菠萝蛋白酶纯化方法总结

第一篇：菠萝蛋白酶纯化方法总结

菠萝蛋白酶的提取方法：

（1）沉淀法

沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝 蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。（2）离子交换色谱法

离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能 获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。（3）固定化金属离子亲和色谱法

固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化 15.4 倍，回收率达 94.6%，而且不会造成任何变性。固定化金属亲和层析技术正逐渐被采用，Pawan Gupta等（2007）将菠萝蛋白酶成功固定在亚氨基二乙酸载体琼脂糖凝胶 6B 型中。Cu2+ 与亚氨基二乙酸（IDA）的络合被用来作为螯合配体将单个组氨酸结合到菠萝酶上。固定化高亲和性载体的制备是试图将可溶性交联菠萝蛋白酶制剂固定到铜-亚氨基二乙酸-琼脂糖凝胶上。（4）超滤法

超滤法是在离心力或较高的压力作用下，选择适当孔径的超滤膜，使水和其他小分子物质通过，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超滤法提取酶蛋白，具有无相变、生物活性不易丧失、得率较高，不会改变溶液糖酸比等特点。用超滤法浓缩有机溶剂提取的菠萝蛋白酶产品质量好，对环境污染少，可以实现清洁生产，酶粉得率比高岭土工艺高出47%。超滤法分离提取的粗酶比活力较单宁沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超滤法浓缩提取菠萝蛋白酶需要对操作条件进行研究，尽最大可能提高超滤效果，促进工业化生产。杨辉等研究认为压力差在300kPa，透过液通量为50L/m2·h时即能保持较大的流量，又不会对酶活造成损失。在对菠萝汁进行超滤的过程中，料液透过通量随压力差增加和循环速度的增大逐渐上升并趋于稳定。用超滤法浓缩提取生物大分子时因不同膜材料的透过通量和截留率不同，而导致不同的分离特性。用聚丙烯腈膜（PAN）膜浓缩工艺较适合对菠萝蛋白酶进行超滤浓缩，可使果菠萝酶回收率达93.3%，截留率达97.8%。用PSA膜超滤菠萝皮汁制得的菠萝蛋白酶酶活总回收率为65.7%。李兴，林哲甫用二氧化钛吸附菠萝果汁中的菠萝蛋白酶再用截留值2万和5万的超滤膜超滤浓缩，能获得较高比活的果酶。得到的果酶活力回收率为54%，比活力为911单位/mg。目前将纳米氧化锌吸附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥法结合的综合性技术已达到国际先进水平，创新性较好。(5)双水相萃取法 利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离、纯化并浓缩蛋白质。该方法的优点是比较温和可在室温下进行，一般不造成酶的变性失活，还可提高其稳定性。与其它分离纯化方法相比，利用双水相萃取法有很多优点，如易于放大、成本低、可以连续操作、并且是环境友好的。这就使其成为分离纯化生物分子的诱人的替代方法，在国外进行了大量的应用。B.Ravindra Babu等（2008）首次使用该法从菠萝中分离纯化菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，结果使菠萝蛋白酶的纯度提高4.0倍，得到约228%的活性回收率。双水相萃取法提供了一种有效的、经济上可行的分离纯化菠萝蛋白酶的方法。在双水相体系中用PEO–PPO–PEO 嵌段共聚物分离纯化菠萝蛋白酶，其活性回收范围为7.5%~79.5%，纯化倍数0.1~1.25倍。在双水相体系中，各种参数如聚合物的分子质量、聚合物和形成相的盐浓度和分离体系的pH对分离纯化的结果影响较大。(6)反胶团萃取法

生物技术的发展为重要生物分子的生产开辟了一条新的途径，在选择性提取的生物分子中，逆胶束有机相很有潜力发展为液液萃取的生物分离技术。反胶团是表面活性剂，使水滴稳定分散在有机溶剂中，这种表面活性剂是双亲性的有机复合物，既亲脂也亲水。反胶团萃取法有如下一些优点：不会造成原有功能或活性的损失、界面张力较低、易于规模化、有连续运作的潜力。H.Umesh Hebbar等（2008）用溴化十六烷基三甲铵/异辛烷/正己醇/正丁醇和磺酸钠/异辛烷的反胶束体系从菠萝废料的水提物中提取和初步纯化菠萝蛋白酶。用反向阳离子表面活性剂（CTAB）胶束体系能使菠萝蛋白酶获得一个较好的活性回收率可达106%，纯化 5.2 倍，而采用阴离子表面活性剂（AOT）则没有获得较好的产率。(7)新型纳米吸附剂法

随着一种以氧化铁纳米粒子为核心，聚丙烯酸为离子交换组的新型磁性纳米吸附剂的开发，其在生物分离和生物医学领域已经被广泛应用。它具有高的离子交换容量和快速的吸附/解吸率。这种纳米粒子用于菠萝蛋白酶的分离是很有效的。近年来，纳米纤维膜由于其非常大的表面积和体积比、优越的机械性能引起人们的广泛关注，Haitao Zhang 等（2010）通过一步静电纺丝技术以二甲基乙酰胺为溶剂制备出超细聚丙烯腈（PAN）纳米纤维膜，用化学的方法连接到壳聚糖的表面，共价连接到染料配体辛巴蓝上制成染料固定化亲和膜，而且可以重复使用，膜的再生显示出良好的机械性和化学稳定性。这种新开发的染料亲和膜首次用于菠萝蛋白酶的吸附，批次试验揭示出它具有一个很高的吸附菠萝蛋白酶的能力，可以实现高效率的大规模的吸附，这种低非特异性结合的亲和膜对于纯化高纯度的菠萝蛋白酶是很有效的。

供试酶液的制备（纳米二氧化钛吸附法分离纯化效果明显好于高岭土吸附法和超滤浓缩有机溶剂提取法，所得酶的比活力分别是后两者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠萝茎在 4℃冷室中预冷 12h，组织捣碎机捣碎，加 1 倍 0.05mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液（含 5 mmol/L 的 EDTA）浸提，缓慢搅拌，浸提 10min，4 层纱布过滤，离（4000rpm，15min），上清液即为供试酶液，蛋白质含量为 1.62 mg/mL。（菠萝果、皮中酶供试液制备方法同上）操作要点：选取干净的菠萝茎，除杂，清水中漂洗三次，沥干，放入 4℃冷室中 预冷备用。预冷后茎用高速组织捣碎机打浆，加 0.05 mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液浸提 10min，4 层纱布过滤，滤液在 4000 rpm 条件下，离心 15min，取上清液，放入 4℃冷室中备用。1.纳米 TiO2吸附法

