质粒DNA抽提实验报告

第一篇：质粒DNA抽提实验报告

质粒DNA抽提实验报告

一．实验目的：

1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCR扩增等。

2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度，构型，含量和分子量大小。

二．实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三．实验仪器及试剂：

1.5mlEP管、高速离心机、移液枪

溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．实验步骤:

1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min，去上清液（重复一次）

2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞

3、加200μl溶液Ⅱ，轻轻摇匀，放置5min

4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min

5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min

6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min 7、70%乙醇洗涤沉淀2次，风干

8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存备用

五．实验结果：得到大肠杆菌质粒DNA

PCR以及电泳实验报告

一．实验原理：

PCR：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

电泳：琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。

二．实验仪器及试剂：

EP管、离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪、移液枪、紫外透射检测仪等 DNA模板、与特定DNA模板结合的引物、去离子水、商业化的DNA聚合酶以及缓冲液、dNTP、DNA荧光染料溴化乙锭、琼脂糖凝胶

三．PCR反应体系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl

四．操作步骤 1、94℃预变性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循环7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循环23次 3、72℃，10s

4、电泳检测

五．实验结果分析

分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表：

如右图所示：实验所用的琼脂糖凝胶浓度为1.3%，实验的DNA条带位置在500bp-750bp之间，接近500bp，证明实验是成功的

2000bp 1000bp

750bp 500bp 250bp 100bp 实验组

对照组

第二篇：质粒DNA的抽提与纯化 (附注问题非常详细)

质粒DNA的抽提与纯化(附注问题非常详细)

目的： 采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术

原理： 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

仪器与主要试剂 仪器（见附录）：

主要试剂： 溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖 10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH 1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc(pH4.8)溶液 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTA

实验方法：

1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16～18小时

2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒

3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀 4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟

5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟

6．加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟

7．12000rpm离心15分钟 8．将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯仿：异戊醇各抽提一次

9．加入1毫升预冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc(3 mol/L,pH5.2)，盖紧，并翻转EP管数次混匀

10． 置于-20℃冰箱1～2小时

11． 15000rpm离心15分钟，去除上清，收集管底白色沉淀 12． 70%乙醇洗涤一次，空气干燥或真空抽干

13． 将沉淀溶于50μl TE缓冲液或去离子水，完全溶解后，-20℃保存 14． 取样5μl，在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA条带。

附注：

1．溶液Ⅰ--－溶菌液

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。EDTA的作用：

（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作辅基）。

（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2．溶液Ⅱ--NaOH-SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时，该系统的PH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性.SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3…R┿-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。3．溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc(pH4.8)溶液

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸.所以该溶液实际上是NaAc-Hac的缓冲液.用PH4.8的NaAc溶液是为了反pH12.6的抽提液,调回PH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在.而高盐的3MOL/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA,RNA,以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之.前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全.4.为什么用无水乙醇沉淀DNA? 用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂.DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右.因而也可改用95%乙醇来替代懈水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵).但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率.折中的做法初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇.也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA.一般在室温下放置15-30分钟即可.5.在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAC或NaCL至最终浓度达0.1－0.25MOL/L? 在Ph为8左右的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAC或NaCL,使Na2+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好.在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀.6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与Kac来处理? 加进去的Rnaese本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加Kac使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全.也可用饱和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnese。在溶液中，有人以Kac代替NaAc，也可以收到较好的效果。7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa=7.2）和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围,可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCL系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性.8.如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA? 采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20%.本实验选择性沉淀4.3Kb的pBR322质粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其最终PEG浓度为12%.PEG选择性沉淀DNA的分辩率大约100bp.9.抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好? 酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层.作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水想有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA.所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好.经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走.也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用.10.为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇? 在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容光焕发器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用.加入异戌醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生.一般采用氯仿与异戌醇为24:1之比.也可以采用酚,氯仿与异戌醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加入一份24:1的氯仿互异戌醇即成,)节同时异戌醇有助于分相,使离必后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定.11.为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化? 因为酚与水有一定的互溶.苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中,不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失.用Tris调节至PH为8是因为DNA在此条件下比较稳定.在中性或碱性条件下(PH5~7),RNA比DNA更容易游离到水相,所以可获得RNA含量较少的DNA样品.保存在冰箱中的酚,容易被空气氧公而变成粉红色的,这样的酚容易降解DNA,一般不可以使用.为了防止酚的氧化,可加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%.8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在一定程度上能抑制Dnase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris PH8.0水溶液饱和后的酚,最好分装在棕色小试剂瓶里,上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子这宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或-20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

第三篇：质粒抽提常见问题与解答

1.没有提出质粒或者质粒收获量很低

A菌种老化

建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。二次培养时间最好不要超出16小时(或者OD600不超过3.0)。

B低拷贝质粒

建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量。

C质粒丢失

建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。

D裂解不充分

建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。并确保细菌混悬均匀。

EBuffer中有沉淀未溶解

建议：BufferB1和BufferN1，BufferC1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37℃温育片刻，待溶液澄清后使用。

FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇

建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。

G离心柱中乙醇残留

建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提，大提和朝大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻(或置于65℃烘箱)，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。

H洗脱液加入位置不正确

建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。

I洗脱液pH值不正确

建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0-8.5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)进行洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH在7.0-8.5之间。

J洗脱体积的选择

建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，请根据试剂盒要求进行二次洗脱，再用推荐的方法进行沉淀，浓缩质粒。

