第一篇：高效液相色谱仪检测食肉中瘦肉精含量
液相色谱法测定肉类食品中瘦肉精残留量
摘要瘦肉精是一种动物用药，将瘦肉精添加于饲料中，可以增加动物的瘦肉量、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。近期，国内双汇火腿肠出现食品安全问题所引发的“瘦肉精”事件令国人对食品安全颇为堪忧，因此 ,对动物肉类或内脏中盐酸克伦特罗的监督检测显得十分必要。为此南京科捷应用LC-600液相色谱仪，探讨肉类样品中瘦肉精（盐酸克伦特罗）的前处理方法 ,了解本市肉品中盐酸克伦特罗的残留情况。用水提取肉品中盐酸克伦特罗残留量 ,我们用固相萃取法对肉类样品提取液进行净化和浓缩 ,可以有效去除干扰 ,简便 ,灵敏度高 ,适于在日常检测工作中推广使用。残留监测作为食品安全的重要课题。使之越来越广泛地应用于不同类型兽药、农药及毒素类有毒有害物质的检测分析之中。关键词瘦肉精盐酸克伦特罗兽药农药残留高效液相色谱法 液相色谱仪 液相色谱 色谱仪 分析仪器
本方法的应用范围
本方法的检测思路可供食品中农药、兽药残留检测的借鉴。如兽药残留动物源食品中硝基呋喃类残留(呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋马唑酮)磺胺类药物残留(磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹嚼啉)喹诺酮类(嚼喹酸、萘啶酸)氯羟吡啶、莫能菌素和盐霉素、乙氧酰胺苯甲酯、氯霉素、伊维菌素、克伦特罗、尼卡巴嗪、土霉素、四环素、金霉素(国标GBT14931．1)阿莫西林、盘尼西林及喹乙醇等。农药残留氨基甲酸酯农药、有机磷农药、百草枯、杀草快、草甘膦及氨基膦酸、苯并眯唑类杀菌剂、利谷隆、灭草隆及敌草隆、三嗪类多种农药的检测。
2.实验步骤
(1)仪器和设备
①LC-600高效液相色谱仪整套配置如下
P600宝石恒流泵1台UV600紫外检测器1台
7725i六通进样阀1只WS600色谱工作站1套
②匀浆机 ③旋转蒸发仪 ④电子天平：0.01mg ⑤紫外分光光度计
⑥离心机 ⑦固相萃取仪 HGC-8 ⑧固相小柱
（2）试剂
①盐酸克伦特罗标准品 ②乙醚；分析纯 ③正己烷：分析纯 ④甲醇：色谱纯
⑤盐酸克伦特罗标准液 ⑥lmol／I。盐酸溶液 ⑦0．05mol／L乙酸缓冲液
⑧0．3mol／L乙酸缓冲液 ⑨lmol／LNaOH溶液 ’
⑩甲醇液：甲醇—重蒸水(75+25)
(2)仪器和设备
②匀浆机 ③旋转蒸发仪 ④电子天平：0.01mg ⑤紫外分光光度计
⑥离心机 ⑦固相萃取仪 HGC-8 ⑧固相小柱
(3)测定步骤
①提取和净化 取组织样品10g，加入30ml lmol／L盐酸溶液匀浆，超声波振荡3h，5000r／mln的速度离心10min，—上清液用lmo]／LNaOH溶液滴至碱性，乙醚或正已烷抽三3次，抽提液在水浴锅上蒸发至5ml后上Silioa小柱，以除去大部分杂质，洗脱液上Alu—mina
A小柱，将待测成分吸附在小柱上，用0．05mol几乙酸缓冲液(pH7．0)洗涤小柱3次，o．3mol／L乙酸缓冲液洗脱待测成分，冷冻干燥，用0．5ml甲醇液溶解后取100uL供高效液相色谱仪检测。
②测定
a．色谱条件
色谱柱：C18柱，250mmX4.6mm
流动相：甲醇—水(75+25)
流速：0．65ml／mill
检测波长：243nm
进样量：100uL
b．色谱测定 分析样品按上述仪器操作条件供高效液相色谱仪分析。
③空白试验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。
(4)检测限和回收率
本方法在猪的肌肉和肝脏组织中的检测限为0．001ug/g’回收率范围为80％±20％
传真025-83738955销售热线025-83738955
技术咨询025-84372573售后服务025-84372572
公司网址：www.xiexiebang.com
第二篇：高效液相色谱仪验证方案
高效液相色谱仪验证方案
