第一篇：转化方法和酵母质粒抽提
酵母转化（快速）
侯昕
1、挑单菌落于3ml 2XYPAD培养基中，30°C 200rpm培养至菌浓度为2X108 cell/ml。（约18h）。
2、用1.5ml离心管收集菌液两次，每次1ml，13500rpm，常温离心30秒。3、4、2mg/ml carrier DNA变性，100°C 5分钟，置冰上备用。在菌中依次加入
50％PEG3350
240ul
1M LiAc
34ul 2mg/ml S.S.carrier DNA
50ul plasmid DNA(各1ug)
36ul 每加入一种后，要吸打混匀。5、6、42°C水浴1－3小时。
13500rpm离心1分钟，吸弃上清。沉淀中加500ul水，吸打均匀，100ul涂皿。
7、30°C培养两天
此方法可用于已知蛋白互做检测，将两个质粒共转化。
2×YPAD：Yeast Extract
16g
2mg/ml carrier DNA：
Peptone
32g
鲑鱼精DNA（Sima D1626）
Glucose
32g
溶于水，低温放置过夜，灭
Adenine hemisulfate
80mg
菌后－20°C保存。
d2 H2O
800ml 酵母转化（高效）
侯昕
1、挑酵母单菌落于100ml SC液体培养基中，30°C，200rpm摇至菌浓度为2X107 cell/ml（稀释20倍，OD545或OD600为0.1）。※或挑酵母单菌落于50ml 2XYPAD液体培养基中，30°C，200rpm摇至菌浓度为2X108cell/ml（稀释200倍，OD545或OD600为0.1）。
2、用两个50ml离心管分别收集40ml菌液，3000g，常温离心5分钟。
3、将菌分别转入两瓶150ml 2XYPAD培养基中，扩大培养至菌浓度为2X107cell/ml。
4、用500ml离心管收集300ml菌液，3000g，5分钟。用 200mlddH2O洗两次，将菌转入一个50ml离心管。
5、2mg/ml carrier DNA变性，100°C 5分钟，置冰上备用。
6、配Mixture：
50％PEG3350
14.4Mml
1M LiAc
2.16ml 2mg/ml S.S.carrier DNA
3ml plasmid DNA＋ddH2O
2.04ml
7、把Mixture加入菌沉淀中，吸打均匀。
8、42°C水域热激45分钟；每5分钟摇一下，使其受热均匀。
9、3000g，离心5分钟，弃上清，菌沉淀中加40ml水，吸打均匀，涂皿，100－200u/皿。
此方法可用于酵母双杂交文库筛选，建议分步转化。
酵母质粒抽提
侯昕
1、收集菌液，10000g，离心10秒。
2、菌沉淀中加200ul YLS，牙签打散。
3、加200ul 苯酚氯仿异戊醇（25：24：1），摇5分钟，13000rpm，离心5分钟。
4、将上层转入一新离心管中，重复3。
5、将上层转入一新离心管中，加20ul 3M NaOAc（pH5.2）、500ul乙醇，摇匀，10000g，4°C离心10－30分钟。
6、750ul 75％乙醇洗，10000g，离心5－10分钟。
7、重复6。
8、吹干，加10－20ul 水或TE。
此方法得到的质粒可用于电转大肠杆菌
Yeast lysis solution（YLS）：
2％（v/v）
Triton X－100
1％（w/v）
SDS 100mM
NaCl 1mM
EDTA
第二篇：质粒DNA抽提实验报告
质粒DNA抽提实验报告
一．实验目的：
1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCR扩增等。
2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度，构型，含量和分子量大小。
二．实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三．实验仪器及试剂：
1.5mlEP管、高速离心机、移液枪
溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶
溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．实验步骤:
1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min，去上清液（重复一次）
2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞
3、加200μl溶液Ⅱ，轻轻摇匀，放置5min
4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min
5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min
6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min 7、70%乙醇洗涤沉淀2次，风干
8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存备用
五．实验结果：得到大肠杆菌质粒DNA
PCR以及电泳实验报告
一．实验原理：
PCR：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
电泳：琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。
二．实验仪器及试剂：