（纳米 TiO2的用量直接影响吸附效果。用量不足，对酶的吸附不完全；用量过多，增加处理和洗脱难度，浪费资源）（超滤过程中会发生浓差极化现象，导致菠萝蛋白酶的损失。在压力较低时，随压力增大，通量呈直线上升，但随压力增大，膜逐渐被压实，浓差极化（膜分离过程中的一种现象，会降低透水率，是一个可逆过程。是指在超滤过程中，浓差极化由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。）现象增加，膜通量增幅变缓。）

供试酶液中加纳米 TiO2搅拌均匀→离心（4000 rpm，15min）→取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱→搅拌（30min）→离心（4000 rpm，15min）→取上清液→超滤浓缩→冷冻干燥→酶制品。操作要点： ① 吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米 TiO2搅拌均匀，吸20~30min，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。② 超滤：洗脱液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。③ 冷冻干燥：据共晶点确定干燥参数。④ 纳米 TiO2吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用 0.1mol/LNaOH 溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复 90%以上。通过正交试验得影响实验效果的因素主次为：纳米 TiO2用量＞吸附液 pH＞吸附时间＞吸附温度 高岭土吸附法（高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率及纯化倍数都较低，投资较大。）

供试酶液→加 4%高岭土，搅 20min，10℃吸附 30~60min→静置→吸出上清→沉淀用 16%NaOH 调 pH6.5~7.0→加 7%~9%NaCl，搅 30min→压滤，滤液用 1:3（体积比）盐酸调 pH5.0→搅拌→加滤液量 25%（NH4）2SO4→溶解→4℃静置过夜→离心→沉淀→干燥（王平诸等，2002）。操作要点：

①吸附：将供试酶液加入吸附槽中搅拌，同时加入 4%的高岭土，搅拌约 20min，在 10℃吸附 30~60min，用虹吸排掉上清液，收集高岭土吸附物。

②洗脱：用 16%的 NaOH 溶液调节吸附物的 pH 至 7.0 左右，再加入吸附质量为 7%~9%的工业食盐，搅拌 30min 进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。

③盐析：将压滤液收集在盐析槽中，用 1:3 的盐酸调节 pH 至 5.0 左右，搅拌加入压滤液质量 25%的硫酸铵，待完全溶解后，4℃过夜；然后离心，收集沉淀盐析物，干燥即为粗酶。

3.超滤浓缩有机溶剂沉淀提取

供试酶液→超滤浓缩→有机溶剂沉淀→干燥→酶制品。

操作要点：①超滤：供试酶液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量 的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及 其它小分子杂质。

②有机溶剂沉淀：将浓缩液降温至 0~4℃，边搅拌边加入-20℃的 95% 乙醇，直至混合液中乙醇浓度为 50%，静置，使酶沉淀，移出上清液，即 为湿酶。

③干燥：将湿酶在 0℃下减压干燥即得菠萝蛋白酶制品。2.4.4.5 离子交换层析条件的确定（D.R.马歇克等，1999.）

pH：配制pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的0.01 mol/L Tris-磷酸盐缓冲液（含0.01 mol/LNaCl及1 mmol/LEDTA）。量取离子交换树脂 1mL，用蒸馏水充分冲洗，定量到 10mL 悬浆。取 7 个 2mL 离心管，每管加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用上述缓冲液平衡。去掉多余缓冲液。按纳米二氧化钛吸附法最佳条件制得供试酶样品，配成一定浓度酶液。取 1mL 样品与相应缓冲液等量加入离子树脂中，混匀，离心取上清液，测酶活性。离子强度：取 4 支 2mL 离心管各加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L NaCl 的初始 pH6.0 的 0.01 mol/LTris 缓冲液充分润洗 1~4 号试管，使离子树脂与相应缓冲液平衡，去掉多余缓冲液，向各管中加入 1mL 样品及等量缓冲液。混匀，静置 10min，离心取上清，测酶活性。吸附容量：取4支2mL离心管加入同初始缓冲液平衡后的离子交换树脂0.2mL。用离心管处理样品，于1、2、3、4号管中各加入1mL、2mL、3mL、4mL的样品。混匀，离心取上清液，测酶活性。离子交换层析：（1）PH的确定pH6.0的0.01mol/LTris-磷酸盐缓冲液（2）洗脱液的浓度采用 1.5mol/L 的 NaCl 溶液作为梯度洗脱的上限浓度。（3）吸附容量的测定为保证柱层析效率和菠萝蛋白酶的回收率拟选择 1mL 为最佳吸附容量。

离子交换法的详细步骤.1 离子交换介质处理与转型

用初始缓冲液替换倾倒澄清掉 20%乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占 75%，缓冲液占 25%），作真空脱气处理备用。2 装柱与平衡

将所有材料和试剂平衡至室温，配制初始缓冲液为 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液（含 0.01%的 EDTA）和洗脱液为 1M NaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）。根据试验中柱子（1.1cm×30.0cm）的类型取所需量的凝胶，打开层析柱顶部，关闭出口，用 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡。将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡的产生，同时用缓冲液填充柱子的剩余部分。打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液。打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定的流速 通过，稳定柱子。用 3~4 倍柱体积的缓冲液平衡柱子，直至流出的平衡液和初始平衡液 pH 相等时表示已达到平衡。同时连接紫外检测仪，等流出液在检测仪上绘出的基线稳定后平直即可。3 加样

略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无 SO42-的酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将样品溶液加到凝胶表面，最好避免破坏凝胶，以保持凝胶表面平坦。打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。.4 洗脱

加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入 1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）以 1mL/min 流速，开始洗脱，同时连接紫外检测仪，调整横流泵为 1mL/min，同时以自动部分收集器收集，每5min 收集一管，分别测定每管的蛋白浓度及酶活。

