第一篇：微生物的培养与生长
第四章
微生物的培养与生长
所有生物为了生存都必须不断地从外界环境中吸收所需的各种物质从中获得 原料和能量以便合成新的细胞物质，生物所需的这些物质称之为营养物质。生物吸收利用营养物质的过程一般称为营养。营养物质是生物进行一切生命活动的物质基础，失去这个基础，一切生物都无法生存，微生物也不例外。可见，营养对微生物的重要性。
第一节 微生物的营养
一、微生物细胞的化学组成
分析微生物细胞化学组成是了解微生物营养物质的基础。主要成分：C、H、N、O和无机成分。其中主要是水分、蛋白质、碳水化合物、脂肪、核酸和无机盐。水分占90-97，其余占3-10%。
二、营养物质及其生理功能
微生物所需的营养物质，主要包括碳素化合物、氮素化合物、水分、无机盐类和生长素。这些物质对微生物的生命活动主要有三方面的作用：
（1）、供给微生物合成细胞物质的原料；（2）、合成代谢和生命活动所需的能量；（3）、调节新陈代谢。
（一）、碳源
碳源主要用来供给菌体生命活动所需的能量，构成军菌体细胞及代谢产物。常用的碳源有：糖类、脂肪和某些有机酸、部分醇类。
在某些特殊情况（如碳源贫乏），蛋白质水解产物或氨基酸等也可以被某些菌种作为碳源使用。由于菌种所含煤系统并不完全相同，所以，各种菌能利用的碳源亦不相同。
葡萄糖、麦芽糖、乳糖等单糖和双糖是绝大部分细菌、酵母菌、放线菌及霉菌可利用的碳源，大多数霉菌、放线菌和部分细菌可直接利用糊精和淀粉作为碳源。
（二）、氮源
氮源主要用来构成菌体细胞物质（如氨基酸、核酸、蛋白质）和含氮代谢产物。常用的氮源可分为两类：有机氮源和无机氮源。黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、鱼粉等属于有机氮源；氨水、硫酸铵、尿素、硝酸钠、硝酸铵和磷酸氢二铵等为无机氮源。
（三）、水
水是微生物体内外的溶媒，只有通过水，微生物所需要的营养物质才能进入细胞，也只有通过水其代谢产物才能排出体外。另外，水也可以直接参加代谢作用，如蛋白质、碳水化合物和脂肪的水解作用都是在水参与下才能进行的。
（四）、无机盐
无机盐也是微生物生长所必不可少的营养物，其中又可分为主要元素和微量元素两大类。主要元素微生物需要量大，有P、S、Mg、K、Ca、Na等，它们参与细胞结构物质的组成，有调节细胞质pH值和氧化还原电位的作用，有能量转移、控制原生质胶体和细胞透性的作用。微量元素有Fe、Cu、Zn、Mn、Co等，它们的需要量 虽然极微，但往往强烈地刺激微生物的生命活动。它们或是酶活性基的组成成分或酶的激活剂。
（五）、生长因子
有些微生物在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中仍不能正常生长，如在培养基中加入某种组织（或细胞）提取液时，则微生物生长良好，说明这种组织中含有某些微生物生长所需的生长因子。凡是微生物生长所不可缺少的微量有机物都称为生长因子。包括维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶及其衍生物。
这些物质之所以称之为生长因子，是由于某些微生物自己不能合成之，必须由外界提供。它不是一切微生物所必需的。
第一类是不需要外源供给的微生物，像自养型细菌和广泛分布的一些腐生性细菌和霉菌，它们自己可以合成这些物质，以满足自身 的需要。
第二类是缺乏自制一种或两种能力的微生物，如金黄色葡萄球菌需要硫胺素，根瘤菌需要生物素。这类微生物中有些种类，当外界供给所需要的前体物质，亦能满足需要。
第三类为对多种维生素、氨基酸、碱基都缺乏合成能力的微生物，在培养基中提供水解蛋白质和织物组织液才能生长（如麦芽汁、酵母汁）。
维生素作为酶的活性基团起催化作用。氨基酸是组成蛋白质的结构物质，嘌呤、嘧啶是合成核苷酸的主要物质。
三、微生物的营养类型
由于各种微生物的生活环境和对物质的利用能力不同，它们对营养的需要和代谢方式也不尽相同，根据微生物所需要的营养和能量的不同，尤其是碳素营养来源的不同，可把它们分成自养微生物和异养微生物两大类。
自养型微生物：能利用简单的无机物作为营养物质进行生长繁殖，能以CO2或碳酸盐为碳源，以氨或硝酸盐为氮源，在体内合成有机物，不需要外界供给有机物。
异养型微生物：只能用现成的有机物作为碳源，如单糖、双糖、淀粉、纤维素、有机酸等，另外，根据能量来源不同，又可分为两种类型。即光能营养型和化能营养型。光能营养型能利用光能。化能营养型是来自物质氧化过程释放的能量。
根据碳素来源和能量来源可分四种类型。
（1）、光能自养型：这类微生物利用日光作为其生活所需的能源，利用CO2作为碳源，以无机物为供氢体来还原CO2,合成细胞有机物质。如蓝细菌（光合细菌）。
（2）、光能异养型：有少数微生物种类具有光合色素，能利用光能把CO2还原为碳水化合物，但必须以某种有机物为CO2同化中的供氢体。如红螺菌属利用丙醇作为供氢体，积累丙酮。
（3）、化能自养型：能利用氧化无机物时产生的能量，把CO2还原成有机碳水化合物。如硝化细菌、铁细菌等。
（4）、化能异养型： 能源来自有机物 的氧化或发酵产生的化学能，以有机物为碳源，以有机或无机氮为氮源。这类微生物的种类最多。
四、微生物对营养物质的吸收方式
微生物对营养物质的吸收取决于细胞膜的结构和生物功能。细胞膜是一层具有高度选择性的半透膜，控制营养物质及 代谢产物的进出细胞。细胞膜上有丰富的酶，这些酶与物质的吸收和排泄有关。微生物对营养物质吸收的机制有四种：
1、被动扩散：由高浓度向低浓度扩散。
2、助长扩散：有载体蛋白参加。
3、主动运输：从低浓度向高浓度扩散，需要能量和载体蛋白。
4、基因转移：通过磷酸化转移。
五、培养基
微生物的生长和繁殖需要一定的营养物质，根据微生物对营养物质的需要，经过人工配制适合比同微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质就成为培养基。培养基的主要用途为：促使微生物生长与繁殖，用于微生物纯种分离、鉴定 和制造微生物制品等。
（一）、培养基的类型
由于各种微生物所需要的营养物不同，所以培养基的种类也有很多种，估计可有数千种之多，但大致可以分为以下几类。
1、根据营养物质来分
（1）、合成培养基：是由已知化学成分及数量的化学药品配制而成的。这种培养基成分精确，重复性强。但价格高，一般多用于实验室内供研究有关微生物的营养、代谢、分离和鉴定生物制品及选育菌种用。
（2）、天然培养基：采用化学成分还不十分清楚或化学成分不恒定的天然有机物，可用组织提取液等。如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨、牛奶、血清等。玉米粉、马铃薯配制方便、经济，运用于实验室和生产。
（3）、半合成培养基：在天然有机物的基础上，加入一些化学药品，以补充无机盐成分，使其更能充分满足生长需要。该培养基是使用最多的培养基。
2、根据培养基物理性状分
（1）、固体培养基：在液体培养基中加入2%琼脂，成为固体状，用于菌种保藏、分离、菌落特征观察、计数等。
（2）、液体培养基：一般用于生产。
（3）、半固体培养基：加入0.35%-0.40%琼脂。
3、根据培养基的用途来分
（1）、基础培养基：满足一般微生物生长需要的营养物质。
（2）、加富培养基：在培养基中加入额外的营养物质，使某些微生物在其中生长，而不适合其它微生物生长。通常加入血、血清、动植物提取液。
（3）、选择培养基：在培养基中加入某些化学药品以抑制不需要的微生物生长，而促进需要的微生物生长，往往加入一些抑菌剂或杀菌剂。
（4）、鉴别培养基；根据微生物能否利用培养基中的某种成分，依靠指示剂的颜色反应，借以鉴别不同种类的微生物。
（二）、培养基配制的原则
1、根据微生物的营养要求配制；
2、注意营养成分的比例；
3、培养基的pH值；
4、氧化还原电位。
第二节
微生物的生长
一、微生物的生长
微生物在适宜的环境中，按照自己的代谢方式，不断地吸收营养物质，进行新陈代谢，即进行同化作用和异化作用。如果同化作用大于异化作用，细胞会增大，细胞的体积逐渐增加，这就是生长。细胞的生长有一定限度的，当增到一定限度时，细胞就开始分裂，形成两个基本相似的子细胞，子细胞又可重复进行生长和分裂。细胞分裂形成子细胞，使个体数目增加，这就是分裂。从生长到繁殖的过程也就是由量变到质变的 发展过程，这一质变过程叫发育。微生物在比较合适的条件下，能正常生长和繁殖。当环境发生某些变化，此变化超过了微生物能适应忍受的程度时，微生物的生命活动就会受到抑制而发生变异，甚至死亡。
细菌的生长的标志：以群体数目的增加作为生长标志。因为很难将生长与繁殖分开。
放线菌和霉菌：是以菌丝的伸长和分枝表现为生长的。
对于微生物的应用，不论是在食品和其他方面的应用，主要是利用它的菌体，及其产生的代谢产物和酶类，而这与微生物的生长是密切相关的。所以了解和掌握微生物的生长特性是很有必要的。
二、微生物的纯培养
目的是从混杂状态中纯化分离细菌，是研究利用微生物的基础，通常采用以下方法：
1、稀释平板法；
2、划线法；
3、单细胞分离法；
4、选择培养基分离法。
此部分试验指导中也有，在此简单介绍。
三、微生物生长的测定
（一）、单细胞的微生物是指细菌和酵母菌等，它们的生长量不是测定细胞大小，而是测定群体增长量。方法如下：
1、全数测定
所谓全数测定，即是培养一定时间后测定细胞的总数。其数量既包括活的细胞，也包括死的细胞。
（1）、计数器法：采用血球计数板。
（2）、染色涂片计数法：取定量菌液将其涂布于1cm2的面积内，染色、镜检、计数。
（3）、比浊法：是测定菌液中细胞数的快速方法，原理是菌液中细胞量越多，浊度越大。用未知细胞数的菌液和已知细胞数的菌液相比，来求出未知细胞数菌液中的细胞数。
2、活菌计数法：测定活菌数。（1）稀释平板法：取待测的细胞悬液作一系列的稀释，稀释级数越高，稀释液中含细胞数愈少，也就越易在培养皿上显出单个菌落。
（2）、液体稀释培养法：采用统计学原理进行测定，如大肠菌群的测定，采用此方法。
（二）、多细胞微生物生长的测定
以菌丝生长的长度或菌丝增加的重量作为生长指标。最简单的方法是将酶菌接种在培养皿内固体培养基中央，在一定时间内测定菌落的直径或面积。对生长速度快的霉菌，可每24h测量一次。可求出菌丝的平均生长速度。
