RNA抽提知识

第一篇：RNA抽提知识

RNA抽提

1：RNA抽提原理

简单地讲，RNA抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的RNA游离在裂解体系中的过程，纯化则是使RNA与裂解体系中的其它成分，如DNA、蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。Trizol试剂的出现基本能解决绝大部分样品RNA抽提，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流。

2：了解你的实验样品

如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：该样品的RNA含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提RNA的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组 DNA，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择抽提方法。但同时提醒的是：没有信息是可怕的，更可怕的是将错误的信息当真的了。

3：实验样品量的取用

样品与Trizol的比例。这个问题非常重要，应该获得足够的重视。Trizol的Protocol，提供了一个简单的比例，1ml 裂解液可以用于 50-100mg 组织或5-10X106个细胞；我的建议是，样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的RNA，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果(纯度及得率)没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。不同得样品其RNA含量差别很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度(0.05-2ug/mg)的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。考虑后续实验，一般情况下，高丰度的样品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中丰度样品50mg/ml Trizol,低丰度样品我们可以根据客户提供的实验样品量酌情取用。重申一下，不是越多越好，在考虑样品在1ml Trizol里能充分裂解的同时，还得考虑大量的样品可能也会带来大量的杂质！利用Trizol试剂抽提血清样品时，Trizol /血清比值不要小于7/3。石蜡样品由于RNA降解严重，含量大打折扣，所以取样时应该按低丰度样品原则取用。

3：裂解方法

裂解的目的就是破坏细胞的结构，释放出里面的RNA，使其溶解于裂解液中。绝大部分样品的裂解，比如冻存的细胞，心、肝、脾、肺、肾等，利用Trizol试剂，普通的匀浆方法就可以达到满意的效果！但是如果碰到比较特殊的样品，我们可能要附加一些其他的辅助手段。1）骨骼。骨骼组织质地坚硬，普通的匀浆器根本无法使其破碎，以致RNA不能完全释放溶解在TRIZOL试剂中，碰到这种类型的样品，我们必须先利用液氮把样品破碎成粉末状，Trizol悬浮混匀再利用Minibeadbeater匀浆5分钟。取上清, 2000g 4℃离心5min再取上清 去沉淀。2）细菌 Trizol虽然对细胞的裂解效果出众，但是对细菌坚韧的细胞壁还是无可奈何，这时我们可以利用超声来辅助破壁。将细菌重悬于300ul的Trizol中，置于Bioruptor冰水浴中，M 档 30s “on”、30“off”超声处理1—2 min.取出用Trizol将体积补至1ml。3)酵母 酵母细胞跟细菌一样，还是因为细胞壁的原因，不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分钟可以很好的消化掉酵母细胞壁，这里需要提醒的是消化缓冲液不能有外源性RNA酶污染，最好附加使用RNA酶抑制剂，做好了这点就不用担心这步有RNA降解的问题。4）石蜡包埋样品 石蜡包埋的组织样品在加Trizol裂解前必须先脱蜡，脱蜡的效果直接影响后续实验，所以我们为使脱蜡充分，选用高温脱蜡与二甲苯脱蜡相结合的两步脱蜡法。脱蜡后加入Trizol匀浆。5）脂肪 脂肪组织可以直接用Trizol 匀浆，这里需要提醒的是脂肪组织匀浆后，需室温静置5min，再室温7500g 离心5分钟，去除上面的脂肪层再继续后续实验！

4：分相

Trizol里含有的物质之一“酚”去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，裂解匀浆后的样品，按1ml Trizol 加200ul 的氯仿，震荡离心，绝大部分样品在这一步是不需要用特殊方法对待的，但对于蛋白含量比较高的组织样品必须要二次抽提，甚至多次抽提方可彻底去除。这里要着重提到的是血清样品！离心分相后，取上清这一步是分相实验的操作难点，一定要谨慎，万不可混入有机相污染，原则是宁缺勿滥！