二．蛋白含量测定方法

采用考马斯亮兰 G-250 法（George R，1973）测定蛋白质含量：①标准蛋白溶液的配制：称取 10mg 牛血清白蛋白溶于去离子水并定容至 100mL，配成 0.1mg/mL 的标准蛋白溶液。②考马斯亮兰 G-250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮兰 G-250，溶于50mL 95%的乙醇后，再加入 120mL 85%的磷酸，用水稀释至 1L，过滤后贮于棕色瓶中。③标准曲线的绘制：取 7 支试管，编号后如表 1，混匀，放置 2min后，在 595nm 波长下比色测定（应在 1h 内完成），以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标。根据表 1 不同蛋白质浓度样品液分别测定吸光度，以蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线：：y＝0.0028x+0.0743；R2=0.9996；式中：y 为吸光度，x 为蛋白质浓度 μg/mL。

酶的活力测定：精密移取PH7.0的干酪酸溶液5ml与15ml的具塞试管中，置于37摄氏度恒温水浴中保温十分钟，准确取一定量的的供试菠萝蛋白酶液，用酶液激活液（ph4.5L-cys胱氨酸和EDTA-2Na配置）稀释至1ml，加入上述底物溶液中，摇匀，立即置入37摄氏度的恒温水浴中，准确反应10min，加入5ml三氯乙酸溶液中，终止反应，用力混匀，在37摄氏度恒温水浴中静置保温30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷却至室温于3500rpm离心10min，取上清液于275nm波长下测为其吸光度A。另取等体积的供试酶液，按上述步骤操作，对换酶液和三氯乙酸的加入顺序，测得吸光度A0。

菠萝蛋白酶活性的单位定义：一个酶活力单位（U）定义为特定条件下（PH7.0 ,37加减1摄氏度）酶作用于干酪素底物1min产生1ug酪氨酸所需酶量。

第二篇：菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响

菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响 目的要求

1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。

2、学习酶活力测定的方法。

3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。

5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。

二、实验原理

1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。

2、以陶瓷层析结合超滤法纯化菠萝蛋白酶，吸附材料化学性质好，可用于柱层析。

3、温度恒定时,菠萝中菠萝蛋白的热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t,失活半寿期是常数，可以用作衡公菠萝蛋白酶热稳定性的指标。

本实验应用动力学方法，以菠萝蛋白酶的热失活半衰期为热稳定性的指标，定量研究了梭酸盐和Ca2+,Zn2+士对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响，以期找到一种高效、可行的增强菠萝蛋白酶热稳定性的方法。

4、修饰的菠萝蛋白酶对温度和pH值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶,但它的稳定性较差,影响了它的应用。此外,菠萝蛋白酶易受有关因素的影响而失活。聚乙二醇(PEG)为一种无毒且具亲水性的免疫惰性大分子，本实验采用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,提高了其对环境的稳定性,使其半衰期延长。实验材料 试剂和材料

1、新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白

2、柠檬酸钠、单宁、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液、激活剂

3、Brolain试剂、牛血清白蛋白、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液、PEG活性酯。

（二）实验仪器

1、榨汁机；

2、离心机；

3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；

4、恒温水浴锅（37℃）；

5、试管、试管架；

6、烧杯、容量瓶；

7、移液管；

四、试验方法

（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤：

将菠萝切碎→加柠檬酸钠，榨汁→菠萝汁→纱布过滤→澄清液→2000r/min，7min离心→上清液→加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液→4200r/min,5min离心→酶复合物→加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心→酶复合物沉淀→冻存备用 菠萝蛋白酶活力的测定

1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；

2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；

3、另取5支试管，分别对应标号1、2、3、4、5，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；

4、将10支试管置于37℃水浴；

5、然后按下表操作

试管号 1 标准酪蛋白

（0.1mg/mL）

0

0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 待测酶蛋白

（mL）0

0

0

0

0

0

0

1.0 磷酸缓冲液

（mL）1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

0 考马斯亮蓝

（mL）4 通过测定不同试管中菠萝蛋白酶的吸光度A的值，进而确定酶活力的大小。

（三）聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰 1.1修饰酶的制备

60gPEG6000溶于400mL干燥吡啶,加入1.01g琥珀酸酐后60℃保温2h,然后在60℃减压蒸馏除去溶剂。加入苯直至残余物溶解,再加100mL冷己烷,4℃振荡2h过滤,残渣溶于蒸馏水后透析。PEG活性酯和菠萝蛋白酶按摩尔比50：1投料,加入到0.1molPL柠檬酸盐缓冲液中,4℃反应4h。产物在pH4.6的柠檬酸缓冲液中透析,冻干后得到白色的PEG-菠萝蛋白酶(修饰酶)。1.2 TNBS法测定修饰率

取1mL蛋白酶溶液(1mgPmL),加入1mL4 %的碳酸氢钠溶液,1mL10%的十二烷基磺酸钠溶液,20min 后加入1mL0.1%的TNBS 溶液,40℃保温2h ,用0.5mL 1mol/L的盐酸终止反应。325nm测光吸收值。同样浓度蛋白酶溶液在修饰后与修饰前的光吸收值之比即为残留氨基率。修饰率=1-残留氨基率

（四）某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性 1.1 菠萝蛋白酶热稳定性实验方法

新鲜菠萝榨汁100mL加人到55℃预保温的一定浓度梭酸盐溶液中，不同保温时间测定菠萝蛋白酶活力，按热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t方法求出菠萝蛋白酶的半衰期。1.2 有机羧酸盐对菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

pH7.0时草酸钠对菠萝蛋白酶有明显稳定作用，100 mmol/l草酸钠使tl/2延长6倍，丁二酸、酒石酸甲钠也有一定的保护作用。醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠都有一定程度的保护作用，且浓度变化对保护作用的影响不大。结果与讨论

1、修饰率的测定

测定结果按下式进行计算:修饰率= 1修饰后的光吸收值P修饰前的光吸收值= 113.2、章佩芬,郭勇,罗焕敏.菠萝蛋白酶的研究与应用进展[J ].华西药学 杂志,2002 ,17(2):1286.（五）结果讨论

从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：

1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；

2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；

3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；

4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；

5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。

6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响

第三篇：直链淀粉的分离纯化--自己总结

橡实直链淀粉与支链淀粉的分离纯化

谢 涛,陈建华,谢碧霞

(中南林学院资源与环境学院,中国湖南株洲412006)

