分子实验学习总结——郁娟娟

第一篇：分子实验学习总结——郁娟娟

DNAstar：序列拼接 MEGA：分析碱基组成 CLUSTAL：序列比对 PAUP：跑树 DABE：饱和性分析

总思路：序列拼接-比对-

四、下载序列的方法

打开.Fasta格式的序列-File export-sequance alignment-保存 在NCBI上找到相应的序列方法：

Search Nucleotide

for 文章的genibank序列号-reports-复制序列到txt文件中，删除没用的东西，只留下序列和学名。保存成txt文件后，打开Editseq-将,txt序列复制到其中-save保存为seq格式

五、将拼接序列翻译成蛋白质方法

打开拼接的序列-全选中-Goodies-translate DNA

2、如何计算碱基含量比值、答：MEGA-Nucleotide Composition

六、DAMBE序列饱和性分析

序列的饱和性分析在DAMBE程序中，以转换、颠换数为纵轴，以TN93模型（Tamura and Nei, 1993）校正的距离为横轴做散点图。如果这些点随序列间分歧增大呈线性分布就说明序列间替换没有达到饱和，序列可以用于后续的系统发育分析。DAMBE还长用在单倍型的归纳、基因频率和碱基组成分析、遗传距离计算、序列排序、5.2.2碱基替换饱和效应的检验

当核苷酸序列分歧较小时，序列之间被观察到的核苷酸差异数接近实际替换数。如果序列分歧较大，DNA序列的变异可能会受到饱和效应的影响，这时观察到的碱基差异可能包含了部分进化杂音。一般说来，碱基转换发生的频率高于颠换，但是随物种分歧程度的增加，转换/颠换的比率接近或小于1，说明转换可能已经趋于饱和并可能成为进化杂音，所以转换和颠换发生的频率与序列间分歧度的关系就可以反映出碱基替换是否受饱和效应的影响。在着手构建分子系统树前，为了排除这种进化杂音获取正确的进化信息，必须对目的片段的碱基替换是否受到饱和效应的影响进行检验。

用 DAMBE（Xia，2000）分别对四个mtDNA片段的碱基替换模式进行检测，以此估计所研究mtDNA片段的碱基替换是否受到饱和效应的影响。

打开DAMBE-FILE-Open standard sequence file-类型unknown-打开

proteincoding

and

nuc.seq-invMtdna-trains-table

versis

advance –go-graphics-trainsition tranversion –tn93-g0-graphstyle-curve only-保存.bmp

问题

1、如何计算密码子的不同位上碱基变化，转换颠换比值

2、如何进行序列的饱和性分析

序列的饱和性分析在DAMBE程序中，以转换、颠换数为纵轴，以TN93模型（Tamura & Nei, 1993）校正的距离为横轴做散点图。如果这些点随序列间分歧增大呈线性分布就说明序列间替换没有达到饱和，序列可以用于后续的系统发育分析。

3、如何看用Editseq检验拼接后的序列是否能正确翻译为蛋白质

4、如何计算遗传距离（DAMBE）

一、DNAstar：序列拼接

在序列的拼接时，修改红色和小写字母的碱基 具体步骤：

1、2、ABI文件包括图形和序列、SEQ文件只有序列没有图。DNAstar—seqman—File—NEW，把序列都放近去，有两个正向，俩个反向的序列—Time ends—LOW—SEAN ALL-ASSEMBLE –出现contig 打开-双击contig_@_核对-contig-save consenus-single file-保存位置-sequce-add-选择保存到的位置-点序列名字-add-双击-拼接完关闭。3、4、5、原始序列和拼接的序列各保存在一个文件夹内。EDIT-GOODIES-TRALS 翻译成蛋白质。‘

从ncbi上下载相关的序列和测得的序列保存在一个文件夹内，把前面的内容都删除，保留种名。加〉符号-保存

二、序列的比对

6、先切齐序列：用Seqman-sequence-add-skip-把所有的序列加进去进行删除，使序列整齐。-contig双击,将序列切齐，再复制到一个新建的文本文档。

7、切齐后保存方式：contig-export sequences-multiple files=set location-file-保存切齐

8、当在切齐的序列中发现反向序列要改正：用editseq打开序列-select all –goodies-reserse complement-全选粘贴到文本文档中，目的是比对。

三、构建NJ树方法(MEGA)

1、将TXT格式保存为nexus和clustal格式（生成alndndnxs）CLUSTAR-进行比对-FILE-LOAD SEQUENCE-打开新建的文本文档txt-加入进去后-aligment-do complete Alignment-File-Save sequence as –format-custal-ok-File-Save sequence as –format-NEXUS最后保存为nexus和clustal格式，NEXUS是PAUP格式-关闭clustal.2、点击MEGA-File-open data-.aln文件-打开-ok-点击向下的绿色图标MEGA-File-open data-切齐序列,meg-ok-yes-inverttebrate-ok-ok-删除最后没用的东西-保存-切齐序列,meg-

