂片观察，小培养显微镜鉴定，诱导形态观察(25℃与35℃下双相型真菌的特征孢子及菌丝的产生和两种菌落的形成及脑心浸液琼脂培养基，KT培养基，KelleyAgar培养基转相诱导，另外常用的还有皮肤癣菌VB1生长刺激，吴氏荧光检查，毛发穿孔试验及在特殊情况下进行的一些生化鉴定等。其中，小培养显微镜检对于丝状真菌的鉴定，特点是动态直观，易于观察，且节约材料。解放军总医院第一附属医院皮肤科马天

(2)酵母菌鉴定：形态学鉴定主要是玉米吐温诱导下特征菌丝及特征孢子的检验，血清芽管形成，而在形态学基础上还必须进行生化鉴定：有标准鉴定，自动仪器鉴定，显色鉴定，其中，自动仪器鉴定(如ApI20C，ID32C等)，显色鉴定对于酵母样真菌的鉴定，特点是快速简便;标准鉴定是按传统双歧表流程鉴定(包括糖同化试验，糖发酵试验，CAFC酚氧化酶试验，尿酶试验，KNO3同化试验，脂肪酸需求试验)，是真菌鉴定的金标准，系统准确，缺点是程序繁琐，耗时长，与临床治疗不太适应。此外，还有血清学玻片凝集试验，动物致病性实验，分子生物学鉴定：如核酸杂交，DNA探针杂交，pCR扩增序列分析，pCR-SSCp单链构象多态性分析，pCR-RFLp限制性片段长度多态性分析，pCR-RApD随机扩增多态性分析，pFCG脉冲电泳核型分析等。

对于酵母样真菌首选CHROMagar念珠菌显色培养基，而显色培养基不能鉴定的酵母样真菌可采用自动仪器YBC卡进行鉴定或ApI板;条件较差的实验室可采用传统标准鉴定法中鉴定值较高的试验，如酚氧化酶鉴定新型隐球菌(+)，尿素区分毛孢子菌属(+)，地丝菌属(-)，念珠菌属(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球拟酵母属(-)，隐球菌属(+)，玉米-土温培养基上产菌丝区分念珠菌属(+)与球拟酵母属(-)，隐球菌属(-)与毛孢子菌属(+)，地丝菌属(+)。而同化试验推荐平皿法，一个平皿内可观察多种糖类的同化情况，且结果易于观察，重复性好。对于丝状真菌及双相型真菌，可采用小培养法，快速简便易于观察。而对于双相型真菌还须经过脑心浸液培养基转相试验后确证。而血清学及分子生物学则主要用于流行病学和一些难培养难鉴定真菌的检验，由于成本高或要求技术难度较高，故而不适合在常规工作中采

第四篇：分子鉴定

分子鉴定

现代真菌鉴定分型方法

北京大学第一医院(100434)王端礼

真菌 的 鉴 定不仅是临床的需要，在植物病理学、生物退化、生物技术和环境的研究都很重要，分子鉴定。许多真菌已经鉴定到种，但是分类学家仍在忙于新种的描述和其分类的研究。有些菌种由于经济学的关系或是病理学的重要性，有深人的研究，其他则需要现代手段来进行研究。

一、形 态学

用表 型 特 征来进行分类鉴定，是过去和现在都普遍应用的方法。致病真菌的鉴定，需要光镜，现在更加上荧光显微镜和细胞化学，还有各种染色法，如子囊泡子染色法。真菌在宿主体内鉴定比较困难，如菌丝只能看到有无分隔，有无色素。需要培养来鉴定菌种。某些病例用种特异性抗体探针非常有用，但此种技术尚未在医真菌学领域内作为常规技术使用。合适的培养基培养鉴定菌种，是常用的方法。

医学 真 菌 学家常见到的是半知菌，要看抱子形态和抱子发生，看产抱细胞，即分生抱子梗。有两种型，一是芽生抱子发生，在产抱细胞上有一小点产生分生抱子，另一是叶状抱子发生，整个细胞是产抱细胞，分成一至数个细胞。基于超微结构观察，有许多词语，但未能普遍应用。有的真菌没有分生抱子，但仍有一些特征，如菌核(sclerotia)、厚壁抱子和一些特殊的菌丝结构，如皮肤癣菌。在少数情况下，一些机会真菌产生有性结构，有许多特点用于菌种鉴定，如子囊菌、担子菌和结合菌。