1.2.3 橡实直链淀粉与支链淀粉的分离纯化

取10 g橡实淀粉,先以少量的无水乙醇润湿,再加200 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液,在热水浴中加热分散至整个淀粉糊完全透明,冷至室温,离心(6 000 r/min,20 min)除去不溶性杂质.淀粉糊以2 mol/L的HCl调至中性,再加90 mL正丁醇和异戊醇混合溶液,混合液中V(正丁醇)∶V(异戊醇)=3∶1,在沸水浴中加热搅拌至整个体系透明,冷却至室温,置于7℃冰箱中过夜,离心(6 000 r/min,20 min),沉淀物和上清液分别处理如下.将沉淀物加入120 mL饱和的正丁醇水溶液,在沸水浴中加热搅拌至溶液分散透明,冷至室温,在7℃冰箱中过夜,离心(6 000 r/min,20 min).按上述步骤所得的沉淀物重复处理5~10次(即重结晶5~10次).然后将沉淀物浸于无水乙醇中24 h,再反复以无水乙醇洗涤沉淀后,置于室温下真空干燥,此时得到的是纯化的直链淀粉样品.无水乙醇洗涤沉淀的目的是除去直链淀粉中所络合的正丁醇.上清液中加入10 mL正丁醇于沸水浴中加热搅拌至溶液分散透明,冷至室温,在7℃冰箱中过夜,离心(6 000 r/min,20 min),重复上述操作2~3次.将上清液真空浓缩后,加入冷的无水乙醇进行沉淀,再以无水乙醇洗涤沉淀物数次,室温下真空干燥得到纯化的支链淀粉样品.芋头淀粉的分离和纯化

孙忠伟 张燕萍 向传万

(江南大学食品学院,无锡, 214036)

干燥的芋头淀粉,用体积分数85%甲醇脱脂24h后,用无水乙醇脱脂6h,在40℃干燥48h,待用。

1·3·2 直链淀粉与支链淀粉的分离与纯化

1·3·2·1 直链淀粉与支链淀粉的粗分离

称取10g芋头淀粉,放入500mL烧杯中,加少量的无水乙醇,使样品湿润,再加入0·5mol/LNaOH溶液200mL。在沸水浴中加热搅拌20~30min至完全分散。冷却后离心(6000r/min,20min),去除未分散的残渣(沉淀部分)。用2mol/LHCl中和离心液,并加入100mL正丁醇-异戊醇(体积比3∶1)混合液,然后在沸水浴中加热搅拌20 min,此时溶液透明,冷却至室温,移入2~4℃冰箱静置24 h,离心(6 000 r/min, 20min),沉淀物即为粗直链淀粉,上清液即为粗支链淀粉溶液。分别收集备用。1·3·2·2 直链淀粉的纯化

将沉淀物即粗直链淀粉全部转移至装有120mL正丁醇饱和水溶液,然后置沸水浴中搅拌直至溶液分散透明,再逐渐冷却至室温,移入冰箱内(2~4℃)保持24 h,取出离心(6 000 r/min,20min),将得到的沉淀重复上述操作6次,然后将沉淀物浸入无水乙醇中24h,以无水乙醇洗涤沉淀数次,该沉淀于室温下真空干燥,即得直链淀粉纯品。无水乙醇沉淀的目的是除去直链淀粉中络合的正丁醇。

1·3·2·3 支链淀粉的纯化

支链淀粉溶液置于分液漏斗中静置,取下层溶液加40mL正丁醇-异戊醇(体积

比1∶1)混和液,在沸水浴中加热搅拌直至溶液分散透明,冷却至室温,移入冰箱于2~4℃静置48h,离心(6000r/min,20min),去除沉淀物,用上清液重复上述操作3~5次,所得上清液减压浓缩至原体积的一半,加入2倍体积的无水乙醇沉淀、离心,将沉淀溶于热的200mL 0·5mol/L NaOH溶液中,离心去沉淀,离心液中再加入2倍体积的无水乙醇,将沉淀溶于200mL的蒸馏水中,用2倍体积的无水乙醇再沉淀,以无水乙醇洗涤数次,室温下真空干燥,即得支链淀粉纯品。

直链淀粉的分级制备研究

刘志强,益小苏

(浙江大学高分子科学与工程系,浙江杭州310027)

1.3 原淀粉的去脂处理

(1)将210 g丙三醇或正丁醇与去离子水配成醇浓度为70%或85%的处理液,倒入500 mL的三颈烧瓶中.加入16 g淀粉,配成固含量约5%的淀粉悬浮液.(2)将烧瓶放入超级恒温水槽中,通氮气保护,搅拌溶液.控制水浴温度,使其在1~1.5 h中由

30℃上升至89℃.在89℃保持1 h后将烧瓶撤离水浴.(3)待烧瓶中的溶液冷却至25℃,将其分成两份,分别倒入500 mL的三颈烧瓶中,各加入300mL无水乙醇,搅拌1 h.(4)搅拌结束后,将悬浮液抽滤,用无水乙醇冲洗沉淀约3~4次,得到不含处理液的去脂淀粉.1.4 分散法分级

(1)将二甲基亚砜(DMSO)400 mL和去离子水100 mL倒入1 000 mL的烧杯,配成分散溶液.然后加入50 g淀粉,室温下搅拌若干小时(4,8,18 h),溶液呈乳液状.(2)将乳液倒入1 000 mL烧瓶中,在某一温度(60,80,100℃)的恒温水浴中搅拌加热30 min,然后加入100 mL的正丁醇,同时不停地搅拌5 min.(3)将溶液撤离水浴,冷却至室温,溶液中有细针状沉淀出现.用高速沉淀机分离沉淀(2 000r/min,30 min).(4)取出沉淀于500 mL烧瓶中,加入200 mL的1% NaCl溶液,在80℃的恒温水浴中加热30min,此时沉淀完全溶解.缓慢滴加100 mL正丁醇于热溶液中,同时用玻棒搅拌.(5)滴加结束后,将烧瓶撤离水浴,静止冷却至室温.用高速沉淀机分离出沉淀(2 000 r/min, 30 min).(6)根据需要重复(4),(5)步,增加重结晶次数.(7)取出沉淀置于培养皿,在70℃真空烘箱中干燥至恒重,得到直链级分.1.5 水浸法分级