3、点击Mitochondrial-ok-

4、phylogency-construct phylogency-NJ树-none改成bootstrap-k 2p-compute-保存（image-EMF）

5、使用Mega 2.0分析序列间的p-distance, 即两两序列间的核酸差异比例，分析序列变异情况 方法1：

Distance-compute pairwise-distance only改为std err-compute 方法2：

pattern-compute composition distance

三、构建MP树方法

1、MrBays，目的是转化为.nex文件步骤为：

用bioedit将.txt文件比对转换成.nex文件格式

方法：打开BioEdit，将.txt文件打开-Accessory application-clustal multiple alignment-File-export-sequence Aligment-选paup/nex命令.nex-保存-把.nex begin 前面的都删除。File-open-切齐序列.txt-accessory appliacation-clustal multiple aligment-file-expore-sequence aligment-选paup/nenu命名.nex-保存

2、在.nex中加命令模板

;end;begin paup;log file=coimp;set maxtrees=1000;set criterion=parsimony;hsearch addseq=random nreps=1000;showtrees;describetrees 1/plot=phylogram brlens=yes;savetrees file=coi(mp).tre root=yes brlens=yes;contree all/file=coi.tre;pscore all/CI=yes RI=yes RC=yes;bootstrap

nreps=1000 search=heuristic/addseq=random nreps=100;savetrees file=coi(mpb).tre root=yes;END;

2、打开paup-打开1.nex-open –开始跑树

3、用treeview 打开.tree树。

keepall=yes

MrBays建树

1、用bioedit将.txt文件比对转换成.nex文件格式

方法：打开BioEdit，将.txt文件打开-Accessory application-clustal multiple alignment-File-export-sequence Aligment-选paup/nex命令.nex-保存-把.nex begin 前面的都删除。

File-open-切齐序列.txt-accessory appliacation-clustal multiple aligment-file-expore-sequence aligment-选paup/nenu命名.nex-保存2、3、用paup运行.nex文件

接着继续用paup打开modeltest3.7 文件夹中的model paupblock命令-运行结束后，在modeltest 的modelfolder中生成一文件名为”model.scores”文件。

4、运行modeltest批处理文件，生成一文件名为”mt.txt”文件，则为最适合的模型文件

5、将最适模型文件中的参数(hLRTs)拷贝到.nex文件后，加入贝叶斯运行命令，并改正.ne格式等。删除前后没用的，改正外群名字等。只能用一个外群。

begin mrbayes;log start filename=coibayes.log;outgroup Cinara;Prset statefreqpr=dirichlet(0.3321,0.1058,0.1271,0.435);Lset nst=6 rates=gamma;mcmc ngen=1000000 printfreq=100 nchains=4 savebrlens=yes startingtree=random;end;

6、将加好命令的.nex文件拷贝到MrBayes文件夹所在路径内，运行人头的MrBayes , 输入execute.文件名.net,回车。

7、8、输入 sump burnin=1000回车 输入 sumt burnin=1000回车

9、运算完毕后点击close 弹出一对话框，输入命令语句“ save tree file＝文件名.tre；”回车。

菜单栏Tree中的Show internal edge labels 即可显示各结点的bootstrap值。

9、生成的.con，用treeview打开

注意：贝叶斯树只能用一个外群。建设一个新文件夹，将.scores、mt.txt、txt、nex文件都放到一个文件夹内。

ML建树

方法同MrBays相似。预测模型利用贝叶斯得到的模型。把ML命令模板拷贝到.nex，把log file改成自己的名(=coiML)，外群也改(Daktulosphaira_vitifoliae Cinara_edulis C_arizonica);-把最适模型lset base---likhood下面savetree file=coi savetrees file=coin(mb)Lset Base=(0.3365 0.0976 0.1280)Nst=6 Rmat=(26794342.0000 8028280.5000 10365153.0000 1.4084 255543472.0000)Rates=equal Pinvar=0.7355;–生成的.nex.con文件-treeview打开。

注意：外群要写成Cinara_edulis形式，可以有多个外群。打开方式和mp树一致。

戴传银笔记 PAUP NJ tree begin paup;outgroup outgroupname;setcriterion=distance;bootstrap search=nj nreps=1000 keepall;savetrees file=nj.tre;end;

PAUP MP TREE begin paup;outgroup outgroupname;setcriterion=parsimony;hsearch addseq=simple(random)bootstrap nreps=1000;describetrees 1/plot=phylogram brlens=yes;savetrees from=1 to=1000;end;

PAUP ML TREE begin paup;outgroup outgroupname;setcriterion=likelihood;gettrees file=xxx.tre;(xxx modeltest文件保存的树的名称)hsearch addseq=asis bootstrap nreps=1000;savetrees file=ml.tre;end;

