血清γ-球蛋白的分离纯化
一、目的与要求
1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。
2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。
3、学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案，技术路线，质量监控和保证措施。
二、实验原理
血清蛋白有300多种，可粗略的分为清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡萄糖凝胶G-25脱去球蛋白中的盐分最后用DEAE纤维素阴离子交换柱便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白,其反应机理如下：
C2H5
H
纤维素-O-(CH2)2-N(C2H5)2
纤维素-O-(CH2)2-N+……H2PO4
H++H2PO4
DEAE纤维素离子交换柱
COOH
C2H5
α、β、γ球蛋白
NH2
COO
H
经过盐析和脱盐的球蛋白液
纤维素-O-(CH2)2-N+…α和β
G
PH6.3
NH2
交换到柱上的α和β-球蛋白
H2PO4
COOH
γ-球蛋白
NH3+
被DEAE柱分离纯化的γ-球蛋白
被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。
三、仪器和材料
仪器：离心机，1.5×40cm层析柱，层析架或滴定台，核酸-蛋白检测仪，部分收集器，紫外分光光度计，色谱柱，电泳槽，电泳仪。
材料：马血清，Sephadex
G-25×200g，DEAE-32×200g。
四、实验步骤
（一）分离纯化步骤
1、取3mL,4℃预冷血清，加入3mL
4℃预冷的饱和硫酸铵。边滴边摇。
2、静置大于10min后，3500rpm离心15min，弃去上清液，将沉淀溶于少量的生理盐水。从中取0.5mL用于测定蛋白质含量。
3、将剩余的样品上Sephadex
G-25柱，用0.02
mol/L
pH6.5的NH4AC缓冲液洗脱，每管收集3
mL，用于绘制洗脱曲线，选择颜色最深（即浓度最高管）的取0.5mL留待电泳用。
4、将剩余的蛋白质溶液上已平衡好的DEAE-32柱（装一半的柱子），用0.02
mol/L
pH6.5
NH4AC缓冲液洗脱，用干净的试管收集，并用20%磺基水杨酸检测是否有蛋白流出，并绘制洗脱曲线，收集的蛋白质溶液即为γ球蛋白（留少量电泳用，0.5ml测[Pr]）。
5、柱子再生。先用0.3mol/L高盐缓冲液，再用0.02mol/L缓冲液平衡。
（二）电泳步骤
1、安装垂直板电泳槽，按表配制分离胶溶液。用滴管吸取分离胶溶液，沿管壁注入玻璃板至距上端3cm处(插梳为准)
2、立即用滴管沿凝胶管壁加人蒸馏水约0.5cm高度，加水时应注意减少胶液表面的震动与扩散。加蒸馏水的目的，隔离空气中的氧和消除凝胶柱表面的弯月面，使凝胶表面平坦（加水时切勿呈滴状滴入胶液）。
3、静置30分钟，在凝胶表面与水之间出现清晰的界面，表示聚合已完成（注：刚加水时看出有界面，后逐渐消失，等再看出清晰界面时，表明凝胶已聚合）。用滴管吸去凝胶管的水层，并用滤纸条（无毛边）轻轻吸去凝胶表面残留的水分，注意不要损伤已聚合的凝胶表面。
4、按表制备浓缩胶，沿管壁加入浓缩胶，插上梳子，静置15分钟，待凝胶聚合后，待用。
5、加入10倍稀释的甘氨酸一Tris缓冲溶液于电泳槽中，用注射针排除样品孔中的气泡，样品与样品处理液1：1混合后，用微量注射器上样。
6、将上电泳槽的电极接至电泳仪的负极，下电泳槽的电极接至电泳仪的正极，接通电源，刚开始5分钟内6-7
mA／板，待示踪染料迁移到下口约0.5cm处时，就可停止电泳，切断电源（电泳时间约为
2／小时左右）。
7、剥胶
取下玻璃板，用带有10cm长的注射针头，内盛蒸馏水作润滑剂。将针头插人胶与玻璃板之间，边注水边慢慢推针前进，靠水流压力和润滑作用使玻璃板与凝胶分开。
8、固定，染色与脱色
固定染色液染色过夜，用脱色液脱色.9、染色，加入染色液，染色过夜。
10、拍照，记录结果。
五、实验结果与分析
**
血清样由于蛋白质种类较多，区带不清。脱盐后，样品中剩余蛋白质为α、β、γ-球蛋白，从结果中可以看到几条较为明显的区带。γ-球蛋白的电泳结果显示其分离的较为纯净。
六、注意事项
1、上样前要将使用过的柱子重生。
2、上样时要注意3个相切：缓冲液与柱床表面相切；样品与柱床表面相切；洗样时缓
冲液与柱床表面相切。
3、用琼脂糖封胶时一定要封延时，防止漏胶。
4、配胶时要按照顺序加样，配完后要立刻混匀。
5、剥胶时要在水冲洗的情况下进行。
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