《微生物的培养与应用》学案

第一篇：《微生物的培养与应用》学案

生物选修一第二章微生物的培养与应用教案 ★课题目标

（一）知识与技能

了解有关培养基的基础知识；掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术

（二）过程与方法

分析实验思路的确定和形成的原因，分析实验流程，对比前面的实验设计，归纳共性，分析差异，增加印象

（三）情感、态度与价值观

形成勇于实践、严谨求实的科学态度和科学精神 ★课题重点 无菌技术的操作 ★课题难点

无菌技术的操作 ★教学方法

启发式教学 ★教学工具

多媒体课件 ★教学过程

（一）引入新课

在传统发酵技术的应用中，都利用了微生物的发酵作用，其中的微生物来自于制作过程中的自然感染。而在工业化生产中，为了提高发酵的质量，需要获得优良菌种，并保持发酵菌种的纯度。这就要涉及到微生物的培养、分离、鉴别等基本技术。现在我们开始学习微生物的培养和应用专题。

（二）进行新课 1．基础知识

1．1 培养基的种类包括 固体 培养基和 液体 培养基等。

〖思考1〗琼脂是从红藻中提取的 多糖，在配制培养基中用作为 凝固剂。【补充】培养基的类型及其应用：

〖思考2〗从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？ 1．3 培养基除满足微生物生长的 ph、特殊营养物质 和 氧气 等要求。【补充】生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。

〖思考3〗牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供 糖、维生素 和 有机氮 等营养物质。

〖思考4〗培养乳酸杆菌时需要添加 维生素，培养霉菌时需要将培养基ph调节为 酸性，培养细菌时需要将ph调节为 中性或微碱性。活动2：阅读“无菌技术”，讨论回答下列问题：

1．4 获得纯净培养物的关键是 防止外来杂菌的入侵。1．5 无菌技术包括：

（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ；

（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。1．6 比较消毒和灭菌（填表）

〖思考5〗无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是 防止感染实验操作者。1．7 消毒方法：

（1）日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法；

（2）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏 消毒法（作简要介绍）；

（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增强消毒效果，然后使用 紫外线 进行物理消毒。

（4）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒； 1．8灭菌方法：

（1）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法；

（2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法，所用器械是 干热灭菌箱 ；（3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用器械是 高压蒸汽灭菌锅。（4）表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法，所用器械是 紫外灯。

〖思考6〗对接种环灭菌时要用酒精灯的 充分燃烧 层火焰灼烧可能伸入试管或培养皿的部位。

〖思考7〗利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是避免妨碍热空气流通。

【补充】培养基的配制原则：

①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。

②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③ph要适宜：细菌培养基ph中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。2．实验操作

2．1 计算：根据配方比例，计算100ml培养基各成分用量。

2．2 称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。

2．3 溶化：①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100ml。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。2．4 调ph：用1mol/lnaoh溶液调节ph至偏碱性。

2．5 灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。

2．6 倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：

①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；

②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；

③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。

〖思考1〗锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。〖思考2〗倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。〖思考3〗若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？ 不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。

〖思考4〗配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。〖思考5〗试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。2．7 接种

2．7．1微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法，另外还有穿刺接种和斜面接种等。

2．7．2平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是： ①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。

②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划3～5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。⑧将平板倒置放在培养箱中培养。

〖思考6〗取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。〖思考7〗在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。2．7．3 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。2．7．4 系列稀释操作：

①取盛有9ml水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。

②用灼烧冷却的移液管吸取1ml菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。③从101倍液中吸取1ml菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。3．结果分析与评价

3．1 培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。3．2 在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。3．3 培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。〖思考9〗在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。

〖思考10〗频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在－20℃冷冻箱中。

（三）课堂总结、点评

（四）实例探究

例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是 答案：d 例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是 a.防止杂菌污染 b.消灭杂菌 答案：b ☆综合应用

例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答： 编号成分含量 ①粉状硫10g ②（nh4）2so40.4g ③k2hpo44.0g ④mgso49.25g ⑤feso40.5g ⑦h2o100ml（1）右表培养基可培养的微生物类型 是。