（三）、细胞物质的测定
测量活菌或死菌。
1、干重法：过滤或离心，烘干称重。
2、含氮量法：细胞的蛋白质含量比较稳定。而氮又是蛋白质的重要组成。因此，测定微生物细胞的含氮量来表示其生长情况。
四、生长曲线
是指细菌等单细胞微生物，以细胞增长数的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标作图时，可以绘出一个曲线，此曲线称为生长曲线。
细菌纯培养的生长曲线：由于细菌各个时期生长繁殖速度不同，所以，生长曲线又可分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。
（一）、延迟期
少量的细菌接种到新鲜培养基后，开始时，细胞一般不立即进行繁殖。因此，它们的细菌数几乎不增加，甚至还有减少。生长曲线中的这一段时间称为延迟期。
处于延迟期的细菌体积增长较快，特别是在此期的末期。
延迟期的出现可能是因为细胞在新的环境中，需要合成新的必需的酶、辅酶或某些中间代谢产物，或者为了适应新环境而出现的调整代谢的时间。延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄及移种到新鲜培养基前后所处的环境条件是否相同等因素有关。
繁殖速度较快的菌种接种时，其延迟期也较短，甚至检查不到延迟期；接种到同样组成的培养基比接种到组成不同的培养基中，其延迟期要短些；增大接种量可缩短甚至消除延迟期。
由于延迟期的长短能影响微生物的正常生长周期，在发酵工业生产中延长生产周期，会降低设备的利用率。所以，生产实践中总是设法缩短延迟期。为此，采取的措施有：
（1）、增加接种量；（2）、用对数生长期的菌种；（3）、用健壮的菌种；
（4）、在种子培养基中加入发酵培养基中的某些成分；（5）、采用最适种龄等。
（二）、对数期
在延迟期末，细胞开始出现较大量的分裂，培养基中的菌数急剧增加，进入了对数期。在此期内，如用菌数的对数与培养时间作图时，则该线呈一条直线，此期为对数期。
对数期的菌数按几何级数增加。即1个细菌繁殖几代，产生2n个细胞。对数生长期的菌体代谢活跃，消耗营养多，生长速率高，个体数目显著增多。另外，群体中的细胞化学组成与形态、生理特征等比较 一致，这一时期的菌种 很健壮，因此，在生产上常用它作为接种的种子。
实验室也多用对数期的细胞作为试验材料。通常对数期维持的时间较长，但它也受营养及环境条件所左右。
（三）、稳定期
在一定的培养液中，细菌不可能按对数期的高速率无限地生长繁殖，这是由于对数期中细菌的活跃生长已经消耗了大量的营养物质，所以，在对数期末，细菌生长速率逐渐下降，死亡率大量增加，以致使新增值的细胞数与死亡的细胞数趋于平衡，因此活菌数保持相对的稳定，成为稳定期。
处于这个期的细胞生活力逐渐减弱，开始大量储存代谢产物。同时，也积累了许多不利于微生物活动的代谢产物。由于微生物的生长改变了它自己的生活条件，出现了不利于细菌生长的因素，如pH值、氧化还原电位等，致使大都数芽孢杆菌在这个生长阶段形成芽孢。
由于稳定期有大量代谢产物积累，人们要获得其代谢物质，可在这一时期提取。在此稳定期内，活菌数达到最高水平。如要得到大量菌体，也应在此期开始收获。稳定期持续时间长短取决于菌种的繁殖与衰亡的数量之比。环境条件对稳定期的长短也有影响。
（四）、衰亡期
稳定期后，如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致使死亡数大大超过新生数，总的活菌数明显下降，即死亡期。其中，有一阶段活菌数以几何数下降。因此，也称为对数衰亡期。
这个时期，细菌菌体常出现多种形态，包括畸形和衰退型，因此，此期的菌种不宜作种子。
微生物中单细胞生长曲线，反映了一种微生物在某种生活环境中（试管、摇瓶、发酵罐）的生长、繁殖和死亡的规律。研究生长曲线既可为研究营养和环境条件提供理论依据，又可用来调控微生物的生长发育。
霉菌的生长也有延迟期、稳定期和衰亡期。由于它们不是单细胞微生物，所以它们的繁殖不按几何级数增加，故而没有对数生长阶段。
五、连续培养
1、分批培养：在培养微生物时。将微生物置于一定容积的定量培养基中培养，称为定量培养。
2、连续培养：是在微生物的培养过程中，不断地供给营养物质，并排除老菌液，让培养的微生物相对地维持较长时间的对数生长期，以利于提供较多的对数生长细胞。在发酵工业上，可提高发酵率和自动化水平，减少动力消耗并提高产品质量。有三种方法：
（1）、恒浊连续培养法；（2）、恒化连续培养法。
连续培养法在工业生产上称为连续发酵。我国在丙酮、丁醇、酒精的生产以及柠檬酸的发酵上已采取了连续发酵法，缩短了发酵周期，效果良好。连续发酵的最大优点是取消了分批发酵中各批之间的间断时间，缩短发酵周期，提高设备利用率。再者，连续发酵便于工业生产，自动化控制，产物均一，产量高。但是在工业化生产中连续发酵容易发生杂菌污染及菌种退化等问题。
第三节
环境条件对微生物的影响
外界环境对微生物的作用有三种情况：
（1）、外界环境条件适宜时，微生物生长旺盛，代谢作用加速；（2）、外界环境条件不太适宜时，微生物生长缓慢，代谢作用受到一定程度的抑制；
（3）、外界环境不适宜的情况达到微生物难以忍受的程度，这时，微生物生命活动受到严重的影响，可能发生变异或死亡。
人们控制和调节微生物所处的环境条件的目的是要促进某些有益微生物的生长，发挥它们的有益作用；抑制和杀死那些不利于人类的微生物，并清除它们的有害作用，如防止食品的腐败变质等。
了解以下常用的几个概念；
（1）、防腐（Antisepsis）：又叫抑菌，是防止或抑制微生物的生长繁殖。（2）、消毒（Disinfection）：是指杀死病原微生物的措施。
（3）、灭菌（Sterilization）：杀灭物体上所有的微生物，包括病原微生物及非病原微生物。
（4）、商业灭菌：是从商品的需要出发对食品进行的灭菌，指食品经过杀菌处理后，按一定的检验方法检不出活的微生物或者仅能检出极少数的非病原微生物，而且，它们在一定的保存期内不至于引起食品变质腐败。
（5）、无菌（Asepsis）：即无活的微生物存在。如无菌操作。
（6）、死亡（dead）：是指微生物不可逆的丧失了生长繁殖的能力，即使再放到合适的环境中也不再繁殖。
环境因素包括：物理条件、化学条件和生物条件
一、温度
温度是影响生物机体的最重要的因素之一。温度的变化影响着微生物的细胞中生化反应速度。
热力致死时间（Thermal Death Time TDT）：是指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间。
D值（Decimal reduction time）在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90％的活菌被杀死）时，所需要的时间（min）。
Z值：如果在加热至死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90％的加热时间）所需要升高的温度（oC）。
F值：在一定的基质中，其温度为121.1 oC，加热杀死一定数量微生物所需要的时间（min）。
高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌。
（一）、干热灭菌（diy heat sterilization）
主要用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。
1、火焰灭菌：直接利用火焰燃烧杀灭微生物。该方法灭菌迅速、彻底。
2、加热空气灭菌：将空气加热达140-160oC，保持1-2h。
（二）、湿热灭菌（moist heat sterilization）
1、煮沸灭菌：煮沸温度接近100 oC，保持15-30min，可杀死微生物的营养体，若要杀死芽孢，则需要2-3h，此法适用于可以浸泡在水中的物品，如食品、器材、衣物等。
2、间歇灭菌（vfractional sterillization或tyndallization）：用蒸汽加热灭菌温度不超过100 oC，每日一次，每次加热30min，连续三次。
3、巴氏消毒（pasteurization）：有些食品或物品在高温下会受到不同程度的损害，不宜用过高的温度灭菌，可采用较低的温度进行灭菌，条件是62-63 oC，30min；或72 oC，15s。适用于杀死食品中的病原菌。
4、高压蒸汽灭菌（normal autoclaving）：1kg/cm2，121.5 oC，15-30min。
5、超高温瞬时杀菌法（Ultra high temperature short time，UHT）：灭菌温度132-150 oC，3-5s，可杀死微生物的营养细胞和耐热性强的芽孢细菌，但污染严重的鲜乳在142 oC以上杀菌效果才好。
二、湿度
干燥能引起微生物细胞内蛋白质变性和盐浓度增高，这是抑制微生物生长或促进其死亡的主要原因。
三、渗透压
嗜盐微生物、嗜糖微生物的概念。
除以上耐高渗微生物之外，一般来说，18%-25%的盐浓度能完全阻止微生物的生长。
由于高渗透压对微生物有抑制作用，所以，在食品工业上，广泛地利用腌制和糖渍方法来保存食品。
四、氧化还原电位
不同的微生物需要的氧化还原电位不同。
五、辐射
1、紫外线：细胞中的核酸具有吸收紫外线的性能，紫外线的辐射能量作用于核酸时，能引起核酸的变化。妨碍蛋白质和酶的合成。紫外线杀菌作用常用于空气消毒和器材物体表面消毒。
2、x、γ射线：x射线不如γ射线，γ射线被空气吸收较少，射程远，穿透力强，可用于食品杀菌。
由于各种射线照射杀菌时不需要高温，所以这类杀菌又称为冷杀菌。
六、超声波与微波
超声波对微生物细胞内含物有强烈的震荡作用，可破坏细胞，另外，水溶液经处理后能产生过氧化氢，因而有杀菌能力，可以用来保藏食品。
微波是利用热效应对微生物有杀灭作用。微波产生热效应的特点是加热均匀，热能利用效率高，加热时间短。目前微波用于食品灭菌。
七、氢离子浓度
pH值对微生物生长影响较大，主要影响菌体细胞膜上的电荷，影响物质的吸收、代谢。每种微生物都有自己适宜的pH值范围。超过此一定范围后，生长就会停止。由于pH值不同会影响微生物的代谢活动，改变物质合成方向。
