真菌微生物的研究进展

第一篇：真菌微生物的研究进展

论文题目：真菌微生物的研究进展

作者：华江涛 专业：生物化工工艺 班级： 生化1321 学号： 2013277102 指导老师：刘磊

2016年4 月12日

真菌微生物的研究进展

目录

第1章 传统微生物培养法.................................3 第2章 分子生物学方法...................................3 2．1基于PCＲ的克隆文库方法..........................3 2．2变性梯度凝胶电泳（DGGE）.........................3 2．3末端限制性长度多态性（T-ＲFLP）...................4 2．4实时荧光定量PCＲ..................................4 2．5荧光原位杂交（FISH）...............................4 2．6序列标签标记的高通量测序..........................4 第3章 宏基因组学技术（Metagenomics）.....................5 前景与展望........................................5 致谢......................................................6 参考文献..................................................6

摘要

真菌广泛存在于自然界，在生态系统中发挥着重要的作用。随着分子生物学技术在微生物多样性研究中的广泛应用以及宏基因组学技术的出现，打破了传统微生物培养法的局限性，人们对于真菌多样性的认识日渐提高。该文主要综述了研究真菌多样性方法的主要发展历程，介绍几种有关真菌多样性研究常用的分子生物学方法，包括基于PCＲ的克隆文库方法、变性梯度凝胶电泳、末端限制性长度多态性、实时荧光定量PCＲ、荧光原位杂交、序列标签标记的高通量测序以及宏基因组技术，并且阐述宏基因组学技术在此领域蕴含的巨大发展潜力

关键词

真菌；多样性；研究方法 Abstract Fungiwidelyexistsinnatureplayinganimportantroleintheecosystem．Thepervasiveapplicationofmolecularbiol-ogytechnologyinmicrobialdiversityandtheemergenceofmetagenomicbreakedthelimitationsoftraditionalmicrobialculturemeth-odsothatimprovethehumansrecognitionoffungaldiversity．ThispaperreviewedthemaindevelopmentcourseofstudyingfungaldiversityapproachesintroducedseveralcommonlyusedmethodsofmolecularbiologyonfungaldiversityresearchmainlyincludingclonelibraryPCＲbased，DenaturinggradientgelelectrophoresisTerminalrestrictionfragmentlengthpolymorphismeal-timeflu-orescentquantitativePCFluorescenceinsituhybridizationandbarcodedpyrosequencingndexpoundedthehugepotentialofmetagenomicsinthisfield．

Keyword fungi；diversity；method 正文

自然界中的微生物分布广、种类多、资源极其丰富，主要包括细菌、病毒、真菌等。迄今人们已发现的微生物物种仅为自然界中微生物总数的1%～10%［1］。微生物群落多样性是环境微生物多样性研究的核心内容。目前微生物多样性研究多局限于细菌，而对真菌的研究相对较少。研究真菌群落多样性可以了解真菌群落结构、真菌的种类和数量分布特点，并且可以进一步为控制和优化真菌群落结构提供参考，同时也是研究微生物群落多样性的重要内容。真菌遍布于自然界，据估计约有数百万种，已发现的仅9万余种，已发现的导致人类疾病的仅约400种。人类也生活在真菌包围的环境中，日常工作、生活中所接触到的真菌种类目 前的认知。因此，不论是自然环境还是人体都具有较高的真菌多样性。真菌多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看，大致上可分为：传统的微生物培养法、分子生物学方法以及宏基因组学技术。随着现代科学技术的发展，越来越多的新技术、新方法用于真菌多样性领域的研究，使人们对真菌多样性的认识更加全面深入。

1传统微生物培养法

从传统上讲，真菌多样性的研究主要利用分离培养及形态学检测的方法，该技术在实验室被广泛使用。尽管各种新的培养技术不断出现，但此方法费时费力，敏感度和特异性也较低，也不能反应全部的真菌群落信息。Amann等曾根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学研究结果认为：在自然界中，通过实验室人工培养方法已经被分离和描述的微生物物种数量仅占估计数量的1%～5%，而其余大多数微生物种群还仍然未被分离和认识，因此，人们不能利用传统的微生物培养技术获得真菌多样性的全部信息，极大的限制了研究的广泛性。在临床致病菌的鉴定方面，培养的方法更为常用。Ｒasi等利用培养法对从伊朗花斑糠疹患者皮肤上分离得到的马拉色酵母菌进行鉴定过程中，发现球形马拉色菌是最常分离到的菌种，大约占31．3%，其次是糠秕马拉色菌（20．5%）等。Findley等［7］通过微生物培养法从10个健康成人的14个部位的皮肤分离真菌，经鉴定11个刚体部位和胳膊表面的优势真菌是马拉色菌属，通过比较，脚底、脚趾甲和趾间具有较高的真菌多样性。

2分子生物学方法

鉴于分离培养技术的局限性，近年来，利用不依赖培养的方法分析和鉴定微生物群落多样性的实验越来越普遍。自从Pace提出将分子生物学方法用于微生物多样性研究，微生物分子生态学得到了长足的发展。分子生物学技术应用于微生物群落结构分析使得对环境样品中占大部分的不可培养微生物的研究成为了可能。目前，大多数用于分析微生物群落结构的方法是基于PCＲ扩增的。在分析微生物群落结构多样性时，rＲNA是目前应用最广泛的分子标记，它具有在功能上高度保守，其序列上的不同位置具有不同的变异速率，存在于所有的有机体（病毒除外）内等优点。对于细菌而言，16SrＲNA分析在实际应用中最为广泛，与细菌相比，使用真菌18SrDNA只能鉴定到属或科的水平。真菌的非编码rＲNA区域，如ITS区域（Inter-naltranscribedspacer），进化快速，序列上的变化更加广泛，因此提供了更多的分类信息，弥补了18SrＲNA的局限性。虽然如此，在实际研究内容中仍然要根据对分类等级的不同要求来选择合适的分子标记。分子生物学方法的应用使在遗传水平上研究微生物多样性成为了可能，该方法可归纳为三方面：①基于PCＲ技术的研究方法，这些方法是对样品直接提取DNA或者ＲNA，然后对特定基因设计引物进行PCＲ扩增，再利用不同的方法进行分析，（Fluorescenceinsituhybridization，FI可以对微生物在特定环境中的存在与否、分布模式及丰度等情况进行研究，具有较高的灵敏性和特异性。③基于DNA序列测定的研究方法，分析具体碱基序列的分布情况，通过与生物信息学结合，进行数据比较分析，如元基因组（Metagenome）测序技术，成为研究难培养微生物或不可培养微生物多样性的重要方法。

2．1基于PCＲ的克隆文库方法

基于PCＲ的克隆文库方法使对不可培养微生物的分析成为可能，Pace提出将PCＲ产物进行克隆后测序，大大提高了对微生物群落结构的认识，是使用较为广泛的一种方法。目前已有研究采用针对18SrDNA及ITS的克隆文库构建技术对肠道内真菌群落的多样性进行分析，研究结果表明人肠道真菌多样性比较低，主要以不同亚型的芽囊原虫属为主

2．2变性梯度凝胶电泳（DGGE）

DGGE最初是lerman等［12-13］发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。1993年，Muyzer等［14］首次将其用于微生物群落多样性的研究。DGGE普遍用于分析环境中细菌、真菌、病毒群落的生物多样性。Kim等利用PCＲ-DGGE技术分析了日本和中国发酵豆瓣酱中的细菌和真菌群落多样性，确定了米曲霉和鲁氏酵母的存在。We-erasekera等［16］通过PCＲ-DGGE方法研究人唾液中的酵母菌，在其中六个样品中鉴定出两种酵母菌，分别是白色念珠菌和杜氏假丝酵母，有力的证明利用DGGE技术研究口腔中的酵母菌是一种相对快速便捷的方法。

2．3末端限制性长度多态性（T-ＲFLP）

T-ＲFLP技术是在末端限制性片段长度多态性技术基础上发展起来的，依据rDNA序列的保守性和特异性，选择具有系统进化标记特征的序列作为目 的序列。T-ＲFLP技术灵敏度高，对于评估复杂环境样品的多样性和快速的比较不同生态系统的微生物群落结构和多样性是一种有力的工具。Curlevski等［17］使用T-ＲFLP方法研究了澳大利亚商业化混交林和单一种植南洋杉林场土壤真菌群落的不同，通过对真菌的ITS区域进行分析表明子囊菌门的丰度最高，其次是担子菌门和接合菌门，但在不同类型的林场中它们的相对丰度存在差异。

