以Chelex100为介质抽提DNA解析

第一篇：以Chelex100为介质抽提DNA解析

以Chelex 100为介质抽提DNA

近年来，DNA的分析技术已广泛地应用于肿瘤学的研究中。获取DNA的传统方法是以新鲜、-70℃或液氮保存的标本为材料，通过蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提而获取DNA。1987年，Fey等［1］首先用NP40成功地从骨髓涂片中提取到较高分子量的DNA，用于Southern印迹分析。国内的一些学者［2,3］也用相似的方法，从骨髓涂片中提取到DNA。但这两种方法均需蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀等步骤，操作复杂，费时。同时，需要在多个离心管之间转移，增加了标本间的交叉污染。由于PCR技术对DNA样品的纯度和分子量的要求相对较低：对微量的DNA即可扩增，且只需待扩增的靶序列完整即可，不要求高分子量。因此，部分降解的DNA均可作PCR检测。由于PCR有极高的敏感度，需严格控制标本间的交叉污染，同时为了适应血液系统恶性肿瘤标本来源的特点，我们通过与常规酚、氯仿提取DNA进行比较，以了解以Chelex 100为介质提取DNA对PCR的影响。

一、材料和方法

1.细胞：(1)细胞株：B-NHL细胞株-村林细胞。(2)外周血有核细胞：由健康志愿者提供。

2.DNA获取率比较：(1)将不同培养瓶中已培养的村林细胞混合；A组取10份，5 ml/份；B组取10份，0.5ml/份。(2)A组用酚、氯仿抽提DNA ：按Sambrook等［4］介绍的方法提取DNA。(3)B组用Chelex 100为介质提取DNA：将已培养定量的村林细胞加入Eppendorf管中，加去离子水1ml，间歇振荡30 分钟。15 000r/min离心5分钟，弃去上清液470 μl，加10% Chelex 100 170 μl，56℃温育30分钟。超速振荡15秒，沸水浴8分钟，15 000 r/min离心5分钟，上清液即为DNA模板［5］。(4)DNA定量：在微量紫外分光光度计上分别测两种不同方法提取DNA的吸光度(A，曾称光密度OD)值，换算出DNA的浓度和获得量：

DNA浓度(μg/ml)=OD260 ×50×稀释倍数

DNA获得量(μg)=DNA浓度×DNA溶液体积(5)统计学处理：采用两样本均数检验法进行检验。

［4］

3.PCR敏感性比较：(1)外周血有核细胞DNA的提取：按Sambrook等方法用酚、氯仿提取。(2)实验分组：以Chelex 100为介质抽提的村林细胞DNA与外周血有核细胞DNA混合为A组；以酚、氯仿抽提的村林细胞DNA与外周血有核细胞DNA混合为B组，使村林细胞DNA含量分别为5%、1%、0.5%、0.3%、0.2%和0.1%。(3)PCR扩增：取1μgDNA，选用IgH基因重排引物，按Trainor等［6］方法进行Semi-nest扩增。(4)取PCR产物15 μl于8%聚丙烯酰胺凝胶200V电泳2小时，EB染色，紫外灯下观测，拍照。本实验重复3次。

4.PCR准确性的比较：(1)PCR扩增：分别以Chelex 100法和酚、氯仿法抽提的50ng DNA为模板，进行扩增，方法同前。(2)SSCP检测：按Yap等方法进行［7］。(3)银染：1%硝酸浸泡5分钟，去离子水冲洗2次；0.2%硝酸银浸泡3～5分钟，去离子水冲洗2次；3%无水碳酸钠显影至条带清晰而背景不至过深，10%乙酸浸泡5分钟，停止反应。风干后拍照。重复3次。

5.血红蛋白对PCR敏感性的影响：(1)以Chelex 100 为介质提取村林细胞DNA：方法同前。(2)用健康志愿者外周血10 μl，按以Chelex 100 为介质抽提DNA的方法和过程，对其进行处理。(3)用酚、氯仿抽提外周血有核细胞DNA：方法同前。(4)用微量紫外分光光度计测DNA的含量：方法同前。A组：以Chelex 100为介质抽提的村林细胞DNA按5%、1％、0.5%和0.3%的比例用外周血有核细胞DNA稀释。PCR扩增时模板加量分别为1 μg。B组：以Chelex 100为介质抽提的村林细胞DNA按5%、1％、0.5%和0.3%的比例用外周血有核细胞DNA稀释。PCR扩增时的模板加量也为1 μg，但同时加5 μl的本节实验步骤2处理后的上清液。(5)PCR扩增、电泳、染色及拍照：同前。本实验重复3次。