MEGA3.1分析其核酸组成

1、打开MEGA，点击“File”中的“Open Data”打开“COI.aln”文件，点击绿色箭头－“Convert to Mega format”快捷键，出一把COI.aln转换成Mega格式的对话框，点击OK，即转换成COI的Mega file，保存。

2、用Mega 打开该文件。选Data Type。Protein－coding nucleotide sequence data？Yes。Select genetic Code。程序自行计算。

3、点击TA图标，出现Sequence Data Explorer C：Conserved sites 291/660,分母613是总位点数 V：Variable sites 352/660 P: Parsimony-informative sites 26/660 N: Nonparsimony-informative sites 352-26＝326。

4、Mega-File-open

date-运

算

-sequence

Data Explorer-write data to file-title-写名字.nex 注意：序列一定要正确，不能是反向的！！！

5、打开paup-打开1.nex-open –开始跑树

6、Bootstrap 值检验及树的保存

输入命令“bootstrap nreps＝1000 keepall＝yes search＝heuristic/addseq＝random nreps＝100；”点击回车键，程序开始运算。运算完毕后点击close 弹出一对话框，输入命令语句“ save tree file＝文件名.tre；”回车。

菜单栏Tree中的Show internal edge labels 即可显示各结点的bootstrap值。

7、用treeview 打开.tree树。

阿征笔记 begin paup;set autoclose=yes notifybeep=yes;log file=log.txt;outgroup A00;set root=outgroup outroot=monophyl;set criterion=parsimony;hsearch chuckscore=1;savetrees format=nexus brlens=yes append=yes file=mp.tre root=yes;contree

all/file=mp(contree).tre

strict=no

addseq=random

nreps=500

nchuck=5 majrule=yes percent=50 le50=yes;bootstrap nreps=1000 conlevel=50 keepall=no search=heuristic/addseq=random nreps=100;savetrees

file=mp(bootstrap).tre

root=yes brlens=yes savebootp=both from=1 to=1000;end;征征 20:31:57 我每次都是先写到contree那一步，然后在里面敲命令，后两条分别

征征 20:32:13 begin paup;set autoclose=yes notifybeep=yes;log file=log.txt;outgroup A00;set root=outgroup outroot=monophyl;set criterion=parsimony;hsearch chuckscore=1;savetrees format=nexus brlens=yes append=yes file=mp.tre root=yes;contree

all/file=mp(contree).tre

strict=no

addseq=random

nreps=500

nchuck=5 majrule=yes percent=50 le50=yes;end;征征 20:32:25 然后bootstrap nreps=1000 conlevel=50 keepall=no search=heuristic/addseq=random nreps=100;征征 20:32:36 跑完后 savetrees file=mp(bootstrap).tre root=yes brlens=yes savebootp=both from=1 to=1000;征征 20:32:54 保存一个有bootstrap的树 征征 20:33:35 再给你个阿荣给我的 征征 20:33:42

set autoclose=yes criterion=parsimony notifybeep=yes;log file=...;Hsearch addseq=random

nreps=100

start=stepwise savereps=yes randomize=addseq rstatus=yes hold=1 swap=tbr multrees=yes;savetrees format=nexus brlens=yes append=yes file=...;contree all/strict=no majrule=yes percent=50 le50=yes;bootstrap nreps=1000

conlevel=50

keepall=yes search=heuristic/addseq=random nreps=10;征征 20:34:16 对了，我的outroot=monophyl;你们分子不是monophyl

PAUP软件使用简要说明

1.数据输入格式

将需要分析的一组DNA数据经Clustal软件比对分析后，将其比对结果的*.aln文件用Mega软件打开并转换为Mega格式（File-〉Convert To Mega Format），转换结果会以*.meg文件存在与*.aln同一目录下，再用DNAsp软件将*.meg文件转换为PAUP格式（File-〉Save/Export Date As，以NEXUS File Format保存）即可。

2.MP法分析

先启动PAUP软件，选择相应数据文件，然后在命令行内依次键入

outgroup_外群名 回车

Bootstrap_nreps=1000_keepall 回车

Describetree 回车

Savetrees_from=1 to=1000 回车

3.NJ法分析

先启动PAUP软件，选择相应数据文件，然后在命令行内依次键入

outgroup_外群名 回车

Set_criterion=distance 回车

Bootstrap_search=nj_nreps=1000_keepall 回车

contree 回车

Savetrees_from=1_to=1000 回车

4.ML法分析

先启动PAUP软件，选择相应数据文件，然后在命令行内依次键入

outgroup_外群名 回车

Set_criterion=likelihood 回车

Bootstrap_nreps=100_keepall 回车

contree 回车

Savetrees_from=1_to=100 回车

注：外群名指的是分析数据中外群的代号；

下划线“_”表示键入一个空格；

结果以*.tre格式存在分析数据的同一文件夹内，用Treeview软件打开。

郁娟娟总结

一 Seqman 用来Assemble ,改错后保存成Seq.Seqman 将所有的序列打开，将反方向的用Editseq转换过来。

二 Editseq 打开所有的Seq序列——export as one----fas格式 三 Mega 打开fas格式文件——Alignment---alignment by clustle