2．4实时荧光定量PCＲ

（qPCＲ技术于1996年由美国AppliedBiosys-tems公司推出，是将荧光能量传递技术（Fluores-cenceresonanceenergytransfer，FＲET）应用于PCＲ，实现了PCＲ从定性到定量的飞跃。qPCＲ技术目前已得到广泛应用。李晓然等在对汾酒发酵过程和汾酒酒曲制作过程中细菌和真菌多样性的研究中，利用qPCＲ技术对整个过程中的细菌和真菌进行了定量，发现在汾酒发酵过程中真菌的数量保持相对稳定，在酒曲制作过程中真菌的数量整体上呈下降趋势。Li等通过qPCＲ方法研究了老年人舌背的真菌多样性，表明老年人口腔中的真菌多样性极高，并不仅限于念珠菌属，其多样性与老年人的健康状态也具有密切的关系。

2．5荧光原位杂交（FISH）

比起费时费力且难以展现全部微生物群落信息的依赖于培养的方法和难以实现定量分析的多种依赖于PCＲ扩增的分子生物学方法，使用探针杂交来研究微生物群落多样性是一种更为快速的方法。荧光原位杂交是以荧光标记的寡核苷酸探针来探测生态系统中微生物细胞的一种技术，不仅能研究自然或人工环境中的微生物个体，并且可以对微生物群落进行评估。Lepère等使用酪胺信号放大技术与FISH结合的方法，用18SrDNA特异性的引物分析了湖水中的真核超微浮游生物的主要类群，获得了真核浮游微生物的定量结果。虽然分子生物学方法目前是阐述微生物多样性的强有力技术手段，并且在真菌多样性研究中具有传统培养法无法比拟的优势，但是基于PCＲ扩增的各种方法及FISH等方法仍然存在着多种弊端，例如引物的偏向性、PCＲ存在的其他系统偏差以及FISH方法中由于引物的不匹配造成对分析结果的错误估计等。在实际的研究中，通常将多种技术综合使用，以避免由于方法原理本身所带来的不可避免的偏差，可提供更加全面准确的微生物多样性变化的信息

2．6序列标签标记的高通量测序

随着测序技术的发展，被称为“第二代测序（next-generationsequencing［NGS］）”技术在过去几年中不断涌现。其特点是：高通量，低成本，可以同时对多个单独的DNA分子进行测序，这一改进比

起每条序列需要单独分析的Sanger法具有巨大的优势。第二代测序技术主要包括罗氏454公司的GS-FLX测序平台、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer测序平台和ABI公司的Solid测序平台［25］。自从Hamady等建立了在不同的样品PCＲ引物上分别添加序列标签（barcode）来作为高通量测序后根据序列区分不同样品的标记，高通量测序技术越来越广泛地应用到微生物群落多样性的分析中。综合比较二代测序平台，在研究微生物多样性方面应用较广泛的是焦磷酸测序（Pyro-sequencing）。李晓然等［18］利用真菌ITS1的焦磷酸测序，研究了中国传统汾酒发酵过程中的真菌群落多样性，分析了在汾酒发酵过程中真菌的变化以及主要存在的真菌菌种，其中有60%的ITS序列属于酵母菌科，丰度最高的是东方伊萨酵母，其次为啤酒酵母。Delhaes等利用焦磷酸测序的方法对囊泡纤维症患者的真菌多样性进行了研究，结果表明肺功能下降及临床状态不好的患者真菌多样性明显降低。Hoffmann等对人体肠道的真菌多样性进行研究，通过焦磷酸测序表明人肠道中的真菌共66个属，丰度较高的是子囊菌纲和担子菌类。

3宏基因组学技术（Metagenomics）

利用基于rDNA的分子生物学方法研究微生物多样性，对于庞大的微生物世界仍然是不足够的，远不能阐明微生物的生理生化代谢特征。1998年，Handelman等［29］首次提出宏基因组的概念，并第1次使用了Metagenomics这个词。宏基因组学技术是通过提取某一环境样品所有微生物的基因组DNA，或通过鸟枪法直接测序探究环境中微生物的群落结构和功能，或构建宏基因组文库及对文库进行筛选寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物。通过这两方面的研究，极大地丰富了我们对环境样品微生物多样性和其功能的认知。宏基因组学技术避开传统的微生物分离培养方法，直接从样品中提取总DNA来展开研究，理论上覆盖了环境样品中的全部微生物，在分析环境微生物复杂群落结构领域得到广泛应用。该技术在微生物多样性领域的研究，有关细菌方面的居多，而关于真菌群落多样性的研究为数并不多。Il-leghems等利用宏基因组学技术研究了可可豆自然发酵过程中的真菌和细菌群落多样性，研究结果表明，葡萄汁有孢汉逊酵母、仙人掌有孢汉逊酵母、啤酒酵母、发酵乳杆菌和巴氏醋杆菌是主要存在的菌种，并且确定了主要以乳杆菌为宿主的肌病毒科和长尾噬菌体的存在。这是第1篇利用宏基因组学技术并结合454焦磷酸测序研究自然发酵可可豆中群落多样性种系发生分析的报道，显示了宏基因组学技术相比于之前研究方法的优越性，能够获得更加全面的微生物群落信息。宏基因组学技术不仅在研究微生物群落结构方面蕴含巨大潜力，在发现新功能基因及活性物质方面也具有极大的优势。Cardoso等 在对被蜗牛侵袭的农作物进行宏基因组学分析中，第1次对其微生物群落和参与生物化学通路的主要基因进行了研究，发现变形菌门是主要的细菌门，其次是拟杆菌门和硬壁菌门，而病毒、真菌及古细菌的多样性稍低。另外，通过功能分析发现其中存在的大量微生物基因有助于宿主降解木质纤维素、对异生物质脱毒以及合成必需氨基酸和维生素，同时有利于蜗牛的适应性和广泛摄食，并且检测到2700多种编码糖苷水解酶区域和碳水化合物结合结构域的基因。通过宏基因组学技术不仅能够避免PCＲ扩增带来的偏差，全面而准确的研究微生物群落多样性，同时也为研究样品中微生物生化代谢、发现新功能基因和活性物质提供了极大的便利。宏基因组学技术在分析群落多样性中不可避免地也会存在一些弊端，例如测序产生的大量数据为后续的序列分析和处理带来了挑战，同时对计算机以及数据库的要求也在不断提高。尽管如此，宏基因组学技术本身所具有的巨大优势是目前其他研究方法不可比拟的。近年来，宏基因组学技术已经开始影响真菌生物学，逐渐成为研究真菌多样性的一个新的发展方向和研究热点，也增加了获得新生物活性物质的机会，显示宏基因组学技术在此方面蕴含的巨大发展潜力。

前景与展望

近年来，随着各种新技术的不断完善与发展，对真菌多样性的研究逐渐深入，利用这些新技术可以从不同的角度来研究真菌多样性，为环境微生物多样性和人体真菌病的诊断治疗奠定坚实的基础。值得一提的是，为了获得更为全面的真菌多样性信息，在条件许可的情况下可将几种方法结合起来使用。目前对于真菌多样性的研究是多方面的，不论是环境中、食品中还是定植于人体各部位的真菌，通过对其多样性的研究必能为指导实践提供理论基础。因此，真菌多样性研究方法的不断完善必将推动真菌多样性研究的快速发展。做生物的多样性和微生物代谢产物的多样性，永远是发现新药的无穷宝藏。随着生命科学的发展，一些新的抗真菌药物作用靶点的发现，必将有更多更有效的抗真菌抗生素被发现和应用。在过去的 20年间，刺白菌素类抗生素的发现和应用，更增强了从微生物代谢产物中寻找抗真菌抗生素的信心。在今后的若干年间，将会有更多的作用靶位用于抗真菌抗生素的筛选，并一定能够由此获得更多更有效的抗生素。

致谢

大学三年学习时光已经接近尾声，在此我想对我的母校，我的父母、亲人们，我的老师和同学们表达我由衷的谢意。感谢我的家人对我大学三年学习的默默支持;感谢我的母校安徽职业技术学院给了我我在大学三年深造的机会，让我能继续学习和提高;感谢生化班的老师和同学们三年来的关心和鼓励。老师们课堂上的激情洋溢，课堂下的谆谆教诲;同学们在学习中的认真热情，生活上的热心主动，所有这些都让我的三年充满了感动。这次毕业论文设计我得到了很多老师和同学的帮助，其中我的论文指导老师刘磊老师对我的关心和支持尤为重要。每次遇到难题，我最先做得就是向刘磊老师寻求帮助，而刘磊老师每次不管忙或闲，总会抽空来找我面谈，然后一起商量解决的办法。

我做毕业设计的每个阶段，从选题到查阅资料，论文提纲的确定，中期论文的修改，后期论文格式调整等各个环节中都给予了我悉心的指导。这几个月以来，刘磊老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想给我以无微不至的关怀，在此谨向刘磊老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。

同时，本片毕业论文的写作也得到了白杨，江双双等同学的热情帮助。感谢在整个毕业设计期间和我密切合作的同学，和曾经在各个方面给予过我帮助的伙伴们，在此，我再一次真诚地向帮助过我的老师和同学便是感谢!