(1)取8 g淀粉,350 mL去离子水倒入500 mL的三颈烧瓶中,配成浓度约为2%的淀粉悬浮液,用pH为6.3的磷酸缓冲液调节悬浮液的pH值为6.3.(2)将该悬浮液放入某一温度(70,80,90,98℃)的恒温水浴中,搅拌,通氮气保护.(3)保持15 min后,立即把溶液转移至薄壁塑料杯,放入冰盐浴中进行快速冷却.(4)把已冷却的悬浮液用离心沉淀机离心30 min,转速为2 000 r/min.(5)抽取上层清液,将其在60℃水浴中加热10 min后,缓慢滴加200 mL正丁醇,同时不停地搅拌,直至白色细针状沉淀生成.(6)用离心沉淀机分离沉淀(2000 r/min,10 min).(7)取出沉淀放入培养皿中,在70℃真空烘箱中干燥至恒重,得到完全干燥的直链级分.【玉米淀粉】

直链淀粉提纯方法的研究

无锡轻工大学食品学院(214036)

杨光丁霄霖

2·3·3碱液分散法

先加少量无水乙醇将淀粉充分湿润,加入0·5MNaOH溶液,沸水浴10~30min,用2NHCl溶液中和至pH7·5左右,加入丁醇-异戊醇(1∶1, v/ v),沸水浴10~30min,冷却至室温后,于4℃下静置至少12h,离心(1000r/min)20min,得到沉淀物,加适量丁醇饱和水溶液,沸水浴15~30min,不断搅拌,使沉淀物完全溶解,于4~25℃下静置3~12h,离心(1000r/min)20min,得到沉淀;如此循环3次以上,然后分别用78%乙醇洗涤3次,用95%乙醇洗涤3次,用无水乙醇洗涤3次,于40℃下真空干燥,即得直链淀粉纯品。

3·结果与分析

3·1碱液分散法

采用碱液分散法时,加入丁醇后,静置2~6h,即形成大量的沉淀,用普通离心机进行离心,可以将沉淀很好地分离。但是,应注意静置的温度不宜过低,否则,容易导致直链淀粉的老化。老化后的直链淀粉不溶于水,甚至加热至沸腾也不溶解,给以后的使用带来麻烦。直链淀粉老化主要是由直链淀粉结晶造成的,因此,随着纯化次数的增加,饱和丁醇水溶液的添加量也应该相应有所增加,使淀粉浓度适当稀释,尽量避免发生淀粉老化。

葛根直链淀粉和支链淀粉分离纯化的研究

杜先锋 许时婴 王 璋

(无锡轻工大学食品学院,无锡,214036)

1.3.2 淀粉组分的分离和纯化

取10g葛根淀粉,先以少量的无水乙醇润湿,再加200ml 0.5mol/L NaOH溶液,在热水浴中加热分散至整个淀粉糊完全透明,冷至室温,离心(6000r/min,20min)除

去不溶性杂质。淀粉糊以2mol/L HCl调至中性,再加90ml正丁醇-异戊醇(3∶1,V∶V)溶液,在沸水浴中加热搅拌至整个体系透明,冷却至室温,置于7℃冰箱中过夜,离心(6000r/min, 20min),沉淀物和上清液分别处理如下:

(1)沉淀物加120ml饱和的正丁醇水溶液,在沸水浴中加热搅拌至溶液分散透明,冷至室温,在7℃冰箱中过夜,离心(6000r/min,20min),所得的沉淀物按上述步骤重复操作5~10次(即重结晶5~10次),然后将沉淀物浸于无水乙醇中24h,再反复以无水乙醇洗涤沉淀,该沉淀物于室温下真空干燥,得到纯化的直链淀粉样品。无水乙醇洗涤沉淀的目的是除去直链淀粉中所络合的正丁醇。

(2)上清液中加入10ml正丁醇于沸水浴中加热搅拌至溶液分散透明,冷至室温,在7℃冰箱中过夜,离心(6000r/min,20min),重复上述操作2~3次。上清液经真空浓缩后,加冷的无水乙醇进行沉淀,再以无水乙醇洗涤沉淀物数次,室温下真空干燥得到纯化的支链淀粉样品。

马铃薯直链淀粉与支链淀粉的分离方法

吉宏武丁霄霖

A无锡轻工业大学食品学院

2.3淀粉的分散

称取10g干淀粉分散于100ml,水中，然后慢慢地倒入1.3L0.15mol/LNaOH中，并轻轻搅拌均匀，静置5min后加360ml5%NaCl溶液，用HCl中和至pH为6.5-7.5，在室温下放置15-20h，分为两层，将上清液吸出，经两次过滤，即为直链淀粉粗提液，下层胶体为支链淀粉粗提液。

2.4直链淀粉的纯化

直链淀粉粗提液，按10:1体积比加入重蒸的正丁醇，在常温下搅拌1h，静置3h后，将部分沉淀物离心(3500r/min,20min)，沉淀物再用正丁醇搅拌饱和1h、静置、离心，重复四次后，将沉淀物转至无水乙醇中浸泡24h，再用乙醇洗涤几次，在室温下真空干燥，即为直链淀粉。

2.5支链淀粉的纯化

支链淀粉粗提液经离心后(30min,20°C,7000r/min)，弃去上清液，沉淀物加入适量的1%NaCl,并轻轻搅动，放置15h左右，待其分层后，弃去上清液，部分沉淀物离心(30min,20°C,7000r/min)，弃去上清液，沉淀物再加入适量的1%NaCl,并轻轻搅动，静置、离心，重复四次后，将沉淀物转至无水乙醇中放置一夜，再用无水乙醇洗涤3-5次，室温下真空干燥，即为支锭淀粉纯品。

[玉米淀粉]

直链淀粉和支链淀粉纯品的提取及其鉴定

（江南大学食品学院，无锡）

洪雁顾正彪刘晓欣

1.2.1直链淀粉和支链淀粉的分离与纯化

1.2.1.1直链淀粉与支链淀粉的粗分离

称取10g玉米淀粉，加入少量无水乙醇分散并湿润样品，再加入350ml 0.5mol/L的氢氧化钠，在沸水浴中搅拌10min，使溶液清澈透明，无结团状，冷却后冷冻，高速离心（8000r/min）10min，用2mol/L的盐酸中和至中性，加入100mL3:1丁醇(异戊醇的混合液，在沸水浴中加热搅拌10min后，冷却至室温，于2-4°C的冰箱中静置24h，取出，冷冻，高速离心（8000r/min）10min，得到的沉淀物为粗直链淀粉，离心液为粗支链淀粉。

