细胞研究论文

第一篇：细胞研究论文

骨缺损(尤其是大型骨缺损)的治疗，由局部伤情复杂和缺乏理想的修复材料，一直是困扰临床医生和基础医学工作者的一大难题，而寻找一种尽可能达到或接近自体骨移植效果的理想的骨替代材料更是无数学者热切探索、孜孜以求的目标。近年来日趋活跃的骨组织工程(bone tissue engineering)技术为这一课题的研究带来了新的亮点和希望。目前动物实验已能从骨膜、骨髓等定向性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cells, DOpC)密集处分离培养出成骨细胞，经体外扩增并与载体结合，回植体内骨缺损处取得骨缺损修复的成功［1］。与此同时，基于对患者易接受性、可操作性和更简单易行性等方面的考虑，研究者又开始把目光投向诱导性骨祖细胞(inducible osteogenic precursor cells, IOpC)。其中，在体内分布广泛、数量巨大、部位表浅、取材方便、培养传代易行、分裂增殖迅速的成纤维细胞首先成为了研究的焦点。由于目前许多相关研究尚处于实验阶段，为此，本文着重就成纤维细胞的生物学特性及其成骨作用等作一综述。

1　成纤维细胞的来源及其生物学特性

成纤维细胞(fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。

不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。

成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同［4,5］。

处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。

2　成纤维细胞在一般创伤修复中的表现

各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化(ectopic ossification)。但对于异位骨化的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程［6，8］。

3　成纤维细胞在骨创伤修复过程中的表现

最简单和常见的骨创伤即是骨折，其愈合过程须经过炎性反应、清扫、纤维骨痂和骨性骨痂4个阶段［4］。不同阶段参与的细胞主体不同。成纤维细胞从骨折第3天起就出现于骨折局部血肿中［6］，骨折后5天即在机化血肿及骨折断端的间隙及其周围大量存在，是参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分［4，5］。在此阶段成纤维细胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型胶原，使肉芽组织逐步变成疏松的结缔组织，将骨断端包围起来，形成接合两骨折断端的巨大的纤维骨痂。然而，这种由无数成纤维细胞和丰富的肉芽组织为主体构成的纤维结缔组织却不会演变为在其它组织创伤修复时常见的瘢痕组织，而是通过钙盐结晶在其内部不断沉积，逐渐演变为骨性骨痂，使骨折局部的修复达到骨性愈合，恢复骨组织的结构。此时，骨折愈合部只有骨组织而不再存在成纤维细胞［4，5，9～11］。

4　成纤维细胞的成骨作用

成纤维细胞在骨折愈合过程中不同于其它组织创伤修复的表现，以及在某些病理条件下可以参与异位骨化［6，7］，使人们对成纤维细胞的分化能力、钙化骨化能力以及在成骨过程中其成骨能力如何发挥、细胞演变的最终归宿如何等等问题产生了浓厚的兴趣。对成纤维细胞成骨能力的研究也正是开始于对骨折愈合过程中成纤维细胞表现的观察。

对骨折局部骨形成区的电镜观察显示，除了成骨细胞在此发挥成骨作用外，成纤维细胞确实也存在着类似的成骨表现［4，5，9～13］。例如，在其线粒体内可清晰见到钙盐颗粒，部分内质网腔内可见成熟的胶原纤维，分泌到其四周的胶原纤维内可见高密度的钙盐结晶沉积。不仅如此，成纤维细胞还能象成骨细胞一样产生基质小泡并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成丛毛球状的钙球，钙球随后合并、融合为骨组织。以上种种现象表明，成纤维细胞与成骨细胞一样具备提供钙盐沉积及骨形成所必需的条件。在从纤维性骨痂到骨性骨痂的演变过程中，成纤维细胞也随之演变为骨细胞，与成骨细胞的归宿相一致。但二者在演变过程中的表现又不尽相同，主要有以下几点可资鉴别［9，13］：①成纤维细胞及其细胞核均呈不规则的椭圆形或长方形，而成骨细胞及其细胞核则为边缘比较光整的椭圆形；②成纤维细胞均单独存在，细胞之间有众多的胶原纤维相隔，成骨细胞则以连续排列的形式出现；③成纤维细胞的细胞质内溶酶体少见，而成骨细胞的细胞质内则常有溶酶体可见；④成纤维细胞四周的骨组织都由丛毛球状钙球或针状钙盐结晶组成，成骨细胞则都有一面紧贴比较成熟与致密的骨组织；⑤成骨细胞是一个一个地被骨组织(类骨质)包围变为骨细胞，而成纤维细胞则可以是两个或两个以上同时被骨组织包围在一个陷窝内，然后再随着细胞之间基质的钙化而分隔为各占一个骨陷窝。