如不想浪费此培养基，可再加入，用于培养。

养基可用于培养。

（4）表中营养成分共有 类。

（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化 后分装前，要进行的是。

（6）右表中各成分重量确定的原则是。

（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是。

答案：⑴自养型微生物 ⑵含碳有机物 金黄色葡萄球菌 ⑶固氮微生物 ⑷3 ⑸调整ph ⑹依微生物的生长需要确定 ⑺琼脂（或凝固剂）

（五）巩固练习

2．根瘤菌能利用的营养物质的组别是 3．配制培养基的叙述中正确的是

a．制作固体培养基必须加入琼脂 b．加入青霉素可得到放线菌 4．自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是 生 物硝化细菌根瘤菌酵母菌谷氨酸棒状杆菌

代谢类型自养需氧型异养需氧型异养兼性厌氧型自养需氧型 a．根瘤菌、谷氨酸棒状杆菌 b．硝化细菌、酵母菌

6．甲、乙、丙是三种微生物，下表ⅰ、ⅱ、ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在ⅲ种正常生长繁殖；甲能在ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是（）粉状硫 10gk2hpo4 4gfeso4 0.5g蔗糖

10g（nh4）2so4 0.4gh2o 100mlmgso4 0.5g ⅰ++++-+++ ⅱ+++-++++ ⅲ++++++++ a、甲、乙、丙都是异养微生物

b、甲、乙、丙都是自养微生物、丙是异养微生物

d、甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物

7．微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是

b．微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子

d．生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往不足。8．某一种细菌株要从环境中提取现成的亮氨酸（20种氨基酸中的一种）才能生长，此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表中细菌菌株类型。根据实验年目的，选用的培养基类型是（）

注：ｌ—亮氨酸

ｓ—链霉素

“＋”—加入

“—”—不加入

如：ｌ—：不加亮氨酸

ｓ＋：加入链霉素

选项筛选出不需要亮氨酸的菌株筛选出抗链霉素的菌株筛选出不需要亮氨酸的抗链霉素的菌株

ａｌ＋

ｓ＋ｌ—

ｓ—ｌ＋

ｓ－ ｂｌ－

ｓ—ｌ＋

ｓ＋ｌ—

ｓ＋ ｃｌ—

ｓ＋ｌ＋

ｓ＋ｌ—

ｓ— ｄｌ＋

ｓ—ｌ—

ｓ—ｌ＋

ｓ＋

9．要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他的细菌分离出来，应将它们接种在

10．酵母菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，原因是 ★课余作业

１、收集生活中与微生物有关的实例，并通过所学知识对其进行解释 ２、我们打针输液时，首先要用酒精擦拭针刺处，为什么？ ★教学体会

本节课可以通过生产实例导入，使学生认识在微生物的培养过程中，保持培养物纯净的重要性。在课堂上可以跳出教材，充分发挥学生的主动性，让学生收集列举更多的生产生活中的实例，从中体会培养物纯净的重要性。当时由于微生物的微观性和危害性，一定要教育学生培养良好的卫生习惯。★资料袋 微生物的特点

1.个体微小，结构简单

在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。2.繁殖快

生长繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。3.代谢类型多，活性强。4.分布广泛

有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。5.数量多

在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。6.易变异

相对于高等生物而言，较容易发生变异。在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。微生物种内的遗传多样性非常丰富。所以微生物是很好的研究对象，具有广泛的用途。

第二篇：微生物的分离与培养

病原物的分离与培养

病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤: 1.有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。－、灭菌与消毒

灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

(一)热力灭菌

热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1．干热灭菌

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。

干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。湿热灭菌

(1)高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0.1MPa，121℃保持15～30 min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。

(2)常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。

常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内，每天加热100℃，30 min，连续3 d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18～24 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。

(二)过滤除菌

许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，—均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：

(1)蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液臵于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小，滤板分为3种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。

(2)微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装臵的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：

① 组装、灭菌 将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。

② 压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。

提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。

(三)辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。

注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。

此外，采用60Co-γ射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。

(四)化学药品灭菌

化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。

植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。

二、培养基的制作

1、目的要求

了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。

2、基本原理

在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好，因此，对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围。－般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。

培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂，半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂。琼脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏(Czapek)培养基等。