1.2.1.2直链淀粉的纯化

将粗直链淀粉沉淀全部移入丁醇饱和的200ml水中，加热溶解至溶液透明，冷却至室温后放入2-4°C的冰箱中静置24h，取出，冷冻，高速离心（8000r/min）20min，得沉淀物，再纯化数次后，将沉淀物在砂芯漏斗中过滤，用无水乙醇洗涤数次，样品在40°C的鼓风干燥箱中干燥8h，即得纯直链淀粉。

1.2.1.3支链淀粉的纯化

将粗支链淀粉离心液在分液漏斗中静置数分钟后，分成三层，取下层乳胶体溶液，加40ml1:1丁醇(异戊醇的混合液，于沸水浴中加热搅拌10min，冷却后放入2-4°C的冰箱中静置48h后，冷冻，高速离心（8000r/min）10min，离心液中缓缓加入二倍体积的无水乙醇，在2-4°C的冰箱内静置24h，将沉淀物溶于热的0.5mol/L氢氧化钠溶液，依上述方法纯化数次，用无水乙醇脱水洗涤，样品在40°C的鼓风干燥箱中干燥8h，即得纯支链淀粉。

第四篇：多糖的提取纯化及分析鉴定方法研究

多糖的提取纯化及分析鉴定方法研究

王霄

(合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥230009)

摘要：详细介绍了动植物多糖的常见提取纯化方法的最新研究进展，并比较了各种方法的优缺点。每种方法都有各自的优缺点，在提取时应根据所选材料的性质选用不同的方法，有些方法在一定的条件下可与别的方法协同作用，并对糖的含量测定及分析鉴定方法的研究进展作了概述。

关键词：多糖；提取；纯化；分析鉴定；研究进展 中图分类号：TU 411.01文献标识码：A

Progress of Polysaccharides Extraction, Purification and Identification Methods

WANG Xiao

(School of Biological and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract: This paper reviews the extraction, purification and identification methods of animal and plantpolysaccharides, and compares the advantages and disadvantages of each mothed.Each mothed has its own advantages and disadvantages, appropriate mothed should be selected according to the nature of the chosen material, and some of these methods can be synergy with other methods under certain conditions.In addition, analysis and identification of polysaccharides are outlined.Key words: polysaccharides;extraction;purification;analysis and identification;research progress

菌来源的糖缀合物具有广泛的药理及生物活性

0多糖概述

多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。由相同的单糖组成的多糖称为多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以没的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。

近年来，国际上对糖及糖复合物的研究己成热点，糖类结构测定和生物活性研究取得了明显的进展。大量实验事实揭示糖类是重要信息分子，参与许多生理和病理过程

[1-2]

[3]。

在对各种中药材化学成分研究的过程中，人

们逐步提高了对植物多糖的关注。植物多糖研究比较深入的是茶多糖、菜籽多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、银杏叶多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品领域已经取得很好的应用。多糖作为重要的生物活性物质具有调节免疫、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等活性，在医疗保健、食品、动物养殖等领域有着广阔的应用前景

[4-7]。

1多糖的提取工艺

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最

。到目前为止。己有

300余种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从中草药、食药用菌中提取的水溶性多糖最为重要。已发现有100多种中草药、食药用

终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5 h，多糖的质量分数和得率均较高。影响多糖提取率的因素有：提取温度、浸提料液比、提取时间以及提取次数等。为此，研究者对影响多糖提取工艺的这些因素进行了大量研究。林娟[8]

等研究表明水提法提取甘薯多糖的优化工艺条件为：提取温度85℃，加水比1：7，提取时间2.5h，提取率为26．71％。刘永[9]

等研究表明：最佳提取条件为95℃，料液比1：20(g：mL)，提取时间2h，提取3次，茶叶多糖含量为35.92 mg/g。

水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高[10]。

1.2酶法提取

酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件下分解植物组织，加速有效成分的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等非目的产物。此法可使后续的浓缩和脱蛋白工艺更简易、省时，粗多糖的纯度更高。但会提高生产成本，对提取条件要求较高。杨云

[11]

等人采用的单酶法和复合酶法提取大枣多糖，单酶法提取多糖含量最高可达44.69％，而复合酶法多糖最高含量可达68.13％。1.3超声波提取

超声法是利用超声波对细胞组织的破碎作用来提高多糖浸出率的，具有快速、安全、简便、成本低、多糖提取率高，成分又不被破坏等优点，但对提取设备要求较高。李进伟

[12]

等通过响应面

分析法考察超声波功率、提取时间、提取温度、料液比对枣多糖得率与纯度的影响，得出枣多糖最佳的提取工艺条件为：超声波功率86～96W，提取温度45～53℃，提取时间20min，料液比1:20（g:ml），枣多糖得率7.63%，纯度35.57%。与传统的水浴浸提法相比，该方法不仅缩短了提取时间，且提高了枣多糖得率与纯度。1.4微波提取

微波萃取是高频电磁波穿透萃取媒质，到达被萃取物料的内部，能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升，细胞内部压力超过细胞壁承受力，细胞破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度下溶解于萃取媒质，通过进一步过滤和分离，获得萃取物料。赵怡红

[13]

等研究表明北冬虫夏草

多糖微波提取最佳条件：微波功率550W、固液比l：30、提取时间30s、提取1次，多糖收率3.67％。刘青梅

[14]

等研究结果表明:对于紫菜多糖

提取微波提取优于热水提取,微波冻融提取效果最佳,提取率最高达7.45%,而热水提取率为2.05%.影响微波浸提的主要因素为浸提时间,其次是微波功率和液固质量比。优选方案为微波功率200W、提取时间8 min、水与紫菜液固质量比40:1。

1.5超临界流体提取

超临界流体提取法根据某些气体在超临界状态下具有特殊的液相性质，对一些组分有较好的溶解性，用来提取目的产物。一般采用CO2超临界萃取多糖组分。朱俊玲

[15]

通过超临界CO2流体

萃取处理芦荟多糖，多糖得率为85.1％，是传统方法的1.5倍。超临界萃取的最佳工艺条件是乙醇用量为250 ml/100g芦荟、萃取压力为25 MPa、萃取温度为35℃。1.6超滤法