目 录1.设备基本情况1.1 概述1.2 基本情况3 职责3.1 验证委员会3.2 工程处3.3 QC4 验证内容4.1 安装确认4.1.1 安装确认所需文件资料4.1.2 关键性仪表及消耗性备品4.1.3 评价仪器的安装是否符合GMp及供应商提议的要求4.1.4 起草标准操作规程4.2 校正4.2.1 紫外检测器4.2.1.1 固定波长紫外检测器波长示值误差的校正4.2.1.2 可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差和重复性误差的检定4.2.2 高压泵4.3 运行确认4.3.1 紫外检测器4.3.2 高压泵4.4 性能确认4.4.1 最小检测浓度4.4.2 定性、定量测量的重复性4.5 拟订再验证项目及周期4.6 验证结果评定与结论1.设备基本情况1.1 概述本高效液相色谱仪主要由一个二元泵、一个柱温箱、一个可变紫外检测器、一个带有20μL定量环的进样器和一台工作站组成，各部分由工作站软件控制。本仪器主要用于分析原料和成品的有关物质和含量。1.2 基本情况设备编号：设备名称：高效液相色谱仪型 号：生产厂家： 供货厂家： 安装日期： 使用部门： 工 作 间： 保 管 员：2．验证目的 为确认高效液相色谱仪测试数据准确可靠，性能稳定，特制订本验证方案，对高效液相色谱仪进行验证。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证委员会批准。3 职责3.1 验证委员会1.负责验证方案的审批。2.负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。3.负责验证数据及结果的审核。4.负责验证报告的审批。5.负责再验证周期的确定。3.2 工程处1.负责设备的安装、调试，并做好相应的记录。2.负责建立设备档案。3.负责数字显示器、记录仪的校正。3.3质量部1.负责验证用对照品、样品及其它消耗性备品的准备2.负责备品、备件的保存。3.负责设备仪器的操作。4.负责记录各种测试结果。5.负责拟订再验证项目及周期。6.负责收集各项验证、试验记录，起草验证报告，报验证委员会。7.负责起草仪器使用、维护保养的标准操作规程。4 验证内容4.1 安装确认4.1.1 安装确认所需文件资料 工程处在设备开箱验收后建立设备档案，整理使用手册等技术资料，归档保存。4.1.2 关键性仪表及消耗性备品 列出关键性仪表及消耗性备品的目录，汇总统计，作为仪器的关键资料，用来与仪器以后的变动做比较。4.1.3 评价仪器的安装是否符合GMp及供应商提议的要求 查阅设备采购定单、操作手册等，列出设备安装、使用所需条件，包括温度、湿度、通风条件、电路等。检查仪器安装与使用所处的环境条件，是否符合上述要求。4.1.4 起草标准操作规程--高效液相色谱仪标准操作规程--高效液相色谱仪维护保养规程--高效液相色谱仪校正规程4.2 校正4.2.1 紫外检测器4.2.1.1 固定波长紫外检测器波长示值误差的校正通常用一块滤光片获得指定波长的光者，可小心将滤光片取出，用高精度的分光光度计检定。4.2.1.2 可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差和重复性误差的检定取120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/l硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得重铬酸钾的硫酸溶液将检测器与记录仪联好，接通电源预热稳定后，用注射器注入重铬酸钾的硫酸溶液将吸收池充满，在235nm、257nm、313nm、350nm波长处检定仪器的波长示值误差。将记录纸速调到4mm/min，将检测器波长调到较规定波长低5nm处（例如检定257nm时，检测器波长先调到252nm，调记录笔到中间位置，然后每15秒改变1nm，直至规定的波长高5nm处，记录各点的吸收度，分别找出最小与最大点的波长与标准波长之差即为波长示值误差。每点重复测3次，最小与最大值之差即为波长重复性误差。标 准：固定波长紫外检测器波长示值误差应<±2nm可调波长紫外-可见检测器波长示值误差应<±2nm，重复性误差<±1nm。基线漂移≤5×10-3（AU/h）；基线噪声≤5×10-4（AU）最小检测浓度（静态）_ch 4×10-8g/ml（奈的甲醇溶液）。4.2.2 高压泵校正泵流量设定值：将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器连接好，以甲醇为流动相，按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确收集至规定的时间，称重，按下式计算SS。表1 SS的检定
