微生物,痰培养相关总结[五篇]

第一篇：微生物,痰培养相关总结

关于痰标本

1.痰标本中需要检测的主要致病菌：肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌（可引起原发性肺炎）、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌（各种器官的化脓性感染，呼吸道的有气管炎、肺炎脓胸等）、铜绿假单胞菌(条件致病菌，院感主要病原菌之一，在人体抵抗力低下时可引起呼吸道感染等感染，该菌引起的慢性肺部感染占有较大比例)。

2.非病原菌：酵母菌、草绿色链球菌、凝固酶阴性葡萄球菌。3.省医院对痰标本的处理过程：

1）每个接收的痰标本进行痰涂片（老师称之为痰质控片），镜下观察痰标本是否合格。合格的痰标本标准为WBC>25/LP,EPC<10/LP或二者比值大于2.5。由于种种原因，不合格的痰标本是不会退回的。痰质控片记录的相关信息包括：每低倍镜下的WBC数和EPC数，若查见细菌，报告细菌的种类（如G+C、G-b）、排列方式、数量（几个+）。还要记录真菌和孢子的镜检结果。不合格的痰标本依然会接种（若申请单上有培养）。痰质控片的作用：在筛查标本接种出来的平板时根据痰质控片的结果进行相关分析。

2）痰标本接种：接种三种平板，分别是血平板、麦康凯平板、巧克力平板（安图筛选嗜血杆菌的平板，名称为CAH）。

3）孵育和接种平板筛选：接收的痰标本均要两夜的孵育。第一夜过夜孵育后取出进行平板筛选，做好相关记录。第二次过夜孵育后取出再筛选一次，和前一天的记录相比较，记录或改正相关筛选结果。孵育两夜的意义在于防止某些生长缓慢的致病菌被漏检。4.关于如何筛选需要进行下一步检验的标本 1)数量标准

手工接种：血平板上第四区有5个菌落，表示有105，已经达到治病的数量。可以继续往下做鉴定和/或药敏。

仪器接种：因使用消化液，计数需有107（痰标本使用消化液，使很多胞内菌释放，上机前都是加过生理盐水的，经过这两步那么这个判断治病的数量级是如何得出的，经验，实验结果？）。2)其他

在微生物室的老师经过一定时间的经验积累，对于常见的致病菌，根据其菌落形态就可以将其鉴别出来。比如通常情况下在血平板上G+菌的菌落较小，圆形，光滑，而G-菌的菌落较大，扁平，粗糙。而痰标本接种后的血平板上哪些细菌需要进行下一步试验不仅需要相应的理论知识作基础还需要经验积累。

在血平板上达到量的细菌，还要看是否是优势生长和纯量生长。但是优势生长的细菌并不一定是致病菌，如培养出来的全是口腔的正常菌群，相对来说，必定有优势生长得细菌。所以优势生长得细菌要是相关的致病菌。

在引起呼吸道感染的G-b有肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌等。是否痰标本培养出G-b就一定是致病菌？答案是痰中出现革兰阴性菌不一定就是致病菌。因为某些病人，如ICU病人，在呼吸道插管存在的情况下，呼吸道是与外界相通的，这时就会定植很多细菌，如铜绿假单胞菌，这些细菌只是定植但不会引起感染。如果一个病人来自ICU，且是第二次或者多次做痰培养的时候，培养出大量纯量的铜绿假单胞菌或者鲍曼不动杆菌（这两种菌常从ICU病人分离到）就需要考虑是定植菌。省医院遇到这样的情况只会报一个该细菌的量，而不是进行鉴定和/或药敏。判断一株细菌是不是致病菌，单独在实验室很难做到，必须与临床联系。有的时候，即使从痰标本中只分离到根本不占优势几个菌落的革兰阴性或阳性菌，这种细菌也可能是真正引起感染的致病菌。痰标本的培养、鉴定和药敏结果通常情况下对临床医生只是起到一个辅助的作用，如果病人有症状，也分离到相应的致病菌，那么可以帮助临床医生肯定诊断。如果培养结果和临床症状不相符合，临床医生会从多方面考虑原因（送检标本不合格，某种细菌实验室检出能力低）并且经验性用药（病人有明确的感染症状）。

总之，致病菌的筛选不仅需要检验工作者的丰富经验还需要多和临床沟通，多了解临床才能做好。

（整理的报告内容根据省医院老师的讲解和相关资料查询而得，不一定完全正确，而且必定不全面。在接下来的学习中会去完善。有错误的地方希望郭老师指出！）

第二篇：微生物实验室培养

平陆中学高二生物

课题一：微生物的实验室培养第二课时

车柳顺2.24学习目标：

1、明确配制培养基的步骤

2、说出纯化微生物的方法和步骤

目标一：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

1、步骤：计算→称量→溶化→→灭菌→倒平板。

2、演示倒平板操作

导思：（完成倒平板操作的讨论题1——4）

目标二：纯化大肠杆菌

1、微生物接种最常用的方法是划线法和涂布平板法。

2、平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续分散到培养基的表面。稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度，然后将不同稀释度的菌液分别到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

3、总结平板划线法和稀释涂布平板法的操作步骤并演示

（1）平板划线操作：

导思：（完成平板划线法的讨论题）

（2）稀释涂布平板法：

导思：（完成稀释涂布平板法操作的讨论题）

4、平板划线法和稀释涂布平板法的异同点是

目标三：菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用的方法

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用的方法。

自我反思

1、以下关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述错误的是（）

A.操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌

B.将称量好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯

C.将培养皿冷却至50C左右时进行倒平板

D.待平板冷却凝固约5—10min后将平板倒过来放置

2、有关倒平板的操作错误的是（）

A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上

B.将打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰

C.将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上

D.等待平板冷却凝固后需要倒过来放置

3、有关稀释涂布平板法，叙述错误的是（）

A.先将菌液进行一系列的稀释

B.然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面

C.适宜条件下培养

D.结果都可在培养基表面形成单个的菌落

4、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（）

A.一个细菌、液体培养基B.许多细菌、液体培养基

C.一个细菌、固体培养基D.许多细菌、固体培养基

第三篇：微生物总结

微生物：一类分布广泛、体积微小、结构简单、肉眼直接看不到，微小生物的总称。

细菌L型：细菌细胞壁的肽聚糖结构受理化或生物因素直接破坏或合成被抑制，这种细胞壁受损的细菌在高渗环境下仍可存活，称细菌细胞壁缺陷型或L型。

质粒：是染色体外的遗传物质，控制某些特定的生物学性状，不是细菌生长所必需。

荚膜：是细菌合成分泌的包绕于细胞壁外的一层粘液性物质。界限清晰性质稳定结合牢固。培养基：由人工方法经灭菌后制成，专供微生物生长使用的混合营养制品。一般pH为7.2-7.6。