对成纤维细胞的成骨作用，有学者认为这是成纤维细胞的固有特性在骨折这一特定情况下得以表达的结果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨组织及软骨组织，以及骨基质中的某些大分子都有可能诱导成纤维细胞表达其成骨作用进而演变为骨细胞［14，15］。较早在骨基质中发现的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMp)即对成纤维细胞有一定的诱导作用。对骨折愈合中BMp作用的研究［16，17］，表明创伤使内源性BMp呈阶段性合成与释放，并诱导周围软组织中的间充质细胞或/和成纤维细胞等向成骨方向转化。应用pAp法发现［16］，骨折后第3、5天局部纤维肉芽组织中的成纤维细胞样间充质细胞内以及第14天新生骨小梁间纤维组织中的成纤维细胞样间充质细胞内，都与成骨细胞、软骨细胞和骨基质一样存在BMp，表明这些成纤维细胞样间充质细胞已被诱导为可合成分泌BMp、具有成骨作用的细胞。而Sampath［15］从牛骨基质中分离提纯得到的成骨素对成纤维细胞的骨诱导能力更是超过了BMp和当时已知的其它骨生长因子。

成纤维细胞在其成骨作用得以表达后，可能通过两种方式成骨：①膜内成骨；②在环绕软骨的纤维层内成骨。开始分泌胶原纤维后，参与成骨的成纤维细胞只有两个归宿［4，5，9，13］：①变性、死亡、碎裂直至消失，这种演变发生早、范围广，故从纤维性骨痂形成开始，就逐渐有基质成分发生钙化，进而转变为骨基质；②演变为骨细胞，这一过程出现较晚，并穿插在前一过程之中，故在形成骨组织的细胞成分的同时，还使丰富的纤维骨痂演变为骨性骨痂，形成骨组织。但这种由成纤维细胞演变成的骨细胞，其结局如何、其生物学特性与由成骨细胞演化而来的骨细胞是否相同仍不清楚。例如，骨细胞从骨陷窝脱离后，可恢复为功能活跃的成骨细胞，再次参与骨组织的形成；而由成纤维细胞演变成的骨细胞在脱离骨陷窝后，是成为成骨细胞还是恢复为成纤维细胞、此时是否还具备成骨作用等一系列问题尚缺乏研究。

5　成纤维细胞体外培养的生物学特性［18］

成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。

成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍。通常，以酶消化法获得的成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平；最快者大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。采用组织块法则大约在接种后2～3天［2，3］到1周左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞。待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行传代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，将成纤维细胞从底壁消化下来后分瓶作传代培养。成纤维细胞在体外培养条件下能保持良好的分裂增殖能力。细胞分裂时变为球形；分裂后又平铺在附着物的表面成为有突起的扁平细胞。体外培养的成纤维细胞，其生命期限与物种等因素有关。例如：人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养30代；而小鼠成纤维细胞多数只能生长8代左右。另外，从老年个体取得的成纤维细胞的寿命要比取自年轻者短。由于在细胞传代和进行体外培养时，细胞的生物学特性会逐渐发生一些不同于体内的改变，故通常只将前10代视这正常细胞，可在此时将生长旺盛的成纤维细胞冻存起来，以备将来复苏使用，这在将培养的细胞由动物实验向人体实验过渡的过程中必须给予足够的重视。

6　成纤维细胞在体外培养中的成骨作用

徐荣辉［2］等通过体外培养家兔皮肤成纤维细胞发现，经传代培养的成纤维细胞至第8天时，其细胞集落中有不透光的骨小结节形成；到37天时，小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构。经活体四环素标记显示，所形成的结构为新生骨组织。他们还注意到，成纤维细胞在参与骨形成的过程中并无分化为成软骨细胞或成骨细胞的明确迹象，故推测并未发生此种分化，而成纤维细胞之所以能发挥成骨作用，很可能是受某些诱导因素作用的缘故。他们认为用以培养成纤维细胞的中厚皮片中混杂存在的上皮细胞(或/与内皮细胞)，可能是诱导成纤维细胞形成骨组织的一种诱导因素。而Friedenstein［6，19］较早的实验则认为，属于诱导性骨祖细胞之一种的成纤维细胞，在上皮细胞(如膀胱上皮)或脱钙骨基质等诱导因子作用下，可以分化为成骨细胞进而形成骨组织。邓廉夫［20］等分离培养取自关节内的损伤性和晚期骨关节炎性的滑膜细胞，发现其中的成纤维细胞样细胞增殖迅速，呈束状或交叉铺展并可形成多层结构，细胞表面有其分泌物形成的不透光结节，经四环素标记、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色，显示结节为新生骨组织。在缺乏常规的诱导因子——上皮细胞的作用下，取自滑膜的成纤维细胞样细胞也能发生成骨作用，他们推测是在关节损伤后或骨关节炎的发生与发展过程中，改变的关节微环境(如TNF样活性物质增多等)可能会触发滑膜的成纤维细胞与骨形成相关的多基因表达，使其向成骨型细胞分化，这样，滑膜成纤维细胞样细胞在体内时即已具备成骨性能，故在培养条件下可发挥成骨作用。Dodda［21］等的研究则指出，变性滑膜细胞多种细胞因子和生长因子的表达、关节液内多种细胞因子的出现，可能是滑膜成纤维细胞样细胞成骨表型表达的重要始动因素。这些相关的研究表明成纤维细胞成骨表型的表达可能存在着较复杂的调控机制，而其诱导因素也是多样的。