5:异丙醇的沉淀

异丙醇的沉淀，目的是使RNA从裂解体系中沉淀下来，从而实现RNA与其它杂质 – 主要是盐 – 的分离。实际操作中，有的杂质也会与RNA一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。异丙醇的沉淀并不是非常特异性的，有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。在不影响后续实验的情况下，我们是可以忽略这些盐污染。有些实验样品，由于前期用药物或某种方法处理过，导致会残留有一些特殊的杂质，之所以残留，往往是因为这些杂质与RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。这些特点决定了它们往往是非常强的酶抑制剂，对后续实验影响非常大。这里介绍有几种方法除去这些杂质：1）TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。2）介质纯化：遇到一些与RNA共同沉淀下来且影响后续实验的一些杂质，可以利用BioMag公司提供的连有 Oligo dT的磁珠纯化出总RNA中的mRNA，这个方法优点是基本能解决绝大多数有杂质污染的总RNA（目前没有遇到这种方法处理不了的），缺点是成本比较高。对与RNA含量少的样品，直接异丙醇沉淀得率会很低，而且基本看不见沉淀物，这也会给后续的操作带来很大的麻烦，进一步损失RNA。遇到这种情况我们可以使用一种媒介(Golycogen)跟RNA共同沉淀下来，这种媒介物质既能很好的跟RNA共同沉淀下来，又不会影响后续实验。不要迷信试剂说明书里的标准方法；有时，使用标准方法碰到问题在标准方法中是找不到答案的，要具体问题具体分析。

6：洗涤

洗涤注意四点：首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当RNA沉淀比较大时 ；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。在异丙醇沉淀后，绝大多数时是能看见管底的白色沉淀，但还是有时候是看不见的，即使是加过Golycogen的。遇到这种情况不要慌，没看见不等于没有，遇到这种情况可以先用移液器小心的吸去上清，注意枪头不要碰到管壁。加入75%乙醇，上下颠倒几次，短暂离心后用移液器吸去上清，同时仔细观察管壁是否有挂液。如果有，那没问题，可以确定沉淀都附在管壁上了。

7：RNA的溶解和保存

纯化后的RNA溶解以水为主，用无Rnase酶的水溶解的RNA基本上还算稳定，其稳定与温度成反比，与浓度成正比。所以抽提好的RNA应尽快保存在-70℃，避免反复冻融，同时注意不要把浓度稀释的太低，大概保持在1000ng/ul。如果温度合适，保存中RNA发生降解或者消失，其原因应该是酶残留导致的酶解。

8：RNA质量的检测问题

将抽提好的RNA直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，不可全信。目前实验室用于正式实验前检测RNA质量的方法，一是电泳，二是NANO-Drop。电泳检测的主要是RNA的完整性和大小，该方法还是比较可信的；同时电泳还可以用于估计核酸的浓度，其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。NANO-Drop检测的是纯度和核酸含量。然而，由于NANO-Drop不能确保非常准确，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行NANO-Drop检测和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。（A260/A280 比值低 – 蛋白质残留但更可能是苯酚残留。A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差可初步判断是苯酚残留。）

第二篇：血液总RNA抽提

血液总RNA抽提

1.取250ul血清加入750ul Trizol LS（用于液体中RNA的抽提）中，剧烈震荡，静置。2.加入200ul 三氯甲烷，剧烈震荡，静置10min。3.4度，12000g 离心15min。4.吸上清至新的EP管，加入500ul(与所吸出的上清比列为1:1)异丙醇，并加入1ul的糖原，轻轻上下颠倒混匀，-20度冰箱沉淀过夜。5.4度，12000g 离心15min。留沉淀（RNA），将上清倒掉，加入1ml 75%的乙醇（DEPC水配），上下颠倒，洗涤RNA沉淀。6.4度7500g离心10min。去上清，将沉淀晾干（不能太干）加入10ul左右的Rnase free 的水溶解即可。

第三篇：RNA的抽提与鉴定

RNA的抽提与鉴定

背景

核糖核酸(RiboNucleic Acid，简称RNA)是由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名,简称RNA。

遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)是对中心法则的补充。

三种常见的RNA 1.mRNA 信使RNA 功能：蛋白质合成的直接模板 2.tRNA 转运RNA 功能：氨基酸的运载体

3.rRNA 核糖体RNA 功能：核糖体的组成成分，蛋白质的合成场所

其他小分子RNA 1.hnRNA 核内不均一RNA 成熟mRNA的前提 2.snRNA 核内小RNA 参与hnRNA的剪接与转运 3.snoRNA 核仁小RNA rRNA的加工与修饰