参考文献

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第二篇：微生物,真菌实验（范文模版）

青 岛 农 业 大 学

兽医微生物学课程论文

题 目：姓 名：学 院：专 业：班 级：学 号：指导教师：

病原真菌的分离鉴定

动物科技学院 动物医学

2014年月 13 日

病原真菌的分离鉴定

动医1205

李春成20121450 摘要：制作固体培养基，将A、B、D三种真菌接种到培养基和盖玻片上进行3-5d的培养（温度为28℃，观察真菌在固体培养基上的生长表现，在显微镜下观察小培养中的真菌形态，用美蓝染色液染酵母菌，进一步观察其形态。关键词：真菌；分离；形态；接种 引言：

真菌在自然界分布广、数量大、种类多。有些真菌可引起人和畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接的危害人类和动物健康。了解真菌的培养方法，认识其形态十分重要。

真菌中的酵母菌是单细胞微生物，细胞核和细胞质有明显的分化，个体直径比真菌大10倍左右，多为圆形或卵圆形。酵母菌无性繁殖主要是出芽生殖，在特殊的情况下能形成假菌丝，有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。用美蓝染色液制成水浸片，不仅可以观察其外形，还可以区分死活细胞。

霉菌的营养体是分支的丝状体，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝又分化出繁殖菌丝，不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。

霉菌的菌丝较大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以指标本是常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长的时间，溶液本身呈蓝色，有一定的染色效果。

利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态。

制作霉菌封闭标本，一般用石炭酸棉染色液封片，其中含有甘油，不易干燥，石炭酸有防腐作用，棉蓝有一定的染色作用，便于观察。1材料和方法 1.1材料

待鉴定的三种真菌A、B、D

1.1.1培养基 PDA培养基 1.1.2仪器

悬液、载玻片、盖玻片、无菌培养皿、湿盒，1mL无菌注射器、生理盐水、酒精灯等 1.2方法

1.2.1划线分离：将接种环经火焰灭菌冷却后，取待测的真菌，按照细菌的平板划线分离法进行平板划线，即用接种环从待测培养基上蘸取菌种在平板上划1/5-1/4，划毕灼烧灭菌接种环，待冷却后，于第二段处再做划线，且从第一段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。冷却后，于第三段再做划线，且从第二段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。冷却后，于第四段再做划线，且从第三段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。

1.2.2小培养：用注射器吸取液体培养基于载玻片上，将接种环在火焰下灭菌，挑取待检菌放于液体培养基上，待液体培养基将要凝固，但仍有部分呈液体状时，盖上盖玻片，标记好菌种。

1.2.3酵母菌水浸片的制备：先取干净的载玻片滴上生理盐水1-2滴，将接种环在火焰下灭菌，挑取酵母菌少许，均匀涂在液滴中，再将美蓝染色液滴于载玻片上，染色2-3min后加盖玻片。（注意切勿产生气泡）然后低倍镜和高倍镜观察其细胞形态、芽殖方式。2.结果与分析 2.1观察三个培养基：A菌在固体培养基上菌落呈油脂状，表面光滑、湿润、粘稠，颜色呈黄色。B菌在固体培养基上菌落为毡状，颜色是绿色，具有典型的放射状皱纹。D菌在固体培养基上菌落密集，最初呈白色，孢子呈黑色。

2.2实验现象

2.2.1小培养形态鉴定现象

前三图均在40X下观察）

A菌体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。光镜下可见细胞质所在范围及细胞壁的影子，高倍镜中可现细胞核。B菌菌丝呈无色，有分隔，其分生孢子梗经过多次分支，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为扫帚体。D菌菌丝无隔，有匍匐菌丝和假根，假根着生处有直立向上孢子囊梗，其顶端彭大成孢子囊，孢子囊底部有半球形囊轴。

2.2.2美兰染色现象

显微镜下看到的是单细胞, 不形成菌落的真菌，无色细胞为活酵母菌细胞，蓝色细胞为已死的酵母菌细胞。

3.讨论

本次试验做的还可以，试验结果都能看到，现象比较明显，不过，显微镜聚焦不是很好，看的不是很清楚，现象也不太明显，在做小培养时充分发挥了团队合作精神，使得试验做的很快（因为做小培养时，液体培养基温度不那么高了，凝固时间很快），做美兰染色时，也很注意没有弄进气泡，不影响观察。4.结果

经以上试验可得出，A为酵母菌；B为青霉菌；D为根霉菌。

4.参考文献

兽医微生物实验教程

胡贵学

2006

第三篇：影响土壤真菌多样性的土壤因素及土壤真菌研究进展

土壤真菌多样性研究及真菌分类方法研究进展

陈秋君 201231142005 经济管理学院12级20班

摘要：简述了土壤真菌的多样性以及影响土壤真菌多样性的因子，介绍了土壤真菌分类方法近年来的研究进展。

关键词：土壤真菌 多样性 影响因子 研究方法

0 引 言

真菌是一类种类繁多、分布广泛的真核微生物.真菌多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供大量未开发的生物资源方面起到了重要作用.真菌构成了土壤的大部分微生物生物量, 具有分解有机质, 为植物提供养分的功能, 是生态系统健康的指示物.在农业中, 真菌既降低粮食产量, 又为控制植物病虫害和其他真菌生物防治提供一条有效途径.对根际真菌结构和多样性的了解将有助于更好的了解真菌对病原菌的抑制功能.在林业中, 丛枝真菌与植物相互共生作用, 为植物提供养份, 使植物能耐受干旱或贫养的条件, 同时也提高了植物的多样性.在草地生态系统中, 分解者生物量总体中78% ~ 90%是真菌.20 世纪60 年代以来, 微生物生态学研究发展较快, 推动了土壤真菌学研究的发展, 人们对探究土壤中真菌存在的形式、数量、活性以及它们在物质转化中的重要作用等方面充满兴趣。70 年代以后人们更进一步认识到土壤真菌是微生物区系的主要成分, 并具有较高的生物活性。80 年代至今, 由于逐渐采用新的研究技术和手段, 土壤真菌研究的发展进入了一个新时期。

虽然真菌在陆地生态系统中有很重要的作用, 但是人们对自然界的真菌多样性了解还很少.受到全球气候变化、环境污染和人类活动等诸多因素的影响, 自然环境中真菌的种类和数量、分布都发生了显著的变化.土壤真菌研究越来越受到人们的重视。土壤真菌多样性

1.1 物种多样性

通常真菌被描述为具有真核, 能产生孢子、无叶绿素的有机体, 以吸收方式获得营养, 普遍以有性和无性两种方式进行繁殖, 菌丝通常是由丝状、分枝的枝细胞构成, 并典型地被细胞壁所包裹.真正意义的真菌包括四大类群, 壶菌门、接合菌门、子囊菌门、担子菌门.已知的壶菌约100 属, 1 000种.最新研究估计全世界的真菌种类约有150 万, 但至今已被正式描述的只有5%~ 10%[ 18~ 20] , 绝大多数是未知的.其原因一方面在于对真菌分离培养技术的依赖, 不能从少量材料中分离出目标生物, 缺少对所有真菌群落生物都适应的培养基和培养条件;另一方面在于对真菌生活环境缺乏全面了解, 不能准确地评价不同地域(特别是热带雨林地区)真菌群落的结构组成.1.2 生境多样性

真菌广泛分布在各种各样的土壤环境中, 包括农田、林地、草地、沼泽湿地、温泉热土、冻土层等.由于不同环境因子的影响, 使土壤真菌在其生活环境中形成独特的群落种类、组成和分布规律.例如在林地中外生菌根真菌的种类、数量较多, 而在草地生态系统中丛枝菌根真菌的分布比较广泛.在一些极端环境, 如南北极的冻土层中则分布着丰富的子囊菌门生物, 而在温泉热土中则与其他土壤例如林地的优势种类几乎完全不同.一些真菌的生活环境仍然没被完全的报道,真菌能否像细菌一样生活在一些极端环境中? 这有待我们进一步去发现新环境中新的种类, 并探索其生理机制.1.3 功能多样性