为获取大量具有成骨表型的成纤维细胞并了解其转化机制，邓廉夫［22］等将分离纯化的人皮肤成纤维细胞置于加有不同浓度EGF、IL-

6、TNF-α、BMp-2的培养液中进行体外培养，采用生物化学、组织化学和电镜观察等方法检测成纤维细胞成骨性标记物的形成状况，发现TNF-α和BMp-2联合应用，可使成纤维细胞分泌碱性磷酸酶、骨钙素及胶原纤维的量增加；成纤维细胞可由梭形向圆形或多突形转化，蛋白分泌旺盛；细胞外基质中，丰富的胶原纤维定向或杂乱排列，其间散在较多的钙颗粒；细胞可重叠交织形成多层结构，其表面有分泌颗粒和钙盐结晶堆积，并不断融合扩大成骨结节，表明TNF-α和BMp-2可以诱导成纤维细胞成骨。但这种完全由成纤维细胞经诱导而形成的骨组织，在缺乏典型的成骨细胞参与下是否能在体外或植入体内后经改建成为成熟的板层骨及其改建过程如何?仍有待进一步研究。

7　展望

尽管成纤维细胞受哪些因素诱导可以产生成骨作用、这些因素的诱导方式及其机制如何以及成纤维细胞在骨形成中是否分化为成骨细胞等等问题尚未完全解决，但成纤维细胞经诱导可以形成骨组织这一现象已逐渐为广大科学工作者所接受。由于成纤维细胞直接参与了骨折愈合过程中纤维性骨痂的形成，其自身又具备被诱导成骨的能力，可以设想，利用成纤维细胞分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活、增生繁殖较快等较其它具有成骨作用的细胞(如骨膜成骨细胞、骨髓基质细胞等)优越之处，在体外大量培养扩增成纤维细胞，并施以有效的诱导因素(如上皮细胞、TNG-α和BMp等)使其具备成骨效能，然后与合适的生物材料载体复合，同时使该复合体在体外或体内保持良好的成骨能力并进行一定程度的成骨，则有望获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损，这无疑将为骨缺损的修复治疗开辟一条新的有辉煌前景的道路。在组织工程技术和生物材料科学已有较大发展的今天，这一设想是极有可能实现的。当然，从目前所处的实验阶段过渡到临床应用尚有很大一段距离，需要解决的问题还很多，而且随着研究的展开和深入，问题可能还会越来越多，但这确实是一项很有临床应用价值和社会、经济效益的重大课题，值得广大基础医学工作者和临床科研人员为之而努力。

第二篇：皮腔血管细胞研究论文

经皮腔内血管成形术(pTA)是治疗冠状动脉及周围动脉狭窄的有效手段,但约有25%～60%的病人术后发生再狭窄。金属内支架的应用降低了pTA术后急性闭塞的发生率,但并未能彻底解决再狭窄的问题代写论文。大量实验研究及临床观察表明再狭窄与血栓形成、内膜增厚和血管重构有关,内皮细胞的损伤、修复及功能改变在其中扮演重要角色。

一、内皮损伤、血栓形成与再狭窄

pTA可造成血管损伤，内皮的剥脱造成内皮下组织的暴露,血小板立即通过Von Willebrand因子（VWF）黏附于内皮下的基质,随后发生聚集并释放α颗粒成分,其释放的血小板衍生生长因子(pDGF)可能与中膜平滑肌细胞的激活和迁移有关［1］。最近的研究表明血小板减少可抑制已激活的平滑肌细胞从中膜向内膜迁移。由内皮损伤引发的凝血过程将形成附壁血栓,血栓的形成不仅可造成血管的急性闭塞,而且为平滑肌细胞内迁提供了框架,血栓的机化可直接引起内膜增厚,而且血栓中的凝血酶本身就是强力的平滑肌细胞致分裂原［2］。实验证明损伤部位内皮的早期重建可抑制血小板附着和血栓形成［3］。