兼性厌氧菌：兼有需氧呼吸和无氧发酵两种功能，无论在有氧或无氧环境中都能生长，但以有氧时生长较好，大多数病原菌属于此。菌落：在固体培养基中，经过十八到24小时培养后，单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细红细胞吸附：流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素（HA），具有吸附脊椎动物红细胞的能力，这一现象称为红细胞吸附。抗毒素：通常是用细菌类毒素给马多次注射后，取其免疫血清提取免疫球蛋白精制而成抗生素：微生物来源的抗菌药物，以及人工化学修饰或半合成的衍生物

无菌：就是指没有活菌的意思。

1：细胞壁结构、化学组成及功能？答：化学组成：G+①肽聚糖：聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥②磷壁酸：粘附功能，与致病性有关；抗原性很强③其他成分：如A群链球菌的M蛋白G-①肽聚糖：聚糖骨架；四肽侧链②外膜：脂蛋白；脂质双层；脂多糖：脂类A（毒性成分，无种属特异性）；核心多糖；特异多糖。功能：①维持细菌固有形态②保护细菌抵抗低渗环境③物质交换④决定菌体的抗原性。2：G-菌与G+菌细胞壁的异同点及其意义？答：兼性厌氧菌、专性厌氧菌。

11：与医学有关的合成代谢产物？答：① 毒素与侵袭性酶：外毒素和内毒素②热原质：G-菌细胞壁的脂多糖，耐高温，250℃干烤破坏。③抗生素：某些微生物代谢中产生的一类能抑制或杀死其他微生物或肿瘤细胞的物质。④维生素：如VitK、B族维生素。⑤色素：脂溶性和水溶性色素。⑥细菌素：无治疗应用价值。13：病毒的形态、结构与化学组成。答：多数病毒呈球形或近似球形，少数呈杆状（植物病毒）、丝状（初分离的流感病毒）、弹状（狂犬病毒）、砖块状（如痘类病毒）和蝌蚪状（噬菌体）。病毒的核心和衣壳，二者构成核衣壳，病毒包膜和其他辅助结构。化学组成：核心：主要为核酸，化学组成为DNA或RNA。衣壳：包绕在核心外面的一层蛋白质，由许多蛋白质亚单位（壳粒）组成。包膜：化学组成： 脂质蛋白质糖类。

答：单细胞真菌呈圆形或卵圆形。多细胞真菌

结构：菌丝和孢子，菌丝：分为营养菌丝、气中菌丝、生殖菌丝；孢子：是真菌的繁殖体。结构：细胞壁外成分；细胞壁；隔膜；其他结构。

25：真菌培养特性。答：最常用的培养:沙保弱培养基。温度:多数都在22 ~ 28oC，但深部感染真菌最适温度为37oC，pH4.0 ~ 6.0病原菌通常生长缓慢，1~4周。

26：真菌繁殖方式。答：①无性生殖：①由菌丝断裂形成新个体②细胞直接分裂产生子细胞③产生芽生孢子④产生孢子囊孢子和分生孢子②有性生殖：指经过两性细胞配合产生新个体的繁殖方式。

27：真菌抵抗力答：①对干燥、阳光、紫外线及常用消毒剂有强抵抗力②不耐热，菌丝与孢子60℃ 1小时均可杀死③2﹪石炭酸、10%甲醛、0.1%升汞、2.5%碘酊敏感④抗真菌药物：菌集团。

纯培养基：挑取一个菌落，移种到另一培养基中，生长出来的细菌均为纯种。

毒性噬菌体：在宿主菌细胞内噬菌体增殖产生子代噬菌体，宿主菌被裂解，形成溶菌性周期。温和噬菌体：噬菌体基因与宿主菌染色体整合，成为前噬菌体，噬菌体DNA能随细菌DNA复制而复制，并随细菌的分裂而传到子代细菌的基因组中，变成溶原性细菌，形成溶原性周期。前噬菌体：整合在细菌染色体上的噬菌体基因。转座子：细菌基因组中的一段DNA序列，可以在染色体、质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，伴随转座子的移动，会出现插入突变。基因转移：遗传物质由供体菌转入受体菌的过程为基因转移。

重组：转移的基因与受体菌DNA整合在一起称为重组，重组使受体菌获得供体菌的某些性状。转化：细菌通过性菌毛相互连接沟通，将质粒或染色体等遗传物质从供体菌转移给受体菌的过程。

接合：是受体菌直接摄取供体菌DNA片段，从而获得新的遗传性状的过程。

转导：以噬菌体为载体将供菌的DNA片段转移到受菌体内使受菌获得供菌的部分遗传性状。溶原性转换：某些前噬菌体可导致细菌基因型和性状发生改变，例如白喉棒状杆菌产生白喉毒素的机理，温和噬菌体感染细菌时，其基因可整合于宿主菌染色体中，使宿主菌获得噬菌体基因赋予的新的性状，称溶原性转换。原生质体融合：将两种不同的细菌经溶菌酶或青霉素等处理，失去细胞壁成为原生质体后进行融合的过程。融合后的染色体之间发生重组。病毒的自我复制：以病毒核酸为模板，经过复杂的生化过程，复制子代病毒的核酸并通过转录翻译产生病毒蛋白质，装配成熟后释放到细胞外，这种增殖方式称为病毒的自我复制。顿挫感染：被病毒侵入的细胞如不能为病毒增殖提供必需成分，则病毒不能合成本身成分，或能合成但不能组装和释出有感染性的病毒颗粒。非容纳细胞与容纳细胞