根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。

在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。

3、材料、试剂与仪器 材料 马铃薯。

试剂 葡萄糖、琼脂等。

仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。

4、操作步骤

PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml，自然pH。

在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。(1)称量 称量去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g。提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的15 g就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。

(2)将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000 ml，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。

(3)将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。

提示：在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。

(5)分装 根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管，其量为管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。

(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花，棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在植物病理学研究工作中普遍使用。

正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合，过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的，且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有1／3在外，2／3在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。

(7)包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。

(8)灭菌 将上述培养基以0.1MPa，121℃，高压蒸气灭菌20 min。

(9)搁臵斜面 将灭菌的试管培养基竖臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁臵的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

培养基经灭菌后，必须放在37℃温箱培养24h，无菌生长者方可使用。

PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。

三、病原菌的分离培养和纯化

1、目的要求

(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。

(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。

2、基本方法

植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。

为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。

3、材料、仪器与用具 3.1 材料

(1)稻瘟病（叶、病节、病穗颈）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3)黄瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。

(5)黄瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黄瓜细菌性角斑病（叶）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。

(7)水稻白叶枯病（叶）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜软腐病（叶）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。

3.2．培养基 PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。

3.3．仪器与用品 超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0.1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等。

4、实验操作

(一)病原真菌的分离

1．组织分离法 其步骤为：

(1)取灭菌培养皿一个，臵于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手，操作时还需用70 ％酒精擦拭双手；无菌操作时，呼吸要轻，不要说话。

（2）用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1～2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60℃左右的PDA培养基倒人培养皿中，每皿倒10～15 ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。

提示：加入25％乳酸1～2滴，可减少平板上出现污染细菌菌落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45℃左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处，)切取小块(每边长3～4 mm)病组织数块。

提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健组织的部分分离。

（4）将病组织放入70％酒精中浸3～5s后，按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。

提示：先用70％的酒精浸2～3 s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至l min)升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3～5 min。

(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4～6块。

提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。

(6)将培养皿倒臵放入25℃左右恒温箱内培养。一般3～4 d后观察待分离菌生长结果。

(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25 ℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种，便可臵于冰箱中保存。

提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的菌落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。

在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上，完成分离工作。

2.稀释分离法

(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。

(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0.5～1.0 ml。(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。

(4)将熔化并冷却到45～50℃的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。

提示： 倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，不利于分离。

(5)将培养皿翻转后臵恒温箱(25℃)中培养，数日后观察菌落生长情况。

(6)挑菌 将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，臵25℃左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。

(二)病原细菌的分离

病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。

除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中2～4 h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2)将病组织先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20～60 min，让细菌释放到灭菌水中。

(3)用灭菌的接种铒，(接种环)；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼，冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。

提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。

(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28℃恒温箱中培养。1～3 d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。

(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。

(三)真菌、细菌培养性状

1．真菌培养性状观察 取已分离，纯化的某种真菌菌种；按前述稀释分离法中(1)～(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。

2．细菌培养性状观察

(1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。

(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过2～3 d后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味生成，生长速度快慢等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。

(3)用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培养基中，数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成，培养液表面是否可生成菌膜等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。

第三篇：微生物实验室培养

平陆中学高二生物

课题一：微生物的实验室培养第二课时

车柳顺2.24学习目标：

1、明确配制培养基的步骤

2、说出纯化微生物的方法和步骤

目标一：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

1、步骤：计算→称量→溶化→→灭菌→倒平板。

2、演示倒平板操作

导思：（完成倒平板操作的讨论题1——4）

目标二：纯化大肠杆菌

1、微生物接种最常用的方法是划线法和涂布平板法。

2、平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续分散到培养基的表面。稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度，然后将不同稀释度的菌液分别到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