第二篇：分子实验

分子生物学实验设计方案

学院： 专业班级： 课程： 实验名称： 组员： 实验日期：

一、实验目的

1、学习与掌握利用ITS序列鉴定真菌的原理；

2、掌握用ITS序列鉴定真菌的方法有步骤。

二、实验原理

1、菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，是传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。内转录间隔区ITS(internal transcribed space), 位于5.8S和18S之间（ITS1）以及5.8S和28SrDNA之间(ITS2)，ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之内。近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区域既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序。随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。

2、ITS（Internal Transcribed Spacer）：内转录间隔区。是真菌核糖体RNA（rRNA）基因非转录区的一部分。用于真菌鉴定的ITS序列通常包括ITS1、5.8 S 和ITS2。真菌ITS 区域长度一般在650 ～750 bp(碱基对)。

ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。

ITS鉴定的原理：rDNA 上的5.8、18 和28 SrRNA 基因有极大的保守性, 即存在着广泛的异种同源性。而由于ITS 区不加入成熟核糖体, 所以ITS 片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小,因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性, 即使是亲缘关系非常接近的2 个种都能在ITS 序列上表现出差异, 显示最近的进化特征。研究表明,ITS 片段的进化速率是18 S rDNA 的10 倍。这就是ITS 序列在微生物种类鉴定和群落分析的理论基础。ITS1 和ITS2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一致, 种间差异比较明显。这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。由于ITS 的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异, 此外ITS 序列片段较小、易于分析, 目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中。ITS 的序列分析还有效地解决Lenti nul a、Suill us、Tuber、Cer at ocystis 和Oi diodendron等真菌应用形态学特征进行分类所引起的纷争, 弥补了传统分类上的一些不足。

ITS 鉴定的方法学：真菌rDNA ITS 序列分析用于真菌系统分类通常通过多聚酶链式反应(PCR)技术实现。rDNA 多复制的特性, 有利于低浓度或被更高度降解的DNA 样品中ITS区域的扩增。这有利于研究尚无任何rDNA 序列资料的生物。根据这些基因上高度保守区段设计出通用引物, 借助PCR 技术扩增rDNA 的目的片段。PCR 技术在真菌分类、鉴定中与直接测序法相结合有很大的优越性[ 14] : ①只需少量的DNA, 每次扩增只需约0.1 ～10 ng;②可对DNA 的2 条链测序, 从而减少错误;③可利用总DNA 的较粗制备品;④适合于自动测序仪进行测序。

三、实验器材

1、真菌总基因组DNA的提取及其纯度、浓度的检测：

1)、仪器： 离心机 离心管 移液枪(200μL、1000μL)枪头 研钵 恒温水浴锅 超净工作台 琼脂糖凝胶电泳系统 一次性手套 凝胶成像系统 紫外分光光度计 2)、材料：真菌 3)、试剂：

(1)、DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS(2)、3M NaAc(3)、TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA(4)、酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)(5)、氯仿:异戊醇(24:1)(6)、异丙醇(7)、无水乙醇(8)、75%乙醇

(9)、加入巯基乙醇(10)、RNaseA

2、ITS片段的PCR扩增及其产物电泳检测：

1)、仪器：PCR热循环仪 琼脂糖凝胶电泳系统 移液枪 一次性手套 2)、材料：真菌ITS片段 3)、试剂：

（1）、引物：ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(5’端引物)ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’(3’端引物)（2）、ddH2O(2.5mM)（3）、10×MgCl2 缓冲液（4）、DNA模板（5）、脱氧核糖核酸聚合酶(Taq酶)（6）、50×TAE贮存液（7）、6×加样缓冲液（8）、100bpDNA ladder。(9)、溴酚蓝染料

3、ITS片段测序

1)、仪器：PCR热循环仪 高压电泳仪 测序用电泳槽 制胶设备 吸头、与电泳玻璃相配的染色盘、小指管

2)、材料：ITS片段PCR扩增产物 3)、试剂：

药品： 三羟甲基氨基甲烷（Tris）乙二胺四乙酸(EDTA)硼酸 尿素 丙烯酰胺 N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）过硫酸铵 冰乙酸 碳酸钠（Na2CO3）甲醛 硫代硫酸钠 硝酸银（AgNO3）测序级Taq DNA 聚合酶 4种 d/ddNTP混合液 pGEM-3ZF(+)对照DNA 1μg/μL ITS4/ITS5正向引物 粘合硅烷 硅烷