缺陷病毒：病毒基因组不完整或某一基因位点改变，不能正常增殖，不能复制出完整有感染性的病毒颗粒，此病毒即缺陷病毒。缺陷病毒+辅助病毒完成复制

干扰现象：当两种病毒感染同一宿主细胞时，发生一种病毒的增殖抑制另一种病毒增殖的现象。某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化（如HAd），但能干扰其后感染的另一病毒的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE 芽孢：某些细菌在一定环境条件下，胞质脱水浓缩，在菌体内部形成的一个圆形或卵圆形小体。

正常菌群：正常人的体表和与外界相通的眼结膜，口腔、鼻腔、肠道、泌尿生殖道等腔道粘膜中的不同种类和数量及对人体无害而有益的微生物。正常微生物群通称为正常菌群

细菌群体：细菌附着在有生命或无生命的材料表面后，由细菌及其所分泌的胞外多聚物共同组成的呈膜状的细菌群体。机会性感染：由正常菌群在机体免疫功能低下、寄居部位改变、菌群失调等特定条件下引起的感染。

毒力：致病性的强弱程度。

侵袭素：某些细菌的基因编码一些具有侵袭功能的蛋白多肽，促进该病原菌向邻近组织扩散甚至介导进入邻近黏膜上皮细胞内。

包涵体：细胞浆或细胞核内出现光镜下可见的斑块状结构

G+ 菌:①肽聚糖：聚糖骨架,四肽侧链,五肽交联桥,三维立体②磷壁酸:重要表面抗原，与粘附致病有关，加强稳定细胞壁G－菌:①肽聚糖：聚糖骨架,四肽侧链组成二维结构, ②外膜（脂蛋白、脂质双层、脂多糖组成）功能:屏障结构LPS是G－菌的内毒素。细胞壁结构异同:G+菌/G－菌--强度:较坚韧/较疏松--厚度:厚20-80nm/薄10-15nm--肽聚糖层数:多可达50层/少，1-2层--肽聚糖结构:聚糖骨架,四肽侧链,五肽交联桥,三维立体/聚糖骨架,四肽侧链,二维平面--脂类含量/少/多--磷壁酸:有/无--外膜:无/有,由脂蛋白、脂质双层、脂多糖组成3：细菌L型，特殊结构种类、化学组成、抗原性及意义？答：定义：细菌细胞壁的肽聚糖结构受理化或生物因素直接破坏或合成被抑制，这种细胞壁受损的细菌在高渗环境下仍可存活，称细菌细胞壁缺陷型或L型。种类：G+菌细胞壁缺失后，仅有胞膜，称原生质体，G--菌肽聚糖层受损，尚有外膜，称原生质球。抗原性及意义：高度多形性，大小不一；大多染成G－；高渗低琼脂含血清培养基—油煎蛋样菌落；去除诱因后，有些可回复为原菌；某些L型仍有致病性,引起慢性感染。作用于胞壁的抗菌性药对L型感染治疗无效

4：细菌的特殊结构？答：①荚膜：多糖或多肽的多聚体。功能a抗吞噬b黏附作用c抗有害物质的损伤d有抗原性，用于细菌的鉴定和分型②鞭毛：蛋白质，由基础小体丝状体钩状体组成，高度抗原性。功能a是细菌的运动器官b某些细菌的鞭毛与致病性有关c根据鞭毛的动力和鞭毛的抗原性可用以细菌的鉴别和分类③菌毛：由亚单位菌毛蛋白构成。功能a黏附作用b传递遗传物质④芽孢：生产芽孢的细菌都是革阳菌。功能：a增强抵抗力b不直接致病c鉴定。

5：细菌的遗传物质？答：细菌染色体，质粒，噬菌体：

6：基因转移与重组方式的种类及定义？答：定义：基因转移：遗传物质由供体菌转入受体菌的过程为基因转移。重组：转移的基因与受体菌DNA整合在一起称为重组，重组使受体菌获得供体菌的某些性状。分类：转化,接合,转导,融合,转换.【表格】类型：基因来源/转移方式--转化：供菌游离的DNA片段/直接摄入--接合：供菌质粒DNA/ 性菌毛--转导：供菌任意DNA或噬菌体与供菌特定DNA/噬菌体--融合：两菌原生质体的DNA/融合--转换：温和噬菌体/吸附穿入

7：噬菌体及其相关概念。答：1）毒性噬菌体：在宿主菌细胞内噬菌体增殖产生子代噬菌体，宿主菌被裂解，形成溶菌性周期。2）温和噬菌体：噬菌体基因与宿主菌染色体整合，成为前噬菌体，噬菌体DNA能随细菌DNA复制而复制，并随细菌的分裂而传到子代细菌的基因组中，变成溶原性细菌，形成溶原性周期。

8：细菌生长繁殖的条件？答:营养物质/酸碱度 多数病原菌最适pH为7.2~7.6/温度 多数病原菌生长最适温度为37℃/气体 据代谢时对分子氧的需要与否，专性需氧菌、微需氧菌、兼性厌氧菌、专性厌氧菌/渗透压。

9：细菌群体的生长繁殖？答：生长曲线：一定数量的细菌接种到定量的液体培养基中，连续定时取样测定活菌数量，以培养时间为横坐标，以活菌数的对数为纵坐标作图，得到的一条曲线。迟缓期：适应阶段。对数期：对抗生素敏感，细菌鉴定选此期。稳定期：代谢产物形成（如外毒素、抗生素、芽胞等）。衰亡期：菌体细胞呈现多种形态。

10：按细菌对氧需要的分类？答：据代谢时对分子氧的需要与否，专性需氧菌、微需氧菌、14：双链DNA病毒的复制周期？答：vDNA（RNA聚合酶）→早期mRNA（翻译）→早期蛋白（酶）→ vDNA（酶）子代DNA → mRNA→结构蛋白.→子代DNA+结构蛋白→子代病毒。简要过程：吸附，穿入，脱壳，生物合成，组装、成熟与释放。