高浓度氢离子可引起菌体表面蛋白质和核酸的水解，破坏酶的活性。另外，某些有机酸可引起氧化作用，具有杀菌作用。如食品防腐剂苯甲酸和水杨酸等。高浓度的碱具有杀菌作用，如石灰水、氢氧化钠、碳酸钠等作为机器、工具以及冷库等的消毒剂。
八、化学物质
（一）、氧化剂：氧化剂杀菌的效果与作用和浓度成正比关系，杀菌的机理是氧化剂放出游离氧作用于微生物蛋白质的活性基团（氨基、羟基和其他化学基团），造成代谢障碍而死亡。主要有高锰酸钾、过氧化氢、漂白粉、过氧乙酸、碘等。
（二）、甲醛：杀菌机理是与蛋白质的氨基结合而使蛋白质变性至死。
（三）、酚类：机理是蛋白质变性。石炭酸（苯酚）、来苏儿。
（四）、醇类：脱水剂，乙醇：70%的乙醇杀菌能力最强。
（五）、新洁尔灭
（六）、毒性物质：SO2、H2S、CO、CN-。
（七）、染料：结晶紫、孔雀绿、复红、次甲基蓝、孟加拉红对微生物有抑制作用。
（八）、重金属盐类：重金属盐类对微生物都有毒害作用，其机理是金属离子容易和微生物的蛋白质结合而发生变形或沉淀。
第二篇：微生物的生长与环境条件答案
第六章
微生物的生长与环境条件答案
一、选择题 60975.D
60976.B 60977.B 60978.A 60979.B 60980.A 60981.B 60982.B 60983.A 60984.A 60985.B 60986.B 60987.B 60988.C 60989.B
二、判断题 60990.对 60991.错 60992.错 60993.错 60994.错 60995.错 60996.对 60997.错 60998.错 60999.错 61000.错 61001.对 61002.对 61003.对 61004.对 61005.对
三、填空题
61006.专 性 嗜 冷, 兼 性 嗜 冷。61007.室 温 , 体 温。61008.6.5-7.5。61009.7.5-8。61010.5-6。
61011.98kpa, 121。C, 30min。61012.真 菌 和 放 线 菌。61013.代 时。61014.中。
61015.前 者 杀 死 微 生 物 的 营 养 体，后 者 杀 死 所 有 微 生 物 的 细 胞，细 菌 的 芽 胞。
61016.高 温 杀 菌，化 学 杀 菌，幅 射 杀 菌。61017.低 温 型，中 温 型，高 温 型。61018.慢，冰 冻。
61019.孢 子，菌 种 干 燥 保 藏。61020.烘 干，晒 干，熏 干。61021.不 同。
61022.70%，2-6ml/M3。
61023.发 生 质 壁 分 离，吸 水 膨 胀 甚 至 破 裂。
61024.分 裂 迟 缓，代 谢 活 跃，菌 数 增 长近于 零。
包 括 61025.细 菌 数 以 几 何 级 数 增 加。
61026.新 增 殖 的 细 胞 数 与 老 细 胞 的 死 亡 数 几 乎 相 等，此 时 活 菌 数 最
多。
61027.菌 体 的 死 亡 数 超 过 新 生 数。
61028.滞 留 适 应 期，对 数 生 长 期，最 高 稳 定 生 长 期，衰 亡 期。61029.对 数 生 长。61030.连 续 培 养 法。61031.最 高 稳 定。61032.好 氧，厌 氧。61033.20-25。
61034.加 大 接 种 量 和 采 用 处 于 对 数 生 长 期 的 菌 种 接 种。
。61035.62-63C，30min或 71C，15min。61036.常 压 80-100℃ 处 理 15-60 分 钟，37℃ 保 温 培 养 过 夜，再 同 上 蒸 煮，如 此
连 续 三 天。
61037.5℃，25-37℃，45-50℃。
61038.30 ℃，45-55 ℃，60-75 ℃，温 泉 和 堆 肥 中。61039.-5-0℃，10-20℃，25-30℃，冷 藏 食 品 上。
61040.-12℃，5-15℃，15-20℃，海 洋 深 处、雪 山 等 地。61041.中 温 型 的。
61042.中 温 型 的。
61043.计 数 板 计 数 法，涂 片 计 数 法，比 浊 法。
61044.稀 释平板 计 数 法，滤 膜 培 养 法，稀 释 培 养 法(MPN 法)。61045.化 学 吸 氧 法，密 闭 容 器 内 反 复 抽 真 空 后 充 N2。61046.10-15℃，25-37℃，45-50℃。61047.恒 浊 法，恒 化 法。
61048.好 氧，兼 性 厌 氧，厌 氧，微 好 氧。61049.乳 酸 菌，乳 酸，腐 生 细 菌。61050.杀 菌，防 腐。61051.低 温 防 腐，加 无 毒 的 化 学 防 腐 剂，干 燥 防 腐，利 用 微 生 物 产 酸 防
腐。
61052.是 细 胞 的 组 分，是 生 化 反 应 的 介 质，是 吸 收 营 养 物 质 和 分 泌 代 谢
物 的 良 好 溶 剂，能 有 效 地 控 制 细 胞 温 度。
61053.引 起 细 胞 膜 电 荷 的 变 化，从 而 影 响 微 生 物 对 营 养 物 质 的 吸 收，影 响 代 谢 过 程 中 酶 的 活 性，改 变 环 境 中 营 养 物 质 的 可 给 性 及 有 害 物 质 的 毒 性。
61054.25-30% 61055.丙 酸 钙
61056.苯 甲 酸 钠
四．名词解释
61057.生 长 是 指 微 生 物 的 细 胞 组 分 与 结 构 在 量 方 面 的 增 加 过
程。61058.从 生 长 到 繁 殖 是 一 个 量 变 到 质 变 的 过 程，这 个 过 程 就 是 发 育。61059.由 细 胞 分 裂 而 引 起 的 个 体 数 目 的 增 加，称 为 繁 殖。61060.在 有 氧 无 氧 条 件 下 均 能 生 长 的 细 菌。61061.指 在 空 气 或 氧 气 存 在 下 生 长 的 微 生 物。61062.在 没 有 空 气 或 氧 气 条 件 下 生 活 的 微 生 物。
61063.经 过 反 复 分 离 纯 化 后，在平板 上 挑 取 的 由 单 个 菌 落 繁 衍 的 微
生 物 后 代。
61064.单 个 细 胞 完 成 一 次 分 裂 所 需 的 时 间。
61065.当 细 菌 在 适 宜 的 环 境 条 件 下 培 养 时，如 果 以 培 养 的 时 间 为 横
座 标，以 细 菌 数 量 变 化 为 纵 坐 标，根 据 细 菌 数 量 变 化 与 相 应 时 间 变 化 之 间 的 关 系，可 以 作 出 一 条 反 应 细 菌 在 培 养 期
间 菌 数 变 化 规 律 的 曲 线，这 种 曲 线 称 为 生 长 曲 线。
61066.在 一 定 条 件 下(如 10 分 钟)，杀 死 某 种 微 生 物 的 最 低 温 度。61067.在 一 定 条 件 下(如 60℃)杀 死 微 生 物 所 需 要 的 最 短 时 间。
61068.将 微 生 物 置 于 一 定 容 积 的 培 养 基 中，经 过 培 养 生 长，最 后
一
次 收 获，此 称 为 分 批 培 养。
61069.细 菌 纯 培 养 生 长 曲 线 表 明，细 菌 培 养 物 的 最 高 得 率 在 对 数 生
长 期。通 过 控 制 环 境 条 件，使 细 菌 的 生 长 始 终 保 持 在 对 数 生 长 期，从 而 可 以 获 得 更 多 的 细 菌 培 养 物，这 种 方 法 称 为 连 续
培 养。
61070.指 能 在 氧 分 压 低 于 正 常 大 气 环 境 中 表 现 最 大 生 长 速 度 的 细
菌。
61071.在 分 子 氧 存 在 下 也 能 生 活 的 厌 氧 菌。
61072.二 元 培 养 是 纯 培 养 的 一 种 特 殊 形 式。有 些 寄 生 微 生 物 只 能 在
寄 生 微 生 物 体 内 寄 生，必 须 将 寄 生 微 生 物 和 寄 主 微 生 物 培 养 在 一 起，同 时 排 除 其 它 杂 菌。例 如 培 养 苏 云 金 杆 菌 及 其 噬 菌 体，需 先 在平板 培 养 基 上 培 养 苏 云 金 杆 菌 的 细 菌 坪，然 后 在 细 菌 坪 上
接 种 苏 云 金 杆 菌 的 噬 菌 体，经 培 养 后，在 苏 云 金 杆 菌 的 细 菌 坪 上 出 现 噬 菌 体 感 染 的 透
明 空 斑，这 种 培 养 方 法 称 为 二 元 培 养。
61073.在 15% 以 上 盐 浓 度 下 才 能 生 长，最 适 生 长 的 盐 浓 度 为 25-30% 的
嗜 盐 菌 称 为 极 端 嗜 盐 菌。
61074.采 用 物 理 或 者 化 学 的 方 法 使 微 生 物 处 于 比 较 一 致 的 生 长 发 育
阶 段 上 的 培
养 方 法 叫 同 步 培 养。例 如 利 用 孔 径 大 小 不 同 的 滤 膜，将 大 小 不 同 的 细 胞 分 开 培
养，可 使 同 一 大 小 的 细 胞 处 于 同 一 生 长 阶 段。
五．问答题
61075.温 度 对 微 生 物 的 影 响 可 概 括 为： 适 宜 的 温 度 有 利 于 微 生 物 的 生 长 高 温 可 使 菌 体 蛋 白 变 性，导 致 微 生 物 死 亡，常 用 高 温 进行 消 毒 灭 菌低 温 对 微 生 物 具 有 抑 制 或 杀 伤 作 用，故 低 温 用 于 保 藏 食 品
61076.秋 天 之 所 以 容 易 栽 培平菇 是 因 为： 秋 冬 病 虫 害 少平菇 子 实 体 形 成 温 度 比 菌 丝 生 长 温 度 要 低，当 菇 床 菌 丝 长 满 以 后，适 当 降 温，(秋 冬 天 降 温 容 易)，有 利 于平菇 子 实 体 的 形 成。
61077.细 菌 的 纯 培 养 生 长 曲 线 分 为 四 个 时 期，即 滞 留 期，对 数 生 长 期，最 高 稳 定 生 长 期 和 衰 亡 期。
滞 留 期 的 特 点 是： 分 裂 迟 缓，代 谢 活 跃。
对 数 生 长 期 的 特 点 是： 细 菌 数 量 以 几 何 级 数 增 加。
最 高 稳 定 生 长 期 的 特 点 是： 新 增 殖 的 细 胞 数 与 老 细 胞 的 死 亡 数 几 乎 相 等。
衰 亡 期 的 特 点 是； 活 菌 数 按 几 何 级 数 下 降。