4.scRNA/7SL-RNA 胞质小RNA 蛋白质内置为定位合成信号识别体组成成分 5.siRNA 小的干扰RNA siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素

实验原理

细胞中的RNA可分为信使RNA，转运RNA和核糖体RNA三类，这三种类型的RNA都存在于细胞质中，所以从不同组织中提取的总RNA的本质就是细胞的裂解，RNA的释放，通过不同的方式去除蛋白质，DNA等杂质，最终获得高纯度的RNA产品工艺。

实验目的

1完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。2临床诊断中的应用：病毒检测等

RNA提取的方法及步骤

1提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来。（该方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。）

2在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相，而达到分离RNA的目的。

根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下两种制备方法： 1胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 2LiCl/尿素法 以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。

Trizol（异硫氰酸胍-苯酚法）

1由苯酚和硫氰酸胍等配制而成的单相的快速抽提试剂；

2可在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性；

3在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA； Trizol可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。如果细胞量过少或组织来源特异，可以采用相应试剂盒提取RNA。

Trizol法的原理

1异硫氰酸，β-巯基乙醇，SDS裂解细胞

2酸性条件（pH4.0)下酚、氯仿抽提，离心，蛋白质，DNA和脂质进入有机相，而RNA存在于水相

3异丙醇沉淀水相中的RNA

Trizol法提取RNA操作步骤

1.剪碎的鼠肝中加入Trizol试剂，进行机械匀浆，取1ml Trizol匀浆液于1.5ml离心管内，室温放置5分钟，以充分裂解细胞。目的：变性剂充分作用裂解细胞，释放核酸。2.每管加入200ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min；注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

3.4℃ 12,000rpm离心15min；

4.吸取上层水相，至另一离心管中；注：不要吸取中间界面。目的：分离RNA、DNA、蛋白质等。

5.加入0.5ml 异丙醇混匀，室温放置5-10min；

6.4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；目的：沉淀RNA。异丙醇会夺取大量RNA分子间的水分子，因此RNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。7.按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。（此时可放-70℃保存）目的：洗涤RNA，去除残余的盐类等杂质。8.4℃10000rpm离心5min，尽量弃上清。

9.短暂离心收集管壁液体并吸弃。室温晾干2-3min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

10.用200ul(体积可根据RNA的沉淀量具体调整)DEPC处理的H2O溶解RNA样品，溶解后立即置于冰上。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。

简易TBE电泳观察RNA的完整度 1制胶：琼脂糖凝胶粉（0.7%），消毒TBE缓冲液，Goldview显色剂

2上样：10ul样品（含上样缓冲液）混匀后，加入凝胶孔中；上样缓冲液（loading Buffer): 溴酚蓝、二甲苯青FF、蔗糖，甘油 3电泳：电泳110V，15min。4紫外灯下观察

RNA 质量及纯度的分析

方法

一、检测RNA溶液的吸光度 260、320、230、280nm的吸光度分别代表核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质的水平；

纯的RNA，230：260：280＝1：2：1；

一般OD260/OD280= 1.8~2时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的； 当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显； 当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了； RNA浓度=OD260×40μg/ml×稀释倍数。

方法

二、RNA的电泳图谱

检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量好。

方法

三、保温试验

RNA溶液在70℃的恒温水浴中保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。比较两者的电泳条带，说明RNase的污染情况。

如何尽量避免RNA的降解？

1及时处理样本，或置液氮中保存

2试验器皿及配置试剂用水用0.1%DEPC处理且高压消毒 3尽可能早的去除组织与细胞内的蛋白质 4联合使用RNase抑制剂

5操作过程中，戴手套口罩，避免空气流通 6进行完整性的检测

第四篇：invitrogen trizol rna抽提说明书

RNA抽提全过程(TRIZOL)

一，准备工作 1，实验器具与材料：

（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul

（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml

（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）

2，实验器具的处理与准备

（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）

将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。或直接购买经DEPC处理的枪头和EP管,每盒大约30元,基本上试剂公司都可以购买。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次（或180度干烤）。（3）金属制品：（镊子等）