流量设定值（ml/min）0.51.02.0测量次数333收集流动相时间（min）864允许误差3%2%2%计算公式：Fm=(W2-W1)/ρ·t Ss =(Fm-Fs)/Fs ×100%其中：Fm为流量实测值(ml/min)，Fs为流量设定值(ml/min)，W2为容量瓶加流动相的重量(g)，W1为容量瓶的重量(g)，ρ为实验温度下流动相的密度(g/cm3)，t为收集流动相的时间(min)4.3 运行确认进行运行确认的目的是在不使用任何试样的条件下，确认该仪器能够达到设计要求。4.3.1 紫外检测器基线漂移和基线噪声的测定。将仪器的各部分连接好，紫外检测器波长调到254nm，流动相为100%甲醇，流速为1.0ml/min，纸速为5mm/min，吸收度范围选择最灵敏档，开机，待基线稳定后，记录基线30~40分钟，计算基线漂移和噪声。基线漂移应≤5×10-3(AU/h),基线噪声应≤5×10-4(AU)。4.3.2 高压泵流量稳定性误差SR的检定。将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器连接好，以甲醇为流动相，按表2 设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确收集至规定的时间，称重，按下式计算SR。表2 SR 的检定流量设定值（ml/min）0.51.02.0测量次数333收集流动相时间（min）864允许误差3%2%2%计算公式：SR =(Fmax-Fmin)/F×100% 其中：Fmax为同一组测量中流量最大值（ml/min），Fmin为同一组测量中流量最小值（ml/min），F 为同一组测量中算术平均值（ml/min）。4.4性能确认4.4.1 最小检测浓度在静态条件下，用注射器注入4×10-8g/ml萘的甲醇溶液，样品峰高应大于或等于两倍基线燥声峰高，按下式计算最小检测浓度。Ct=2·HN.C/H式中：Ct:最小检测浓度（g/ml）HN:噪声峰高（记录仪格数或实测高度cm）C:样品浓度（g/ml）H:样品峰高（记录仪格数或实测高度cm）4.4.2 定性、定量测量的重复性将1×10—4g/ml 萘的甲醇溶液，注入高效液相色谱仪中，检测波长254nm，流动相为甲醇，流速1.0ml/min。重复进样8次，计算相对标准偏差（RSD），应小于等于1.5%。4.5拟订再验证项目及周期 质量处负责根据设备仪器情况，确定再验证周期项目及周期，报验证委员会审核。4.6 验证结果评定与结论QC负责收集各项验证、试验结果记录，起草验证报告，报验证委员会。验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论。附件1关键性仪表及消耗性备品情况
仪器名称仪器编号型 号关键性仪表仪表名称生产厂家型号校正证书编号保存处校正周期消耗性备品品名生产厂家型号数量单位保存处 确认使用部门 年 月 日工程部 年 月 日验证委员会 年 月 日附件2 仪器安装条件检查记录
设备名称设备编号型 号安装条件要求实际安装条件温度10～30℃湿度小于65%通风水电气汽其它条件
工作台不受阳光直射。室内应无腐蚀性气体或其它影响测定的气体干扰。周围应无影响测定的强电场、磁场和强烈震动。确认使用部门 年 月 日工程部 年 月 日验证委员会 年 月 日
附件3高效液相色谱仪校正记录
设备名称设备编号型 号温度：湿度：甲醇密度：泵流量设定值误差FstW2W1FmFm均值Ss标准规定判定检测者 复核人 年 月 日确认使用部门 年 月 日工程部 年 月 日验证委员会 年 月 日附件4高效液相色谱仪运行确认记录设备名称设备编号型 号测试项目 标准规定实测结果结论 实测结果 结论 判定基线漂移≤5×10-3(AU/h)基线噪声≤5×10-4(AU)流量稳定性检测者 复核者 年 月 日复核者 年 月 日 确认使用部门 年 月 日工程部 年 月 日验证委员会 年 月 日附件5 高效液相色谱仪性能确认记录设备名称设备编号型 号测试项目标准规定测定结果判定最小检测浓度＜4×10－8g/ml定性定量重复性RSD≤1.5%检测者 复核者 年 月 日复核者 年 月 日确认使用部门 年 月 日工程部 年 月 日验证委员会 年 月 日附件6 高效液相色谱仪再验证项目及周期设备编号： 设备名称： 型号： 序号项目标准验证方法周期1线路连接检查线路、接地2附件检查检查操作记录、操作手册等3清洁清洁仪器外部4泵流量设定值和稳定性基线漂移和基线噪声最小检测浓度定性定量重复性详见验证方法起草： 工程部长： 验证委员会： 年 月 日第三篇：LC1620A高效液相色谱仪 生产厂家