61078.灭 菌 是 杀 死 所 有 微 生 物
消 毒 是 杀 死 或 消 除 所 有 病 原 微 生 物，达 到 防 止 病 原 菌 传 播 的 目的 防 腐 是 利 用 理 化 因 子 使 微 生 物 暂 不 生 长
化 疗 是 有 效 地 消 除 宿 主 体 内 的 微 生 物
61079.取 载 玻 片 一 块，用 蜡 笔 在 中 央 画 出 一平方 厘 米 的 面 积。将 待 测
样 品 稀 释 到 一 定 浓 度 后 取 0.01 毫 升 菌 液 滴 在 载 玻 片 上 的 一平方 厘 米 面 积 上。然 后 在 显 微 镜 下
计 数 每 个 视 野 的 菌 数(至 少 数 10 个 视 野，计 算平均 菌 数)。将 视 野 的 面 积 算 出 来
后，按 下 列 公 式 计 算 样 品 中 的 含 菌 数。
平方 厘 米
每克样品中的含菌数 ＝-------------------- 每个视野的平均菌数100稀释倍数
视 野 面 积
61080.干 重 法 主 要 用 来 测 发 酵 液 中 丝 状 真 菌 或 放 线 菌 的 生 长 量。
取 一 定 量 的 发 酵 液(如 100 毫 升)过 滤 后 连 同 滤 纸 一 道 烘 干 至 恒 重 后 称 重，然 后 再 减 去 滤 纸 的 干 重，即 为 100 毫 升 发 酵 液 中 某 种 微 生 物 干 物 质 的 量。
61081.为 了 防 止 微 生 物 在 培 养 过 程 中 因 自 身 的 代 谢 作 用 产 酸 或 产 碱
改 变 环 境 的 pH 值，通 常 在 配 制 培 养 基 时 预 先 加 入 缓 冲 物 质 如 磷 酸 盐 或 碳 酸 钙。
61082.用 比 浊 法 测 定 微 生 物 的 数 量 主 要 是 在 工 业 生 产 中 采 用，它 的
特 点 是 快 速。
在 测 定 前 首 先 必 需 绘 制 出 浊 度 与 数 量 的 相 关 曲 线，浊 度 用 光 电 比 色 计 测 定，菌 数 靠 用 稀 释平板 法 测 定 或 用 计 数 板 测 定。曲 线 绘 好 后，在 生 产 中，只 要 用 比 色
计 测 出 菌 液 的 任 一 浊 度 后 就 可 以 从 曲 线 上 查 出 相 应 的 菌 数。
61083.在 t0时 菌 数 X=100
在 t1 时 菌 数 Y=1000000000
92n(代 数)=3.3lg(y/x)= 3.3(lg100)÷23.1 = 17.3
在 上 述 培 养 中，该 菌 的 代 时 为 17.3 分 钟，400 分 钟 内 共 繁 殖 了23.1代。
61084.原 因 有 三 条：
蛋 白 质 在 有 水 的 条 件 下 变 性 温 度 比 无 水 时 的 变 性 温 度 要 低。水 蒸 汽 的 穿 透 力 比 热 空 气 的 穿 透 力 强。
水 蒸 汽 有 潜 热。
第三篇：微生物的生长 教案
微生物的生长
教案
第二节《微生物的营养、代谢和生长》-微生物的生长
教学设计
【教学目标】
知识目标
1、微生物群体生长的规律及其在生产实践中的应用（理解）。
2、测定微生物群体生长的方法（识记）。
3、度、pH和氧等因素对微生物生长的影响（理解）。
能力目标
1.通过细菌生长曲线的学习，提高学生的的图表对比分析能力。
2.通过细菌生长曲线与种群生长曲线的对比，培养学生归纳与演绎的能力。
情感态度与价值观
通过微生物的一般生长规律与种群的生长规律的对比，培养学生正确看待一般问题与特殊问题，个性与共性的关系。【教学重点】
（1）微生物群体生长的规律及其在生产实践中的应用。
（2）温度、pH和氧等因素对微生物生长的影响。【教学难点】
微生物群体生长的规律及其在生产实践中的应用。
教学设计
【导入新课】
前面，我们已经学习了微生物的营养与代谢，知道了微生物需要不断从外界吸收营养物质，通过代谢，获取能量并合成自身的组成物质，以维持自身正常的生命活动。那么，从代谢的角度来看，当同化作用大于异化作用时，微生物将表现出怎样的特征？
学生回答：生长的现象。
那么什么是微生物的生长呢，我们一般是如何来研究微生物的生长的呢？
这就是本节课我们所要学习的内容——微生物的生长。【推进新课】
微生物的生长包括微生物细胞体积的扩大与细胞数目的增多，由于大多数微生物细胞体积较小，个体质量较轻，微生物的个体生长不易观察；同时由于微生物繁殖速度一般较快，因而通常以微生物的群体为单位来研究微生物的生长。
那么，微生物的群体生长会具有怎样的特征呢？群体生长状况是否具有一定的规律？假如有的话，这是怎样一种规律？研究这一规律具有怎样的现实意义呢？接下来我们一起来学习
学习目标一：微生物群体生长规律
教师分析：由于在自然环境下微生物群体生长受到非生物影响、种内关系、种间关系等多种因素的综合影响其群体生长的状况多变而复杂，往往难以描述，因而，从实际工作的角度出发，微生物的群体生长状况的研究一般是置于人工控制的条件下进行的。那么，我们如何来描述 细菌的生长曲线呢？
师生共同总结：从细菌接种到培养基中开始到培养基中的细菌群体死亡的动态变化，可以分为调整期、对数期、稳定期、衰亡期四个重要时期。
教师强调：微生物的群体生长曲线是种群内个体生长的一个频率统计，反应的是微生物种群概念上的数量变化特征，因而并非是该时期的所有个体均具有相应的特征。
教师设置问题情景，引导学生思考：细菌生长曲线是运用数学模型研究群体生长规律的一种方法。那么，我们一般是按怎样的标准来划分各区段的？具体而言，不同区段究竟蕴涵了怎样的生物学含义呢？
师生互动，教师利用投影，呈示下述表格，使学生明确需要研究的问题。
（1）调整期
细菌刚被接种到培养基上时，对新环境有一个短暂的调整或适应的过程，一般不立即进行分离的情景，同时反映细菌的形态结构等特征，教师对调整期的时间、群体生长速率、细胞的形态结构与生理特征、实践意义等方面的问题总结如下：
①时间：从细菌刚被接种到培养基上开始，到细菌开始进入快速分裂为止。②生长速率：几乎为零，细胞数目几乎不变。③细胞的形态结构：细菌细胞体积增长较快。
④细胞的生理特点：细菌代谢活跃，是合成初级代谢产物量最多的时期；细菌细胞内大量合成细胞分裂所需的酶、ATP及其他细胞成分，为下一阶段的细胞分裂作准备。
⑤影响该阶段长短的相关因素：
Ⅰ菌种：若把对数期的菌种接种到培养基上时，可相对缩短调整期；若把稳定期或其他时期的菌种接种到培养基上时，则调整期相对较长。
Ⅱ培养基：若培养基的理化性质与原先菌种的培养基比较相似，则调整期时间较短；若培养基的理化性质与原先菌种的培养基相差比较大，则调整期时间较长。
（2）对数期
学生分析观察、讨论： ①时间
教师提问：我们一般把哪一个阶段称为细菌群体生长的对数期呢？
学生回答：从细菌开始快速分裂开始，到培养基中细菌的群体数目不再增加，保持动态稳定为止。
②生长速率
教师提问：在细菌群体生长的对数期阶段，群体生长速率具有怎样的特征？ 学生回答：速率最快，细胞数目以几何级数增加；可以用Bn总=Bn×2来描述。③细胞的形态结构 教师提问：那么，大多数细菌的细胞在这一阶段具有怎样的形态结构与生理特征呢？
学生回答：形态特征最为稳定，细菌生理特征比较稳定，代谢旺盛，细菌细胞内各种组分，特别是核糖体数量剧增，此阶段的代谢容易受到周围环境条件的影响。
④影响阶段长短的相关因素
教师提问：影响这一阶段时间长短的相关因素有哪些呢？ 学生主要从以下几方面展开讨论： Ⅰ菌种：该种细菌的遗传特性；
Ⅱ培养基：培养基的各种理化性质（如培养基化学成分与PH、T、氧气）是否适宜； Ⅲ温度：温度通过影响酶活性来影响微生物的新陈代谢速率，从而影响对数期的长短。
⑤造成该阶段特征的主要原因 学生讨论：略。
教师提问：从生态学角度来看，造成细菌群体生长的对数期的主要原因有哪些呢？ 学生讨论：略。
总结：培养基中营养物质充分，空间充裕，种内斗争不剧烈；培养基中的PH、T、氧气等条件适宜，微生物新陈代谢旺盛，能量供应充足，培养基中一些有害的代谢产物尚未开始积累；微生物种群的出生率大于死亡率，种群密度增加。
⑥实践意义
教师讲述：这一阶段在生产实践上具有相当重要的意义，例如控制对数期。那么，为何要在生产过程中根据生产实际需要，控制微生物群体生长的对数期呢？
学生讨论：略。
教师分析：以酵母菌发酵产生酒精而言，如果对数期过长，营养物质量消耗过多，会导致下一个阶段微生物积累的代谢产物减少；如果对数期过短，培养基中的菌体数目比较少，也会导致下一个阶段微生物积累的代谢产物减少。
（3）稳定期
学生通过对信息的观察、分析与讨论，对稳定期的时间、群体生长速率、细胞的形态结构与生理特征等方面的问题总结如下：
①时间：从培养基中细菌的群体数目不再增加，保持动态稳定开始，到培养基中细菌群体数目开始减少为止。②生长速率：分裂速率相对对数期下降，死亡速率上升，细胞数目动态平衡，活细菌数目达到最高峰。
③细胞的形态结构：某些产芽孢细菌在这个时期开始产生芽孢。
细胞的生理特点：细菌细胞内开始大量积累代谢产物，特别是次级代谢产物。④影响该阶段长短的相关因素：菌种、培养基理化性质、温度等因素。⑤造成原因：
Ⅰ培养基中营养物质在对数期被大量消耗，同时由于培养基中细菌的种群数目达到最你 大，种内斗争剧烈，导致个体死亡率上升，出生率下降。
Ⅱ因为微生物长时间代谢，导致培养基中的PH、T、氧气等理化性质发生改变，微生物新陈代谢速率下降，能量供应不足，细菌细胞生长、分裂速度下降。
Ⅲ培养基中一些有害的代谢产物开始积累，影响微生物生长。⑥实践意义——延长稳定期：
教师提问：为什么延长稳定期可以提高发酵工程的产量呢？生产中该如何来进行合理控制，以延长稳定期呢？
学生小组讨论后，总结：Ⅰ进入稳定期以后，包括抗生素在内的多种次级代谢产物开始大量积累，如果适时补充营养物质，排出有害的代谢产物，则可延长稳定期，提高代谢产物的产量。Ⅱ延长稳定期的方法有很多，其中微生物的连续培养是一种比较常用的办法。
在稳定期后，细菌群体生长将进入什么时期呢？（4）衰亡期
教师提问：什么叫衰亡期？
学生回答：在稳定期之后，随着培养的继续进行，细菌群体的死亡速率大于繁殖速率，培养基中细菌群体的数目开始急剧下降，这一阶段称为衰亡期。
教师提问：该时期的微生物群体、微生物细胞个体有怎样的特点？在生产实践中有何应用价值？