电镜，T EM是观察菌的断面，子囊菌酵母和担子菌酵母的横隔不同，SEM在实际应用有许多发现，如子囊菌的表面结构可以鉴定到种。

现 代 形 态学技术，如自动成像分析、电子颗粒体积、分数几何学分析形态学的特点。

由于 表 型 各种词语没有一定的标准，有很大的主观性，某些表型特征也不稳定，受环境影响，有的不能在人工培养基上生长，有一些真菌尚未分类，分类概念有待近一步建立，鉴定材料《分子鉴定》。

二、分 子 生物学

表型 分 类 受限，生理生化技术在丝状真菌鉴定方面，或是费时费事或是结果不准。分子生物学非常适用。有两种技术，第一，pCR技术，可以分析少量真菌细胞，甚至单个真菌抱子。第二，选择通用寡核昔酸对真菌种特异性引物，测定其核昔酸序列。分子生物学的研究目的由于生物多样性有四个目的。I)系统发生研究。2)分类学的研究，在属、种水平。3)鉴定应用，即决定明确的分类名称。4)流行病学和群体的遗传学研究。具体方法不再详述。

三、其 他 :

I，生 理 学 和生物化学

在纯 培 养 上真菌生长比较快，可以使用生理、生化方法来鉴定菌种。如黑酵母的鉴定。不同的生长温度也用于鉴定。有性和无性是一个辅助工具。在一定的培养基上，有对照，其生长速度也可用于鉴定，如青霉。Ap[系统也用于丝状真菌的鉴定。

2.次 级 代谢产物

次级 代 谢 产物既不是为了生长需要，也不是介导基本代谢，常常发现它是一个与分了有关的混合物，有特殊的和极罕见的化学结构。常见的是固醇、菇、类碱、香豆素等，某些是真菌毒素。将小量从培养皿切下来的标本，直接进行层析色谱法检查，比传统浓缩抽取提纯法简单易行。此法用于地衣的鉴定较好。很少用于真菌分类，由于对环境有一定影响，而且比较难，较少应用，但有人用于子囊菌的分类。

3.泛 酉昆 系统

是一 种 初 级代谢产物，起重要作用。泛酿即辅酶Q，是呼吸系统电子传播链的携带者。一些异戊二烯(isoprene)接触醒核各有不同，对鉴定到属或属以下水平很有帮助。主要鉴定细菌和酵母，也用于黑酵母和丝状真菌。

(Ya ma da Y ,e tal.In t.J.Genet 1989;5 6:309 Y ag uchiJ > e tal.M ycoscience 1996;3 7:55)0

4.脂 肪 酸组成此法 在 细 菌学方面是常规应用的。一是成分，二是相对浓度。极少用于真菌分类。使用热解气相色谱法、热解块状光谱仪、气相色谱仪、隔膜水相聚合物双相系统等，主要应用这些方法。近来应用气相色谱法合并多变量统计分析方法，成功地用于丝状真菌，包括卵菌、担子菌、结合菌、甚至只有菌丝的真菌。用于种间水平。应注意许多变化，如培养状态和温度是最主要的。

5.细 胞 壁组成子 囊 菌 和担子菌含有几丁质和葡萄糖，结合菌含有脱乙酞几丁质(chitosen)和葡聚糖醛酸。不同的皮肤癣菌含有不同的糖分，醉母细胞壁或是缺乏或是含有少量其他多糖(如岩藻搪、乳糖、鼠李糖、木搪等)。

6.蛋 白 质组成用 电 泳 方法可以产生同工酶，可鉴定到属或种。电泳、免疫学方法、蛋白质分析等可解决种间特性。同工酶分析是一个经济和实用技术。等位基因酶(allozyme)通常用于系统发生的研究。