LC1620A高效液相色谱仪价格优惠，专业生产销售厂家：郑州南北仪器设备有限公司（南北设备集团），南北通过向客户提供领先的技术、产品，更为优异的质量和服务，更高的性价比价值体来追求行业第一 可靠的性能.稳定准确的输液能力，是高精度分析的可靠保证。
LC1620A高压恒流泵采用了专利的端面凸轮设计，最大程度避免了加工和装配误差，结合经过精密计算设计的凸轮曲线，从而获得高精度流量。
丰富的功能紫外检测器具有：
.丰富的功能
.波长自动校准和修正功能
.波长扫描功能
.波长时间程序功能
.检测池最大耐压为15Mpa，便于串联其他检测器
自动化的操作.功能强大的智能化反控工作站，所有系统设置均可在电脑上完成。配合准确度和重复性高的自动进样器，您只需在软件上设置好条件，即能轻松完成整个分析过程。
更强的检测能力.除了常规的紫外检测器，LC1620A还可配置示差折光检测器和蒸发光散射检测器。无论您的实验室是从事制药、质量控制、食品安全、化学、环境等何种应用领域，LC1620A都能为您提供适合的行之有效的检测方案，帮助您分析各种各样的化合物，全面满足您分析检测的需求。
多方位的细节设计.流量监控功能：对流动相进行实时监控，双预警设计，当达到设定值时，系统会报警提示或自动停泵，有效保护HPLC系统。
.柱塞杆在线清洗功能： 高压恒流泵采用双密封圈设计，有效清洗缓冲盐，减少关键部件磨损，延长使用寿命。
第四篇：猪肉中瘦肉精的检测
猪肉中瘦肉精的检测
摘 要
鉴于盐酸克伦特罗(瘦肉精)在动物性食品中的残留对人体和国民经济造成了巨大的危害，本文介绍了动物肌肉组织中残留盐酸克伦特罗(瘦肉精)的几种分析检测方法，并对未来的发展方向作了展望。
关键词：瘦肉精 GC-MS HPLC ELISA 引言
瘦肉精是一类药物，而不是某一种特定的药物，任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。在中国，通常所说的瘦肉精是指克伦特罗(Clenbuterol，CLB)【1】，而普通消费者则把此类药物统称为瘦肉精。当它们以超过治疗剂量5—10倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”——促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此，β—受体激动剂被大量非法用于畜牧生产，其中最常用的有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。长期食用含有β—受体激动剂残留的食品将对人体健康产生极大的危害，可诱发和加重心率失常病人的病情，引起心室早搏，四肢、脸、颈部骨骼肌震颤；另外还能引起代谢紊乱，对糖尿病人可发生酸中毒或酮中毒【2】。
盐酸克伦特罗(Clenbuteerol，CLB)，又名克喘素、氨哮素、双氯醇胺，俗名瘦肉精，化学名为α—[(叔丁氨基)甲基]—4—氨基—3，5—二氯苯甲醇盐酸盐，分子式为C12 H18Cl12N2O•HCl，相对分子质量为313.65。
目前，检测瘦肉精残留常用的色谱技术有高效液相色谱(HPLC)、气相色谱—质谱联用法(GC—MS)、高效液相色谱—质谱联用法(HPLC—MS)、毛细管电泳法(CE)等。中国已将高效液相色谱法（HPLC）作为检测饲料中盐酸克伦特罗残留的半确证法，将GC—MS 法定为确证性方法，主要用于最后确认和仲裁。对于动物性食品，GB/T 5009.192—2003 “动物性食品中克伦特罗残留量的测定”规定的第一法为气相色谱—质谱法，第二法为高效液相色谱法，第三法为酶联免疫法。下面将会对这三种方法逐一进行说明，并简单介绍毛细管电泳法（CE）【3】。2 动物性食品（猪肉）中盐酸克伦特罗的检测方法
2.1 气相色谱—质谱法(GC—MS)
GC—MS法优点是把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机结合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，而且具更高的检测极限。GC—MS法与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低【4】。下面将以岛津公司采用的GC—MS法检测瘦肉精为例，对仪器与试剂的选择、样品的处理方法等方面进行介绍。
2.1.1仪器与试剂
仪器：岛津GCMS—QP2010 Plus；