真菌在土壤生态系统中发挥着多种多样的功能, 包括降解纤维素、半纤维素、木质素、胶质、还原氮、溶解磷、螯合金属离子、产生青霉素等一些抗生素等.功能基因多样性又使我们对真菌功能多样性有了更进一步的理解, 使我们认识到真菌生物功能的差异是通过功能基因多样性来体现的.科学家通过从纯培养物和环境样品中扩增漆酶基因序列, 研究了美国东南部沼泽湿地中有木质素降解潜在功能的子囊菌漆酶序列多样性.独特的序列类型显示出真菌群落中这一功能基因的高度序列多样性.虽然这方面的研究受到许多因素的限制, 处于刚刚起步阶段, 但不失为我们未来发展的一个方向.真菌多样性分布影响因子的分析

2.1 种植年限对真菌多样性的影响

蔬菜种植年限对真菌的影响没有一定的规律性，总的说来，棚龄较短的较棚龄长的，土壤真菌的数量和种类都要多，但棚龄超过5 a 以后，真菌数量显著减少，不过一定周期后土壤真菌的数量又会逐渐增多，但只是少数种类真菌数量的增多，这可能与之适应了土壤环

境有关。种植年限对真菌种类的影响与对数量的影响趋势基本相同，到一定年限后，真菌种类呈现减少的趋势。

2.2 土壤碱解氮对真菌多样性的影响

土壤碱解氮含量的高低影响到土壤真菌的种类和数量。随着土壤碱解氮增多，土壤真菌的数量基本呈现出下降趋势，当土壤碱解氮低于50 mg/kg 时，真菌数量最多，达到29.49×104 cfu/g 土，高于300 mg/kg 时，真菌数量最少，仅为17.33×104 cfu/g 土。当碱解氮含量在100~300 mg/kg 之间时，真菌的种类最多，分别为44 种和35种。

2.3 土壤有效磷对真菌多样性的影响

土壤有效磷含量与土壤真菌的种类和数量之间相关性不大（表5），土壤中有效磷含量在10~50 mg/kg 之间时，土壤真菌的数量最多，极显著高于其他磷含量土样中的真菌数

量。有效磷含量为50~100 mg/kg 时，真菌种类最多，为46 种。而其他磷含量不同的土样中的真菌种类差异不大。

2.4 土壤速效钾对真菌多样性的影响

速效钾含量在250~350 mg/kg 之间时真菌数量和种类均最多，分别为21.49×104 cfu/g 土和40 种，显著高于其他土样中的真菌的种类和数量。

2.5 有机肥对真菌多样性的影响

随着土壤有机肥含量的升高，土壤真菌的种类和数量也在上升，当有机质高于40 g/kg，土壤真菌的种类和数量均最高，分别为22.86×104 cfu/g 土和55 种，经过分析得出，有机肥含量与土壤真菌的数量和种类的相关系数分别为0.976和0.960。

2.6 土壤含水量对真菌多样性的影响

土壤含水量在10%~25%之间适宜真菌的生存和繁殖，在这其间真菌的数量差异不大，土壤含水量过高或过低，真菌数量均明显下降。同样，土壤含水量对真菌种类的影响也如此，土壤含水量在10%~30%之间，土壤真菌种类较多，其中含水量在15%~20%之间真菌种 类最多，为50种。

2.7 土壤质地对真菌多样性的影响

土壤质地对真菌的种类和数量影响较大，轻壤土中真菌数量最多，为23.98×104cfu/g 土，极显著高于其他类型土壤中的真菌数量。但中壤土真菌种类最多，为68种，其次是轻壤土中的真菌种类，但中壤偏重和砂壤偏轻土壤中真菌种类最少，仅为1种。关于影响土壤真菌多样性因子的讨论

土壤真菌的数量和种类受耕作制度、土壤层次、气候变化及土壤类型等诸多因素影响，轮作与连作对土壤细菌数、真菌数和放线菌数均有较大影响，设施栽培条件下，轮作有利于土壤微生物群落的多样性和稳定性的提高，有利于土壤生态环境的改善。

施肥能不同程度地促进或抑制土壤微生物数量，影响根际土壤生理活性，尤其是有机肥能够促进蔬菜根际真菌的繁殖。

种植的蔬菜种类也影响土壤真菌的数量和种类。保护地种植年限的延长后，土壤中病原菌如镰孢菌、致病疫霉、链格孢、丝核菌的数量得到累积，一旦发病条件适宜就会造成病害的流行，给蔬菜生产带来巨大的损失。

但土传病害的抑制在一定程度上是土壤微生物的群体作用，土壤微生物群落结构越丰富，物种越均匀，多样性越高时，对抗病原菌的综合能力就越强，这也是单一或少数拮抗菌往往难以成功拮抗病原菌的原因之一。由于土壤条件复杂，微生物之间的作用关系微妙，而化学农药的大量施用，又会杀掉许多有益微生物，破坏土壤生态系统平衡，使病害更加猖獗，因此应采取各种农业综合措施，如通过施肥和轮作等来改善土壤条件，调整和优化土壤微生态结构，使土壤中病原菌数目下降到不至于引起作物病害造成经济损失程度。真菌分类技术在土壤真菌研究中的应用和发展

早在数千年前真菌就已被人类认识和利用,但对真菌的系统研究却只有200 多年的历史。此间, 主要依据形态特征描述和鉴定真菌的属和种,并且在比较形态学的基础上建立了一些分类系统。随着人类整体科学技术水平的不断提高, 真菌分类研究技术也得到了不断的发展、完善和补充, 大大推动了真菌分类研究的进展。到目前为止, 已被描述的真菌约有1 万多属, 12 万多种, 而且还不断有新的真菌属、种被陆续发现。

4.1 传统分类方法

经过多代真菌分类学家们200 多年的不懈努力, 已形成了比较完善的真菌分类体系, 对科学研究和生产实践起着重要的指导作用。

到目前为止, 由以形态学为主的传统分类方法为基础, 建立的分类系统在分类学界仍占据着举足轻重的作用, 99%的真菌属、种级分类单位仍然是建立在传统分类研究基础上的, 并仍在为人类认识真菌物种、了解和利用真菌资源发挥着重要作用。不同真菌分类学家对一些分类特征的认识和理解不同, 提出的真菌分类系统就不同。具有较大影响的真菌分类系统有以Ainsworth为代表的分类系统、Hawksworth分类系统、Kirk分类系统、Alexopoulos分类系统及Kendrick分类系统等。上述分类系统都基本上是基于主要形态学为依据的传统分类方法。传统分类方法主要依据真菌的形态、生理和生化特征等对真菌进行分类。

尽管传统分类方法有一定的局限性, 但是, 目前仍是相当有效而且可靠的方法, 是大多数分类专家所乐于采用和接受的, 仍然是发展其它现代分类方法的重要基础。离开传统分类系统和方法这个基础, 真菌分类学就会成为无源之水, 无本之木。况且, 传统分类方法本身也正处于不断发展和完善的新阶段, 并不排除采用分子生物学、生理学、生态学和生物化学等学科的新进展和新方法,来不断地改进和提高真菌分类研究工作。生物分类研究的目的是认识物种和客观地反映其系统演化关系, 无论将来的分类系统和方法多么先进, 都无法摒弃以简明、节约为主要优点, 并在很大程度上反映客观实际的传统分类方法。

4.2 现代分类技术在土壤真菌研究中的应用

传统的分类方法主要依据于真菌的形态特征及细胞生理和生化等特性, 尤其是有性生殖阶段的形态特征。其主要困难是, 在许多情况下某些真菌的表型性状相对贫乏, 难于透过现象认识其遗传本质。许多真菌有性生殖极少发生, 难以通过检查生殖隔离来界定物种。

近年来多门新兴学科和技术的发展, 尤其是分子生物学技术的兴起极大地促进了真菌分类学的发展。一些已经或即将用于真菌分类研究的分子生物学技术指标日渐显示出重要的分类潜能。利用各种分子生物学手段、特殊探针和特定序列鉴定真菌种类是这一领域深入发展的前提和基础。

2000 年, Muriel等采用非培养条件下, 对ITS 基因直接扩增,克隆和对ITS 区段进行限制性酶切和序列分析的方法尝试检测了土壤真菌的多样性。通过从土壤中直接提取总DNA 和从相同的土壤中分离培养真菌、鉴定后提取其DNA 两种方法来尝试、对比。