EP管、离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪、移液枪、紫外透射检测仪等 DNA模板、与特定DNA模板结合的引物、去离子水、商业化的DNA聚合酶以及缓冲液、dNTP、DNA荧光染料溴化乙锭、琼脂糖凝胶
三．PCR反应体系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl
四．操作步骤 1、94℃预变性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循环7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循环23次 3、72℃，10s
4、电泳检测
五．实验结果分析
分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表：
如右图所示：实验所用的琼脂糖凝胶浓度为1.3%，实验的DNA条带位置在500bp-750bp之间，接近500bp，证明实验是成功的
2000bp 1000bp
750bp 500bp 250bp 100bp 实验组
对照组
第三篇：酵母抽提物生产流程
酵母提取物
前处理和自溶：
废酵母→清水洗涤→过滤→酵母泥→加水调至含干酵母10％～15％→调pH至4．5→夹层热保温45℃～55℃→自溶24小时。
自溶期间每隔1小时开动搅拌2～5分钟，搅拌有利于酶类和酵母内大分子物质充分接触，提高单位接触面底物的浓度，从而加快细胞内酶的反应速度。
为了加速细胞的自溶，还可添加2％～3％的氯化钠，其对提高抽提物得率和上清液氨基氮含量有一定促进作用。
酶解：
自溶结束后，在自溶酵母液中加入0.2％复合酶，调整物料pH为7．0，在50℃条件下酶解24小时。酶解结束后，经纳米对撞机在150MP～200MP下进行破碎。其作用原理是：物料形成150MP以上的高压射流，经分流装置被分成两股，然后，两股高压射流体在一个腔体内发生对撞，产生瞬时高压使振荡片振荡，形成频率高达20000赫兹以上的超声波，酵母细胞在对撞和超声波的强大压力的共同作用下发生纳米级破碎。经纳米对撞机处理后，用显微镜检测，混合物料中大多数为空腔细胞和大量碎片，酵母细胞壁的破碎率可达97．9％，抽提物得率为91．8％。破碎液经进一步纯化、浓缩后可制得淡黄色的胶木抽提物制品。
采用上述方法制得的酵母抽提物，肌苷酸（I）含量为1．27g／100g，鸟苷酸（G）含量为1．498g／100g牞（I＋G）为2．76g／100g。与日本日研公司同类产品相比，指标分别提高294．4％、626．82％、413．96％。具体工艺：废酵母预处理【120目过筛→脱苦→调整母液浓度(10%~15%)→加促进剂（2%Nacl）→自溶（温度50℃，pH5.2～6.0，24h）】→酶解（0.2%,pH7.0，50℃，24h）→纳米对撞机破碎（150MP～200MP，循环2～4次）→加麦芽根酶解酶（70℃，3～4h）→加热灭酶（95℃，10分钟）→离心分离→酵母上清液浓缩→酵母抽提物产品。
以上所述啤酒酵母抽提物的提取技术，其关键点是将传统的自溶、酶解方法与先进的纳米破碎技术相结合，利用高压撞击作用破碎酵母细胞壁，从而使其内容物最大限度溶出，提高制品中氨基酸含量。
第四篇：质粒抽提常见问题与解答
1.没有提出质粒或者质粒收获量很低
A菌种老化
建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。二次培养时间最好不要超出16小时(或者OD600不超过3.0)。
B低拷贝质粒
建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量。
C质粒丢失
建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。
D裂解不充分
建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。并确保细菌混悬均匀。
EBuffer中有沉淀未溶解
建议：BufferB1和BufferN1，BufferC1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37℃温育片刻，待溶液澄清后使用。
FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇
建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。
G离心柱中乙醇残留
建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提，大提和朝大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻(或置于65℃烘箱)，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。
H洗脱液加入位置不正确
建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。
I洗脱液pH值不正确
建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0-8.5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)进行洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH在7.0-8.5之间。