超滤是一种膜分离技术。该技术应用于多糖的提取，具有不损害活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等优点[16]。

1.7酸提法

有些多糖适合用稀酸提取，并且能够得到更高的提取率。如赵宇等

[17]

对海蒿子多糖的提取方

法研究发现，从多糖提取得率来看，酸提法优于传统的水提法。不过此方法只在一些特定的植物多糖提取中占优势，目前报道的并不多。不过在操作上还是应该严格控制酸度，因为在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。1.8碱提法

与酸提法类似，有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。不过，也应控制碱的浓度，因为有些多糖在碱性较强时也会发生水解。

2多糖纯化方法

2.1除蛋白

根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）为5∶1 或4∶1，混合物剧烈振摇20～30 min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种只能除去少量蛋白质，效

率不高，须反复多次，多糖有损失。但此方法比较温和，在避免多糖降解上效果较好，如配合加入一些蛋白质水解酶，用Sevage 法效果更佳。李婉婷

[18]

研究结果表明木瓜蛋白酶-Sevage法除

去款冬花多糖中的蛋白最为理想，该法的最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶的酶底比为l％，pH值7.0，先在50℃水浴中酶解2h，再经Sevage法脱蛋白3次，其蛋白脱除率为88.95％，多糖保留率为92.63％。2.2透析法

透析法是利用一定孔目的膜，使无机盐或小分子糖透过，而将大分子的多糖截留下来从而达到纯化多糖的目的。此法的关键是要选择孔目合适的透析膜。纤维膜孔径为2～3nm，可使单糖分子通过，分离效果较好，透析时常需要多次换水，溶液的pH值维持在6.0～6.5范围内。2.3凝胶柱层析法

凝胶柱层析法主要是根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离目的。但溶液流经多孔性凝胶柱时，小分子已扩散人孔中，各溶质依分子量大小顺序依次流出。此方法快速、简单、条件温和。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sephamse)，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂。此法还可进行多糖相对分子量的测定。王赫

[19]

采用Sephadex G-100凝胶色谱柱

分离纯化，从龙胆水溶性多糖中分离纯化得到2 种不同的均一多糖组分TP-

1、TP-2。2.4纤维素住层析法

纤维素阴离子交换剂柱层析对多糖的分离是利用pH 6时，酸性多糖能吸附于交换剂上，中性多糖不吸附，用pH相同离子强度不同的缓冲液将酸性强弱不同的酸性多糖分别洗脱出来。常用的阴离子交换纤维素有DEAE-纤维素和ECTEOLA纤维素。张兰杰

[20]

等就采用DEAE-纤维素柱分离

北五味子多糖，分别得到了白色结晶和黄色粉末两种多糖产物。

3多糖的分析

3.1含量的测定

测定方法：硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、比色定量法、分光光度法、纸色谱法、离子交换色谱法、yaphe [21]

法、薄层色谱法、酶法、原子吸

收法

[22]、HPLC法、凝胶电泳法、亲和电泳法连、续流动分析法检测法

[23]、次亚碘酸盐定量法、蒽

酮-硫酸法（总糖）、DNS法

[24]

（还原法）、磷钼

比色法、邻钾苯胺比色法等。每种方法只对某些多糖的测量效果好。比色法分光光度法离子交换色谱法酶法和电泳法等可同时用于多糖的定性定量分析。3.2纯度鉴定

多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。多糖纯度鉴定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HPLC法等。现在应用较多的是HPLC法，旋光度测定[25]

也是纯度

测定的一种方法。3.3分子量的测定

多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作常用方法：渗透压法、蒸气压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电泳法、HPLC法、超离心分析法、分子筛色谱法、GPC法

[26]。

4多糖的鉴定

4.1 多糖一级结构测定

多糖的一级结构分析，主要是分析组成多糖的单糖类型、数目连接方式及苷建构型。常用化学法和仪器分析法。多糖组分与分子比例测定法：部分酸解法、完全酶解法、色谱法；吡喃、呋喃环形式结构的分析：红外光谱；连接次序：选择性光谱法、糖苷键顺序水解、核磁共振； α-β-异头异构体：糖苷酶水解核磁共振；羟基被取代情况：甲基化反应、气相色谱、过碘酸氧化、Smith降解法和测硫酸基法（terho法）、核磁共振、质谱法；糖链、肽链连接方式：单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应；多糖结构的分析方法很多，迄今没有一种方法可以单独完成多糖结构的分析。仪器分析与化学方法相结合是常用的多糖结构测定方法。4.2多糖高级结构测定

目前研究多糖的二级结构常用的手段是NMR技术，如2D-NMR，13C谱，通用的方法是将现代NMR技术与理论计算相结合通过一定的理论计算筛选构象，主要的理论计算方法有从头计算、丰度经验计算及经验力场计算

[27]

。圆二色

谱法（CD）也可用于糖的构象分析,张丽萍等

[28]

应用谱测定了金顶侧耳多锗的水溶液构象近年来，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活

动的规律已达到前所未有的深度和广度[29]，多糖

作为一类重要的生物活性大分子其结构的研究势

必推动对多糖的认识向深层次发展。多糖的应用展望

我国对多糖的研究起步较晚，但近年来的工作取得了较大的进展，愈来愈多的多糖被发现并证实它们具有复杂广泛的生物活性和功能。随着对多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性机理，功效因子会更加明确，它的应用领域也将会更加拓宽。然而，由于多糖本身结构比较复杂，种类繁多，其结构测定和分离纯化有很大的难度；有些多糖在天然植物中的含量低且不易分离及多糖的药理作用与诸多因素有关，给多糖的研究和应用带来许多的挑战，这需要相关行业的人士共同应对。

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第五篇：销售方法总结

无敌生意成交5步法：

一、破除旧的观念，制造不满意。先向用户表明当前的现状是有问题的，但这个问题错不在于你，错在自己缺少某个东西，或是有个“第三者”在破坏你。比如卖锅，先表明现在市面上的锅在做菜时是有问题的，经常容易糊锅底，很难弄干净。但这个问题不是你的错，不是因为你做菜技术不高明，而是因为你缺少一个永远不会糊锅底的锅，如果有了这样一个锅，你就永远不会做出糊锅底的菜来。做生意的第一步，先找出当前的毛病问题，找出能够令人们不满意的因素，告诉人们为什么不能用当前的产品。