溶液：

（1）、5×TBE：

Tris 13.5g 硼酸 6.9g EDTA 0.9g 用双蒸水定容至250mL（2）、6%变性聚丙烯酰胺凝胶贮液：

尿素

63.06g

丙烯酰胺

8.5g

N，N’-亚甲基双丙烯酰胺 0.45g 5×TBE 15mL 用双蒸水定容至150mL（用普通滤纸过滤后使用）。

4、BLAST比对、鉴定属、种：

仪器：电脑及携带BLAST程序（基本局部相似性比对搜索工具）

5、进化树的绘制

仪器：电脑及携带MEGA软件（分子进化遗传分析）

四、实验内容及步骤

(一)、实验内容：

1、大量真菌的准备;

2、真菌总基因组DNA的提取；

3、真菌基因组DNA纯度、浓度的检测；

4、ITS片段的PCR扩增；

5、ITS片段的PCR扩增产物电泳检测；

6、ITS片段测序；

7、BLAST比对、鉴定属、种。

(二)、实验步骤：

1、真菌总基因组DNA的提取及其纯度、浓度的检测：（1）、准备大量的真菌，然后去1g真菌，在液氮中迅速研磨成粉。

（2）、2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；

(3)、在1.5mL离心管中加入65℃预热的抽提液700μL。(4)、加入巯基乙醇50μL，上下震荡，使蛋白质变性沉淀，65℃水浴40min，每隔10min振荡混匀一次。

(5)、加入等体积（约750μL）的氯仿/异戊醇(24/1)混匀，除去蛋白质，4℃平衡离心，10000rpm，10min。(6)、取上清（约750μL）到1.5mL离心管中，加1/5体积（约150μL）65℃预热的CTAB/NaCl混匀，加入600μL的氯仿/异戊醇(24/1)混匀，4℃平衡离心，10000rpm，10min。

(7)、取上清，加等体积（约750μL）的CTAB沉淀液，颠倒混匀。65℃水浴30min至沉淀可见。4℃平衡离心，10000 rpm，10min后小心去上清。

(8)、沉淀用TE（0.5mL）溶解，加入等体积（约0.5mL）的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提，4℃平衡离心，10000rpm，10min。

(9)、取上清加入2倍体积的无水乙醇（1mL），再加入1/10体积的NaAC（pH 5.2）约0.1mL。(10)、-20℃冰箱1h，4℃平衡离心，12000rpm，10min，弃上清，用70%酒精清洗2次，滤纸吸去多余水分，超净台吹干。

(11)、0.05mL TE溶解，加入5μLRNA酶液37℃放置30min；(12)、吸取适量样品于紫外分光光度计上检测浓度与纯度；(13)、剩余的样品置于-20℃保存待用。

2、ITS片段的PCR扩增及其产物电泳检测

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’

1)、PCR Amplification reaction system（PCR扩增反应体系）（50μl）ddH2O 38.5μl 10×buffer with MgCl2(MgCl2 缓冲液)5.0μl dNTPs(2.5mM)1.0μl Primer5’（5’端引物）2.0μl Primer3’（3’端引物）2.0μl DNA template（DNA模板）1.0μl Taq DNA polymerase(脱氧核糖核酸聚合酶)(5U/μl)0.5μl

2)、反应程序如下：

（1）94℃ for 5 minutes denaturalization（94℃预变性5min）（2）94℃ for 45 seconds denaturation（94℃变性45s）（3）52℃ for 45 seconds annealing(52℃退火45s)（4）72℃ for 1min30sec extension（72℃延伸90s）重复步骤(2)-(4)30次

（5）72℃ for 10 minutes final extension（72℃最后一次延伸 10min）大概500bp左右

3)、取5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余-20℃保存：

(1)、琼脂糖凝胶：将50×TAE贮存液用蒸馏水稀释成1×TEA电泳缓冲液，待用，按1%称取适量琼脂糖置于250mL锥形瓶中，加入对应量1×TEA稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水分蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复3次，至琼脂糖全部溶化，放置，待其稍冷却。

(2)、胶板的制备：将制胶槽置于水平支持物上，选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。向冷却至50-60℃的琼脂糖凝胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后，小心拔出梳子，将胶块取出，至于已加入足量1×TEA电泳缓冲液的电泳槽内。

(4)、加样：取5μl样品与2μl 6×加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加样品槽中，在第一个孔或最后一个上样孔内加入5μl的100bpDNA ladder。

(5)、电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以5V/cm(约100V)电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

(6)、成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的紫外灯下观察胶块，DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带，用凝胶成像系统照相。

3、ITS片段测序

（一）测序反应：

1.对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)石蜡油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。