3、总结平板划线法和稀释涂布平板法的操作步骤并演示

（1）平板划线操作：

导思：（完成平板划线法的讨论题）

（2）稀释涂布平板法：

导思：（完成稀释涂布平板法操作的讨论题）

4、平板划线法和稀释涂布平板法的异同点是

目标三：菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用的方法

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用的方法。

自我反思

1、以下关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述错误的是（）

A.操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌

B.将称量好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯

C.将培养皿冷却至50C左右时进行倒平板

D.待平板冷却凝固约5—10min后将平板倒过来放置

2、有关倒平板的操作错误的是（）

A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上

B.将打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰

C.将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上

D.等待平板冷却凝固后需要倒过来放置

3、有关稀释涂布平板法，叙述错误的是（）

A.先将菌液进行一系列的稀释

B.然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面

C.适宜条件下培养

D.结果都可在培养基表面形成单个的菌落

4、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（）

A.一个细菌、液体培养基B.许多细菌、液体培养基

C.一个细菌、固体培养基D.许多细菌、固体培养基

第四篇：微生物的培养与生长

第四章

微生物的培养与生长

所有生物为了生存都必须不断地从外界环境中吸收所需的各种物质从中获得 原料和能量以便合成新的细胞物质，生物所需的这些物质称之为营养物质。生物吸收利用营养物质的过程一般称为营养。营养物质是生物进行一切生命活动的物质基础，失去这个基础，一切生物都无法生存，微生物也不例外。可见，营养对微生物的重要性。

第一节 微生物的营养

一、微生物细胞的化学组成

分析微生物细胞化学组成是了解微生物营养物质的基础。主要成分：C、H、N、O和无机成分。其中主要是水分、蛋白质、碳水化合物、脂肪、核酸和无机盐。水分占90-97，其余占3-10%。

二、营养物质及其生理功能

微生物所需的营养物质，主要包括碳素化合物、氮素化合物、水分、无机盐类和生长素。这些物质对微生物的生命活动主要有三方面的作用：

（1）、供给微生物合成细胞物质的原料；（2）、合成代谢和生命活动所需的能量；（3）、调节新陈代谢。

（一）、碳源

碳源主要用来供给菌体生命活动所需的能量，构成军菌体细胞及代谢产物。常用的碳源有：糖类、脂肪和某些有机酸、部分醇类。

在某些特殊情况（如碳源贫乏），蛋白质水解产物或氨基酸等也可以被某些菌种作为碳源使用。由于菌种所含煤系统并不完全相同，所以，各种菌能利用的碳源亦不相同。

葡萄糖、麦芽糖、乳糖等单糖和双糖是绝大部分细菌、酵母菌、放线菌及霉菌可利用的碳源，大多数霉菌、放线菌和部分细菌可直接利用糊精和淀粉作为碳源。

（二）、氮源

氮源主要用来构成菌体细胞物质（如氨基酸、核酸、蛋白质）和含氮代谢产物。常用的氮源可分为两类：有机氮源和无机氮源。黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、鱼粉等属于有机氮源；氨水、硫酸铵、尿素、硝酸钠、硝酸铵和磷酸氢二铵等为无机氮源。

（三）、水

水是微生物体内外的溶媒，只有通过水，微生物所需要的营养物质才能进入细胞，也只有通过水其代谢产物才能排出体外。另外，水也可以直接参加代谢作用，如蛋白质、碳水化合物和脂肪的水解作用都是在水参与下才能进行的。

（四）、无机盐

无机盐也是微生物生长所必不可少的营养物，其中又可分为主要元素和微量元素两大类。主要元素微生物需要量大，有P、S、Mg、K、Ca、Na等，它们参与细胞结构物质的组成，有调节细胞质pH值和氧化还原电位的作用，有能量转移、控制原生质胶体和细胞透性的作用。微量元素有Fe、Cu、Zn、Mn、Co等，它们的需要量 虽然极微，但往往强烈地刺激微生物的生命活动。它们或是酶活性基的组成成分或酶的激活剂。

（五）、生长因子

有些微生物在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中仍不能正常生长，如在培养基中加入某种组织（或细胞）提取液时，则微生物生长良好，说明这种组织中含有某些微生物生长所需的生长因子。凡是微生物生长所不可缺少的微量有机物都称为生长因子。包括维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶及其衍生物。