学生总结：
时间：从培养基中细菌的群体数据急剧减少开始，到培养基中细菌种群消亡为止。生长速率：死亡速率超过繁殖速率，导致培养基中细菌群体的活细胞数目不断下降。细胞的形态结构：细胞出现了多种形态，甚至畸形。细胞的生理特点：有些细菌开始解体，释放出代谢产物。影响该阶段长短的相关因素：1菌种：产芽孢的细菌其芽孢比代谢活跃的营养细胞更易于存活。2培养基梨花性质、温度等因素
造成该阶段特征的原因：1.培养基中营养物质进一步被大量消耗，同时由于培养基中细菌的种内斗争进一步加剧，导致个体死亡率急剧上升，出生率急剧下降。
2.因为微生物长时间代谢，导致培养基中的PH、T、氧气等理化性质发生改变，微生物
微生物新陈代谢速率下降，能量供应不足，细菌细胞生长、分裂速度下降 3.随着部分细菌细胞的裂解，培养基中一些有害的代谢产物大量累积，影响微生物生长。
实践意义：延长衰亡期
通过补充营养和能源、中和环境毒性，可以减缓细胞死亡速率，延长细菌群体的存活时间。
学习目标二：微生物群体生长规律的应用
1.酒精生产中，设法缩短调整期，控制对数期，以便在短时间内获得最大的产量。2.医学上，要通过细菌染色来鉴定细菌，通常采用对数期的菌体，因为这一阶段的细菌细胞生理特征最稳定
3.工业上产生酵母，通常在稳定期收集菌体，因为这一时期菌体数目最大。学习目标三：影响微生物生长的环境因素 1．温度：
微生物生长最旺盛时的温度叫最适生长温度。
在最适生长温度范围内，微生物的生长速率随温度的上升而加快；超过最适生长温度后，微生物的生长速率会急剧下降，这是由于细胞内的蛋白质和核酸等发生了不可逆的破坏。2．pH：
超过最适pH范围以后，会影响酶的活性、细胞膜的稳定性等，从而影响微生物对营养物质的吸收等。多数细菌的最适pH为6.5～7.5，真菌的最适pH为5.0～6.0。3．氧：
环境中氧含量的状况，对不同代谢类型的微生物群体的生长，具有不同的影响。按照微生物对氧含量的要求可分为好氧型微生物、厌氧型微生物和兼性厌氧微生物。【反馈练习】
1．(2004广东生物)将少量的某种细菌接种到恒定容积的液体培养基中，并置于适宜的条件下培养，定期取样统计细菌的数目。如果以时间为横坐标，以细菌数目的对数为纵坐标作图，可以得到细菌的生长曲线。曲线中，细菌数量变化较大的时期为（）A．衰亡期和调整期 B．调整期和稳定期 C．对数期和衰亡期 D．稳定期和对数期
2、（2005北京春理综）将酵母分为a、b、c、d四组，用不同的方式培养，其种群增长曲线如图所示。请据图回答下列问题。
（1）a呈现____型增长，该种群的生长在20h之前处于____期，20h－40h处于_____期。（2）d呈现_______型增长，在100h－200h，d的增长率趋于______________。若在现有条件下继续培养，其种群数量趋于____________。（A增多 B减少）
（3）随着更换培养液的时间间隔的延长，酵母种群的增长率趋于_________，其可能的限制因素是________不足和__________的积累。
【答案】（1）J 调整 对数
（2）S 0（或零）B（或减小）
（3）降低（或减小）营养
有害代谢产物（或有害产物）【板书设计】
第二节 微生物的生长
一、微生物的的群体生长规律
1.调整期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期
二、微生物群体生长规律的应用
三、影响微生物生长的环境因素
1.温度 2.PH 3.氧
第四篇：第六章微生物的生长与环境条件试题
第六章微生物的生长与环境条件试题
一、选择题
60975.高温对微生物的致死是因为：
A高温使菌体蛋白变性。B高温使核酸变性。
C高温破坏细胞膜的透性。DA-C。答：()60976.光波杀菌最强的波长范围是: A0.06-13.6nm。B250-280nm。C300-400nm。答:()60977.消毒效果最好的乙醇浓度为: A50%。B70%。C90%。答:()60978.巴氏灭菌的工艺条件是: A62-63℃30min。B71-72℃30min。C60-70℃30min。答：()60979.杀死所有微生物的方法称为: A消毒。B灭菌。C防腐。答：()60980.测微生物活菌数通常采用：
A稀释平板法。B滤膜培养法。C稀释培养法。答：()60981.测空气中微生物数量的方法通常采用：A稀释平板法。B滤膜培养法。C稀释培养法。答：()60982.测土壤微生物的总数常采用：
A.血球板计数法。B.涂片计数法。C.比浊计数法。答：()60983.各种中温型微生物生长的最适温度为：A20－40℃。B25－37℃。C35－40℃。答：()60984.好氧微生物生长的最适氧化还原电位通常为： A0.3-0.4V。
B+0.1V以上。C-0.1V以上。答:()
60985.黑曲霉在pH2-3的环境下发酵蔗糖:
A主要积累草酸。B主要积累柠檬酸。C主要积累乙酸。答:()
60986.升汞用于实验室非金属器皿表面消毒的浓度通常为: A0.001%。B0.1%。C1%。答:()
60987.防腐的盐浓度通常为:
A5-10%。B10-15%。C15-20%。答:()
60988.链霉素抑菌机制是:
A破坏膜的结构。B阻碍细胞壁的合成。
C阻碍70S核糖体对蛋白质的合成。答:()
60989.丝裂霉素的作用机制是:
A阻碍蛋白质的合成。B阻碍核酸解链。C切断DNA链。答:()
二、判断题
60990.在10分钟内杀死某微生物的最低温度
称为该微生物的致死温度。答：()
60991.食用菌子实体的形成温度比菌丝生长
温度要高，故冬天栽培食用菌要用薄膜复盖。答：()
60992.连续培养的目的是使微生物始终保持
在最高稳定生长阶段。答：()
60993.酒精的浓度越高，杀菌能力越强。
答：()
60994.微生物生长的最适pH与合成某种代谢
产物的pH是一致的。答：()
60995.0.1%升汞可用于各种金属器皿的消毒。答：()
60996.黑曲霉菌丝生长温度比产酶温度要高。答：()
60997.丙酸、盐酸都可用作防腐剂。
答：()
60998.由于分子量越大的物质产生的渗透压
越高，所以罐藏食品通常用50-70%的 糖溶液。答：()60999.青霉素因为能阻止G+细菌肽聚糖的形成，所以也能抑制产甲烷菌的生长。答：()61000.同种微生物菌体生长的最适温度与积累代谢产物的最适生长温度是相同的。答：()61001.同一种微生物由于环境中的PH不同可能积累不同的代谢产物。答：()61002.细胞大小相同的同种微生物可用来进行同步培养。答：()61003.在培养根瘤菌时常加二十万分之一的结晶紫抑制G+细菌的生长。答：()61004.专性厌氧微生物(如产甲烷菌)生长的最适Eh值通常为-0.3至-0.4V。答：()61005.丙酮丁醇梭菌积累丙酮丁醇的最适pH是4.3-5.3。答：()
三、填空题
61006.低温型的微生物又可分为_______________型和____________型。
61007.中温型微生物又可分为____________型和____________型两类。
61008.多数细菌生长最适pH是_______________。
61009.放线菌生长最适pH一般是______________。
61010.真菌生长的最适pH一般是________________。
61011.高压蒸汽灭菌法常用的工艺条件是：压力_______________,温度____________,时间____________。
61012.__________________生长量的测定常用干重法。
61013.指数生长的速率常以___________来表示。
61014.人和温血动物的病源菌一般是_____________温型的。
61015.消毒和灭菌的区别是___________________________________________。
61016.常消毒方法有_____________，_____________，______________等。61017.微生物按其生长温度范围可分为_______、______和_____3类。
61018.温度愈低，食物腐败愈__________。只有当食物__________时，微生物的生长
才是停止的。
61019.一般情况下，微生物的____________抗
干燥能力较强，微生物这一特性已用于______________。
61020.利用干燥对微生物影响的原理，日常生
活中常用__________、__________、__________等方法保存食物。
61021.微生物的不同的生理生化过程有着
_______________________的最适温度。
61022.__________________的乙醇杀菌效果
最好，实验室空气杀菌常用___________的福尔马林熏蒸消毒。61023.高渗溶液会导致微生物细胞
_________________，低渗溶液会导致微生物细胞__________________。61024.细菌生长曲线中滞留适应期的特点是
______，______，______。
61025.细菌生长曲线中对数生长期的特点是
_____________________。
61026.细菌生长曲线中最高稳定生长期的特
点是_________________。
61027.细菌生长曲线中衰亡期的特点是
________________________。
61028.细菌纯培养的生长曲线可分为
____________________________、_________________、________________、___________________等四个时期。61029.计算世代时间应在细菌生长的______________期进行。
61030.生产中，为了长期维持对数生长期可采
取_____________________。
61031.如培养细菌的目的在于获得大量菌体，应在培养的_________________期进行收获。
61032.一般来说，氧化还原电位(Eh)值在0.1V
以上，适宜_____________性微生物的生长，+0.1V以下，适合_______________性微生物的生长。61033.一般细菌的干重约为湿重的_________________________%。