2.对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂：

（1）样品反应：

质粒模板DNA 2.1pmol 5×测序缓冲液 5ml 引物 4.5pmol 无菌ddH2O 至终体积 16ml

（2）对照反应

pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg)4.0ml

5×测序缓冲液 5ml

ITS4/ITS5正向引物(4.5pmol)3.6ml

无菌ddH2 O 至终体积 16 ml

3.在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。

4.从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。

5.在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。

6.把G、A、T、C 4个反应管放入预热至95℃的热循环仪，先经过95℃ 2min，然后进入如下循环：

95℃ 30s 变性 42℃ 30s 退火 70℃ 1min 延伸 45-60个循环后，取出置于冰箱中

7.热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。

（二）、测序凝胶板的制备

1、玻璃板的处理：

（1）短玻璃板的处理

A.在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。

B.用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。

C.4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。

2、长版处理（换双橡胶手套）

(1)、用浸透硅烷的吸水纸仔细擦边玻璃板表面。

(2)、5-10min后，用浸透95%乙醇的干净吸水纸轻轻擦去多余硅烷(硅烷不能过量，否则影响印染效果)。(3)、用0.4mm边条装配好，再用胶带粘好，用夹子夹好以防渗漏。

(4)、将板呈40°角倾斜，按下面的比例直接混合溶液，然后用烧杯直接灌胶，或用50mL注射器注入，避免出现气泡（气泡出现，可敲击玻璃板，使之排出）。

6%变性聚丙烯酰胺凝胶贮液90mL，四甲基乙二胺(TEMED)60μL，过硫酸胺90μL。灌满后将鲨鱼梳子背面插入液面5-6mm，将板放置20°角使之聚合。在室温中约20min内聚合（注意底部不要边条，直接用胶带封，否则边条不易取出）。

3、测区产物凝胶电泳（凝胶灌制后2-24h后均可获得良好结果）

(1)、去掉凝胶两边和底部胶带纸，拔下鲨鱼齿梳并转过来用尖齿插入凝胶约1mm。将凝胶板安装到电泳仪上，在电极上、下槽都倒入1×TBE电泳缓冲液，用吸管吹洗掉梳齿形成加样孔中残留的尿素，并去掉气泡。

接稳定电源，40cm胶以1300V预电泳20-30min，是凝胶加热到60℃左右。

(2)、将G、A、T、C 4个小管，各加入3μLDNA测序反应终止液，置于沸水中煮沸2min迅速插入冰中，上样前，短暂离心混匀。(3)、关闭电源，上样4μL。

(4)、上样后，继续电泳，直至二甲苯蓝染料距离玻璃板底部2cm时，终止电泳。

4、DNA测序凝胶的银染法处理

(1)、玻璃板的分离： 电泳结束后，小心揭开玻璃板，凝胶应牢牢黏附在短板上。

(2)、凝胶的固定： 将凝胶连同放入磁盘中，加入固定液，注意要没过凝胶，放置20min直至溴酚蓝和二甲苯蓝的颜色消失。缓缓水平摇动。固定液可回收做定影液。(3)、洗胶： 用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2min。漂洗时轻轻摇动，每次前都将胶沥干10-20s。(4)、凝胶的染色： 加入染色液缓缓摇动染色30min（25min后可在另一瓷盘中备好显影液，同时要预冷到10℃）。

(5)、凝胶的漂洗： 由于这一步非常关键，所以操作一定要非常快。将染色液倒入一个容器内，将瓷盘用双蒸水涮一下，然后倒入3L双蒸水，将凝胶浸入，然后将凝胶立即放入准备好的预冷显影液中（从胶浸入双蒸水到放入显影液 不能超过5-10s，如超过则重复（4）（5）步）。

(6)、凝胶的显影： 缓缓摇动，直到凝胶上显条带，一般为5-6min，时间不要过长，否则背景会过深（边摇动，边观察，棕褐色条带到一定强度后，马上终止）。

(7)、终止显影： 将等体积定影液直接加入显影液，缓缓摇动2-3min（时间过长会使染色变淡）。

(8)、凝胶的漂洗： 用双蒸水漂洗2次，每次2min。(9)、将凝胶放在空气中干燥，识读序列。

4、BLAST比对、鉴定属、种

5、进化树的绘制

第三篇：陈娟娟拜师总结

拜师学艺总结

双井镇中心小学陈娟娟

2014年秋，为拉动新教师的成长，我校组织开展拜师学艺活动。经过一段时间的学习，我在教育教学过程中进步了很多，感慨很多，现总结如下：

一、对教师职业的认识

教师是教育过程中的主导力量。教师道德品质不仅是教师自身的行为规范，而且还是作用于学生的教育手段。其高尚与否，关系到到素质教育能否得以正确顺利地实施。我深知作为人类灵魂的工程师，必须具有高尚的道德品质，对学生要有慈母般的爱心，且不断更新、充实自己的知识，做到与时代同步，才能培养出符合社会发展需要的人才，挑好肩上这付教书育人的重担。