从土壤中得到67个真菌分离物, 从土壤中提取的总DNA中得到51个扩增子, 进行ITS 扩增、酶切并比较, 共得到了58 个ITS-RFLP 图谱。可培养真菌与土壤中扩增子的ITS-RFLP 图谱差异很大,仅有一种图谱是共有的, 其他的都不相同。同样的, 培养真菌和土壤中扩增子的ITS 序列也差别很大, 58 个ITS 序列同已知序列进行比较, 结果显示所有从土壤中分离培养得到的真菌几乎都是子囊菌, 只有一种为担子菌, 而在土壤总DNA 得到的扩增子中, 除了大部分为子囊菌外, 还有一种担子菌, 一种接合菌, 和几种分别属于藻物界的卵菌(Oomycota)和原生动物界的根肿菌(Plasmodiophoromycota), 可见PCR 直接扩增获得的真菌的范围明显广于培养获得的。与传统方法相比, 它们可以揭示更多的从未检测到的微生物的多样性,并为理解自然状况下土壤真菌的组成和功能提供更加客观可靠的依据。现代科学技术的发展, 尤其是以揭示某些核酸和蛋白质等分子生物学性状来探索真菌的种、属、科、目、纲、门等分类阶元的进化的研究日渐增多, 大大开阔和延伸了人们认识真菌遗传本质的视野。现代分类技术主要包括: 真菌次生代谢产物的应用、可溶性蛋白质凝胶电泳、同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳[ 38]、DNA 水平上的真菌分类学(DNA 中G+ Cmol%含量测定、基于聚合酶链反应(PCR)基础上的DNA 多态性分析、DNA 基因位点的序列分析、多位点酶电泳、脉 冲电泳核型分析、DNA-DNA 杂交和DNA-rRNA 杂交)及数值分类分析等等。

土壤真菌中, 无性态真菌(半知菌)占很大比重。无性态真菌中又以丝孢纲真菌所占份额最大。由于基本上无法通过生殖隔离试验来测定无性态真菌成员之间的亲缘关系, 在培养过程中, 真菌的形态特征和性状, 如菌落的颜色、分生孢子的形态和菌丝的颜色等都易受培养基的类型、光照、温度、培养时间的长短等条件的影响而发生变化。

因此, 在传统分类研究的基础上, 采用现代分类技术, 特别是分子生物学手段来研究此类真菌的分类问题就显得更为迫切和必要。

以传统分类为基础, 不断探求以现代生物技术为手段的综合分类研究方法, 实现传统分类方法与现代分类技术的有机结合, 是未来真菌分类研究的必由之路。

参考文献

1、《土壤真菌研究进展》张 伟,许俊杰 ,张天宇

2、《土壤真菌研究方法及人为干扰对森林土壤真菌群落影响研究进展》陈晓，刘勇，李国雷，孙巧玉，张硕，许飞

3、《土壤真菌多样性及分子生态学研究进展》张 晶，张惠文，李新宇，张成刚

第四篇：室内空气中微生物污染的研究进展

室内环境与微生物 环境污染与防治 网络版 第9期 2008年9月 1 王毓丹1 段俊超2（1.重庆市环境科学研究院，重庆 400067； 2.重庆工商大学废油资源化技术与装备教育部工程研究中心，重庆 400067）介绍了室内空气微生物的危害、原因、来源及其控制措施，重点分析了在室内空气微生物的调查研究、毒理学研究、检测技术研究及空气净化和抗菌技术方面取得的成就及存在的问题，最后讨论了室内空气微生物污染的研究发展趋势。室内空气品质 空气污染 室内空气 微生物 趋势

室内空气品质（IAQ）是一门年轻的跨学科的科学，它的研究成果对人类的健康和幸福有着很大的影响，并将影响未来的社会结构。IAQ科学是环境可持续发展不可分割的一部分，其主要研究对象是人类停留90以上时间的室内环境。研究IAQ的科学家们必须为室内环境的质量问题提供依据，揭示室内污染物对人类的危害，并在充分的科学依据基础上提出降低危险的措施1。

室内空气品质极大地影响着人们的生活质量、健康水平和生产效率。室内空气污染在近年来引起了广泛关注，“非典”病毒肆虐的事实也充分说明，室内生物性污染不可轻视。目前造成城市写字楼和家庭室内的生物污染主要有细菌、霉菌和螨虫等，有的如军团菌、霉菌性肺炎也可伤害人的性命。微生物污染作为室内环境污染的一个重要组成部分，现今已经成为世界各国研究的热点问题。2005年第251次香山科学会议主题就是室内空气污染问题。

细菌和真菌等空气微生物是室内空气质量的重要参数。室内空气微生物污染，可引起人们出现眼刺激感、哮喘、过敏性皮炎、过敏性肺炎和传染性疾病，重者甚至导致死亡，也可称为“不良建筑物综合征”SBS2。室内空气污染及由此引起的SBS等健康问题开始受到普遍关注。研究表明，空气微生物污染也是造成SBS的主要原因之一。

细菌和真 1第一作者：王毓丹，男，1963年生，高级工程师，主要从事环境工程设计。环境污染与防治 网络版 第9期 2008年9月 2 菌等微生物在室内孳生繁殖而污染空气，已经成为目前重要的公共环境卫生问题，在美、日、德、法等国家，是人们最为关注的课题之一。1999年在英国召开第8届室内空气环境国际会议讲演的700篇论文中，以微生物为议题的就有126篇之多，仅次于挥发性有机物218篇。室内空气微生物污染影响人体健康甚至危及生命案例时有发生。近几年，结核在全球死灰复燃，在防治结核的措施中，人们再次认识到环境受污染后进行消毒的重要性3。美国已开始在全国范围内对空气微生物的种属、浓度及季节变化等进行监测4。1.1 污染造成的危害

微生物是室内环境污染源之一，加拿大的一项调查表明，室内空气质量问题，有21％是微生物污染造成的。国内外大量的调查研究证实，空气微生物是引发各种中毒、感染和过敏疾病的主要原因之一，主要引起的疾病有军团病、结核病、呼吸系统疾病和SBS。室内空气中的微生物主要有青霉、芽枝菌、曲霉、葡萄球菌、微球菌、白霉及各种病毒等，其浓度主要与室内湿度、温度、人员活动等有关，室外空气也是室内细菌、真菌的重要来源之一。空气中存在大量微生物，它们通常附着在一定粒径的颗粒物上，以气溶胶的形式存在，如微尘、飞沫核等，主要通过呼吸侵入机体，造成呼吸道感染。经空气传播的传染病，如流行性感冒、结核等的暴发流行，都与空气微生物污染有密切关系。一般来说，当空气中致病性物质达到感染剂量时，往往会引起人类患流感、皮炎、肺炎等急性疾病。细菌可引起人体出现不适、头痛、干咳、胸疼、腹泻等症状，还是昆士兰热、肺结核等呼吸传染病的重要致病原。真菌污染与过敏性鼻炎、哮喘及呼吸感染等疾病有关。长期接触室内真菌代谢产物对人体免疫功能尤其是呼吸防疫功能构成威胁。室内环境还是一些病毒的温床，如青猴病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒，这些病毒可引发出血热。

室内生物气溶胶主要包括细菌、病毒、真菌、花粉、原生动物及生物有机体成分等几大类，它们主要通过与人皮肤接触、呼吸道吸人、消化道摄人等途径进入人体，导致易感人员的身体健康损害，文献5列出了几类具有代表性的室内生物气溶胶及其危害。一般来说，当空气中致病性物质达到感染剂量时，往往会引起人类患流感、皮炎、肺炎等急性疾病，并且还会随着患者打喷嚏、咳嗽等生理活动形成二次生物气溶胶并加以传播，CROFT等对居民抱怨有咳嗽、咽喉肿痛、头疼、疲劳等症状的楼房进行了研究，当采取一系列空气净化措施，并去除室内可能造成微生物大量繁殖的建筑材料后，楼内居民的上述症状得到明显改善6。许多细菌的细胞成分如内毒素、B-葡聚糖也是重要的病原7。真菌通过其孢子在空气中传播，作为条件致病菌主要引起多种呼吸疾病和过敏反应，真菌毒素也可能导致多种中毒反应，SOMERS等8观测到吸人污染空气颗粒的小鼠发生基因突变，这也为空气真菌可能导致肺癌提供了间接证据。室内空气生物污染不仅危害人体的呼吸系统和免疫系统，ANYANWU研究证明产毒真菌的长时间暴露可能影响到儿童神经生理功能，研究人员通过神经行为学问卷调查和一系列的神经生理学测试，问卷结果证明生活在真菌环境污染与防治 网络版 第9期 2008年9月 3 污染空气环境中的儿童发生高水平行为异常现象，而暴露组和对照组的脑电图测试EEG异常率分别是70％和10％，脑干诱发电位BAEP波形异常率分别是90％和0，上述研究部分揭示产毒真菌可能对人体神经系统的健康也存在威胁9。此外，从生物技术产业的角度来说，室内生物气溶胶污染直接影响到其生产的顺利进行并可能污染其产品，对于实验室来说，还有一种潜在的危险，即遗传物质可能从基因修饰微生物中转移到环境的野生物种中，造成基因污染10。