二、内皮细胞和内膜增厚

血管损伤后出现的组织愈合反应可造成不同程度的内膜增厚,其中包括3种主要成分:平滑肌细胞、内皮细胞及细胞外基质。损伤后30分钟就可以检测到平滑肌细胞早期激活的标记——核原癌基因的表达［4］, 活化的平滑肌细胞从收缩表型转向合成表型，从而引发平滑肌细胞的增生迁移和基质的合成。平滑肌细胞增生后向内膜迁移，迁移到内膜的平滑肌细胞部分继续增生。有作者认为平滑肌细胞的增生和分裂是两个不同的机制［5］，一些因素只影响其中一个而不影响另一个，pDGF是平滑肌细胞向内膜迁移强力的趋化因子，成纤维细胞生长因子b（bFGF）则是平滑肌细胞的致分裂原。平滑肌细胞要穿过细胞外基质和弹力层才能到达内膜，其迁移过程与纤维蛋白溶解酶原激活物及金属蛋白酶（MMp）的增加有关。

三、内皮细胞与血管重构

四、内皮细胞损伤、修复及功能异常

五、加快重内皮化、促进内皮细胞功能恢复

蛋白激酶C（pKC）是广泛存在于细胞内的信号传递物质，是内皮细胞增殖所必需的,用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波酯直接活化内皮细胞pKC，发现内皮细胞黏附、伸展及移行能力均增强，而用pKC抑制剂则降低了内皮细胞的再生能力，可见pKC激活剂可作为促进重内皮化的一种方法。

六、金属内支架和血管内皮化

金属内支架的应用大大减低了pTA术后的急性动脉闭塞，其形态稳定性限制了血管的回缩，从而防止了不利的血管重构，但金属内支架本身具致凝性，置入血管后需长期抗凝治疗，而且内支架置入并未彻底解决再狭窄的问题，目前认为pTA术后再狭窄是内膜增生和血管重构双重作用的结果，而内支架置入后再狭窄则主要由内膜增生引起［26］。为阻止内膜增厚，许多学者用带有涤纶被膜的内支紲进行实验研究和临床探索，但一直没有肯定的结果，Schurmann等［27］的实验研究发现，与普通支架相比，被膜式支架引起了更严重的内膜增生和炎症反应；Maynar等［28］的一组股动脉临床资料也表明被膜式支架的通畅率并不理想。支架置入部位的早期内皮化可能预防血栓形成和再狭窄。加速支架内皮化的方法目前主要有两种,一是支架置入后局部灌注药物或导入基因,常用的是VEGF；另一方法是支架置入前在体外先种上内皮细胞［29-31］，可选用转基因内皮细胞进行种植［30，31］，此法最大的障碍是支架置入过程中内皮细胞的丢失［30，31］，但支架金属丝侧面往往有内皮细胞残留，这些细胞可重新增殖并覆盖支架［15,31］。

参考文献

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第三篇：细胞免疫学论文

【摘要】 作为一种具有靶向性的生物大分子，单克隆抗体始终是人们关注的热点之一，被广泛用于治疗肿瘤、病毒感染和抗移植排斥等。但鼠源单克隆抗体的临床应用受限于诱导产生人抗鼠抗体、肿瘤渗入量低、亲和力低和半衰期短等。随着分子生物学技术的发展及其向各学科的渗透，通过基因操作技术对抗体进行改造，可使其适用于多种疾病的治疗。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势，同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服了抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了利器。本文简要介绍上述技术的基本原理、特点和治疗性抗体的研究进展。

【关键词】人--鼠嵌合抗体 生物导弹 人源化抗体 双特异性抗体 【正文】

一、治疗性抗体技术的研究背景 2000年前，人们将自白喉杆菌培养上清液中分离到的可溶性毒素注入马体内，发现得到的抗血清可以治疗白喉，这是第一个用抗体治疗疾病的例子。随着免疫学和分子生物学技术的发展，以及抗体基因结构的阐明，DNA 重组技术开始被用于抗体的改造，人们可以根据需要对以往的鼠抗体进行相应的改造，以消除抗体应用的不利性状或增加新的生物学功能，还可用新的技术重新制备各种形式的重组抗体，标志着基因工程抗体时代的来临。自第一个基因工程抗体———人--鼠嵌合抗体于1984 年诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，包括人源化抗体、单价小分子抗体（Fab、单链抗体、单域抗体等）、多价小分子抗体（双链抗体、三链抗体、微型抗体等）、某些特殊类型的抗体（双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体等）及抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫黏连素等）等。用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中又一突破性进展。在噬菌体抗体库的基础上，近年来又发展了核糖体展示抗体库技术，利用核糖体展示技术筛选抗体的整个过程均在体外进行，不经过大肠杆菌转化步骤，因此可以构建高容量、高质量的抗体库，更易于筛选高亲和力抗体和利用体外进行的方法对抗体性状进行改造，核糖体展示抗体库技术代表了抗体工程的未来发展趋势。