61034.在生产上，要想使滞留适应期缩短，可
采取________________________________等措施。
61035.巴斯德消毒法的工艺条件是
_________________________________。
61036.间歇灭菌法的具体方法
是:_____________________________________________________________________。
61037.室温型微生物的最低生长温度为_________________，最适生长温度为_______________，最高生长温度为___________________。
61038.高温型微生物的最低生长温度为______________________，最适生长温度为_______________，最高生长温度为_______________，主要分布在________________。
61039.兼性嗜冷性微生物的最低生长温度为_____________，最适生长温度为_____________，最高生长温度为_____________，主要分布在____________________。
61040.专性嗜冷型微生物最低生长温度为_____________，最适生长温度为______________,最高生长温度为____________，主要分布在____________________。
61041.土壤中的微生物的生长温度类型一般是________________。
61042.植物病原微生物的生长温度类型一般是__________________。
61043.常用的直接计数法有_________________、_______________、____________等。61044.常用的活菌计数法有___________________、_______________、____________等。61045.造成厌氧环境培养厌氧菌的方法有_______和_____________。
61046.低、中、高温型微生物的最适生长温度分别为__________、__________、___________。
61047.连续培养的方法主要有_______________和_______________两种。
61048.根据微生物与氧气的关系，可将微生物分成_____________、_____________、_________和_______________四个类型。
61049.酸菜，饲料青贮是利用______________发酵产生的____________抑制__________，使之得以长久贮存。61050.强酸、强碱有极强的_____________作用，而某些有机酸却常用作_____________剂。
61051.常用的防腐方法有_________、__________、_________、________等。61052.水对微生物有如下生理功能:____________、______________、________________、________________。
61053.pH影响微生物生长的机制是___________、_______________、__________________________。
61054.极端嗜盐的微生物可在浓度为
_________的盐溶液中生长。
61055.面包，蛋糕中常加入________________
作为防腐剂。
61056.调味品饮料中常加入______________
作为防腐剂。
四、名词解释 61057.生长 61058.发育 61059.繁殖
61060.兼性厌氧菌 61061.好氧微生物 61062.厌氧微生物 61063.纯培养体 61064.世代时间
61065.细菌生长曲线 61066.致死温度 61067.致死时间 61068.分批培养 61069.连续培养 61070.微需氧细菌 61071.耐氧厌氧菌 61072.二元培养 61073.极端嗜盐菌 61074.同步培养
五、问答题
61075.试述温度对微生物的影响
61076.为什么秋天、冬天容易栽培平菇？ 61077.细菌的纯培养生长曲线分为几个时期，每个时期各有什么特点？
61078.试比较灭菌、消毒、防腐和化疗之间的区别。
61079.试述涂片计数的基本方法
61080.怎样用干重法测微生物的生长量？ 61081.为了防止微生物在培养过程中会因本
身的代谢作用改变环境的pH值，在配制培养基时应采取什么样的措施？ 61082.如何用比浊法测微生物的数量？ 61083.某细菌在t0时的菌数是102个/ml，经过
400分钟后，菌数增加到109
个/ml，计算该细菌的世代时间和繁殖的代数。61084.为什么加压蒸汽灭菌比干热灭菌的温
度低？时间短？
第六章微生物的生长与环境条件答案
一、选择题 60975.D 60976.B 60977.B 60978.A 60979.B 60980.A 60981.B 60982.B 60983.A 60984.A 60985.B 60986.B 60987.B 60988.C 60989.B
二、判断题 60990.对 60991.错 60992.错 60993.错 60994.错 60995.错 60996.对 60997.错 60998.错 60999.错 61000.错 61001.对 61002.对 61003.对 61004.对 61005.对
三、填空题
61006.专性嗜冷,兼性嗜冷。61007.室温,体温。61008.6.5-7.5。61009.7.5-8。61010.5-6。
61011.98kpa,121。C,30min。61012.真菌和放线菌。61013.代时。61014.中。
61015.前者杀死微生物的营养体，后者杀死所有微生物的细胞，包括细菌的芽胞。61016.高温杀菌，化学杀菌，幅射杀菌。61017.低温型，中温型，高温型。61018.慢，冰冻。
61019.孢子，菌种干燥保藏。61020.烘干，晒干，熏干。61021.不同。
61022.70%，2-6ml/M3。
61023.发生质壁分离，吸水膨胀甚至破裂。61024.分裂迟缓，代谢活跃，菌数增长近于零。61025.细菌数以几何级数增加。
61026.新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几
乎相等，此时活菌数最多。
61027.菌体的死亡数超过新生数。
61028.滞留适应期，对数生长期，最高稳定生
长期，衰亡期。61029.对数生长。61030.连续培养法。61031.最高稳定。61032.好氧，厌氧。61033.20-25。
61034.加大接种量和采用处于对数生长期的菌种接种。
61035.62-63。C，30min或71。
C，15min。61036.常压80-100℃处理15-60分钟，37℃保
温培养过夜，再同上蒸煮，如此连续三天。
61037.5℃，25-37℃，45-50℃。
61038.30℃，45-55℃，60-75℃，温泉和堆肥
中。61039.-5-0℃，10-20℃，25-30℃，冷藏食品上。61040.-12℃，5-15℃，15-20℃，海洋深处、雪山等地。61041.中温型的。61042.中温型的。
61043.计数板计数法，涂片计数法，比浊法。61044.稀释平板计数法，滤膜培养法，稀释培
养法(MPN法)。
61045.化学吸氧法，密闭容器内反复抽真空后
充N2。
61046.10-15℃，25-37℃，45-50℃。61047.恒浊法，恒化法。
61048.好氧，兼性厌氧，厌氧，微好氧。61049.乳酸菌，乳酸，腐生细菌。61050.杀菌，防腐。
61051.低温防腐，加无毒的化学防腐剂，干燥
防腐，利用微生物产酸防腐。
61052.是细胞的组分，是生化反应的介质，是
吸收营养物质和分泌代谢物的良好溶剂，能有效地控制细胞温度。
61053.引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生
物对营养物质的吸收，影响代谢过程中酶的活性，改变环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性。
61054.25-30% 61055.丙酸钙 61056.苯甲酸钠
四．名词解释
61057.生长是指微生物的细胞组分与结构在量方面的增加过程。
61058.从生长到繁殖是一个量变到质变的过
程，这个过程就是发育。
61059.由细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖。
61060.在有氧无氧条件下均能生长的细菌。61061.指在空气或氧气存在下生长的微生物。61062.在没有空气或氧气条件下生活的微生物。
61063.经过反复分离纯化后，在平板上挑取的由单个菌落繁衍的微生物后代。
61064.单个细胞完成一次分裂所需的时间。61065.当细菌在适宜的环境条件下培养时，如果以培养的时间为横座标，以细菌数量变化为纵坐标，根据细菌数量变化与相应时间变化之间的关系，可以作出一条反应细菌在培养期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线。
61066.在一定条件下(如10分钟)，杀死某种微生物的最低温度。
61067.在一定条件下(如60℃)杀死微生物所需要的最短时间。
61068.将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获，此称为分批培养。
61069.细菌纯培养生长曲线表明，细菌培养物的最高得率在对数生长期。通过控制环境条件，使细菌的生长始终保持在对数生长期，从而可以获得更多的细菌培养物，这种方法称为连续培养。
61070.指能在氧分压低于正常大气环境中表现最大生长速度的细菌。
61071.在分子氧存在下也能生活的厌氧菌。61072.二元培养是纯培养的一种特殊形式。有些寄生微生物只能在寄生微生物体内寄生，必须将寄生微生物和寄主微生物培养在一起，同时排除其它杂菌。例如培养苏云金杆菌及其噬菌体，需先在平板培养基上培养苏云金杆菌的细菌坪，然后在细菌坪上接种苏云金杆菌的噬菌体，经培养后，在苏云金杆菌的细菌坪上出现噬菌体感染的透明空斑，这种培养方法称为二元培养。