这些物质之所以称之为生长因子，是由于某些微生物自己不能合成之，必须由外界提供。它不是一切微生物所必需的。

第一类是不需要外源供给的微生物，像自养型细菌和广泛分布的一些腐生性细菌和霉菌，它们自己可以合成这些物质，以满足自身 的需要。

第二类是缺乏自制一种或两种能力的微生物，如金黄色葡萄球菌需要硫胺素，根瘤菌需要生物素。这类微生物中有些种类，当外界供给所需要的前体物质，亦能满足需要。

第三类为对多种维生素、氨基酸、碱基都缺乏合成能力的微生物，在培养基中提供水解蛋白质和织物组织液才能生长（如麦芽汁、酵母汁）。

维生素作为酶的活性基团起催化作用。氨基酸是组成蛋白质的结构物质，嘌呤、嘧啶是合成核苷酸的主要物质。

三、微生物的营养类型

由于各种微生物的生活环境和对物质的利用能力不同，它们对营养的需要和代谢方式也不尽相同，根据微生物所需要的营养和能量的不同，尤其是碳素营养来源的不同，可把它们分成自养微生物和异养微生物两大类。

自养型微生物：能利用简单的无机物作为营养物质进行生长繁殖，能以CO2或碳酸盐为碳源，以氨或硝酸盐为氮源，在体内合成有机物，不需要外界供给有机物。

异养型微生物：只能用现成的有机物作为碳源，如单糖、双糖、淀粉、纤维素、有机酸等，另外，根据能量来源不同，又可分为两种类型。即光能营养型和化能营养型。光能营养型能利用光能。化能营养型是来自物质氧化过程释放的能量。

根据碳素来源和能量来源可分四种类型。

（1）、光能自养型：这类微生物利用日光作为其生活所需的能源，利用CO2作为碳源，以无机物为供氢体来还原CO2,合成细胞有机物质。如蓝细菌（光合细菌）。

（2）、光能异养型：有少数微生物种类具有光合色素，能利用光能把CO2还原为碳水化合物，但必须以某种有机物为CO2同化中的供氢体。如红螺菌属利用丙醇作为供氢体，积累丙酮。

（3）、化能自养型：能利用氧化无机物时产生的能量，把CO2还原成有机碳水化合物。如硝化细菌、铁细菌等。

（4）、化能异养型： 能源来自有机物 的氧化或发酵产生的化学能，以有机物为碳源，以有机或无机氮为氮源。这类微生物的种类最多。

四、微生物对营养物质的吸收方式

微生物对营养物质的吸收取决于细胞膜的结构和生物功能。细胞膜是一层具有高度选择性的半透膜，控制营养物质及 代谢产物的进出细胞。细胞膜上有丰富的酶，这些酶与物质的吸收和排泄有关。微生物对营养物质吸收的机制有四种：

1、被动扩散：由高浓度向低浓度扩散。

2、助长扩散：有载体蛋白参加。

3、主动运输：从低浓度向高浓度扩散，需要能量和载体蛋白。

4、基因转移：通过磷酸化转移。

五、培养基

微生物的生长和繁殖需要一定的营养物质，根据微生物对营养物质的需要，经过人工配制适合比同微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质就成为培养基。培养基的主要用途为：促使微生物生长与繁殖，用于微生物纯种分离、鉴定 和制造微生物制品等。

（一）、培养基的类型

由于各种微生物所需要的营养物不同，所以培养基的种类也有很多种，估计可有数千种之多，但大致可以分为以下几类。

1、根据营养物质来分

（1）、合成培养基：是由已知化学成分及数量的化学药品配制而成的。这种培养基成分精确，重复性强。但价格高，一般多用于实验室内供研究有关微生物的营养、代谢、分离和鉴定生物制品及选育菌种用。

（2）、天然培养基：采用化学成分还不十分清楚或化学成分不恒定的天然有机物，可用组织提取液等。如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨、牛奶、血清等。玉米粉、马铃薯配制方便、经济，运用于实验室和生产。