先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：

（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶

（5）Trizol：100ml/瓶 存放于4℃

二，抽提时注意事项：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三，抽提步骤 1． 匀浆化作用

取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2． 分离阶段

每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3． RNA的沉淀

将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。4． RNA的洗脱 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。5． RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。6，RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。

TRIzol法抽提总RNA

组织100mg ↓

加1mlTRIzol ↓

研磨，匀浆（研磨时倒入液氮，研磨完后从研钵转入EP管中，）（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）↓

颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓

加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）↓

颠倒混匀15S，室温5分钟 ↓

4℃，离心12000rmp，15分钟 ↓

转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中（注意勿吸入中间那层）↓

加等体积异丙醇（约400-500μl）↓

4℃，离心12000rmp，10分钟 ↓

弃上清 ↓

加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml ↓

4℃离心7500rmp，5分钟 ↓

弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）↓

溶于DEPC水中至50μl（此处可按照实际情况修改，有人用50，也有人用100）（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）↓

立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录

RNA纯度检测及定量

从36μl中取6μl，用无RNA酶的水稀释100倍至600μl，用DU70型分光光度仪分别测定样品在260nm、280nm波长的光密度值，计算出RNA的浓度（μg/ml）。

纯RNA样品的A260/A280比值为1.7-2.1，若低于此值，表明存在蛋白质污染，需重新用酚/氯仿抽提。RNA样品的A260/A230比值应大于2.0，若低于该标准，提示有变性缓冲液残留需重新用乙醇沉淀RNA，然后用750ml/L的乙醇洗涤，以除去残留的变性缓冲液。

RNA电泳

用无Rnase水配TAE电泳液，称1.0g新开封的琼脂糖，加TAE电泳液至100ml，煮沸，加溴乙锭20μl，降至室温后灌胶置DEPC水处理过的电泳槽中，凝固20min，加TAE 缓冲液浸没胶块。取15μl RNA加6×RNA专用上样缓冲液3μl，混匀，用移液枪将样品加入上样孔内，待溴酚蓝迁移至理想位置后，终止电泳，紫外灯下观察、拍照。

上传RNA电泳条带如下

最下面条带代表5s 色浅代表RNA基本无降解

如出现拖把状条带 则为降解较严重情况

但有时这种情况也可以照样RT－PCR

我们同学就有在低温冰箱放了几个月的组织照样可以出结果的

第五篇：RNA 抽提之应知应会

RNA 抽提之应知应会

背景介绍

对大部分实验人员来说，RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。事实上，现有的 RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提 RNA，比抽提基因组 DNA 更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？

组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。现有的 RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白质 – 用嘴碾磨，肠胃抽提。

究竟怎样才能确保 RNA 抽提的成功率呢？实验前选择合适的方法/试剂，这是最重要的一步；好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。当然，您的选择可能仍然有问题，这就需要能正确分析实验失败的原因，以便改进。

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实验前方法/试剂的选择

0：抽提 RNA 的目的

RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，劳民伤财。

1：样品的收集/保存 – 影响降解的因素 样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。

2：样品的破碎及匀浆 – 影响降解和得率的因素

样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。

3：裂解液的选择 – 影响操作方便程度，内源杂质残留的因素

常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。

4：纯化方法的选择 – 影响内源杂质残留，抽提速度的因素

对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。

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RNA 抽提的“三大纪律八项注意”

纪律一：杜绝外源酶的污染。

注意一：严格戴好口罩，手套。

注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要

彻底处理。

注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。

纪律二：阻止内源酶的活性 注意四：选择合适的匀浆方法。

注意五：选择合适的裂解液。

注意六：控制好样品的起始量。

纪律三：明确自己的抽提目的

注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。

注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得

率。(go top)

RNase 污染的10大来源

1：手指头 – 手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。

2：枪头，离心管，移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。

3：水/缓冲液 – 一定要确保无 Rnase 污染。

4：实验台面 – 最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。

5：内源 Rnase – 所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。

6：RNA 样品 – RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。7：质粒抽提 – 质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。