15：顿挫病毒，缺陷病毒的概念？答：顿挫病毒：被病毒侵入的细胞如不能为病毒增殖提供必需成分，则病毒不能合成本身成分，或能合成但不能组装和释出有感染性的病毒颗粒。非容纳细胞与容纳细胞。缺陷病毒：病毒基因组不完整或某一基因位点改变，不能正常增殖，不能复制出完整有感染性的病毒颗粒，此病毒即缺陷病毒。缺陷病毒+辅助病毒=完成复制 16：细菌的感染与致病。答：感染：在一定条件下，微生物与机体相互作用并导致机体产生不同程度的病理过程。★

17：细菌的毒力比较，外毒素与内毒素生物学特性。答：【表格】种类：内毒素★外毒素。来源：G-菌★G+菌部分G-菌。编码基因：染色体基因★质粒或前噬菌体或染色体基因。存在部位：细胞壁成分、细菌裂解后释出★活菌分泌或细菌溶解后散出。化学成分：脂多糖★蛋白质。稳定性：好(160℃2~4h才破坏）★差（60~80 ℃30m可破坏）。毒性作用：弱、各种内毒素作用大致相同★强、对机体组织器官有选择性。抗原性：弱，甲醛处理后不能形成类毒素★强，能刺激机体形成抗毒素，经甲醛脱毒后能形成类毒素。

18：细菌感染的类型答：①不感染②隐性感染③潜伏感染④显性感染：急慢性感染；局部、全身感染⑤带菌状态。

19：病毒感染类型。答：①隐性感染②显性感染：急性病毒感染：潜伏期短，发病急，数日或数周回复，病原消灭型感染。持续性病毒感染：慢性病毒感染；潜伏性病毒感染；慢发病毒感染。

20：细菌的致病机制。答：细菌的致病性强弱取决于毒力，细菌的毒力因子：①侵袭力：致病菌突破宿主生理屏障，进入机体并在体内定植、繁殖和扩散的能力包括黏附素、荚膜和微荚膜、侵袭性物质②毒素：细菌产生的损伤宿主引起生理功能紊乱的毒性物质，包括内毒素和外毒素。

21：正常菌群的生理作用。答：①生物拮抗：竞争粘附（占位性保护）作用；产生有害代谢物质；营养竞争②营养作用③免疫作用④抑癌作用⑤抗衰老作用。

22：病毒分离鉴定方法及病毒在培养细胞中的增殖的指标。答：病毒的分离：①动物接种②鸡胚培养；流感病毒初次分离接种于羊膜腔；流感病毒的再培养接种于尿囊腔③组织培养④细胞培养 — 病毒分离鉴定中最常用的方法单层细胞培养；原代细胞培养；二倍体细胞培养；传代细胞培养。指标：1）细胞的变化①细胞病变效应：有些病毒在细胞内增殖时引起的特有的细胞病变，如细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落②多核巨细胞形成：有些病毒如麻疹病毒、巨细胞病毒等作用于细胞膜，使邻近的细胞融合，形成多核巨细胞③胞质或核内包涵体的形成狂犬病病毒、巨细胞病毒。2）红细胞吸附流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素，具有吸附脊椎动物红细胞的能力，这一现象称为红细胞吸附。常用来鉴定具有血凝素的黏病毒或副黏病毒的增殖3）.红细胞凝集检测含血凝素病毒的方法4）干扰现象5）空斑形成试验。

23：病毒成份的检测（抗原、核酸检测）答：1.病毒抗原的检测2.病毒核酸的检测

24：真菌的形态结构（单细胞和多细胞真菌）。

灰黄霉素、制霉菌素B、二性霉素B、氟康唑和酮康唑；对抗生素不敏感。

28：抗菌药物的种类与作用机制。答：杀菌药和抑菌药。机制：①抑制细菌细胞壁的合成②抑制细菌

细胞膜功③抑制细菌蛋白质合成④抑制细菌核酸合成。29：细菌耐药的机制。答：产生钝化酶；细胞通透性的改变；靶位结构的改变；建立代谢旁路；代谢酶分子的改变

30：医院感染的定义。答：由医院的病原生物或其毒素导致的局部或全身感染性疾病。

31：细菌分离培养和鉴定、生化试验、血清学试验？答：细菌分离培养和鉴定：原则上应对所有送检标本做分离培养，以便获得单个菌落后进行纯培养，从而对细菌做进一步的生物学、免疫学、致病性或细菌的药物敏感性等方面的检查，最终获得确切的报告。生化试验：得到细菌的纯培养物后，用糖发酵试验，吲哚试验，硝酸盐还原实验等对细菌的酶系统和其代谢产物的检查，是鉴别细菌的重要方法之一。血清学实验：利用含已知的特异性抗体的免疫血清，对细菌进行群和型的鉴别。

微生物种类名称★生物学性状★致病物质、致病机理及所致疾病

破伤风梭菌：菌体细长，芽胞正圆比菌体粗，位于菌体顶端菌体鼓槌状★不发酵糖类，不分解蛋白质。条件：局部伤口需形成厌氧微环境，伤口窄而深，有泥土或异物污染，大面积创伤，坏死组织多，局部组织缺血，同时有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染的伤口。防治原则：特异性预防：注射破伤风类毒素主动免疫；迅速对伤口清创扩创，防止形成厌氧微环境；紧急预防：TAT（精制破伤风抗毒素）；治疗： 早期足量使用TAT，抗生素。产气荚膜梭菌：G+粗大杆菌，芽胞位于次极端，椭圆形，直径小于菌体形成明显荚膜★血平板：双层溶血环，代谢十分活跃，牛奶培养基：“汹涌发酵”现象。增加血管通透性，组织坏死，气性坏疽，食物中毒，坏死性肠炎。

肉毒梭菌：G+粗短杆菌，芽胞位于次极端，椭圆形，菌体呈网球拍状，严格厌氧，分型多，生化反应复杂★肉毒毒素，抑制乙酰胆碱释放，引起运动神经末梢失调→肌肉麻痹；食物中毒，婴儿肉毒中毒。