二、各种抗体治疗作用的机理与应用 2.1 抗体的基本组成

抗体的基本单位是由4 条肽链组成的对称结构，包括2 条相同的重链和2 条相同的轻链。重链和轻链分别由可变区和恒定区组成。可变区中的互补决定区与抗体和抗原结合的多样性直接有关，而恒定区的结构与抗体的生物学活性相关。在少数情况下，抗体与抗原结合后可以对机体直接起保护作用，如用抗体中和毒素的毒性，但在多数情况下需要通过效应功能灭活或清除外来抗原。抗体的效应功能有2 类，一类是通过激活补体，产生多种生物学效应，如细胞裂解、免疫黏附及调理作用，促进炎症反应；另一类是通过抗体分子中的Fc 段与细胞表面Fc 受体的相互作用，通过其Fc段分别介导调理作用或抗体依赖性细胞毒作用。此外，治疗性抗体的效应和作用机理直接取决于它所识别的抗原决定簇，例如治疗非何杰金氏B细胞淋巴瘤的抗CD20 抗体能影响细胞膜上离子通道的功能，从而调节细胞的分化、增殖和凋亡。

由于多克隆抗体本身的局限性，所以直到单克隆抗体出现，抗体用于抗肿瘤治疗才真正得以实现。自从1978 年成功制备出第一株抗黑色素瘤单抗以来，相继出现了抗胃肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神经胶质瘤等的单克隆抗体。单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是抗体依赖性细胞介导的细胞效应（ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（CDC）。单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联，成为一种全新的“生物导弹”，可用于导向治疗，已越来越受到重视。另外，用单抗给予T 细胞所必需的重要表面信号分子交联的刺激信号和生长信号，体外诱导肿瘤特异性细胞毒T 淋巴细胞，可用于特异性、被动性的免疫治疗。

自身免疫病多与单或寡克隆抗体的异常增多有关。利用基因工程技术可制备针对这些异常抗体独特型的抗抗体或与自身抗体结合并抑制其作用，或制备能模拟抗原的内影像抗体用于中和体内的自身抗体。目前针对不同的发病机制，治疗方法趋于多样化。许多变态反应与IgE 有关。Fc 片段可与变应原特异性IgE竞争结合嗜碱性粒细胞，封闭变应原介导的组胺释放。此外，还可生产出与患者IgE 竞争结合变应原的Fab 样分子。

2.2 免疫毒素

免疫毒素是一种毒素肽和细胞选择性靶向配体连接的融合蛋白，它能通过靶向结构域的特异结合功能使毒素传递到靶细胞并与之作用进而杀死肿瘤细胞。早期的免疫毒素是由无修饰生物毒素和鼠源抗体连接而成的，连接的方式常为化学偶联法。由于非人源的毒素和鼠源抗体导致的免疫排斥反应，以及低亲和力和无靶向特异性，使免疫毒素无法在临床中得到运用。

新型免疫毒素是将毒素肽和细胞选择性靶向配体都进行改造后，再用工程菌或工程细胞实现高效表达。细胞选择性靶向配体使用了工程抗体、转铁蛋白、表皮生长因子以及IL-2等。抗体的改造主要集中在降低免疫原性、提高亲和力和增强实体肿瘤渗入率等方面，包括改用小分子工程抗体、人源化抗体、人源抗体和突变的高亲和力抗体等。

2.3 抗体－细胞因子融合蛋白

细胞因子能激活某些免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、T细胞和B细胞等。应用细胞因子治疗癌症能够引起免疫应答，但这种免疫反应是非特异的，常产生全身毒性。有人尝试使用抗体工程技术将细胞因子与抗体连接形成融合蛋白，通过靶向作用，细胞因子在肿瘤组织的靶细胞上聚集，在局部杀伤肿瘤细胞，而非特异性毒性将减少或消失。常用的细胞因子包括IL-