（3）、半合成培养基：在天然有机物的基础上，加入一些化学药品，以补充无机盐成分，使其更能充分满足生长需要。该培养基是使用最多的培养基。

2、根据培养基物理性状分

（1）、固体培养基：在液体培养基中加入2%琼脂，成为固体状，用于菌种保藏、分离、菌落特征观察、计数等。

（2）、液体培养基：一般用于生产。

（3）、半固体培养基：加入0.35%-0.40%琼脂。

3、根据培养基的用途来分

（1）、基础培养基：满足一般微生物生长需要的营养物质。

（2）、加富培养基：在培养基中加入额外的营养物质，使某些微生物在其中生长，而不适合其它微生物生长。通常加入血、血清、动植物提取液。

（3）、选择培养基：在培养基中加入某些化学药品以抑制不需要的微生物生长，而促进需要的微生物生长，往往加入一些抑菌剂或杀菌剂。

（4）、鉴别培养基；根据微生物能否利用培养基中的某种成分，依靠指示剂的颜色反应，借以鉴别不同种类的微生物。

（二）、培养基配制的原则

1、根据微生物的营养要求配制；

2、注意营养成分的比例；

3、培养基的pH值；

4、氧化还原电位。

第二节

微生物的生长

一、微生物的生长

微生物在适宜的环境中，按照自己的代谢方式，不断地吸收营养物质，进行新陈代谢，即进行同化作用和异化作用。如果同化作用大于异化作用，细胞会增大，细胞的体积逐渐增加，这就是生长。细胞的生长有一定限度的，当增到一定限度时，细胞就开始分裂，形成两个基本相似的子细胞，子细胞又可重复进行生长和分裂。细胞分裂形成子细胞，使个体数目增加，这就是分裂。从生长到繁殖的过程也就是由量变到质变的 发展过程，这一质变过程叫发育。微生物在比较合适的条件下，能正常生长和繁殖。当环境发生某些变化，此变化超过了微生物能适应忍受的程度时，微生物的生命活动就会受到抑制而发生变异，甚至死亡。

细菌的生长的标志：以群体数目的增加作为生长标志。因为很难将生长与繁殖分开。

放线菌和霉菌：是以菌丝的伸长和分枝表现为生长的。

对于微生物的应用，不论是在食品和其他方面的应用，主要是利用它的菌体，及其产生的代谢产物和酶类，而这与微生物的生长是密切相关的。所以了解和掌握微生物的生长特性是很有必要的。

二、微生物的纯培养

目的是从混杂状态中纯化分离细菌，是研究利用微生物的基础，通常采用以下方法：

1、稀释平板法；

2、划线法；

3、单细胞分离法；

4、选择培养基分离法。

此部分试验指导中也有，在此简单介绍。

三、微生物生长的测定

（一）、单细胞的微生物是指细菌和酵母菌等，它们的生长量不是测定细胞大小，而是测定群体增长量。方法如下：

1、全数测定

所谓全数测定，即是培养一定时间后测定细胞的总数。其数量既包括活的细胞，也包括死的细胞。

（1）、计数器法：采用血球计数板。

（2）、染色涂片计数法：取定量菌液将其涂布于1cm2的面积内，染色、镜检、计数。

（3）、比浊法：是测定菌液中细胞数的快速方法，原理是菌液中细胞量越多，浊度越大。用未知细胞数的菌液和已知细胞数的菌液相比，来求出未知细胞数菌液中的细胞数。

2、活菌计数法：测定活菌数。（1）稀释平板法：取待测的细胞悬液作一系列的稀释，稀释级数越高，稀释液中含细胞数愈少，也就越易在培养皿上显出单个菌落。

（2）、液体稀释培养法：采用统计学原理进行测定，如大肠菌群的测定，采用此方法。

（二）、多细胞微生物生长的测定

以菌丝生长的长度或菌丝增加的重量作为生长指标。最简单的方法是将酶菌接种在培养皿内固体培养基中央，在一定时间内测定菌落的直径或面积。对生长速度快的霉菌，可每24h测量一次。可求出菌丝的平均生长速度。

（三）、细胞物质的测定

测量活菌或死菌。

1、干重法：过滤或离心，烘干称重。

2、含氮量法：细胞的蛋白质含量比较稳定。而氮又是蛋白质的重要组成。因此，测定微生物细胞的含氮量来表示其生长情况。

四、生长曲线

是指细菌等单细胞微生物，以细胞增长数的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标作图时，可以绘出一个曲线，此曲线称为生长曲线。

细菌纯培养的生长曲线：由于细菌各个时期生长繁殖速度不同，所以，生长曲线又可分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。