在注重生活质量和公共卫生的今天，SBS近年来得到人们的极大关注。世界卫生组织提出的SBS是如今越来越多的写字楼上班族常感到的一种身体不适，其症状主要有鼻咽发炎、头疼发热、上呼吸道感染、不明原因的过敏、皮肤干燥等，还伴有整个人感觉懒散恶心11。

1.2 污染类型

（1）真菌（酵母菌和霉菌）真菌是自然界分布最广的一类生物体，在亚洲、非洲的温、湿度较高的地区，适合真菌生长。人们受真菌的感染，易患脚气、皮炎、皮癣、湿疹等症。有些真菌能通过其毒性代谢物霉菌毒素致癌。

（2）细菌和病毒 室内空气中，特别在通风不良、人员拥挤的环境中可有较多的致病微生物存在。除空气中原有的一些微生物外，也存在来自由人体、动物、土壤和植物碎屑携带的细菌和病毒的某些病原微生物。许多病毒如流感、非典型性肺炎等病毒可以通过空气、唾

液传染，一般过滤、滤毒装置对它们毫无办法。

（3）尘螨 尘螨是一种非常小的微生物，在绝大多数住处和办公场所都能被发现。尘螨适合在空气不流通，温度、湿度适合，且密闭的环境中生存，对环境的抵抗力很弱。尘螨是一种极强的变应原，能引起呼吸过敏和皮肤过敏，主要症状是哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎、荨麻疹等。目前对尘螨的研究很多。

1.3 室内空气微生物污染来源

细菌和真菌种类繁多，分布很广，几乎无所不在。在一般居住环境中，空气中的细菌和真菌种类通常也有数十至数百种之多，浓度约在102～l05 cfu/m3。在室内有污染源时，空气污染更加严重，细菌和真菌的浓度可达106～108 cfu/m3，甚至高达1010 cfu/m3。一般来说，空气缺乏微生物生长所需水分和养料，不是微生物生长的适宜环境。由于人们的生产和生活活动，使得空气中可存在某些微生物，包括一些病原微生物在内，并通过空气引起疾病的传播。室内空气特别在通风不良、人员拥挤的环境中，可有较多的微生物存在。据监测，通风不良、密封的房间空气中细菌含量一般较高。开窗通风的房间，每立方米含细菌约5 800个，而密闭的房间每立方米含量可高达19 000个。致病微生物可附着在室内的尘埃上被吸入呼吸道。除大气中原有的一些微生物外，也可能存在来自人体、植物和宠物的某些病原微生物，可能成为空气传播疾病的病原。研究发现，空调机中细菌和真菌可以诱发或加重呼吸系统的过敏性反应而引起哮喘。环境污染与防治 网络版 第9期 2008年9月 4 在室内有污染源时，空气污染更加严重，细菌和真菌的浓度可达106～108 cfu/m3，甚至高达1010 cfu/m3。产生微生物污染最主要因素：

（1）有营养物质：室内的食物、被污染的地毯、潮湿的垫褥、空调系统中长期存在的冷却水；（2）持续潮湿且通风不佳的环境：如冰箱和空调机组的滴水盘。室内的污染源可分为人体活动、建筑部件和家具、设备。（1）室内建筑材料导致空气微生物污染。在室内潮湿、结露的地方或受水侵害的地方，如厨房、浴室和卫生间，环境的相对湿度高达90％～100％，室内的建筑材料和设备，就必然容易孳生细菌和真菌等微生物，特别是真菌，这是个普遍存在的问题12-15。据报道，在北美问卷调查结果显示，有27％～36％的室内建筑材料和设备有霉菌污染问题，实际测定的结果更高，达到42％～56％；在欧洲，英国为17％～46％，荷兰为15％～18％，芬兰为l5％12。在德国的8幢住宅里，地毯中的尘埃真菌总数为103～106 cfu/g，能产生毒素的花斑曲霉为10～105 cfu/g13。室内尘埃中的真菌数达到102～107 cfu/g。受污染的内墙表面的真菌数超过104 cfu/cm2以上。旧建筑材料中往往孳生着大量的真菌，释放出来污染室内空气，特别在拆除旧建筑材料时，污染更为严重，比未拆除前高出4～25倍，达102～107 cfu/m3，拆除旧建筑材料的工人容易发生呼吸道疾病16。由于空气流动，导致在建筑材料和设备中的真菌气溶胶化，悬浮于空气中，造成室内空气污染。在家庭里的废物处理设备中的空气细菌和真菌浓度达103～105 cfu/m3。

美国政府工业卫生学家协会ACGIH指出，任何一种真菌的浓度≥500 cfu/m3时，表明建筑物内可能存在相关污染源。REYNOLDS等14测定6处住宅和办公室环境中的空气真菌总数≥500 cfu/m3980～18 900 cfu/m3，真菌浓度比室外高10至数百倍，表明建筑物内环境处于不正常状态，影响室内人员的身体健康，出现自觉症状。

（2）家用设备导致空气微生物污染。室内家用设备如空调器和加湿器中也容易孳生细

菌和真菌等微生物，成为室内空气微生物潜在污染源。家用空调器过滤器上真菌数高达102～104 cfu/cm3。空调设备中孳生细菌和真菌，导致室内空气污染，严重影响人体健康。空调设备的空气过滤器、制冷盘管、通风管和冷却水中孳生细菌和真菌，导致室内空气污染，严重影响人体健康。国内的一些专业人员通过对一些公共场所、医院的调查发现，军团菌普遍存在于空调冷却塔，已对暴露人群的健康造成威胁17-20。而军团菌污染在国外有许多案例。例如，1976年美国费城召开退伍军人会议，与会者中182人突然生病，其中29人死亡。症状是发热、咳嗽、胸痛、肺炎。调查发现，该病症由空调系统内孳生的一种革兰阴性杆菌在空气中传播引起。这些致病菌后命名为“军团菌”，“军团病”由此得名。l988年，英国广播公司BBC空调设备也引发军团病，BBC的职员和周边的居民约有70人生病，3人死亡。1998年，日本东京1所养老院，由于空调设备污染引起职员和病人123人中11人感染军团病，1人死亡。家庭里废物处理设备中空气细菌和真菌浓度达103～105 cfu/m3。另外，超声波加湿器中孳生的细菌，随着超声波加湿器中的加湿用水生成的水雾一起散发出去，可引发感染症状21。

（3）人体活动产生微生物污染 日常生活中因不良生活习惯等造成的污染却是长期环境污染与防治 网络版 第9期 2008年9月 5 的，需要更多的重视。室内微生物污染程度与周围环境、居住密度和室内空气温度、湿度、灰尘含量及采光通风等因素有关。环境不洁、通风不良、居住拥挤的室内微生物污染比较严重。另外居民在室内饲养的猫、狗等宠物会使微生物包括细菌、病毒、真菌、芽孢、霉菌、螨等大量繁殖。人在咳嗽或打喷嚏时，可喷射出上百万个细小的飞沫小滴。如果在室内吸烟，往往比马路上一辆汽车的尾气对人体危害更大。研究发现，使用吸尘器、中央空调和冷热水系统为室内制造了新的污染源。

（4）建筑部件和家具湿度很高的浴室、厨房容易繁殖霉菌；长期未清洁的地毯上容易滋生螨虫；一般家具的后面和下面都很难清扫，造成灰尘堆积，给微生物繁殖创造了良好的条件。建筑材料中的缝隙，也是藏污纳垢的场所。2.1 调查研究

目前，有关空气微生物的研究多为调查研究，即对某种场所在一定时间内进行空气微生物采样，了解微生物的浓度、种属等情况。国内、外都对多种场所的空气微生物进行了调查研究。所涉及的场所包括室内及室外多种公共场所，室内如：医院各科室22，23、室内娱乐场所舞厅、网吧、保健品生产厂房、居室