2、IL-12和GM-CSF 等，融合的部位可以是全长型抗体或ScFv的N端或C端。抗体－细胞因子融合蛋白作为一种新型的肿瘤免疫治疗药物，其抗体功能域可引导细胞因子浓集在肿瘤组织的微环境中，之后抗体部分直接抑制肿瘤细胞活性，并诱导二次免疫应答，多重作用的相加使抗体－细胞因子融合蛋白对肿瘤的抑制作用明显强于单独使用抗体或细胞因子。由于全长型抗体Fc上存在两个效应细胞结合位点，功能更为强大，其中一个位点与细胞因子结合，激活效应细胞，另一个与FcγR结合，引发抗体依赖细胞的细胞毒作用(ADCC)。

三、治疗性抗体的制备技术与研究意义

由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体称为单克隆抗体，可视为第二代抗体。由于其具有特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少等优点，已经在基础研究、临床诊断及治疗、免疫预防等领域发挥了重要作用。在治疗上，单克隆抗体主要用于抗肿瘤、抗器官移植排斥反应、抗感染、解毒等。近年来将单抗与核素、各种毒素（如白喉外毒素或蓖麻毒素）或药物通过化学偶联或基因重组制备成导向药物，用于肿瘤的治疗成为研究的重点。制备单克隆抗体的常规方法是免疫小鼠，杂交瘤可在实验动物中产生无限量单克隆抗体。对大多数杂交瘤来说，现已可用体外方法生产单克隆抗体而无需应用动物。体外单克隆抗体生产系统已有多种，但大规模生产治疗性单克隆抗体需用中空纤维系统，其成功与否取决于杂交瘤的固有特性，如细胞生长和单克隆抗体生产能力等。因此，大量生产以供临床研究应用还有困难，但有几种方法可以解决这些问题，如嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人单克隆抗体的产生。其中，人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势，同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服了抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。

人源化抗体是从鼠源单抗到全人抗体的过渡形式，在鼠单抗的基础上，用人抗体恒定区置换鼠抗体的相应部位，形成人鼠嵌合抗体。利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达人鼠嵌合抗体，其人源化程度可达到70%左右。嵌合抗体完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和性，降低了免疫原性。美国食品药品管理局（FDA）批准的抗体药物中有4个是嵌合抗体。但由于其整个可变区都是异源的，所以嵌合抗体的异源性还很明显，解决HAMA的效果并不理想。

由于天然抗体主要是通过调理作用、ADCC 或依赖补体的细胞毒效应起到杀伤靶细胞的作用，因此天然抗体的细胞毒效应有限。下列几种途径可以增加抗体对靶细胞的杀伤，如免疫结合物、抗体细胞因子融合蛋白、双特异性抗体、细胞内抗体等。

双特异性抗体亦称双功能抗体，是同一抗体的3 个抗原结合部位分别针对3 个不同的抗原，在结构上是双价的，而与抗原结合的功能是单价的。双特异性抗体可以用化学交联、细胞融合和基因工程等方法获得。由于它可以同时与3 种抗原发生反应，并使之交联，因而可介导标记物与靶抗原的结合，或使某种效应分子定位于靶细胞；此外，又由于它与抗原结合的单价性，不易引起靶抗原的调变，从而可提高抗体的某些生物学效应。双特异性抗体重链的异质性使其FC 片段与FC受体结合的能力明显减弱，减少了该抗体在体内的非特异性分布。双特异性抗体的这些特性使它在诊断和治疗上有广泛的应用前景。目前，作为治疗肿瘤用的双功能抗体常采用抗肿瘤相关抗原（TAA）及CD3 或抗TAA 及CD16，这类双特异性抗体在

荷瘤动物模型中无论是抑瘤试验还是杀伤试验均获得了良好结果。无论采用何种免疫活性细胞的效应分子，其杀伤均无MHC限制，这为临床应用提供了许多方便，目前已有一些双功能抗体正在进行临床试验。

一般的抗体在细胞内合成后分泌到胞外，如果在抗体的N端或C端加入引导序列，就能使抗体表达定位在亚细胞部位，如胞浆、线粒体、内质网或细胞核部位。这种在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体称为细胞内抗体或内抗体。细胞内抗体可以提供一种独有的研究分子功能的新方法，它可以在细胞内抑制病毒复制、抑制生长因子受体或癌蛋白表达，因此有用于基因治疗的前景，研究较多的是用细胞内抗体抑制I型人类免疫缺损病毒I型（HIV-I）和抗肿瘤。