（一）、延迟期

少量的细菌接种到新鲜培养基后，开始时，细胞一般不立即进行繁殖。因此，它们的细菌数几乎不增加，甚至还有减少。生长曲线中的这一段时间称为延迟期。

处于延迟期的细菌体积增长较快，特别是在此期的末期。

延迟期的出现可能是因为细胞在新的环境中，需要合成新的必需的酶、辅酶或某些中间代谢产物，或者为了适应新环境而出现的调整代谢的时间。延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄及移种到新鲜培养基前后所处的环境条件是否相同等因素有关。

繁殖速度较快的菌种接种时，其延迟期也较短，甚至检查不到延迟期；接种到同样组成的培养基比接种到组成不同的培养基中，其延迟期要短些；增大接种量可缩短甚至消除延迟期。

由于延迟期的长短能影响微生物的正常生长周期，在发酵工业生产中延长生产周期，会降低设备的利用率。所以，生产实践中总是设法缩短延迟期。为此，采取的措施有：

（1）、增加接种量；（2）、用对数生长期的菌种；（3）、用健壮的菌种；

（4）、在种子培养基中加入发酵培养基中的某些成分；（5）、采用最适种龄等。

（二）、对数期

在延迟期末，细胞开始出现较大量的分裂，培养基中的菌数急剧增加，进入了对数期。在此期内，如用菌数的对数与培养时间作图时，则该线呈一条直线，此期为对数期。

对数期的菌数按几何级数增加。即1个细菌繁殖几代，产生2n个细胞。对数生长期的菌体代谢活跃，消耗营养多，生长速率高，个体数目显著增多。另外，群体中的细胞化学组成与形态、生理特征等比较 一致，这一时期的菌种 很健壮，因此，在生产上常用它作为接种的种子。

实验室也多用对数期的细胞作为试验材料。通常对数期维持的时间较长，但它也受营养及环境条件所左右。

（三）、稳定期

在一定的培养液中，细菌不可能按对数期的高速率无限地生长繁殖，这是由于对数期中细菌的活跃生长已经消耗了大量的营养物质，所以，在对数期末，细菌生长速率逐渐下降，死亡率大量增加，以致使新增值的细胞数与死亡的细胞数趋于平衡，因此活菌数保持相对的稳定，成为稳定期。

处于这个期的细胞生活力逐渐减弱，开始大量储存代谢产物。同时，也积累了许多不利于微生物活动的代谢产物。由于微生物的生长改变了它自己的生活条件，出现了不利于细菌生长的因素，如pH值、氧化还原电位等，致使大都数芽孢杆菌在这个生长阶段形成芽孢。

由于稳定期有大量代谢产物积累，人们要获得其代谢物质，可在这一时期提取。在此稳定期内，活菌数达到最高水平。如要得到大量菌体，也应在此期开始收获。稳定期持续时间长短取决于菌种的繁殖与衰亡的数量之比。环境条件对稳定期的长短也有影响。

（四）、衰亡期

稳定期后，如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致使死亡数大大超过新生数，总的活菌数明显下降，即死亡期。其中，有一阶段活菌数以几何数下降。因此，也称为对数衰亡期。

这个时期，细菌菌体常出现多种形态，包括畸形和衰退型，因此，此期的菌种不宜作种子。

微生物中单细胞生长曲线，反映了一种微生物在某种生活环境中（试管、摇瓶、发酵罐）的生长、繁殖和死亡的规律。研究生长曲线既可为研究营养和环境条件提供理论依据，又可用来调控微生物的生长发育。

霉菌的生长也有延迟期、稳定期和衰亡期。由于它们不是单细胞微生物，所以它们的繁殖不按几何级数增加，故而没有对数生长阶段。

五、连续培养

1、分批培养：在培养微生物时。将微生物置于一定容积的定量培养基中培养，称为定量培养。

2、连续培养：是在微生物的培养过程中，不断地供给营养物质，并排除老菌液，让培养的微生物相对地维持较长时间的对数生长期，以利于提供较多的对数生长细胞。在发酵工业上，可提高发酵率和自动化水平，减少动力消耗并提高产品质量。有三种方法：

（1）、恒浊连续培养法；（2）、恒化连续培养法。

连续培养法在工业生产上称为连续发酵。我国在丙酮、丁醇、酒精的生产以及柠檬酸的发酵上已采取了连续发酵法，缩短了发酵周期，效果良好。连续发酵的最大优点是取消了分批发酵中各批之间的间断时间，缩短发酵周期，提高设备利用率。再者，连续发酵便于工业生产，自动化控制，产物均一，产量高。但是在工业化生产中连续发酵容易发生杂菌污染及菌种退化等问题。