二、结果

1.两种不同方法提取DNA时的获取率：酚、氯仿抽提组:5ml村林细胞的DNA的平均获取量为82.4 μg±1.04 μg。Chelex 100组，0.5ml村林细胞的DNA的平均获取量9.10 μg±2.84 μg。经统计学检验，t值为0.899 5，P=0.380 25，两组间的差异无显著性。

2.两种不同DNA提取方法PCR敏感性的比较：用以Chelex 100为介质抽提的DNA进行PCR扩增时，其可检测的最低含量为0.3%，即3ng/1 μg。用酚、氯仿抽提的DNA进行PCR扩增，其可检测的最低含量为0.2%，即2ng/1 μg(1)。

1～6:稀释度分别为0.1％、0.2%、0.3%、0.5%、1%、5%，M：Marker Marker左侧为以Chelex 100为介质抽提组，右侧为酚、氯仿抽提组 1 两种不同方法抽提DNA后梯度稀释、PCR扩增结果

3.两者不同DNA提取方法的PCR准确性的比较：结果显示单链位置无差异，表明以Chelex 100为介质抽提的DNA进行PCR扩增的产物经SSCP及银染后与经酚、氯仿抽提的无差异。

4.血红蛋白的存在对PCR敏感性的影响：实验结果显示，两组PCR扩增产物条带在紫外灯下亮度无差异，表明，用Chelex 100 为介质抽提DNA时，红细胞的存在与否，不影响PCR的敏感性（2）。

1～4:稀释度分别为0.3%、0.5%、1%、5%；M:Marker;Marker左侧为不含血组,右侧为含血组 含血与不含血标本PCR扩增结果

三、讨论

在有关分子生物学的研究中，DNA提取的方法很多，但由于操作步骤多易污染，所用的有机溶剂对人体有害，且标本量要求多，保存要求高；或者由于DNA的获取量少，且有PCR扩增的抑制因素的存在，使PCR扩增的结果不稳定［5］，严重影响了该方法在某些方面的应用。

Chelex 100 做为一种离子螯合剂，由苯乙烯和苯二乙烯组成。其悬液在碱性环境(pH 10-11)和100℃的条件下，可导致细胞膜的破裂和DNA的变性并释放出来［5］。本实验通过对两种不同抽提DNA进行PCR扩增的方法的比较，发现以Chelex 100为介质抽提DNA时，DNA的获取率与经典的酚、氯仿抽提法的无差异。这是由于前一方法虽然存在DNA释放得是否完全以及仍有一部分由于高温而降解的问题［8］，但酚、氯仿抽提时由于抽提过程中含有DNA的水相在转移过程中不可避免地要损失一部分，使得DNA的获取率也降低，导致二者在DNA的获取率方面差异无显著性。

此外，本实验结果还表明，用此方法抽提DNA进行PCR扩增的阈值高于经典的酚、氯仿抽提法的：阈值分别为0.3%和0.2%，而忠实性无影响。DNA在［8］100℃的条件下，可发生大量的降解，Sepp等研究证明，沸水浴处理后，所得的DNA的片段在200 bp以下，且量少。这主要是由于标本中的金属离子在高温和低离子强度的条件下对DNA降解的催化作用所致［5］。而在有Chelex 100存在的条件下，金属离子被结合，阻止了其对DNA降解的催化作用，同时，由于Chelex 100 的颗粒在离心后沉淀下来，不会干扰PCR反应体系中的Mg2+浓度，且借助于PCR反应体系中缓冲液，其碱性的上清液也不会影响到PCR的扩增反应。但是，由于高温本身也有一定程度降解DNA的作用，使得该方法提取的DNA片段在1 000 bp以下［8］，其中可含有低于80bp的小片段，也可出现DNA片段断裂在PCR扩增的靶序列区域内。这使得有效的靶序列的拷贝数减少，导致了用以Chelex 100为介质抽提DNA进行扩增的方法的阈值稍高于酚、氯仿抽提法的阈值，而PCR的忠实性无影响。

再者，本实验中，两种不同DNA抽提方法在用梯度稀释进行敏感度检测时的敏感度分别为0.3%(3ng/1 μg)和2%(2ng/1 μg)。由于0.1 μg外周血单个核细胞DNA约含有104个不同的重链基因，上述敏感度分别相当于1 000个外周血有核细胞中可检出3个和2个肿瘤细胞。

另外，在含血的标本中，血红蛋白去除不彻底，其中的卟啉化合物可抑制PCR扩增。在酚、氯仿抽提时，由于蛋白质被去除，也可通过预先去除红细胞，使得卟啉化合物得到去除或明显减少。而在以Chelex 100为介质抽提DNA时，由于未用蛋白酶K消化，卟啉化合物很少从血红蛋白中释放出来，且可能还可以通过与Chelex 100结合，使得PCR扩增不受影响［5］，本实验的结果证实了这一点。