61073.在15%以上盐浓度下才能生长，最适生长的盐浓度为25-30%的嗜盐菌称为极端嗜盐菌。
61074.采用物理或者化学的方法使微生物处于比较一致的生长发育阶段上的培养方法叫同步培养。例如利用孔径大小不同的滤膜，将大小不同的细胞分开培养，可使同一大小的细胞处于同一生长阶段。
五．问答题
61075.温度对微生物的影响可概括为：
1适宜的温度有利于微生物的生长
2高温可使菌体蛋白变性，导致微生物死亡，常用高温进行消毒灭菌低温对微生物具有抑制或杀伤作用，故低温用于保藏食品
61076.秋天之所以容易栽培平菇是因为： 秋冬病虫害少平菇子实体形成温度比菌丝生长温度要低，当菇床菌丝长满以后，适当降温，(秋冬天降温容易)，有利于平菇子实体的形成。
61077.细菌的纯培养生长曲线分为四个时期，即滞留期，对数生长期，最高稳定生长期和衰亡期。
滞留期的特点是：分裂迟缓，代谢活跃。
对数生长期的特点是：细菌数量以几何级数增加。
最高稳定生长期的特点是：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等。
衰亡期的特点是；活菌数按几何级数下降。
61078.灭菌是杀死所有微生物
消毒是杀死或消除所有病原微生物，达到防止病原菌传播的目的防腐是利用理化因子使微生物暂不生长
化疗是有效地消除宿主体内的微生物
61079.取载玻片一块，用蜡笔在中央画出一平
方厘米的面积。将待测样品稀释到一定浓度后取0.01毫升菌液滴在载玻片上的一平方厘米面积上。然后在显微镜下计数每个视野的菌数(至少数10个视野，计算平均菌数)。将视野的面积算出来后，按下列公式计算样品中的含菌数。
1平方厘米
每克样品中的含菌数＝--------------------每个视野的平均菌数100稀释倍数 视野面积 3水蒸汽有潜热。
61080.干重法主要用来测发酵液中丝状真菌
或放线菌的生长量。
取一定量的发酵液(如100毫升)过滤
后连同滤纸一道烘干至恒重后称重，然后再减去滤纸的干重，即为100毫升发酵液中某种微生物干物质的量。
61081.为了防止微生物在培养过程中因自身的代谢作用产酸或产碱改变环境的pH值，通常在配制培养基时预先加入缓冲物质如磷酸盐或碳酸钙。
61082.用比浊法测定微生物的数量主要是在工业生产中采用，它的特点是快速。
在测定前首先必需绘制出浊度与数量的相关曲线，浊度用光电比色计测定，菌数靠用稀释平板法测定或用计数板测定。曲线绘好后，在生产中，只要用比色计测出菌液的任一浊度后就可以从曲线上查出相应的菌数。
61083.在t0时菌数X=100
在t1时菌数Y=1000000000
n(代数)=3.3lg(y/x)=3.3(lg109-lg102)=3.3×7=23.1
代时G=(400-0)÷23.1=17.3
在上述培养中，该菌的代时为17.3分钟，400分钟内共繁殖了23.1代。
61084.原因有三条：
1蛋白质在有水的条件下变性温度比无水时的变性温度要低。
2水蒸汽的穿透力比热空气的穿透
力强。
第五篇：微生物的分离与培养
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤: 1.有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。－、灭菌与消毒
灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一)热力灭菌
热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。湿热灭菌
(1)高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0.1MPa，121℃保持15～30 min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。
(2)常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。
常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内，每天加热100℃，30 min，连续3 d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18～24 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。
(二)过滤除菌
许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，—均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：
(1)蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液臵于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小，滤板分为3种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。
(2)微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装臵的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：
① 组装、灭菌 将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。
② 压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。
提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。
(三)辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。
注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。
此外，采用60Co-γ射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。
(四)化学药品灭菌
化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。
植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。
消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。
二、培养基的制作
1、目的要求
了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。
2、基本原理
在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好，因此，对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围。－般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。
培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂，半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂。琼脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。
根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏(Czapek)培养基等。
根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。
在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。
3、材料、试剂与仪器 材料 马铃薯。
试剂 葡萄糖、琼脂等。
仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。
4、操作步骤
PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml，自然pH。
在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。(1)称量 称量去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g。提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的15 g就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。
(2)将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000 ml，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。
(3)将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。
提示：在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000 ml。
提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。
(5)分装 根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管，其量为管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。