24、教室、实验室等；室外则有：某些城市的交通枢纽区、步行街、校园及不同的风景区等。研究中采用的检测指标有：菌落总数、真菌总数，以及有针对性的病原菌、条件致病菌及微生物耐药情况等。张凤川等25研究了某医院重症监护室的空气细菌谱，刘汝青等26研究了广州某综合性大医院各科门诊候诊室的空气细菌污染状况。国外对工业及医疗场所的空气微生物状况进行了调查研究。工业化养猪场常预防性给猪喂食抗生素，周围环境空气、土壤及水都受到不同程度污染，在空气中发现多重耐药菌，人们可通过多种方式暴露于耐药菌，如食用猪肉、接触农场周围土壤、饮用周围地面水及地下水等27。某地工业冷却塔水被嗜肺军团菌污染，周围空气中也同样检出该菌

28。SHELTON等29在美国的一项大规模调查中发现，空气真菌浓度室内低于室外，夏秋季高于冬春季，常见菌株为枝孢霉、青霉、不产孢子真菌、曲霉等。

2.2 毒理学研究

目前国内空气微生物的毒理学研究尚未见有关报，国外则多为空气中真菌孢子及毒素的毒理学研究。HUTTUNEN等30研究发现，室内空气中的真菌孢子暴露，只有黑葡萄穗霉孢子可增加人肺上皮细胞白细胞介素-6的合成。暴露于黑葡萄穗霉孢子及毒素的幼鼠，其肺泡超微结构显著改变，肺泡表面活性剂转化酶活性降低。据报道，黑葡萄穗霉可使动物中毒，近来又发现它与婴儿肺部血铁质有关。LANDER等31应用嗜碱细胞组胺释放试验HRT来检测真菌特异性血清IgE，发现大部分不良建筑物综合征与HRT阳性显著相关。环境污染与防治 网络版 第9期 2008年9月 6

2.3 检测技术研究

因为室内外空气微生物污染，严重影响人体健康，通过广泛用于室内外进行空气微生物采样技术，研究和评价医院、住宅、办公室等室内空气质量。

如何选择空气微生物采样器以及相应的分析方法，主要从待采集的空气微生物的种类和浓度来考虑，在采样时必须具有获得最大的收集效率32。选择检测方法时要根据检测目的来选取合适的采样器和采样介质，要根据检测环境来布设采样点和采样时间，此外还要考虑到检测的特异性、准确性、可操作性以及气溶胶的粒子大小等33，34。空气微生物采样器可分为两大类：过滤式采样器和撞击式采样器。有固定式和便携式采样器两种。固定式采样器主要用于室外采集空气过敏源。空气微生物采样技术有过滤式空气采样器、撞击式空气采样器、其他采样器（表面空气系统采样器、缝隙式空气采样器、离心式空气采样器、旋风式空气采样器、静电式空气采样器和个体采样器）和平皿法。空气微生物的测定方法也分为两大类：培养基方法和非培养基方法。培养基方法是将采集的微生物经过培养繁殖生长成菌落后计数和鉴别，非培养基方法是在采样后不经过培养就可进行计数和鉴别的方法。在20世纪80年代建立了几种非培养基方法，如光学显微镜方法、荧光显微镜、电子扫描显微镜和流通式血球计方法。目前国内外最常用的检测方法是利用空气微生物采样器主动抽取空气于采样介质中，采样介质可以是液体也可以是固体培养基。培养计数法是目前国内外检测生物气溶胶应用最广泛，结果最可靠的方法35，36。但是培养计数法依赖于微生物的可培养性，首先不是所有的微生物都能够在采样培养基上生长，不同微生物有不同的生长要求。据PARKES和TAYLOR计算，可培养的微生物大约只占空气微生物总数的0.1％～10.0％，所以说培养计数法很容易低估空气中生物气溶胶总量37。

由于传统的菌落计数法不够准确而且耗时耗力，所以许多研究都开始尝试将新方法引入空气微生物检测中，主要有以下几种：①生物发光法。吖啶橙是常用的染色剂，它能够与微生物染色质结合发出黄色荧光，便于在显微镜下细胞计数；②免疫检测。利用微生物的免疫原性检测生物气溶胶，SCHMECHEL等38制备了短密青霉的单克隆抗体，结合酶联免疫吸附检测了实验室发生的生物气溶胶；③生物标记分子的检测。鲎变形细胞溶解物试验广泛用于检定革兰氏阴性细菌的内毒素，但是这种方法更适合于检测微生物的活性而不是总数37，39。革兰氏阳性细菌的胞壁酸，真菌细胞膜的麦角固醇也都可作为生物标记37。分子生物学方法在生物气溶胶检测方面有巨大的应用前景，针对微生物16SrRNA或18S rRNA基因的保守区设计种属特异性的引物和探针，利用PCR和基因探针检测生物气溶胶，相对于培养法来说，该方法不依赖于微生物的生长或其他生理条件，具有良好的特异性、敏感性和分析速

度40，41。3.1 防止微生物污染的方法

室内空气是个小环境，各方面条件差异很大，因环境不同而微生物的来源和分布规律环境污染与防治 网络版 第9期 2008年9月 7 也有所不同，了解不同环境因素对它的影响也有利于进一步对室内空气质量进行监控。建筑物内部有许多适合微生物生长的载体如植物、书籍、垃圾、窗帘等等。温度和湿度是微生物生长的关键因素，寒冷干燥的空气不利于微生物的存活。水浸和渗水的建筑物通常有高浓度的空气微生物浓度，而且室内吸水性的物品或建筑材料往往会成为室内微生物的污染源。控制空气水蒸汽的浓度大约60％以下可以降低微生物污染42。封闭的建筑物尽管避免了室外污染物的侵人，但是由于室内外空气得不到良好交换，所以同样会发生室内空气生物污染，尤其是空调系统没有定期清洁时，室内微生物容易在HVAC的管道、风口或滤网上繁殖，HVAC启动就会造成整个建筑物内空气的污染43。同时，人员活动可以产生供微生物吸附的颗粒物，也有利于空气微生物的传播。因此，在人员密度较高的地方要采取清理措施，适度疏散人群对维持空气洁净有明显效果。控制室内空气污染的关键措施是良好的通风和较低的湿度。王琨等44研究认为，通风可以有效降低室内空气微生物浓度，最为经济、易行。

采取如下措施也可有效改善室内空气微生物状况，改善和提高室内空气质量45-50：（1）去除污染源，被褥经常晾晒。采用降低和消除湿气，防止结露，使细菌和真菌等微生物不能在室内孳生繁殖，或者彻底清除污染建筑材料；（2）保持室内清洁卫生，可有效降低室内空气微生物污染；（3）经常通风，保持室内干燥。通常室外空气中微生物的数量较室内低，将细菌和真菌等微生物排出，降低室内空气微生物浓度；（4）绿化，绿色植物可吸附尘埃从而降低空气微生物含量；（5）定期清洗空调器和地毯。长期使用后，空调的滤网上可吸附大量脏物，有利于微生物的滋生；军团菌常栖息在空调冷却器处，可以气雾形式播散到空气中，使人感染军团菌病；（6）净化空气：使用空气净化器去除室内空气中的微生物，或者用紫外线照射杀死室内空气中微生物，也可以采用有机抗菌剂和无机抗菌剂抑制和杀死微生物，试图减少室内环境中潜在的微生物污染源，达到控制室内空气微生物污染，改善和提高室内空气质量的目的。

3.2 空气净化及微生物杀灭技术

现代人类生活大部分时间都是在室内度过，尤其是办公室工作人员，室内空气质量受到人们的广泛关注。针对空气微生物污染，人们采取了多种空气净化消毒措施，同时，不断研究新的方法，改进和完善原有的空气净化消毒方法。

第五篇：微生物发酵生产油脂研究进展

微生物发酵生产油脂研究进展

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摘要: 微生物发酵产生油脂是开拓油脂新资源的一条好途径。简要地介绍了产生油脂微物生资源的探索, 微生物发酵产生油脂的优点, 特种油脂的功能, 培养条件等因素对微生物产生油脂的影响及微生物产生油脂过程中的生化研究。

关键词: 微生物；发酵；油脂

一 前言

目前，用于生产油脂的原料主要来源于石油和动植物等, 而石油储藏量却在逐年减少, 动植物的养殖业和种植业日益饱和, 因比多渠道开发其他油脂资源就成为必然。经过几十年来科技工作者的共同努力, 已探明微生物发酵产生油脂是开拓油脂新资源的一条好途径。