由于此方法获取的DNA的片段小于1 000 bp，故不能用于扩增靶片段大于1 000 bp的PCR实验中，也不适用于Southern杂交中，应引起注意。

作者单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院儿内血液／肿瘤科（步嵘、王耀平）；上海铁道大学医学院附属甘泉医院检验科（叶元康）

参考文献

Fey MF, Pilkington SP, Summers C, et al.Molecular diagnosis of hoematological disorders using DNA from stored bone marrow slides.Br J of Hoematol, 1987,67:489-492.2 陈勖奇.从骨髓涂片提取DNA用于PCR扩增.中华内科杂志,1993,32:655-655.3 刘艳平, 张鹏，朱平.PCR方法分析骨髓涂片微量DNA－检测微量残留病.中华血液杂志,1993,14:648-649.4 金冬雁，黎孟枫译.见：Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.主编.分子克隆.第2版.北京：科学出版社.1993.456-494.5 Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R.Chelex 100 as a Medium for simple extraction of DNA for PCR-Based typing from forensic material.Biotechniques 1991,10:506-513.6 Trainor KJ, Brisco MJ, Wan JH, et al.gene rearrangement in B-and T-lymphoproliferative disease detected by the polymerase chain reaction.Blood, 1991,78:192-196.7 Yap EPH, Mcgee JOD.Non-isotopic Single-Strang Conformation Polymorphism.In: Griffin H.G, Griffin AM, eds.PCR Technology.Boca Raton: CRC Press, 1994.165-177.8 Sepp R, Szabo I, Uda H, et al.Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR.J Clin Pathol, 1994,47:318-323.(本文编辑：蔡振国)

(收稿：1998-08-15 修回：1999-07-23)

第二篇：DNA抽提试剂盒简介

一．上海生工的试剂盒：

1.基因组小量抽提试剂盒

BS47350Extractions350元BBI

BS474100Extractions420元BBI

SK125150次280元Sangon

SK1252100次380元Sangon

基本说明：通过将组织细胞裂解后，以RnaseA和Proteinase K消化降解RNA和蛋白质。然后经过简单抽提、沉淀获得基因组DNA。本试剂盒适用于从人或动物的血液、培养细胞、各种组织、Gram+/Gram-细菌中快速抽提基因组DNA。

主要特点：1.整个抽提过程30分钟，氯仿抽提仅一次，无需酚抽提。

2.本试剂盒抽提DNA能用于几乎所有生物学实验。

3.按样品准备方法得到的200微升样品中可获得2~10微克DNA。

2.UNIQ-10柱式血液基因组抽提试剂盒

BS48350Extractions390元BBI

BS484100Extractions760元BBI

SK126150次380元Sangon

SK1262100次690元Sangon

基本说明：UNIQ-10柱含有特异性吸附DNA的膜。利用最新研发的血液处理试剂，能特异有效地将血液中白细胞的DNA释放到溶液上清中，有利于膜对血液基因组DNA的吸附。经洗涤除去非特异性结合的杂质，然后用Elution Buffer洗脱。试用于从人和动物外周血货其他途径收集的血液中抽提基因组DNA。

主要特点：1.抓们针对血液基因组DNA的抽提。

2.DNA纯度好，产率高。

3.快速、简便。

第三篇：质粒DNA抽提实验报告

质粒DNA抽提实验报告

一．实验目的：

1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCR扩增等。

2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度，构型，含量和分子量大小。

二．实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三．实验仪器及试剂：

1.5mlEP管、高速离心机、移液枪

溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．实验步骤:

1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min，去上清液（重复一次）

2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞

3、加200μl溶液Ⅱ，轻轻摇匀，放置5min

4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min

5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min

6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min 7、70%乙醇洗涤沉淀2次，风干

8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存备用

五．实验结果：得到大肠杆菌质粒DNA

PCR以及电泳实验报告

一．实验原理：

PCR：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

电泳：琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。

二．实验仪器及试剂：

EP管、离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪、移液枪、紫外透射检测仪等 DNA模板、与特定DNA模板结合的引物、去离子水、商业化的DNA聚合酶以及缓冲液、dNTP、DNA荧光染料溴化乙锭、琼脂糖凝胶

三．PCR反应体系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl

四．操作步骤 1、94℃预变性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循环7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循环23次 3、72℃，10s

4、电泳检测

五．实验结果分析

分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表：

如右图所示：实验所用的琼脂糖凝胶浓度为1.3%，实验的DNA条带位置在500bp-750bp之间，接近500bp，证明实验是成功的

2000bp 1000bp

750bp 500bp 250bp 100bp 实验组

对照组

第四篇：血液标本抽提DNA

抗凝全血中提取DNA

准备： 配制80%异丙醇和70%乙醇各1ml备用。选择2ml的 离心管。血液的体积为2ml。先向2ml的离心管中加入1ml的血液。后加入1ml的buffer MG-A，剧烈摇晃20次；10000xg 离心30s，缓慢倒掉上清。再加入1ml的血液，再加入1ml的buffer MG-A，剧烈摇晃20次；10000xg 离心30s，缓慢倒掉上清。注意： 使用底部带有棱角的离心管，以防倒上清时，沉淀滑出离心管。