二、自己的几点收获

（一）、自己对于工作有了更深刻的认识

我总认为教师只要上好自己的课，把课本上的东西传授给自己的学生就够了，而缺乏对教师社会责任的认识。通过这段时间的学习，我的师傅陈杰老师对我淳淳教诲，进行了系统的教师社会责任的讲解，使我知道了身为一名人民教师，我们不但要把课本上的知识交给学生，还要交给学生做人、做事的道理。通过教师的努力，学生不但要把知识学好，还要遵法守纪，勤劳礼貌，做一个合格的社会公民。

（二）、学到了新的知识

陈杰老师是我校经验丰厚的教师了，理论丰富，知识渊博。在与陈老师的学习中，有很多疑难问题在商讨中得到了解决，使我不仅丰富了课本知识，更增加了许多课外知识，开阔了视野，自己的理论水平也得到了提高，同时也为自己的人生树立了更高的目标，我相信这会对我终生受益的。

（三）、掌握了新的教学方法

在大学实习的过程中，我习惯沿用上学时老师的教学方法，过于陈旧，效果也不是太好，究其原因，是因为我对现在的学生，比如他们的心理和行为认识不够，把握不准，造成了教学方法上的被动。通过陈老师的指导和我自己的努力，我进步了很多。同时，陈老师将他自己多年来研究的教学方法传授给了我。通过对这些方法的运用，上课取得了很好的效果。

（四）、思想境界受到了感染

在与陈师相处的过程中，他心胸豁达，乐观的思想境界深深感染了我。当我遇到了工作中的困难时，自己也能以一种坦然、把苦当乐的心态去克服它。

三、今后的努力方向。

（一）、加强师德修养，展现人格魅力

在教学过程中，我要利用业余时间积极学习国家教育方针，教育政策，遵守学校各项规定，甘做人梯，安于教师生涯，以“捧着一颗心来，不带半棵草去”的高尚情怀，献身教育，努力工作。

（二）、热爱学生，以身作则

教师对学生要有一颗慈母般的爱心。教师对学生慈母般的爱心应来自对教育事业的无限忠诚，对教育事业的强烈事业心和高度责任感。教师的关爱能彻底化解学生的逆反心理和对抗情绪，最大限度地激发学生的学习主观能动性。在日常教学中，教师如像母亲一样，无微不至地关心学生，帮助学生，对差生不嫌弃，不歧视，给他们多一点爱，就能极大地激发学生的积极性，使其在学习上有无穷的力量源泉。

（三）、努力学习提高自己的业务水平

教师要不断更新充实自己的学识。博学多才对教师来说很重要。在教学过程中，学生什么问题都会提出来，而且往往“打破沙锅问到底”。没有广博的知识，就不能很好地解学生之“惑”，传为人之“道”。但知识绝不是处于静止状态，它在不断地丰富和发展，每时每刻都在日新月异地发生着量和质的变化。因而，我们这些为师者让自己的知识处于不断更新的状态，跟上时代发展趋势，不断更新教育观念，改革教学内容和方法，显得更为重要。否则，不去更新，不去充实，你那点知识就是一桶死水，终会走向腐化。

（四）、勤学好问，帮助他人

拜师学艺虽然结束了，但在我们的心中还不能结束。今后我们要继续发扬拜师学艺形成的良好传统，勤学好问，遇到业务上不懂的地方，仍要向师傅及有经验的老教师学习，同时，我们还要用我们学到的技能去帮助比我们年轻，更需要教学经验的新教师。

为了无愧于教师这一职业，也为了实现自己心中的理想信念，今后的工作中，我会更加努力，加强学习，提高素质，完善自己，书写出灿烂美好的未来。

2014年9月22日

第四篇：推优分子总结

zzzzzz

经过近一段时间的自己学习和党员的帮助，本人在思想上积极要求上进，在工作中向党员同志看齐，对党的认识逐渐深刻。现将本人对推优总结及思想情况汇报如下：

思想方面：要提高学习马克思主义理论的自觉性，认真学习马克思列宁主义、邓小平理论，要坚持理论联系实际，学以致用，掌握做好本职工作的知识和本领。

学习方面：我认真学习每一学科的课程，按时完成课后作业，学习有规律有目标。工作方面：本人在系里担任团总支组织部干事，学生会外联部干事，治学自管会组织部，在班里担任团组委等职务。认真负责的执行各部门的工作，平时积极参加院或系里组织的各项活动，如：09年10月新生运动会擒敌拳表演，09年10月优良学风班答辩会，2009年11月趣味运动会，2009年10月“挑战杯”，2009年12月参加了初级党课的学习并取得了结业证书，2010年2月参加无偿鲜血活动，2010年4月学生手册知识竞答赛，2010年4月女生节活动等，当然在工作中我还有很多不足，因此我会更加努力完善自己保证工作保质保量的完成。