(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花，棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在植物病理学研究工作中普遍使用。
正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合，过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的，且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有1／3在外，2／3在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。
(7)包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。
(8)灭菌 将上述培养基以0.1MPa，121℃，高压蒸气灭菌20 min。
(9)搁臵斜面 将灭菌的试管培养基竖臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁臵的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
培养基经灭菌后，必须放在37℃温箱培养24h，无菌生长者方可使用。
PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。
三、病原菌的分离培养和纯化
1、目的要求
(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。
(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。
2、基本方法
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
3、材料、仪器与用具 3.1 材料
(1)稻瘟病（叶、病节、病穗颈）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3)黄瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。
(5)黄瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黄瓜细菌性角斑病（叶）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。
(7)水稻白叶枯病（叶）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜软腐病（叶）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。
3.2．培养基 PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。
3.3．仪器与用品 超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0.1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等。
4、实验操作
(一)病原真菌的分离
1．组织分离法 其步骤为：
(1)取灭菌培养皿一个，臵于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手，操作时还需用70 ％酒精擦拭双手；无菌操作时，呼吸要轻，不要说话。
（2）用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1～2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60℃左右的PDA培养基倒人培养皿中，每皿倒10～15 ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。
提示：加入25％乳酸1～2滴，可减少平板上出现污染细菌菌落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45℃左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处，)切取小块(每边长3～4 mm)病组织数块。
提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健组织的部分分离。
（4）将病组织放入70％酒精中浸3～5s后，按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
提示：先用70％的酒精浸2～3 s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至l min)升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3～5 min。
(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4～6块。
提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6)将培养皿倒臵放入25℃左右恒温箱内培养。一般3～4 d后观察待分离菌生长结果。
(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25 ℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种，便可臵于冰箱中保存。
提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的菌落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。
在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上，完成分离工作。
2.稀释分离法
(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。
(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0.5～1.0 ml。(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。
(4)将熔化并冷却到45～50℃的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
提示： 倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，不利于分离。
(5)将培养皿翻转后臵恒温箱(25℃)中培养，数日后观察菌落生长情况。
(6)挑菌 将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，臵25℃左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。
(二)病原细菌的分离
病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。
除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中2～4 h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2)将病组织先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20～60 min，让细菌释放到灭菌水中。
(3)用灭菌的接种铒，(接种环)；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼，冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。
提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。
(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28℃恒温箱中培养。1～3 d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。
(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。
(三)真菌、细菌培养性状
1．真菌培养性状观察 取已分离，纯化的某种真菌菌种；按前述稀释分离法中(1)～(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
2．细菌培养性状观察
(1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过2～3 d后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味生成，生长速度快慢等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
(3)用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培养基中，数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成，培养液表面是否可生成菌膜等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
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