如果血液体积超过1/2离心管的体积，可分两次进行处理。目的：buffer MG-A的作用是快速裂解细胞，并且促使DNA形成容易沉淀的凝聚物。加入1ml的buffer MG-A。Vortex充分震荡，10000xg 离心 30s，缓慢倒掉上清。加入1ml的buffer MGS, Vortex充分震荡，10000xg 离心30s，缓慢倒掉上清。将离心管倒扣在吸水上2min；或者简短离心，仔细吸除残留的上清。

目的： 洗涤去除DNA凝聚物中的蛋白。加入1ml buffer MGL和10ul Proteinase K，Vortex震荡悬浮沉淀。6 65℃水浴30min（或者更长时间，可过夜），间断摇晃混合。目的：降解蛋白，释放DNA 10000xg 离心 30s，将上清缓慢倒入一个干净的2ml的离心管，加入800ul 80%异丙醇；缓慢翻转离心管20次（出现丝状或簇装DNA凝聚物）,再剧烈摇晃20次使DNA凝聚物变得更紧密。10000xg 30s，缓慢倒掉上清。

注意： 在出现丝状或簇状DNA凝聚物后，需剧烈摇晃去除可能包裹在DNA凝胶中的溶液，不然最后DNA溶解困难，或DNA中有盐残留。

在出现DNA凝聚物之前，DNA为溶解状态，需要缓慢翻转离心管。目的：异丙醇能够沉淀DNA 加入1000ul 70% 乙醇，剧烈摇晃20次；10000xg 离心 30s，缓慢倒掉上清。

目的：洗涤去除盐成分。将离心管倒置在干净的吸水纸上至少5min，或者简短离心，仔细吸除残留的乙醇（勿吸除沉淀）。室温放置10min或者37℃ 放置5min挥发乙醇，干燥至DNA沉淀为半湿润状态，无酒精味，效果最佳。目的：干燥挥发乙醇。加入至少200ulTE，提速Vortex 震荡5s或者剧烈摇晃10次，65℃水浴10-60min 溶解DNA，水浴5min后轻弹离心管底部打散DNA凝聚物（一般继续水浴10min 后即可完全溶解）；或者65℃水浴过夜。

注意：水浴后，DNA为溶解状态，应避免剧烈操作。目的：溶解DNA。

第五篇：酚氯仿抽提解析

DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织，通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。

二、材料以方法

1、材料：培养菌体

2、仪器设备：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，台式离心机，移液枪一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪

3、试剂：

细胞裂解液 100 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 500 mM NaCl 1.25% SDS PH 7.5 饱和酚，氯仿/异戊醇，酚/氯仿/异戊醇 无水乙醇，70％乙醇，异丙醇 M NaAc pH5.2, RNase，50×TE缓冲液，电泳载样缓冲液

三、操作步骤（1）培养菌体

（2）加入10 ml裂解液，1/10体积酚，于65℃下20－30 min，然后加入等体积的氯仿，轻摇（3）12000－15000rpm离心15 min（4）取上淸液，加入等体积氯仿，轻摇，12000－15000rpm离心15 min（5）取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃）（6）加入1/10体积的3 M NaAc(pH5.2)，置于室温下10 min（7）12000－15000rpm离心10 min（8）倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀（9）加入2倍体积无水乙醇（10）12000－15000rpm离心10 min（11）倒弃液体留下沉淀，真空干燥（12）复溶于2 ml TE（13）加入RNase，65℃或37℃处理10－30 min（14）加等体积酚，酚/氯仿，氯仿各一次，12000－15000rpm离心10 min（15）取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃）（16）加入1/10体积的3 M NaAc(PH5.2)，置于室温下10 min（17）12000－15000rpm离心10 min（18）倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀（19）真空干燥沉淀

（20）复溶于0.5－1.0 ml的TE或水中，分装成小体积，4℃或-20℃保存。（21）电泳检测提取DNA的质量

四、结果与分析

点样空，若发亮则说明有污染 超螺旋结构DNA，若条带有拖尾则 说明有破碎的DNA 少量未清除的RNA

五、注意事项

1、重点防止DNA的损伤，包括各种物理、化学和机械损伤。

2、干燥好的染色体DNA最好溶于去离子水，以备后面直接利用。如果用TE 缓冲液溶解，后面还需去离子。

3、取上清时，如果上清液过少，可再加入少量水，重新离心，取上清，避免DNA损失过多。