支原体：菌落油煎蛋型，高度多形态型，细胞膜含高度固醇，无细胞壁，对青霉素有抵抗作用★支原体肺炎，病变为间质性肺炎，可合并支气管肺炎。称为原发性非典型性肺炎。不规则发热，刺激性咳嗽，头痛。婴幼儿病情严重，发病急，病程长，以呼吸困难为主。有些合并其他系统病变，如循环系统等。飞沫传播。立克次体：是一类体积微小，绝大多数为自身代谢不完善，严格细胞内寄生的原核细胞型微生物★流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、恙虫病、Q热

衣原体：严格细胞内寄生，有独特发育周期，能通过细菌滤器，原核细胞型微生物★ 沙眼:感染眼结膜上皮细胞→增殖，包涵体→局部炎症→早期流泪、有粘液脓性分泌物、结膜充血及滤泡增生→后期结膜瘢痕、眼睑内翻、倒睫以及角膜血管翳引起的角膜损害→影响视力或致盲包涵体结膜炎、泌尿生殖道感染、沙眼衣原体肺炎、性病淋巴肉芽肿

螺旋体：是一类细长、柔软、弯曲、运动活泼的原核细胞型微生物基本结构及生物学形状与细菌相似★梅毒，人是唯一传染源，致病物质为荚膜样物质，透明质酸酶；后天通过性接触传播或者先天经过母体传播。

第四篇：微生物总结

第一章、绪论

巴斯得的贡献：

1、彻底否定了“自生说”

2、免疫学—预防接种

3、证实发酵是由微生物引起的3、巴斯德消毒法

柯赫贡献：

1、证实炭疽病菌是炭疽病的病原菌

2、发现了肺结核病的病原菌

3、提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的病原菌——柯赫原则

4、固体培养基分离纯化微生物的技术

5、配制培养基

微生物的5大共性：

1、体积小、面积大

2、吸收多、转化快

3生长旺、繁殖快

4、分布广、种类多

5、适应性强、易变异 第二章、微生物的纯培养和显微技术

一、涂布平板法作用：用于纯种分离、筛选菌落、得到单菌落，对一些细菌进行计数 五区划线发作用：纯化菌种、得到单菌落

摇瓶实验作用：菌种筛选、发酵实验、种子培养等 穿刺法的作用：保藏厌氧菌种、研究微生物的动力 之字划线法的作用：保藏菌种、单菌落的获取

二、斜面菌种保藏法：保藏期限3个月以内，沙土管保藏法：保藏期限1~10年主要适用于产孢子的，如芽孢杆菌、放线菌 石蜡油封藏法：保藏期限1~2年

真空冷冻干燥法：保藏期限5~10年，液氮超低温病结法：保藏期限5~10年 第三章

一、细胞壁：根据细胞壁将原核生物分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两种。

1、革兰氏阳性菌细胞壁的特点：厚度大（20~80nm）和化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。

革兰氏阳性菌的机械阻拦与保护作用有肽聚糖完成。磷壁酸：是结合在革兰氏阳性菌细胞壁上的一种酸性多糖，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。

磷壁酸为革兰氏阳性菌所特有。对于革兰氏阳性菌而言，抗原性由磷壁酸完成。磷壁酸的主要生理功能：1）、其磷酸分子上较多的负电荷可提高细胞周围镁离子的浓度进入细胞后就可以保证细胞膜上一些需镁离子的合成提高活性 2）储藏磷元素 3）、增强某些致病菌如A族链球菌对宿主细胞的黏连、避免被白细胞吞噬以及补抗体的作用 4）赋予革兰氏阳性菌以特异的表面抗原 5）可作为噬菌体的特异性吸附受体

6）调节细胞自溶素的活力，借以防止细胞自溶而死亡

2、革兰氏阴性菌：由肽聚糖和外膜组成，外膜中的脂多糖是革兰氏阴性菌所特有的 外壁层可分为3层：外层为脂多糖层，中层为磷脂层，内层为脂蛋白 革兰氏阴性菌外膜的作用：1）控制细胞透性

2）提高镁离子浓度 3）决定细胞的抗原性

4）类脂A是类毒素的主要成分

脂多糖：是位于革兰氏阴性菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖物质，由类脂A、核心多糖和O-特异侧链

脂多糖的功能：1）其中类脂A是革兰氏阴性菌致病物质——内毒素的物质基础 2）因其负电荷较强，有吸附镁离子、钙离子等阳离子以提高其在细胞表面的浓度作用 3)由于LPS结构多变，决定了革兰氏阴性菌细胞表面抗原决定族 4）是许多噬菌体在在细胞表面的吸附受体 5）具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能

3、革兰氏染色机制：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞膜内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密，故与乙醇与丙酮作脱色处理时因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢留在壁内，使其任呈紫色。反之革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层的类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差，遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘的复合物的溶出，因此，通过乙醇脱色后细胞退成无色。这时，再经沙黄等红色染料进行复染，就使革兰氏阴性菌呈现红色，而革兰氏阳性则保留紫色。

二、芽孢

芽孢：某些细胞在生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体

芽孢的特点：1）芽孢内新陈代谢几乎停止，处于休眠状态，但保持潜在萌发力

2）芽孢不具生殖能力，仅只是一种休眠体 3）抗逆性最强的生命体之一，有抗热、抗化学药物、抗辐射和抗静水压能力 4）含水量低，壁厚而致密，通透性差，不易着色，折光性强

5）一个孢子萌发只产生一个营养状态的细胞 芽孢的耐热机制：芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差和皮层的离子强度很高，从而是皮层产生极高的渗透压去夺取芽孢核心中的水分，其结果造成皮层的充分膨胀，而核心部分的细胞质却变得高度失水，因此，导致核心具极强的耐热性。第四章微生物的营养要求

一、营养物质：能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理条件所需的物质 营养：微生物获得U和利用营养物质的过程

二、1、碳源：是在微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质。为微生物提供碳元素与能量

2、氮源：为微生物提供氮元素来源，只有少数自养微生物能利用铵盐、硝酸盐同时作为氮源与能源（是构成细胞中核酸和蛋白质的重要元素）氮源的类型：无机氮、有机氮、气体氮

3、无机盐：作用：作为酶活性中心的组成部分、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质。

4、生长因子：通常是指那些微生物生长所必需的的且需量很少，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物