试剂：盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB）标准品，内标（Clenbuterol—D9，CLB—D9），N，O—双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA），C18固相萃取小柱（100 mg，3 mL）标准溶液的配制：准确称取盐酸克伦特罗和内标的标准品，用甲醇配成浓度为1 mg/mL的标准储备液，放置于4℃冰箱中避光保存，使用时用甲醇稀释成1μg/mL的标准使用液和内标使用液。
2.1.2 分析条件
色谱柱：Rtx—5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)进样口温度：220℃ 柱温程序：70℃(0.6 min)—25℃/min—220℃(6 min)—25℃/min—280℃(5 min)恒线速度方式，柱流量0.9 mL/min 不分流进样，进样时间1 min 接口温度：280 ℃ 离子源温度：200 ℃ 溶剂切割时间：8 min 检测离子：
CLB：检测 m/z 86，187，243，262，CLB—D9：检测 m/z 95，187，262 以克伦特罗(m/z86)与内标峰(m/z 95)的峰面积比校准定量。
2.1.3 样品制备
精密称取(2 ± 0.01)g 己绞碎的猪肉于具塞离心管中，加入4 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液，旋涡振荡5 min，超声10 min，12000 r/min 离心5 min后，倾出上清液，沉淀再分别用0.1 mol/L 盐酸4 mL，2 mL 两次提取，提取方法同上，合并上清液。
将上清液全部上样至C18 柱，用5 mL 水清洗小柱后，使用0.8 mL 甲醇：20 mmol/L 磷酸溶液=1：1(v/v)的酸化甲醇解析，加磷酸缓冲液调至pH=7，定容至2 mL。将该溶液以0.1 mL/min的流速推过聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）毛细管整体柱萃取后，用0.2 mL 的甲醇解析，加50 μL 的内标使用液后以氮吹仪浓缩至干。加入100 μL 甲苯和100 μLBSTFA，涡旋混匀30 s，置于微波炉中小火衍生5 min。衍生反应完成后取出冷却至室温后再加入300 μL 甲苯，充分混匀，待气质联用仪进样。
2.1.4 结论
该法在样品提取后，用C18 小柱和聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）整体柱进一步富集净化，经N，O—双三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)衍生，选择离子监测方式进行气相色谱质谱测定。
该方法具有检测限低、重现性好、回收率高、样品用量少等特点，适合于猪肉样品中盐酸克伦特罗的定性、定量测定。但GC—MS的缺点是检测过程烦琐、检测时间长、需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。
2.2 高效液相色谱法(HPLC)【5】
HPLC适合测定热不稳定和强极性的β—激动剂及其代谢产物，而且HPLC可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱(MS)等系统联用，容易实现分析过程的自动化。
HPLC 法【6】中常用的检测器有电化学检测器、紫外检测器。
2.2.1 材料与仪器
甲醇：色谱纯；
试验用水：均为超纯水； 其余试剂：均为分析纯；
盐酸克伦特罗标准品：中国药品生物制品检定所；
盐酸克伦特罗标准溶液： 取盐酸克伦特罗标准品24.98 mg置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成含盐酸克伦特罗1 mg/mL的标准贮备液，贮于冰箱中，不同浓度的系列标准溶液由标准储备液稀释而得；
Dionex AT330(美国)高效液相色谱仪：由P680四元泵、UVD170U紫外检测器和AT330恒温箱组成；
超声波提取器(SB25200BTD)； 离心机(6 000 r/min)；
DSY22型电热恒温水浴锅。
2.2.2 色谱条件
色谱柱采用Diamonsil ODS2C18 柱(5 μm，150 mm ×4.6 mm I.D)；检测波长为244 nm； 流动相甲醇∶水=26 ∶74；流速1.0 mL /min； 柱温30 ℃；进样量20μL。