双特异抗体是指具有两种抗原结合特性的抗体，可同时结合两个不同的抗原或抗原决定簇。与mAb相比，双特异抗体具有以下优点：(1)较低浓度即可杀伤或溶解肿瘤细胞；(2)对低表达或不表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞有杀伤或抑制作用；(3)激活结合的细胞毒性T淋巴细胞，发挥多种生物学效应，协助杀伤肿瘤细胞。早期研制双特异抗体的方法是采用细胞工程，即将两株各自分泌不同特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞再融合得到四源杂交瘤，或将一株杂交瘤细胞与免疫的脾细胞融合得到三源杂交瘤，这两种杂交瘤被称为二次杂交瘤)。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应(HAMA)，因此不适用于临床。20世纪90年代起，基因工程和蛋白质工程在抗体生产和改造中得到了成功应用，由此产生了抗体工程。应用抗体工程生产BsAb，具有分子量小、方法稳定、可大量生产、成本显著降低和操作简便等优点。

四、治疗性抗体的研究方向与存在问题

抗体应用于人类疾病的治疗已有很长的历史，但其发展历程是曲折的，自单克隆抗体;杂交瘤技术宣告诞生以来，历经多年反复。目前，FDA 已经批准21 个治疗性单抗上市。近年来，科学界和医药产业界都对治疗性抗体的研究表现出越来越多的关注。人源化抗体和人抗体的出现为治疗性抗体的广泛应用带来了新的希望。但人抗体是否可以解决鼠抗体临床应用中出现的所有问题，还有待大量临床试验的检验。影响抗体免疫原性的因素很多，如抗原呈递方式、次级信号系统以及患者的个体差异性等，而抗体的人源化只能解决一个方面的问题。同样，抗体衍生物也会面临诸如免疫原性、毒副作用等自身固有的问题，所以可行的发展方向是在完善人抗体技术的同时，推进治疗性小分子抗体衍生物的研究。根据临床实际设计灵活的治疗方案，使人源化抗体和抗体衍生物互为补充，达到最佳治疗效果。从已上市的抗体药物不难看出，未来的治疗性抗体将朝着人源化和小型化发展，两条途径的结合将最大程度地克服鼠单抗的缺陷使抗体药物得到更为深入和广泛的应用。

五、治疗性抗体的发展前景

单克隆抗体技术的问世,使研究和生产治疗性单抗药物成为现实。随着基因工程技术的发展,新型的重组抗体技术也随之而生。

人们可以利用DNA重组技术对鼠源抗体进行人源化改造、构建合成或半合成抗体库及噬菌体抗体库,从中筛选获得人源抗体,甚至利用转基因小鼠直接获得人源抗体。抗体药物发展的趋势也从鼠源、人-鼠嵌合、人源化到全人源。近年获得批准的抗体药物以全人源为主。1996年至2008年间进入临床研究的人源化单克隆抗体中45%用于治疗肿瘤,28%个用于治疗免疫紊乱。抗体药物的发展进入研发、回报的良性循环,成了国际制药业争夺的焦点。文章就治疗性抗体发展的历史、现状、市场及未来展望作了简要综述。利用抗体工程研制更有效的治疗性抗体的前景非常光明尽管还存在很多问题。实践已经证明，许多新型工程抗体可以在原核或真核细胞中实现高效表达，它们具有较长的半衰期和生物学效应，大多为ScFv、Fab或它们的多聚体，能够有效进入肿瘤细胞，具有比较理想的治疗效果。新型抗体工程技术的不断出现，将为抗体改造提供了强有力的技术平台。相信不久的将来，治疗性抗体会在人类疾病的治疗中扮演重要的角色。

【参考文献】

[1] JM沃克,R.拉普勒, 编;谭天伟, 黄留云, 苏国富, 等译.分子生物学与生物技术[M] 北京: 化学工业出版社,2003.1 [2] 吴乃虎.基因工程原理（上册）[M] 北京I 科学出版社,1998.3 [3] 卢圣栋，现代分子生物学实验技术[M] 北京I 中国协和医科大学出版社,1999.9

第四篇：细胞克隆培养论文

细胞克隆培养论文

摘要：随着生命科学时代的带来，基因研究已经取得了巨大的进展，克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分，引起了社会各界的广泛关注。克隆包含动物、植物等方面，动物克隆在畜牧业生产、医药生产、疾病治疗、生物学基础理论研究、以及动物转基因工程等诸多领域蕴藏着巨大的应用潜力。通过科学研究者的努力，哺乳动物的克隆技术在农业和生物制药等方面取得了进步，展示了克隆技术的应用价值和发展前景。

关键词：动物克隆技术

1、克隆技术含义: “克隆”，即无性细胞繁殖系，又称为一个细胞株或细胞系，细胞株与细胞系没有本质的区别。也可以理解为复制，拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。无性繁殖的手段有很多种，包括孤雌生殖，胚胎切割和细胞核移植等等。而产生克隆动物的方法则称为动物克隆技术。