5、水：生理功能：1)起到溶剂与运输介质的作用

2）参与细胞内一系列的化学反应

3）维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象

4）是良好的导热体，调节细胞温度 微生物的营养类型分类（P84表格）

三、1、培养基的配制原则：1）目标明确

2）营养协调

3）物理化学条件适宜

4）原料来源的选择

2、C多有助于次生物质分泌，N多有助于个体生长发育

3、PH：细菌：7.0~8.0

酵母菌：4.0~6.0

放线菌：8.0~9.0

霉菌：4.0~5.8

4、维持培养基PH的方法：1）加缓冲剂一氢和二氢磷酸盐的混合物

2）备用碱：CaCO3、CaHCO3 3）弱酸盐：柠檬酸盐、乳酸盐

4）液氨或盐酸

5、原料来源：1）经济节约原则：以粗代精、以废代好、以简代繁

2）原料来源要广泛

3）原料药易处理、处理成本要低

4）原料处理后废物、废液、废气要少

6、选择和配制培养基的方法四种：生态模拟、查阅文献、精心设计、实验比较

四、培养基的分类

1、按成分不同划分：天然培养基：优点为取材方便，营养丰富，种了多样，配制方便合成培养基：优点：组分精确，重复性好确定：较昂贵，一般用于研究

2、根据物料状态划分：固体培养基：一般用于进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏半固体培养基：用于观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定液体培养基：用于大量培养微生物，研究生理代谢

3、按用途划分：基础培养基：用于培养野生型微生物和原养型微生物 加富培养基（营养培养基）：在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基作用一般为分离某种微生物而专门设计或培养营养要求严谨的异样微生物 鉴别培养基：在培养可中加入某种特殊化学物质 选择培养基：根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需要微生物的生长，有利于所需微生物的生长 第五章、微生物代谢

微生物发酵过程的三个阶段：脱氢（电子）、递氢（或电子）和受氢（或电子）发酵：是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某些中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物

代谢：生命存在的基本特征，是微生物体内所进行的全部生化反应的总称。主要由分解代谢和合成代谢两个过程组成。分解代谢：是指将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量（都是氧化反应）合成代谢：是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子，在这个过程要消耗能量（都是还原反应）

代谢途径都是有一系列连续的酶促反应构成的

P102~P105EMP HM ED途径的特点功能以及途径路线

根据氧化还原反应电子受体的不同可将发酵和呼吸分为有氧和无氧呼吸两种 P108 TCA途径图

TCA循环特点：1）氧虽然不直接参与其中反应，但必需在有氧条件下运行

2）每个丙酮酸产生15个ATP 3）位于一切分解代谢与合成代谢的枢纽地位，可为生物合成提供各种碳价原料

TCA的生理意义：1）为细胞提供能量

2）各种能源物质彻底氧化的共同代谢途径（对于微生物来说）3）物质转化枢纽

无氧呼吸：电子受体不是氧气而是外源无机物与部分简单小分子有机物

发酵作用：没有外源电子受体，底物具有的能量只释放一小部分，合成少量ATP 三种磷酸化：底物水平磷酸化，高能磷酸化，氧化磷酸化

光合磷酸化的特点：1）光驱使下电子自菌绿素上逐出后经类似呼吸链又回到菌绿素

2）产还原力[H]和产ATP分别进行，还原力来自于H2O等无机物

3）不产生氧气 合成代谢：微生物利用能量代谢所产生的能量、中间代谢产物以及从外界吸收的小分子合成复杂细胞物质的过程

P118~P119 CO2固定路线图

蓝细菌孤单的抗氧化保护机制：1）分化出特殊的还原性异形胞

2）非异形胞蓝细菌固氮酶的保护将固氮与光合进行时间上分隔

微生物固氮反应6要素：1）ATP的供应

2)还原力[H]及传递氢载体

3）固氮酶

4）还原底物——氮气

5）镁离子

6）严格厌氧微环境

联合固氮菌：指必需生活在植物根茎叶，动物肠道等处才能进行固氮的微生物，不形成类似根瘤的共生结构 微生物的代谢调节主要有两种类型：一是酶活性的调节，即调节已经存在的酶分子的活性，是酶在化学水平的变化。另一类是酶合成的调节，即调节酶分子的合成量，是遗传水平发生的变化 第六章

一、生长曲线延滞期

特点：1）生长速率常数为零，细胞数目不增加或增加很小

2）细胞形态变大或 增长许多杆菌可长成丝状

3）合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP 的合成加速产生各种诱导酶

4）对外界不良条件如NaCl溶液，温度和抗 生素等理化因素反应敏感

出现原因：1）微生物接种到一个新的环境，暂缺乏足够的能量和必需的生长因子

2）“种子”老化即处于未对数期或种子未活化

3）接种时损伤

影响其长短的因素与实践意义：1）接种龄：对数期种子延滞期短，延滞期或衰亡期的种子延滞期较长

2）接种量：接种量大，延滞期较短，接种量小，延滞期较长

3）培养基成分：培养基成分丰富的延滞期较短，培养基成分与种子培养基一致的延滞期较短

二、生长曲线指数期

特点：1）生长速率最快，细胞呈指数增长

2）生长速率恒定

3）代谢旺盛，细胞组分平衡发展

4）群体的生理特性一致

影响指数期的意义：1）菌种：不同菌种代时差异极大

2）营养成分：营养越丰富代时越短

3）营养物浓度：影响微生物的生长速率和生长总量

4）培养温度：影响微生物的生长速率和生长总量

指数期的实践意义：1）是代谢、生理研究的良好材料

2)是增殖噬菌体的最适宿主菌龄

4）革兰氏染色是采用此期微生物

生长曲线稳定期特点：1）活细胞总数维持不变即新增殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，菌体总数达到最高点