2.2.3 样品制备
取10 g绞碎肉试样，加0.1 mol/L高氯酸20 mL 匀浆，超声提取20 min，80℃ 加热30 min，冷却后离心(4 000 r/min)15 min。沉淀加0.1 mol/L高氯酸5 mL洗涤、离心，将上清液合并，用1 mol/L氢氧化钠调pH至11，加入25 mL乙醚，振荡提取20 min，回收有机相，再用20 mL乙醚重复萃取2次，合并有机相，蒸发至干。用0.1 mol/L HC1溶解，纯水定容至10 mL。
2.2.4 结论
目前，中国已将HPLC法作为检测CLB残留的半确证性方法，最低检测限范围为1～15ng/g，其优点是专属性好、选择性强、检测精确度较高，而且假阳性率低，与GC—MS 法相比样品不必衍生【7】；缺点是样品处理时间长，检测
过程烦琐、难于操作，需贵重仪器，在实际应用中受到一定的限制【8】。2.3 酶联免疫吸附法(ELISA）
目前，检测CLB较高效的免疫分析技术是ELISA技术。早在1992年，Oriundi就通过ELISA法对尿液和血清中的β—兴奋剂残留进行直接分析，该方法既适于实验室大量样品的检测，也适于屠宰场地少量样品的迅速检测【9】。目前，英国的Randox Laborato—ries Ltd和德国的r—biopharm公司均开发出了检测肉品、饲料中CLB残留的ELISA试剂盒。中国在应用EIA检测CLB方面的研究起步晚，但近几年取得了明显的进展，目前已有几种试剂盒研制开发成功【10】。
2.3.1 测定原理
“瘦肉精”（克仑特罗）竞争酶标免疫检测的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体【11】（第2抗体）。加入兔抗克仑特罗特异性抗体（第1抗体）与第2抗体结合而被固定，洗涤后加入标准液或样品溶液与酶结合物（酶标记抗原），标准液或样品中的游离抗原与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点【12】。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原，加入酶基质（过氧化脲）和发色剂（四甲基联苯胺）并孵育，结合到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。【13】在单波长450纳米处测吸光度，吸收光强度与样品中的克仑特罗浓度成反比。
2.3.2 样品制备
取粉碎的肉样5克，与25毫升50 mmol/L HCl混合，振荡1.5小时。称6克均质物，加入离心管中。10~15℃条件下4 000转/分钟或更高的转速离心15分钟。转移上清液到另1个离心管中，加300微升1摩尔/升氢氧化钠混合15分钟。加入4毫升500毫摩尔/升磷酸二氢钾缓冲液（pH值3.0），简单混合，并在4℃保存至少1.5小时或过夜。10~15℃条件下4 000转/分钟或更高的转速离心15分钟。分离全部上清液，使其升至室温，然后用C18柱纯化【14】。
C18柱纯化样品必须在室温条件下，并严格控制过柱时流速。用3毫升甲醇洗涤柱子，控制流速为1滴/秒。用2毫升洗涤液（50毫摩尔/升磷酸二氢钾缓冲液pH值3.0）洗涤柱子。将肉样的全部上清液进柱，控制流速为每4秒1滴。用2毫升洗涤液，洗涤柱子，流速为1滴/秒。用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹2分钟，干燥柱子。用1毫升甲醇洗脱样品，控制流速为每4秒1滴。在50~60℃并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶剂【15】。用1毫升蒸馏水溶解干燥的残留物，取20微升进行分析。取10克饲料样品，用10毫摩尔/升盐酸溶解，连续震荡10分钟，用滤纸过滤，在滤液中加入120微升1毫摩尔/升氢氧化钠进行中和，检查pH值，用氢氧化钠控制pH值在6.5~7.5之间，取上清液20微升进行分析，稀释倍数为25。
2.3.3 测定步骤
所有试剂及样品在开始检测前必须回升至室温，测定操作在20~24℃下进行。用盒中缓冲液以体积1∶10的比例稀释实际用量的克仑特罗抗体浓缩液，稀释前混匀抗体，不要猛烈振荡。取出试验需要数量的微孔板条，足够标准品和样品，标准品和样品做2个平行试验，记录标准品和样品的位置。剩余的微孔板条