K洗脱时间的选择

建议：加入洗脱Buffer后，室温放置2-5分钟，将有利于洗脱。

2.质粒纯度不高

A蛋白质污染

建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白。另外如果用ddH2O作为稀释溶液,测定OD比值，比值可能较低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer来稀释。

BRNA污染

建议：检查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA应该存放在4℃，如果存放时间过长，或者没有正确存放，RNaseA活力下降，请重新加入RNaseA。

C基因组DNA污染

建议：加入BufferB1后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入BufferB1的处理时间最好不要超过5分钟。

D菌株为含内源核酸酶的宿主菌株

建议：请选用含内源核酸酶的宿主菌株质粒DNA提取试剂盒，或者转化质粒到不含内源核酸酶宿主菌株中。

3.加样时DNA飘出加样孔外

原因：柱中残留乙醇未除干净。

建议：洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在柱子上。可再离心或者抽真空。

第四篇：DNA抽提试剂盒简介

一．上海生工的试剂盒：

1.基因组小量抽提试剂盒

BS47350Extractions350元BBI

BS474100Extractions420元BBI

SK125150次280元Sangon

SK1252100次380元Sangon

基本说明：通过将组织细胞裂解后，以RnaseA和Proteinase K消化降解RNA和蛋白质。然后经过简单抽提、沉淀获得基因组DNA。本试剂盒适用于从人或动物的血液、培养细胞、各种组织、Gram+/Gram-细菌中快速抽提基因组DNA。

主要特点：1.整个抽提过程30分钟，氯仿抽提仅一次，无需酚抽提。

2.本试剂盒抽提DNA能用于几乎所有生物学实验。

3.按样品准备方法得到的200微升样品中可获得2~10微克DNA。

2.UNIQ-10柱式血液基因组抽提试剂盒

BS48350Extractions390元BBI

BS484100Extractions760元BBI

SK126150次380元Sangon

SK1262100次690元Sangon

基本说明：UNIQ-10柱含有特异性吸附DNA的膜。利用最新研发的血液处理试剂，能特异有效地将血液中白细胞的DNA释放到溶液上清中，有利于膜对血液基因组DNA的吸附。经洗涤除去非特异性结合的杂质，然后用Elution Buffer洗脱。试用于从人和动物外周血货其他途径收集的血液中抽提基因组DNA。

主要特点：1.抓们针对血液基因组DNA的抽提。

2.DNA纯度好，产率高。

3.快速、简便。

第五篇：血液标本抽提DNA

抗凝全血中提取DNA

准备： 配制80%异丙醇和70%乙醇各1ml备用。选择2ml的 离心管。血液的体积为2ml。先向2ml的离心管中加入1ml的血液。后加入1ml的buffer MG-A，剧烈摇晃20次；10000xg 离心30s，缓慢倒掉上清。再加入1ml的血液，再加入1ml的buffer MG-A，剧烈摇晃20次；10000xg 离心30s，缓慢倒掉上清。注意： 使用底部带有棱角的离心管，以防倒上清时，沉淀滑出离心管。

如果血液体积超过1/2离心管的体积，可分两次进行处理。目的：buffer MG-A的作用是快速裂解细胞，并且促使DNA形成容易沉淀的凝聚物。加入1ml的buffer MG-A。Vortex充分震荡，10000xg 离心 30s，缓慢倒掉上清。加入1ml的buffer MGS, Vortex充分震荡，10000xg 离心30s，缓慢倒掉上清。将离心管倒扣在吸水上2min；或者简短离心，仔细吸除残留的上清。

目的： 洗涤去除DNA凝聚物中的蛋白。加入1ml buffer MGL和10ul Proteinase K，Vortex震荡悬浮沉淀。6 65℃水浴30min（或者更长时间，可过夜），间断摇晃混合。目的：降解蛋白，释放DNA 10000xg 离心 30s，将上清缓慢倒入一个干净的2ml的离心管，加入800ul 80%异丙醇；缓慢翻转离心管20次（出现丝状或簇装DNA凝聚物）,再剧烈摇晃20次使DNA凝聚物变得更紧密。10000xg 30s，缓慢倒掉上清。

注意： 在出现丝状或簇状DNA凝聚物后，需剧烈摇晃去除可能包裹在DNA凝胶中的溶液，不然最后DNA溶解困难，或DNA中有盐残留。

在出现DNA凝聚物之前，DNA为溶解状态，需要缓慢翻转离心管。目的：异丙醇能够沉淀DNA 加入1000ul 70% 乙醇，剧烈摇晃20次；10000xg 离心 30s，缓慢倒掉上清。

目的：洗涤去除盐成分。将离心管倒置在干净的吸水纸上至少5min，或者简短离心，仔细吸除残留的乙醇（勿吸除沉淀）。室温放置10min或者37℃ 放置5min挥发乙醇，干燥至DNA沉淀为半湿润状态，无酒精味，效果最佳。目的：干燥挥发乙醇。加入至少200ulTE，提速Vortex 震荡5s或者剧烈摇晃10次，65℃水浴10-60min 溶解DNA，水浴5min后轻弹离心管底部打散DNA凝聚物（一般继续水浴10min 后即可完全溶解）；或者65℃水浴过夜。

注意：水浴后，DNA为溶解状态，应避免剧烈操作。目的：溶解DNA。