2）细胞生长速率为零

3）细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化，细胞成分合成缓慢，革兰氏染色发生变化

三、生长曲线衰亡期

特点：细胞以指数速率死亡，有时细胞速率的降低是由于抗性细胞的积累，细胞变形退化，有的发生自溶，革兰氏染色发生变化

影响衰亡期的因素及实践意义：1）与菌种的遗传特性有关：有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡，有细菌培养基个月乃至几年以后任然有一些货细胞

2）与是否产芽孢有关：产芽孢的细菌更易幸存下来

3）与营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存货时间

四、分批培养：是指将微生物置于一定容积的的培养基中，经过生长培养，最后一次收获培养方式 连续培养：在一个恒定容积的的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物）

连续发酵的优点：1）高效

2）产品质量较稳定

3）节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理

连续发酵的缺点：1）菌种易退化

2）易污染杂菌 3）营养物质的利用率一般 同步生长：就是指在培养物中所有微生物细胞都同一生长阶段，并都能同时分裂的生长方式 同步培养法包括诱导法与选择法

诱导法：是采用物理、化学一男子使微生物生长到某一阶段而停下来，使所有细菌都达到这个阶段时再使其生长 恒浊器：根据培养器内微生物的生长密度并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞的连续培养

恒化器：与恒浊器相反，是一种设法使培养液流速保持不变 最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置 装置

控制对象

培养基

培养基流速

生长速率

产物

应用范围

恒浊器

菌体密度(内控制)

无限制生长因子

不恒定

最高速率

大量菌体或与菌体平行的代谢产物

生产为主

恒化器

培养基流速（外控制）

有限制生长因子

恒定

低于最高速率

不同生长速率的菌体、并使微生物始终在低于其

实验室为主

五、防腐：是在某些化学物质或物理因子作用下防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止其他物质霉变 消毒：利用某种杀死或灭活物质或物体中所有微生物的一种措施，它可以起到防止感染或传播的作用

灭菌：利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施 第七章

1、病毒的特点:1)形态及其微小，一般能通过细菌滤器必须自电镜下才能观察

2）没有细胞构造，主要成分仅为核酸与蛋白质

3）每一种病毒致含有一种核酸

DNA和RNA 4）依靠自身的核酸进行复制，一病毒的核酸和蛋白质等原件实现装配，实现繁殖

5）严格细胞内寄生，缺乏完整的酶和产能系统，只能利用宿主细胞的现成的代谢系统合成病毒自身的核酸和蛋白质

6）在离体条件下，能以无生命力的大分子状态存在，并可长期保持器侵染力

7）对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感

8）有些病毒的基因可以整合到宿主的基因中去

2、病毒与活细胞的区别：1）结构简单，没有细胞结构

2）几乎所有的毒粒中只有DNA或RNA一种类型的核酸

3）在细胞外不能增殖

3、得到一步生长曲线的实验：二院培养系统：1）低浓度病毒宿主细胞(给几分钟时间侵染)2）高倍稀释病毒与细胞的培养物

3）保湿培养

4）不同时间取样，涂布平板，得到效价

5）以时间为横坐标，病毒浓度为纵坐标绘图

4、烈性噬菌体：感染宿主后增殖裂解宿主 溶原性噬菌体（温和性细菌）：感染后大多数可整合到宿主基因中少数以染色体外独立存在

5、病毒分为真病毒和亚病毒，亚病毒又分为类病毒、卫星病毒、卫星RNA、朊病毒 类病毒：是一种只包含RNA的病毒，只在植物中出现，分质量极小，不能编码蛋白质 卫星病毒：寄生于与之无关的辅助病毒的基因产物的病毒 卫星RNA：是指必需依赖一些辅助病毒进行复制的小分子单链RNA，他们被包藏在辅助病毒的壳体中

朊病毒：是一类能引起哺乳动物亚急性海绵样脑病的病原因子 第八章

P204页Griffith转化实验等3个实验

基因组：是指位于细菌或细胞中的所有基因 大肠杆菌基因组的特点：1）遗传信息的连续性

2）功能相关的结构基因组成操纵子结构

3）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝

4）基因组重复序列少而短

质粒：是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物中

转座子：是位于染色体或质粒上的一种能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中

质粒的主要类型：致育因子、抗性因子、Col质粒、毒性质粒、代谢质粒、隐秘质粒

致育因子：又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（结合作用）有关的质粒

抗性因子：是另一类普遍而重要的质粒，主要包括抗药性和抗重金属两大类，简称R质粒 Col质粒：该质粒含有编码大肠菌素的基因，大肠菌素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响

毒性质粒：致病菌中携带的能引起致病性的质粒，这些质粒具有编码毒素的基因 代谢质粒：携带有能降解某些基质的酶的基因的质粒

隐秘质粒：不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理方法检测出来 原核生物中对的转座因子有3种类型：插入顺序（IS）、转座子（Tn）、病毒（Mu）转座的遗传学效应：插入突变、产生染色体畸变、基因的移动和重排

基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变包括一对或几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化

碱基变化对遗传信息改变的四种类型：同义突变，错义突变，无义突变，移码突变 同义突变：是指某个碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的密码子变化

错义突变：是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的改变（可能为致死突变）无义突变：是指某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质的合成的终止密码子，蛋白质的合成提前终止，产生短截的蛋白质

移码突变：由于DNA序列中发生1~2个核苷酸的缺失或插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致改变位置以后的氨基酸序列的完全变化（一般为致死突变）

表型变化的突变型：营养缺陷型，抗药性突变型，条件致死突变型，形态突变型 营养缺陷型：缺乏合成其生存所必需的营养物的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或前体物才能生长 影印平板P218 抗药性突变型：是由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素产生抗性的一种突变型

条件致死突变型：是指在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型 形态突变型：是指造成形态改变的突变型（包括菌落形态、颜色一件噬菌斑形态）