放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，2~8℃冷藏。
每个微孔底部加100微升稀释后的抗体溶液，室温孵育微孔板15分钟，避免光线照射。孵育的同时进行酶标记物的稀释，洗板，甩出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打，直到纸上无明显水迹（拍打3次），以保证完全除去孔中的液体。
用250微升蒸馏水充入孔中，再次甩掉微孔中液体，并在吸水纸上拍打，重复操作2次。加洗涤水的移液器管尖必须置于微孔上方约0.5厘米处打出洗涤水，避免将板孔中的游离抗体带入洗涤水中。洗板后立即进行下步操作，不要让板孔干燥【16】。加入20微升标准品和处理好的样品到各自的微孔底部，标准品和样品做2个平行实验。加入100微升稀释的酶标记物至微孔底部，轻轻震荡微孔，并在桌面上作圆周运动以混匀。移液器管尖不要接触到孔中的混合物，避免交叉污染。室温孵育微孔板30分钟，避免放置，尽可能每隔10分钟轻轻振荡1次，准备好酶基质，并注意避光放置。
在洗板过程中加洗涤水的移液器置于微孔板上方0.5厘米处打出洗涤水，避免将板孔中的游离酶标记物带入洗涤水中。不要让板孔干燥，迅速加入100微升酶基质到每个孔中，操作步骤要迅速，避免反应时间相差过长。移液器管尖不要接触微孔中的混合物，避免交叉污染。室温暗处孵育微孔板15分钟，暗处避光放置，同时，准备好反应停止液。每孔加入100微升反应停止液，混匀，60分钟内用酶标仪测量450纳米处波长吸光度值【17】。
2.3.4 结论
ELISA的优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速、价格便宜；缺点是仍不能实现现场检测，而且假阳性率高。
故而，ELISA方法只是一种大范围的筛选方法，它不能起到定性和定量的作用，检测结果出现可疑，可以用其他检测方法进行定性和定量分析。
2.4 毛细管电泳法（CE）【18】
毛细管电泳法（CE）非常适用于难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析。优点是有很大的灵活性许多分离参数如缓冲液的组成和pH 值毛细管的类型以及所使用的电场的波形都可以调节，操作简便，所需样品量极少，一般只需几纳升。缺点是检测时间仍很长，不能满足在线检测，仪器复杂、缺乏配套的检测器 CLB检测技术的未来趋势和发展方向
当前，造成盐酸克伦特罗屡禁不止的原因之一就是国内外检测CLB 的方法、手段还不完善，还没有建立准确、迅速、方便、精确的检测方法。鉴于目前国内外检测CLB 各种方法的进展情况以及CLB 滥用及残留的严峻性，建立一种克服上述各种检测方法缺点的简便、快速、精确、可实现在线检测的CLB 技术势在必行。
生物传感器技术(Biosensor，BS)【19】和滴金免疫技术(DIGFA)【20】是两种快速、高效的残留物分析技术，如能研究、开发运用到检测生物样品中CLB的残留可能会产生理想的效果。
纳米材料是非常敏感的化学和生物传感器，固定有能选择性结合靶分子的生物探针的纳米传感器称为纳米生物传感器。它们能和生物芯片、免疫技术、标记
技术等技术手段结合，从而使检测更加高效、简便。与液质联用分析克伦特罗的方法相比，基于碳纳米管的无标记电化学免疫传感器免除了样品分析前的固相萃取及纯化步骤，使得操作方法更简便。与ELISA 法相比，该传感器同样具有样品处理简单及高能量的优点。此外，该传感器的方法很少受到基质效应的影响，或者至少比在ELISA 方法中的影响小【21】。
纳米金免疫标记技术，是蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面的包被过程，由于金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，用于定性或半定量的快速免疫检测方法中【22】。
可以预见的是，在未来一定会有更加灵敏、快捷、方便的检测方法问世，从而使猪肉中瘦肉精的检测问题得到彻底解决。
参考文献
【1】 路平，肖肖，张衍海，王玉东，曲志娜，王娟，赵思俊，徐天刚，郑增忍，我国“瘦肉精”监管现状分析及对策建议，中国动物检疫，2011年第28卷第4期
[【2】 丁芳林，张朝辉，谭胜国，廖三赛，高效液相色谱法测定猪肉中的盐酸克伦特罗的研究，食品与机械，2007年10月，第23卷第5期