J洗脱体积的选择
建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，请根据试剂盒要求进行二次洗脱，再用推荐的方法进行沉淀，浓缩质粒。
K洗脱时间的选择
建议：加入洗脱Buffer后，室温放置2-5分钟，将有利于洗脱。
2.质粒纯度不高
A蛋白质污染
建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白。另外如果用ddH2O作为稀释溶液,测定OD比值，比值可能较低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer来稀释。
BRNA污染
建议：检查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA应该存放在4℃，如果存放时间过长，或者没有正确存放，RNaseA活力下降，请重新加入RNaseA。
C基因组DNA污染
建议：加入BufferB1后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入BufferB1的处理时间最好不要超过5分钟。
D菌株为含内源核酸酶的宿主菌株
建议：请选用含内源核酸酶的宿主菌株质粒DNA提取试剂盒，或者转化质粒到不含内源核酸酶宿主菌株中。
3.加样时DNA飘出加样孔外
原因：柱中残留乙醇未除干净。
建议：洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在柱子上。可再离心或者抽真空。
第五篇：酵母抽提物应用研究新进展
酵母抽提物应用研究新进展
酵母抽提物是以蛋白质含量丰富的食用酵母为原料，采用生物技术，将酵母细胞内的蛋白质、核酸等进行降解后精制而成的天然调味料，主要成分为多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族维生素及微量元素。酵母抽提物具有纯天然、营养丰富、味道鲜美醇厚等优点，在食品工业中应用广泛。
近年来，随着人们对酵母抽提物认识的加深，酵母抽提物市场越来越大，应用范围也越来越广，而食品生产厂家对酵母抽提物的要求也越来越高，这大大促进了酵母抽提物在研制和应用方面的发展，出现了一些新的进展和趋势。
首先，由于拓展国际市场和满足国内高端市场的需要，部分酵母抽提物生产厂家已经通过调整改进生产工艺和设备，生产出浅色、溶解性好的高纯度酵母抽提物。与以往的抽提物产品相比，新的高纯度酵母抽提物产品在理化指标、溶解性能、加工性能等方面更加接近国际同类产品，这就为产品进入国际市场提供了保证。
其次，高I+G含量的强鲜型酵母抽提物随着调味行业对天然、营养、健康的强烈鲜味剂的大量需求而出现并受到普遍关注。由于中国人对鲜味的偏爱，市场上销售的各种调味品往往都会突出一个鲜字，因而各种鲜味增强剂如味精、I+G等产品都具有较大的市场。一般的酵母抽提物虽然在整体呈味上比味精强，但往往给人鲜度不够的感觉。高I+G含量的强鲜型酵母抽提物通过在自溶过程中控制核酸的降解，使产品中呈味核苷酸（I+G）的含量增加，从而提高产品的鲜度，再加上酵母抽提物具有天然、营养的特性和良好的加工性能，大大提高了酵母抽提物在与其他鲜味剂竞争中的优势。
再次，酵母抽提物开始向风味化方向发展。与普通酵母抽提物和香精不同，风味化酵母抽提物由于在酵母抽提物基础上糅合了热反应技术，且其主要原料就是酵母抽提物，因此其可以看作是酵母抽提物和香精的结合体。
第四，一些针对某些行业的专用型酵母抽提物开始出现。专用型酵母抽提物往往重点针对某一行业的特定需求和特殊加工要求，有目的地在产品中加以强化，由于对下游产品的生产过程和质量要求了解透彻，针对性很强，很容易抓住客户的需求，得到客户的认可。比如安琪酵母股份有限公司的鸡精专用型酵母抽提物和酱油专用型酵母抽提物在推向市场后都获得了很好的效果。
第五，咸味香精行业对酵母抽提物越来越认可，使用量也越来越多。随着食品加工行业的迅猛发展和对香精认识的逐步加深，其对食用香精提出了更高的要求，这也对食用香精行
业的发展起到了巨大的推动作用。
第六，方便面行业开始尝试在干脆面的面身中使用酵母抽提物。方便面行业在调料中使用酵母抽提物已经形成了一种共识，而一些厂家在其即食干脆面面身中使用酵母抽提物也获得了满意的效果。随着应用技术的逐步提高，面身中使用酵母抽提物将会得到越来越多厂家的认可。
第七，焙烤食品（饼干、面包等）加工中对酵母抽提物有了新的认识。研究表明，酵母抽提物在面团中通过与面筋基质相互作用，可以改善面团的延展性、烘焙特性以及口感和结构。而酵母抽提物中所含有的海藻糖具有优异的防止淀粉老化的作用，尤其在低温或冷冻的条件下表现更为突出。海藻糖可以抑制油脂成分中脂肪的分解，对保持食品品质起到了非常好的作用。
第八，豆瓣酱等传统调味品行业开始接受酵母抽提物。豆瓣酱行业一般采用传统工艺进行制作，生产周期较长，产品质量也容易出现波动。应用实验表明，在豆瓣酱的制作过程中添加酵母抽提物后对缩短产品成熟期、提升产品风味具有较好的效果。
酵母抽提物作为一种快速发展的食品配料，其研制与应用已经越来越受到人们的关注，并在行业内广大人员的努力下取得了很大的进步。随着行业的发展和技术水平的提高，国内对酵母抽提物产品的研制表现出了既与国际接轨，又结合中国实际的良好趋势。而国内食品加工业对酵母抽提物的接受程度也越来越高，并不断在加工和应用中寻求新的结合点。在酵母抽提物厂家与广大食品调味品企业的共同努力下，国内酵母抽提物行业和食品调味品行业必将拥有更美好的明天。
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