生活方面：在日常的生活中，乐于助人团结同学，待人友善，我与寝室各个男同学之间时常联系。经常互相传达着班级及学校的信息。使得学校及老师下来的事情能更深入地渗入同学们的一言一行中，班级的各项工作也得到了进一步顺利地开展。

我深知自己里党组织还有很远的距离，因此我会在学习生活和工作中更加努力认真，不断学习有关党的知识，使自己不断向党组织靠近，不断完善自己成为同学的榜样最终能够完成自己对党的追求。

第五篇：滨湖镇郁郎小学2015年寒假学习总结

滨湖镇郁郎小学2016年 寒假期间政治学习工作总结

为深入学习贯彻落实党的十八大精神，进一步提高教职工的政治思想素质和业务素质，保障教育改革的顺利进行和素质教育的全面推进，根据市教育局文件精神，我校对全体教师继续进行寒假期间政治学习活动。我校制定了切实可行的学习计划，工作安排清晰，学习内容丰富，一、明确目的，提高认识

让教师们明确学习的目的，提高认识，是开展政治学习的基础。政治学习是加强教师职业德建设，促进广大教师进修提高和政治素养提高的良好时机，教师们都能认真正确地对待这次学习。

本次政治学习以 “崇德向善 爱岗敬业”师德专项教育活动，以加强师德师风建设为核心，以增强教师魅力重点，以提高教师的整体素质为目标，旨在通过学习，使教师能与时俱进，增强教书育人的责任感和事业心，用教师职业道德准则来规范自己的言行，做到依法执教，爱岗敬业，为人师表，乐于奉献，做一个忠诚党的教育事业、为人民服务、让人民满意的教师。

二、加强领导，精心组织

为了切实有效地开展好政治学习活动，我校成立了以校长为组长，中层干部为成员的政治业务学习领导小组，以严肃认真的态度和高度负责的精神组织每一次的学习活动，确保学习质量。领导小组提前召开了有关学习的组织筹备会，对学习的各项工作作了统一的安排布置，要求讲解人员预先作好充分准备，备讲资料齐全，学习记录详实，先学习后讨论，要求讨论发言积极，人人过关。

三、内容充实，安排得当

我们安排的学习内容丰富，主要有：组织学习滨湖镇寒假学习活动方案，和相关学习材料汇编。

四、严明纪律，严格要求

学习期间，教师严格遵守作息制度，并制定了教师学习考勤记录，严格考勤，特殊情况请假必须向校长请假，批准后方可请假。

在学习过程中，大家积极参与，踊跃发言，精心做好记录。每次学习后采取简短的分组讨论形式，对当天学习的内容进行内化，教师针对当天所学，结合实际，踊跃发言，各抒己见，最终达成共识。通过每次简短的讨论，使我们的教师更深刻地领会了所学内容的精髓。

开学后，我们要求每位教师根据自己在学习过程中的体会，结合自己的实际工作情况，对学习比较深刻的活动内容，撰写了体会文章，每位教师的文章都结合自己的实际工作情况以及自己的切身体会，写出了作为一个教师的真实想法，语言朴素、精练，反思深刻。

五、效果明显，思想转化

通过学习，我们教师的法制意识明显增强，师德水平明显提高，团结意识明显加强，收到了良好的学习效果。

1、法制观念明显增强

通过对法规制度的学习，教师们更进一步地增强了遵守宪法、维护宪法的自觉性，在依法治园、依法从教、依法保护自己合法权益等方面转变了观念，增强了意识。教职工们纷纷表示，只有依法办事、依规管理，我园的各项工作才能快速发展，教育不正之风才能及时纠正。

2、职业道德明显强化

老师们进一步明白了自己育人的职责，应遵循的道德规范。通过学习和讨论，使教职工们更加明确了遵守职业道德是加强行风建设的关键，是树立良好校风的基础，更是促进学校发展和进步的前提。

3、责任意识明显好转

在联系本校和自己教育教学工作实际的讨论中，绝大多数教师认真反思了一年来的经验和教训，认识到加大教学管理、强化课改意识是推动教育事业发展的基础性工程。在教学中必须尽快转变教育观念，以人为本，探索适合我校实际的、符合课改要求的，能整体提高教学水平的课堂教学模式。

总之，通过寒假政治学习，使我校22多名教师的思想政治素质、职业道德修养以及业务水平者得到了提高，对于我校今后的教育教学工作有着十分重要的指导意义！

滨湖镇郁郎小学 2016.2.22

滨湖镇郁郎小学2016年 寒假期间政治学习工作总结

2016.2.22