在《中国大百科全书·生物学者》中，对“克隆”的解释是：克隆又称无性繁殖细胞系和无性繁殖系，是一个细胞或个体以无性繁殖重复分裂或繁殖所产生的一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传结构。克隆技术同整个生物界的进程一样，是由低级到高级，有简单的复杂不断发展和进步的。它由单个细胞获得2个以上细胞、生物体，发展到生物体内的生物大分子的自我复制，在DNA复制酶的作用下，复制生成俩个一模一样的DNA分子。

2、动物克隆的进程：

1938年，国外就有人提出提出成年动物的细胞核入卵子法克隆哺乳动物的设想。

1978年，我国著名科学家童第周成功地进行看了克隆黑斑蛙的实验，他将黑斑蛙的红细胞核移入到事先去除了核的黑斑蛙卵中，这种换核卵发育成了黑斑蛙的蝌蚪。

1996年，用成年哺乳动物体细胞克隆出的哺乳动物个体克隆羊多莉出世，开创了体细胞繁殖哺乳动物的成功先例。

2003年，克隆马出世，是世界上首例哺乳动物生下自己的克隆体。

2003年8月，中国科学家在世界上首次采用克隆技术培育出含人免DNA混合物胚胎。

2003年9月，沃斯宣布他已克隆出了含人，牛DNA的混合胚胎。

2008年1月7日，2头具有绿色荧光遗传特征的小猪在哈尔滨诞生。

3、动物克隆技术的应用：

动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学，遗产学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。

动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5%的动物携带外源基因外源基因整合动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的几率低难以遗传给下一代。Schnieke等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子IX的转基因羊比原核显微注射法要有效得多。其中，两者最显著的差异是体细胞克隆的中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出世后才能得知，而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性的制备雌性的转基因动物，有利于在母乳中表达外源基因。

克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培养出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏病、神经损伤等多种疾病。用这种方法培养出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善。目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。

动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短了育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。

4、动物克隆技术的不足及未来发展方向

动物克隆技术然取得了一定的进展，在生物医药领域也得到了初步的应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels等报道克隆羊的端粒较同年羊短。Renard等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。

导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支持是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累不少数据，但一些很基本的问题任亟需解决。

动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要做连续核移植等。

综上所述，动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大的进步。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，人们要提高动物克隆的成功率还需不懈的努力。另外克隆动物与正常胚胎的发育有何异同，也值得深入研究。这些问题的解决将有助于人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。

5、结束语

要紧跟世界科技发展的潮流，充分利用克隆技术为人类带来巨大的利益，又要严格控制可能造成混乱的克隆人出现。

参考文献：

《生命伦理学》、《生命的化学》 学院：呼和浩特职业学院

专业：生物技术及应用 年级：12级

姓名：郝媛 学号：12305060023

第五篇：研究发现NK细胞新特征

研究发现NK细胞新特征

加州大学微生物免疫系与癌症研究中心的研究人员发现自然杀伤细胞的一种新的特征，这一成果公布在1月11日Nature在线版上。

自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。

在获得性免疫应答机制中，感染发生后未致敏的T细胞会开始复制增殖，免疫系统会生成具有长期记忆性的细胞，在经历第二次相同病毒的感染时候，免疫细胞就能迅速的调动起来，发挥免疫功能。

在现在的理论中，自然杀伤细胞被归为天然免疫细胞，它与细胞毒性T细胞具有诸多相似的特点。研究者以小鼠为模型，让其感染巨细胞病毒，与细胞毒性T细胞相似的特性出现了，脾脏中表达病毒特异性的Ly49H受体的自然杀伤细胞数量增高100倍，在肝脏中高达1000倍。经历收缩期后，Ly49H阳性的自然杀伤细胞定居在淋巴组织或是非淋巴器官中长达数月之久。这些能自我更新的有记忆性的自然杀伤细胞再次遭遇相同的病原后能迅速的反应，脱颗粒，释放细胞因子发挥免疫功能。如果将这些有记忆性的自然杀伤细胞转移到年幼的动物体内，自然杀伤细胞能在年幼动物首次遭遇相应病原的时候发挥杀伤作用，也就是说这些记忆性的自然杀伤细胞能拿来即用。

这些研究结果证明，自然杀伤细胞其实不仅是天然免疫系统中的重要作用成分，它同样具有获得性免疫细胞的一些特征（有记忆性）。

研究者认为，在免疫系统中，NK细胞反应的速度比T细胞或B细胞要快，因此，NK细胞的这种记忆性能可能有助于设计更有效，反应更迅速的疫苗。日期：2009年1月16日-来自[免疫系统]栏目