二、为什么要选择本行或本产品的类型。向人们表明在所有这类商品中只有我们的产品才是最棒最适合的，其他同行业中各种类型的产品都不是最佳选择。比如人们想买饮品，饮料的种类有很多种，有矿泉水、茶饮料、果汁饮料、可乐饮料、咖啡饮料等等，向人们说明为什么自己的产品类型才是最适合人们使用的，从而帮人们确认定位产品，觉得确实只有我们的产品才是最适合他们的。

三、说明自己品牌的优势，进行价值分析。说明自己的产品结果好、速度快、很简单、无风险。比如减肥产品的宣传，三天减七斤（速度快），只要贴在肚脐上就可以轻松减肥，无需运动，睡一晚上等于运动八千里（很简单），一个月最少减三十斤（结果好），绝对不反弹（无风险）。说明自己产品的独特优势，从而增强人们的信心。

四、报价。先报高价，为后面的成交做掩护。举出优点，证明高价的合理性。比如三个月就可以回本，投资后很快就能收回成本，所以其实并不是很贵。最后突然降价，瞬间激发成交行动。比如说现在购买，六折优惠，到今天晚上十点之前就恢复原价，现在购买非常实惠，名额有限，先到先得等等。

五、行动呼吁。讲出你的联系方法、购买方式、支付方法，说明你的售后服务、赠品优惠等措施，呼吁人们进行购买，这样就可以了。

这个生意成交5步法，就是热销的商家经常采用的方法，通过这5个步骤，自己的产品都会成为热销的产品。

终端销售5步法

第一步：打招呼。做推销的销售人员要接近顾客首先必须要做的当然是向顾客打招呼。打招呼时要注意三点，热忱、目光、笑容。第一点热忱，不知大家注意过没有，在主动与别人打招呼时绝对会出现的情况就是打招呼的人热情对方就跟着热情，冷漠的给别人打招呼就会的 得到冷漠的回应，所以我们在给顾客打招呼时一定要热忱为先。你的热忱会影响顾客的心情。终端销售技巧第二个要点目光，用专注的目光盯住对方的眼 睛，这会给顾客一定的震撼作用会让顾客心对你产生亲近，有人觉得这样做好像不太礼貌特别是男销售员面对女顾客时，我只能告诉你，你这种想是大错特错。这样说的道理其实很 简单，一个人热情的对你打招呼而且你发现他的眼睛有神的盯着你好像在说话，你的心理活动会是什么样的呢？一是觉得好奇，这个人怎么这样看着我。二是有一丝 紧张又有点害怕（这点紧张害怕就会让别人能在几分钟之内控制你的思维），产生紧迫感，紧迫感使你紧张方乱，不知所措，此时你就可能接受他的安排了。三是觉 得兴奋并开始对这个人产生好感（这也是美女一般很容易被大胆的人短时间追到手的原因）。而呆滞、散乱的目光只会给你带来相反的效果。在此我不多说只要你随 便找个人试验一下就明白了。第三点一定要有真诚的笑容，真诚的笑容会拉近你与顾客之间的距离，会将因目光给对方造成的那一丝紧张和害怕变成对你的尊重与心 理依靠。

终端销售技巧第二步：介绍自己。不管是对陌生顾客还是对打过交道的顾客你都不要忘在打招呼后介绍自己来强化顾客 的记忆系统。介绍自己时也要注意三点，简单、清楚、自信。一是要简单，简单的介绍不 但可以让顾客一下子了解你也会为你下面的销售工作留下足够时间，还有就是简单的就是顾客最容易记的，一个顾客记住了你，他 就可能给你介绍来更多顾客，也有利于建立与顾客今后的交易。二是要清楚，为什么要清楚我想不讲大家都明白。三是自信，自信是最重要的，自信不但能影响你自 己还能控制顾客。

终端销售技巧第三步：介绍产品。介绍产品时

1、把产品放到顾客手上，让顾客参与进来体验产品，这会让他觉得产品 已经是他的了，然后突然从顾客手拿回产品让顾客产生失落感。善于利用失落感：适当的给对方失落感，会使对方失落和不甘心，从而使你的销售活动更顺利。

2、介绍产品要简洁，明了。尽量用顾客听得懂语言介绍产品，最好不用让顾客听不明白的专业术语。

3、炒起价格要求火爆、真诚，用眼 睛注视顾客了解对方的心理活动。炒价格就比较产品做活动与平时的价格差，没做活动的产品就和同类比较贵的产品来比较，如果自己的产品是行业里最贵的就炒产 品的价值与价格之间的差，总之是让顾客有赚钱的成就感就行。

终端销售技巧第四步：成交。

一、成交时动作要求专业化和恰到好处，专业化会让对方觉得他的购买决定是对的。

二、提出顾客想了解的问题，并快速解答处理问题，不要让顾客自己有过多的思考机会，要不然太多的异问不但会让你手忙脚乱打破销售进程还会让顾客疑虑越 来越多使你无法控制，动摇顾客购买的决心。

三、要多用假设——假设成交、假设使用、举例等。让顾客感觉产品已经是他的了。

终端销售技巧第五步：再成交。乘胜追击，抓住对方的购买动机，再次刺激其购买欲望。善于利用拥有感：拥有感会使 对方无限满足，从而忘记他的付出。做到这一点就可以坚定顾客的信念不会后悔购买你的产品。

只要大家按上面的步骤将自己所销售产品的过程进行分解，进行反复练习我相信就能做好一个终端营销员。刚做销售人员大都心情紧张，对顾客十分畏惧，此时 的唯一销售法宝就是要多练习，忽略销售对象，背诵销售五步，背得流利树立了自己的信心就可能实现销售。

当你了解了销售五步后就要有自我表现欲，懂得利用对方心理和终端销售技巧后就要开始使用自己的主观思维制造气氛，使对方在自己的安排下实现销售目的。有非常强的自我表现能力的人，要了解对方的欲望。使对方在自己的强烈感染下实行销售。

最后将销售五步练习成自己的本能，跳出销售做销售。做这点你就不但可以成为优秀的终端营销员，你已经可以胜任任何营销职务了。