第五篇：真菌的鉴定

真菌的鉴定

麦曲在黄酒酿造中起着重要的作用，真菌的鉴定。分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育，对于理顺麦曲中的微生物与产地环境的相互关系、建立麦曲微生物生态数据库和麦曲品质的分子评价指标，具有重要的指导意义。

不同培养基进行真菌平板分离的结果

文章来源华夏酒报

为了最大限度地分离出麦曲中的真菌，采用了三种培养基，其中pDA和CpK培养基是用来分离真菌的常用培养基，此外还使用了麦曲浸提液培养基(WQE)，因为它的营养成份近似于微生物最原始的生存环境。对于三种培养基进行平板菌落计数，pDA和WQE培养基上的菌落数在48小时后达到最大，菌落数分别达到4.7×104cfu/g干曲和8.4×104cfu/g干曲。而在CpK培养基上，由于本身是合成培养基，营养不够丰富，所以24小时后开始慢慢形成菌落，56小时后达到最大值，仅为1.4×104 cfu/g干曲。

不同培养基的麦曲真菌分布

根据菌落大孝形态和颜色等表型特征进行初步区分，共得到24株纯种菌株。各个纯株在3种分离培养基上的分布情况见表1。从pDA，CpK和WQE三种培养基上分离得到的纯种真菌分别为8种、18种和11种。pDA是营养丰富的培养基，但分离出来的真菌数目最少。而近似于微生物最原始生存环境的WQE培养基分离得到的真菌种类，要比预期的少。在合成培养基CpK上分离获得的真菌种类最多，暗示在低营养长时间的培养条件下，能够较多地回收得到麦曲样品中的真菌。

将10—5稀释度以上检测到的真菌认为是麦曲样品中的优势菌。从表中可以看出，不同的培养基分离出来的优势菌是不一样的，且每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株，所以必须联合使用多种分离培养基，才能准确解析麦曲中的真菌多样性。另外，在分离培养基中有必要加入去氧胆酸钠来抑制菌丝的蔓延。

纯种真菌的鉴定

对分离获得的24株真菌纯株进行形态初步鉴定和基于ITS序列的分子鉴定，具体测序结果见表 综合平板分离和测序的结果可以看出，通过大规模的系统分离培养方法确定麦曲中的优势真菌为：伞枝犁头霉(Absidia corymbifera—like)，米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus.niger)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、季氏毕赤氏酵母(pichia guilliermondii)和异常毕赤酵母(pichia anomala)，鉴定材料《真菌的鉴定》。

本研究分离鉴定出的焦曲霉(Aspergillus ustus)、土曲霉(Aspergillus terreus—like)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、桔青霉(penicillium citrimum)、季氏毕赤酵母、异常毕赤酵母，小孢根霉，多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)、球毛壳霉(Chaetomium globasum)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)和phaeosphaeria fu-ckelii等菌株在以前的研究结果中均未出现。所用的麦曲是人工脚踏成型，此前公司采用培养法对机制麦曲中的真菌进行过研究，机制麦曲中的优势真菌为伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、米根霉(Rhizopus oryzae)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。除了米根霉以外，其余优势真菌与本文的研究结果一致。

人工脚踏成型麦曲中的真菌种类比机械压制成型麦曲丰富，其原因是人工踩制曲坯能起到提浆作用，赋予曲坯表面较丰富的营养和较好的保温功能，因而比机械压制成型的曲坯更适合微生物的生长繁殖。

对分离获得的真菌纯株序列进行系统发育分析发现，所分离得到的纯种菌株大致分为11个属，分别是曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopusmucor)、毛霉属(Rhizopus)、青霉属(penicillium)、散囊菌属(Eurotium)、枝孢属(Cladosporium)、毕赤酵母属(pichia)、球毛壳属(Chaetomium)、念珠属(Candida)和伊萨酵母属(Issatchenkia)，反映出绍兴黄酒成品麦曲中真菌的资源非常丰富。从属的分类水平来看，在脚踏曲中出现的属除了散囊菌属(Eurotium)、毕赤酵母属(pichia)和球毛壳属(Chaetomium)外，其它的属在机制曲中均有出现。

本文所得到的序列用菌名加代号表示，来自于GenBank数据库的序列用菌名加登录号表示。比例尺代表5%的核酸序列差异性。