二 产油脂微生物资源的探索

微生物产生油脂研究已有半个多世纪的历史。第二次世界大战期间,由于连年战火，油脂奇缺，德国科学家们就开始了微生物生产油脂的研究工作，并发现了高产油脂的斯达油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)，粘红酵母属(Rhodotorulaglutinis)，曲霉属(Aspergillus)以及毛霉属(Mucor)等微生物。80年代初，日本成功地建立了发酵法工业化生产长链二元酸的新技术，结束了以蓖麻油裂解合成十三碳二元酸的历史。1986年，日本和英国等国家率先推出含微生物γ-亚麻酸(GLA)油脂的保健食品、功能性饮料和高级化妆品等产品，微生物油脂实用化已迈出了第一步[1]。之后我国上海工业微生物研究所也利用微生物发酵生产了GLA。

进入90年代，特种油脂的发展越来越受人们的重视。罗玉萍等[2]分离到一株高产棕榈油酸的酵母，总脂中棕榈油酸含量高达50.14%。Matsunaga等筛选到两株Cyanobacteria总脂中棕榈油酸的含量分别达54.4%和54.5%。这些工作为利用微生物发酵生产棕榈油酸提供了广阔的前景；Stewdansk和Radevan分别筛选到产生花生四烯酸(AA)的真菌,它们总脂中AA的含量达到42%～55%[3,4]；1996年Yazawa[5]从Pacificmarkarel的肠内容物中分离到一株叫SCRC—2378的海生细菌，能产生一种多烯不饱和酸，即二十碳五烯酸(EPA)，其产量达24%～40%，被认为是EPA 的一种新资源。1996年Nakahara等从海水中分离到一株Schizochytriumsp.SR21，其二十二碳六烯酸(DHA)产量达到每天2g/L。1996年Singh等在优化培养基上对Thraustochytrium ATCC28210 进行培养，5d后DHA产量达到1061mg/L。研究者还发现某些海藻和硅藻也能生产出较高产量的EPA 和DHA[6]。据文献报道，产特种油脂的微生物主要有三类，即真菌、藻类和细菌等。

三 微生物发酵产生油脂的优点及特种油脂的功能

微生物发酵产生油脂是一条开发新油源的好途径。微生物适应性强，生长繁殖迅速，生长周期短，代谢活力强，易于培养，生活所占空间小，不受原料和产地的限制等。另外，通过微生物发酵也能把一些农副产品及其废弃物等碳水化合物转换为可利用的油脂，在环境卫生方面具有现实的意义。

利用微生物发酵法可以得到各种类型的脂肪酸。有单烯不饱和酸，如棕榈油酸等；多烯不饱和酸,如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等；及羟基脂肪酸、支链脂肪酸等。这些脂肪酸的功能主要可归纳为以下几个方面：抗炎症作用[7]；抑制肿瘤细胞的形成、扩散和转移[8]；预防和治疗心血管疾病，尤其是糖尿病患者的心血管疾病[9]；降血脂、降血压等功能[10]；多不饱和酸还能调节皮肤正常的生理功能, 具有护肤作用等。

四 培养条件等因素对微生物产生油脂的影响

实验证明, 不同种属的微生物其产油脂量、油脂成分及含量各不相同。而就同一种微生物菌株，在不同培养条件下,其产油脂量、油脂成分及含量也不尽相同。与此相关的培养条件主要有碳源、氮源、温度等，其中以碳源的影响为最大。

4.1 碳源对产生油脂的影响

微生物高产油脂的一个关键因素，就是培养基中碳源充足而其他营养成分缺乏，在这种状况下, 微生物菌株主要将过量的碳水化合物转化为脂类。目前发酵生产食用级脂类的碳源主要有葡萄糖、淀粉、糖蜜和乙醇等。但通常采用的碳源是葡萄糖, 因为葡萄糖作为碳源所生产的菌体生物量高，且产脂量也高。

4.2 氮源及碳氮比对产生油脂的影响

氮源的作用是促进细胞的生长, 在严重缺氮的条件下，可观察到细胞内脂类的积累。赵人俊等[11]在研究被孢霉M14菌株产脂条件时，认为无机氮有利于不饱和脂肪酸产生，有机氮有利于细胞增殖，低C/N比有利于菌丝体产量的提高，高C/N比则促进菌体细胞内的油脂合成。

4.3 温度对产生油脂的影响

温度调节脂肪酸成分，是由于细胞对外界温度变化的一种适应性反应。通常情况下不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸低, 短链脂肪酸比长链脂肪酸低。因此当菌株从高温转移到低温生长时，细胞膜中不饱和脂肪酸及短链脂肪酸含量增加，主要是棕榈油酸或油酸等含量的增加；而当温度升高时，平均链长就增长。这些变化都是为了保证细胞膜的正常流动性和通透性[12]。

4.4 其他因素对产生油脂的影响

Cohen等发现有几种吡定族的除草剂能抑制脂肪酸去饱和，SAN9785是ω3脱饱和的最有效抑制剂。1996年Khozin等研究表明，除草剂SAN9785能降低Red alga 和Porphyridiumcruentum的EPA产量, 却同时又能将Eustigmatohyte和Monodussubterraneus的EPA产量从54%增到81%。pH 值的变化对微生物产生油脂的影响也较大，一般最适产生油脂的pH值与其最适生长pH值相一致。不同的干燥方式也能影响脂肪酸成分的变化[13]。实验还证明，NaCl浓度、菌体稀释率、苯酚浓度、日照等对一些菌株产生油脂也有影响[6,12,14]。

微生物产生油脂过程的生化研究微生物产生油脂过程与动植物产生油脂过程相似，都是从乙酰CoA羧化酶催化羧化的反应开始，然后经过多次链延长，或再经过去饱和作用等完成了整个生化过程。在此过程中, 有两个主要的催化酶，即乙酰CoA 羧化酶和去饱和酶。乙酶CoA 羧化酶催化脂肪酸合成的第一步，是第一个限速酶。此酶是由多个亚基组成的复合酶，以生物素作为辅基。乙酰CoA 羧化酶结构中有多个活性位点，如乙酰CoA 结合位点，ATP 结合位点，生物素结合位点等等。因此该酶能为乙酰CoA、ATP和生物素所激活。ADP 是该酶AT P 的竞争性抑制剂，抗生物素蛋白作用于生物素而抑制了该酶的活性，丙二酸单酰CoA 起反馈抑制作用。另外，丙酮酸盐对该酶有轻微的激活作用，磷酸盐对该酸的活性有较低程度的抑制。去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径生成不饱和酸的关键酶。去饱和作用是由一个复杂的去饱和酶系来完成的。70年代中期，科研人员就发现酵母微粒体中的去饱和酶系主要由三个酶组成，即NADH—Cytb5还原酶，Cytb5和末端去饱和酶。NADH—Cytb5还原酶是一种黄素蛋白，其催化作用是将电子从NA DH传至Cytb5。Cytb5只作为去饱和酶的电子供体，对去饱和并未起到实质性的作用，而去饱和酶才是产生不饱和酸的关键。在脂肪酸链延长机理方面，人们也作了一些探索。Heath等[15]在研究E.coli菌株时发现，循环过程中有关的酶主要有ACP转酰基酶(fabO)β-酮酰基-ACP合成酶Ⅲ(fabH）、β-酮酰基-ACP还原酶(fabG)、β-羟癸酰-ACP脱水酶(fabA)和烯酰-ACP 还原酶(fabI)，其中fabH和fabI在链延长循环中引发脂肪酸合成。

五 微生物发酵产生油脂的前景

利用微生物发酵产生油脂具有比动植物更大的优越性，它不受时间和空间的限制，能大量生产人们所需的脂肪酸。到目前为止，虽然日本、英国等国家已有γ-亚麻酸、双高γ-亚麻酸和花生四烯酸的发酵产品问世，但除γ-亚麻酸外的其他特种油脂，目前均未能实现工业化生产。因此其他脂肪酸, 特别是不饱和脂肪酸还需要人们去努力开发和探索。总的来说，微生物产生油脂研究还处在起步阶段，还有待于去发现和分离更多更有效的高产油脂的菌株，还有待去对微生物产脂的生理及调控机理作更深的研究。由于生物技术的飞速发展，人们可以通过基因克隆、基因突变和细胞融合等手段来获取大量的高产油脂的菌株，也可以借助反应器技术提高发酵效率。

因此，以微生物为资源生产脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸在医药学、营养学、生物学等方面具有广阔的应用前景。

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