8：RNA 保存 – 即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。

9：阳离子(Ca, Mg)– 在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。

10：后续实验所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。

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RNase 和 DEPC 处理

1：高压灭菌是可以灭活部分 Rnase A 的。实验证明：37 C 与 RNA 反应，没有灭菌的 PBS，活性点为 100 pg/ml；灭菌后，活性点为 100 ng/ml。当然，灭菌后 Rnase 仍然不能认为没有残留。

2：DEPC 在水中半衰期为 30 分钟。0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟可以认为彻底破坏了 DEPC。破坏后可以闻到一点气味。

3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分别加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 实验。结果提示，0.1% DEPC 只对 MOPS 有效，而 1% DEPC 对三种试剂都有效。4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A 的浓度分别为：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。

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RNA 抽提的10大窍门

1：快速阻止 Rnase 活性 – 样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活 Rnase。2：选择合适的抽提方法 – 高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。3：预判质量要求 – Northern，cDNA 文库构建对完整性要求高，RT-PCR, RPA(Ribonuclease protection assay)对完整性要求不是很高。RT-PCR 对纯度(酶抑制物残留)要求很高。

4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。

5：检查 RNA 的完整性 – 电泳检测，28S:18S =2:1 是完整的标志，1:1 对大部分实验也是可以接受的。

6：去除 DNA – 用于 RT-PCR, array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。

7：降低外源酶的污染 – 不能从外面又导入酶。

8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及 DNA 污染。

9：彻底溶解 RNA，必要时可以 65C 加热 5 分钟。

10：合适的保存方法 – 短时间可以 –20C 保存，长期请保存于 –80C。

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提高 RNA 得率

首先要意识到不同得样品其 RNA 含量差别很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度(0.05-2ug/mg)的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。

1：裂解细胞使 RNA 释放出来 – RNA 如果不被释放出来，得率是会降低的。电动匀浆比其它匀浆方法效果更好，但也可能需要结合其它得方法，如液氮捣碎，酶消化(Lysozyme/Lyticase)

2：抽提方法的优化。基于苯酚的方法的最大问题是分层不彻底和部分 RNA 的丢失(不能全部将上清取出)。分层不彻底是因为核酸和蛋白质含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低样品量解决。脂肪组织要增加一步氯仿抽提。RNA 的丢失可以用反抽方法或者去除有机层后再离心的方法降低。基于柱离心式方法的最大问题是样品过量。(go top)

经典抽提小技巧

1：Phenol 纯化：将等体积的 1:1 Phenol/Chloroform 加入，剧烈混允 1-2 分钟。高速离心 2 分钟。小心取上清(80-90%)。决不能取到中间层。可以使用等体积的反应液加入 Phenol/Chloroform 中，同样再取出上清。将两次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。混允时不能太温和，也不要试图取出全部上清。2：70-80% 乙醇洗涤：洗涤时，一定要将核酸悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去。同时，在倒掉乙醇后，立即高速离心数秒，再用移液器去除残留的乙醇。室温静置 5-10分钟后，溶解。

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特殊组织的抽提

纤维组织：心脏/骨骼肌等纤维组织抽提 RNA 关键在彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，故单位重量的组织 RNA 的含量就少，最好用尽可能多的起始量。一定要在冷冻条件下将组织彻底磨碎。

蛋白/脂肪含量高的组织：脑/植物脂肪含量高，PCI 抽提后，上清含白色絮状物。必须用氯仿再次对上清进行抽提。

核酸/核酶含量高的组织：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷冻条件下碾磨组织，再快速匀浆，能有效灭活核酶。但如果裂解液太粘稠(因为核酸含量高的缘故)，PCI 抽提不能有效分层；加入更多裂解液可以解决此问题。多次PCI抽提可以去除更多残留的 DNA。如果加入醇后马上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。溶解后用酸性 PCI 再次抽提，可以去除 DNA 污染。

植物组织：植物组织比动物组织更为复杂。一般，大家都是在液氮条件下对植物进行碾磨的，所以内源酶作用使 RNA 降解的现象不常见。如果降解问题不能解决，几乎可以肯定是样品中的内含杂质导致。许多植物的内含杂质都会导致残留，之所以残留，往往是因为这些杂质与 RNA 有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。这些特点决定了它们是非常强的酶抑制剂。目前，商品化的 RNA 抽提试剂经过小量调整，可以适合几乎所有的动物组织，但却没有一种商品化的 RNA 抽提试剂，可以适合大部分植物组织。