自发突变的缘由：1）NDA复制过程产生的错误

2）碱基互变异构体的相互转变

3）转座子的随机插入基因

自发突变的特性：1）非对应性

2）稀有性

3）规律性

4）独立性

5）遗传和回复

6）可诱变性

诱发突变：碱基类似物、插入染料、直接与DNA其化学反应的诱变剂、辐射和热、生物诱变因子

DNA损伤修复：光复活作用、切除修复、重组修复、SOS修复 光复活：由phr基因编码的光解酶进行

切除修复：又称暗修复，该修复系统除了碱基错误配对和单核苷酸插入不能修复外，几乎其他DNA损伤均可修复，是细胞内主要修复系统

重组修复：是一种越过损伤而进行的修复，这种修复不将损伤碱基除去

SOS修复：是DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应 P226~227 高频重组菌等

转导：是由病毒介导的细胞间进行遗传交换的一种方式

供体DNA进入受体的命运：1）发生稳定的转导子

2）流产转导：即不被降解，又不被整合，也不被复制

3）外源DNA被降解，转导失败

遗传转化：是指同源或异源的游离DNA分子被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程

4个影响供体DNA与受体细胞间的最初相互作用：1）转化片段的大小

2）形态：双链DNA 3）浓度：在在临界值出现之前成正比

4）生理状态：感受器——刚停止DNA合成 微生物育种：诱变育种、代谢育种、体内基因组育种 代谢育种：改变代谢途径、扩展代谢途径、构建新的代谢途径 体内基因组育种：原生质体融合，杂交育种

融合子的判别：1）亲本遗传标记的互补的2）亲本灭活后性状的恢复

3）具有双亲本的荧光标记 第九章

顺式作用元件：位于基因的旁侧，可以调控影响基因表达的核酸序列。其本身并不编码蛋白质

反式作用因子：通常为蛋白质或RNA，其特征是可以合成并扩散到目标场所发挥作用 正调控：控制因子通过与启动子原件结合来激活基因的表达 负调控：抑制物与操纵基因结合起来阻止基因表达 P248 操纵子的结构

P249图

P250 图

启动子：是RNA聚合酶和CAP的结合位点，控制着转录的起始，一个启动子可以启动多个基因的表达

操纵基因：DNA上的一个结合位点，阻抑物能与之结合抑制相邻启动子的起始转录，操纵基因不表达任何东西 终止子：控制转录结束

转录因子：转录起始过程中RNA聚合酶所需要的辅助因子

转录水平的调控:1）DNA的结构

2）RNA聚合酶的功能

3）蛋白质因子及其他小分子配基的相互作用

第五篇：微生物的分离与培养

病原物的分离与培养

病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤: 1.有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。－、灭菌与消毒

灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

(一)热力灭菌

热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1．干热灭菌

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。

干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。湿热灭菌

(1)高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0.1MPa，121℃保持15～30 min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。

(2)常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。

常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内，每天加热100℃，30 min，连续3 d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18～24 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。

(二)过滤除菌

许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，—均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：

(1)蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液臵于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小，滤板分为3种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。

(2)微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装臵的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：

① 组装、灭菌 将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。

② 压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。

提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。

(三)辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。

注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。

此外，采用60Co-γ射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。

(四)化学药品灭菌

化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。

植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。

二、培养基的制作

1、目的要求

了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。

2、基本原理

在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好，因此，对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围。－般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。

培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂，半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂。琼脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏(Czapek)培养基等。

根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。

在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。

3、材料、试剂与仪器 材料 马铃薯。

试剂 葡萄糖、琼脂等。

仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。

4、操作步骤

PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml，自然pH。

在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。(1)称量 称量去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g。提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的15 g就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。

(2)将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000 ml，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。

(3)将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。

提示：在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。

(5)分装 根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管，其量为管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。

(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花，棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在植物病理学研究工作中普遍使用。

正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合，过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的，且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有1／3在外，2／3在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。

(7)包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。

(8)灭菌 将上述培养基以0.1MPa，121℃，高压蒸气灭菌20 min。

(9)搁臵斜面 将灭菌的试管培养基竖臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁臵的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

培养基经灭菌后，必须放在37℃温箱培养24h，无菌生长者方可使用。

PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。

三、病原菌的分离培养和纯化

1、目的要求

(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。

(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。

2、基本方法

植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。

为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。

3、材料、仪器与用具 3.1 材料

(1)稻瘟病（叶、病节、病穗颈）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3)黄瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。

(5)黄瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黄瓜细菌性角斑病（叶）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。

(7)水稻白叶枯病（叶）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜软腐病（叶）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。

3.2．培养基 PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。

3.3．仪器与用品 超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0.1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等。

4、实验操作

(一)病原真菌的分离

1．组织分离法 其步骤为：

(1)取灭菌培养皿一个，臵于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手，操作时还需用70 ％酒精擦拭双手；无菌操作时，呼吸要轻，不要说话。

（2）用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1～2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60℃左右的PDA培养基倒人培养皿中，每皿倒10～15 ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。

提示：加入25％乳酸1～2滴，可减少平板上出现污染细菌菌落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45℃左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处，)切取小块(每边长3～4 mm)病组织数块。

提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健组织的部分分离。

（4）将病组织放入70％酒精中浸3～5s后，按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。

提示：先用70％的酒精浸2～3 s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至l min)升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3～5 min。

(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4～6块。

提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。

(6)将培养皿倒臵放入25℃左右恒温箱内培养。一般3～4 d后观察待分离菌生长结果。

(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25 ℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种，便可臵于冰箱中保存。

提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的菌落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。

在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上，完成分离工作。

2.稀释分离法

(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。

(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0.5～1.0 ml。(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。

(4)将熔化并冷却到45～50℃的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。

提示： 倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，不利于分离。

(5)将培养皿翻转后臵恒温箱(25℃)中培养，数日后观察菌落生长情况。

(6)挑菌 将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，臵25℃左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。

(二)病原细菌的分离

病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。

除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中2～4 h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2)将病组织先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20～60 min，让细菌释放到灭菌水中。

(3)用灭菌的接种铒，(接种环)；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼，冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。

提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。

(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28℃恒温箱中培养。1～3 d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。

(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。

(三)真菌、细菌培养性状

1．真菌培养性状观察 取已分离，纯化的某种真菌菌种；按前述稀释分离法中(1)～(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。

2．细菌培养性状观察

(1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。

(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过2～3 d后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味生成，生长速度快慢等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。

(3)用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培养基中，数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成，培养液表面是否可生成菌膜等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。