【3】 张清安 范学辉，动物性食品中盐酸克伦特罗(瘦肉精)残留危害及其检测方法研究进展，食品与发酵工业，2004 Vol.30 No.9(Total 201)【4】 柳显文，韩学颖，瘦肉精”检测原理及操作步骤，养殖技术顾问，2012年1月
【5】 蒋剑，盛毅，方智，罗薇，瘦肉精检测方法研究进展，草食家畜（季刊），2012 年3 月第1 期（总第154 期）【6】蒋珊;毛慧玲;;GC-MS法测定猪肝、猪尿中盐酸克伦特罗残留量 研究[J];安徽农业科学;2007年33期
【7】管月清,楚清脆,叶建农;肉制品中β-兴奋剂的毛细管电泳-电化学检测方法[J];华东师范大学学报(自然科学版);2005年02期
【8】裴艳涛,孙继国,林密,苏小庚;动物性产品中“瘦肉精”残留的检测方法研究进展[J];动物科学与动物医学;2004年01期
【9】刘维红;;动物产品中盐酸克伦特罗残留危害及检测方法[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年23期
【10】李娜;祁克宗;;免疫分析法在兽药残留分析中的应用[J];动物医学进展;2006年02期
【11】董美玲;;畜牧兽医科技创新与“三农”问题[J];广东农业科学;2011年23期
【12】孙凌志,陈庆勋;“瘦肉精”猪肉的简易检验法[J];河南畜牧兽医;2002年02期
【13】刘国艳,柴春彦;如何全面认识“瘦肉精”[J];动物科学与动物医学;2002年06期
【14】秦永平,邹远高,梁茂植,王建新,黄英,余勤,李芚;反相高效液相色谱紫外检测法测定血浆中沙丁胺醇浓度[J];中国药学杂志;2000年07期
【15】宋广林;“瘦肉精”害人[J];中国食物与营养;2001年03期 【16】张志刚;邹忠爱;;无公害猪肉安全控制模式探讨[A];福建省科协第六届学术年会卫星会议“增强科技创新能力，促进优质畜牧业发展” 研讨会论文集[C];2006年
【17】汪伟;食品安全之忧成就沈阳“天价猪肉”[N];粮油市场报;2011年
【18】杨正慧;气相色谱—质谱法检测β-受体激动剂残留量的方法研究[D];吉林大学;2012年
【19】陈瑞清;;液相色谱质谱联用技术及其在食品中兽药残留检测的应用[A];首届中国兽药大会动物药品学暨中国畜牧兽医学会动物药品学分会2008学术年会论文集[C];2008年
【20】谢静;;肉类食品中激素残留检测技术的研究[J];肉类研究;2009年11期
【21】李英;;我国动物源性食品安全保障战略[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（下册）[C];2009年
【22】徐江涛;王志亮;鲍恩东;;新城疫检测技术研究进展[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
第五篇：瘦肉精检测
通许县动物卫生监督所关于
外销生猪“瘦肉精”检测的报告
开封市动物卫生监督所：
为了保证畜产品质量安全，保障人民身体健康，全面推进和谐社会的创建，2010年6月21日，通许县畜牧局下发文件开展世博会期间整顿生猪经营处等检疫秩序活动，特别是重点开展 “瘦肉精”的检测工作，坚决杜绝在饲料中使用莱克多巴胺及克伦特罗等违禁药物，整顿和规范饲料、兽药市场，严厉打击假冒伪劣产品，实现全县生猪生产的安全无污染，确保外销到市场的是“放心猪”。
通许县动物卫生监督所认真学习贯彻了县局文件精神，开展以“瘦肉精”和重大动物疫病为主的检测检验；加大对使用“瘦肉精”的打击力度，建立生猪疫病防治体系，确保生猪及其加工产品的质量安全。对检测出“瘦肉精”的生猪产地在3个月内禁止外销，经检测合格后重新申请进入市场。逐步推行生猪产品市场准入制度、“一猪一标一码”标识管理制度。对生猪“瘦肉精”进行重点抽检，检验中凡发现有“瘦肉精”的生猪均进行销毁，并向产地通报和封停该地生猪进入市场。
据汇总统计，2010年6月至8月份我县共外销生猪8603头。分批次发往浙江省慈溪市、江苏省无锡市、安徽省和县、浙江省宁波市、江苏省常州市、广东省湛江市、安徽省合肥市、安徽省淮南市、安徽蒙城县等九个城市和地区。“瘦肉精”检测全部呈现阴性。其中6月份外销生猪2053头，抽检生猪尿样110多个，检测结果全部呈现阴性，合格率达到100%。7月份外销生猪3190头，抽检生猪尿样160多个，检测结果全部呈现阴性，合格率达到100%。8月份外销生猪3360头，抽检生猪尿样170多个，检测结果全部呈现阴性，合格率达到100%。
二○一○年九月八日
主题词：瘦肉精 抽检 报告
通许县动物卫生监督所二○一○年九月八日印
点击咨询 