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样品冻融的影响

冷冻的样品可能较大，用于抽提 RNA 之前，需要切割。切割过程中样品往往出现融化(可能是部分融化)。冷冻的样品抽提 RNA 前可能还要称重，这个过程肯定会出现融化。有时候，液氮碾磨过程中也会出现样品的融化；或者冷冻样品不经过液氮碾磨直接加入裂解液中，在彻底匀浆前肯定会出现融化。实验表明，冷冻组织在融化过程中比新鲜组织更容易发生 RNA 的降解。可能的原因是：冻融过程破坏了细胞内的结构，使内源酶更容易与 RNA 直接接触。

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RNA 质量的判断

通常，使用电泳判断 RNA 的完整性，使用 A260/A280 判断 RNA 的纯度。理论上，完整的 RNA 拥有 28S:18S = 2.7:1 的比例，大部分资料则强调 28S:18S = 2:1 的比例。事实是，除了细胞外，从其它样品中抽提的 RNA 几乎都得不到 2:1 的比例(此结论使用 Agilent Bioanalyzer 获得)。RNA 的电泳结果受许多因素的影响，包括二级结构，电泳条件，上样量，被 EB 饱和的程度等。使用非变性电泳检测 RNA，以 DNA Marker 做对照，如果 2kb 处的 28S 和 0.9kb 处的 18S 条带清晰，且 28S:18S > 1，该完整性可以满足绝大部分后续实验要求了。A260/A280 是一个给大家带来许多困惑的指标。首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的 RNA，其 A260/280 = 2.0 左右。纯 RNA 是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’。现在大家却在拿 A260/A280 当‘因’用，认为“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在您的 RNA 样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG 等，再测 A260/A280 比值。现实是，许多抽提 RNA 时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在 A260 和 A280 处附近有吸收，对 A260/A280 产生影响。目前最具有指导性的做法是：对 RNA 样品在 200-300 nm 范围扫描。纯 RNA 的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230 和 A260 是两个拐点，A300 接近0，A260/A280 = 2.0 左右，A260/A230 = 2.0 左右。如果没有扫描数据，也一定要测定 A260/A230 比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。要考虑设备的线形范围(A260 要处于 0.1 – 0.5 之间)。另外有两个有用的现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。

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RNAguard：抑制组织/细胞内源酶的试剂

综上所述，确保 RNA 不降解的传统做法是：在取组织前将含液氮的容器放在手边，一旦取出所需组织，立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾钵中加入适量的液氮，再将组织从液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾钵中碾磨。碾磨过程中要及时补充液氮以防止组织融化。待组织彻底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好挥发完时，立即将碾磨碎的组织移入裂解液中快速匀浆......安全的称重几乎不可能。这么严格的操作，是没有多少实验人员去认真执行的。

RNAguard 能快速抑制样品中的内源酶活性，确保动物组织/细胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一个月不降解，-20C 一年以上不降解。RNAguard 适用的样品包括：动物组织，培养细胞，昆虫，及部分植物组织。经过 RNAguard 处理的样品可以用几乎所有常用的 RNA 方法/试剂抽提 RNA，所有的操作与用新鲜组织没有什么不同。

使用 RNAguard 的操作非常简单：在取组织前预先估计组织的重量，在一个容器中加入 5-10 倍体积的 RNAguard，放在手边。取出所需组织后，立即切割成厚度小于 0.5 厘米，放入含 RNAguard 的容器中即可。抽提前先用镊子将组织从 RNAguard 中取出，在室温进行切割和称重后，移入裂解液中快速匀浆。

如果您面临下面的情况之一，您一定会发现使用 RNAguard 的好处：

实验室没有液氮罐或者 –70C 冰箱保存样品

易降解样品的 RNA 抽提或者抽提 RNA 经常碰到降解问题

样品必须准确称重 大规模 RNA 的抽提

样品的采集 – 手术室，野外

样品的邮寄