第三节

环境条件对微生物的影响

外界环境对微生物的作用有三种情况：

（1）、外界环境条件适宜时，微生物生长旺盛，代谢作用加速；（2）、外界环境条件不太适宜时，微生物生长缓慢，代谢作用受到一定程度的抑制；

（3）、外界环境不适宜的情况达到微生物难以忍受的程度，这时，微生物生命活动受到严重的影响，可能发生变异或死亡。

人们控制和调节微生物所处的环境条件的目的是要促进某些有益微生物的生长，发挥它们的有益作用；抑制和杀死那些不利于人类的微生物，并清除它们的有害作用，如防止食品的腐败变质等。

了解以下常用的几个概念；

（1）、防腐（Antisepsis）：又叫抑菌，是防止或抑制微生物的生长繁殖。（2）、消毒（Disinfection）：是指杀死病原微生物的措施。

（3）、灭菌（Sterilization）：杀灭物体上所有的微生物，包括病原微生物及非病原微生物。

（4）、商业灭菌：是从商品的需要出发对食品进行的灭菌，指食品经过杀菌处理后，按一定的检验方法检不出活的微生物或者仅能检出极少数的非病原微生物，而且，它们在一定的保存期内不至于引起食品变质腐败。

（5）、无菌（Asepsis）：即无活的微生物存在。如无菌操作。

（6）、死亡（dead）：是指微生物不可逆的丧失了生长繁殖的能力，即使再放到合适的环境中也不再繁殖。

环境因素包括：物理条件、化学条件和生物条件

一、温度

温度是影响生物机体的最重要的因素之一。温度的变化影响着微生物的细胞中生化反应速度。

热力致死时间（Thermal Death Time TDT）：是指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间。

D值（Decimal reduction time）在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90％的活菌被杀死）时，所需要的时间（min）。

Z值：如果在加热至死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90％的加热时间）所需要升高的温度（oC）。

F值：在一定的基质中，其温度为121.1 oC，加热杀死一定数量微生物所需要的时间（min）。

高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌。

（一）、干热灭菌（diy heat sterilization）

主要用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。

1、火焰灭菌：直接利用火焰燃烧杀灭微生物。该方法灭菌迅速、彻底。

2、加热空气灭菌：将空气加热达140-160oC，保持1-2h。

（二）、湿热灭菌（moist heat sterilization）

1、煮沸灭菌：煮沸温度接近100 oC，保持15-30min，可杀死微生物的营养体，若要杀死芽孢，则需要2-3h，此法适用于可以浸泡在水中的物品，如食品、器材、衣物等。

2、间歇灭菌（vfractional sterillization或tyndallization）：用蒸汽加热灭菌温度不超过100 oC，每日一次，每次加热30min，连续三次。

3、巴氏消毒（pasteurization）：有些食品或物品在高温下会受到不同程度的损害，不宜用过高的温度灭菌，可采用较低的温度进行灭菌，条件是62-63 oC，30min；或72 oC，15s。适用于杀死食品中的病原菌。

4、高压蒸汽灭菌（normal autoclaving）：1kg/cm2，121.5 oC，15-30min。

5、超高温瞬时杀菌法（Ultra high temperature short time，UHT）：灭菌温度132-150 oC，3-5s，可杀死微生物的营养细胞和耐热性强的芽孢细菌，但污染严重的鲜乳在142 oC以上杀菌效果才好。

二、湿度

干燥能引起微生物细胞内蛋白质变性和盐浓度增高，这是抑制微生物生长或促进其死亡的主要原因。

三、渗透压

嗜盐微生物、嗜糖微生物的概念。

除以上耐高渗微生物之外，一般来说，18%-25%的盐浓度能完全阻止微生物的生长。

由于高渗透压对微生物有抑制作用，所以，在食品工业上，广泛地利用腌制和糖渍方法来保存食品。

四、氧化还原电位

不同的微生物需要的氧化还原电位不同。

五、辐射

1、紫外线：细胞中的核酸具有吸收紫外线的性能，紫外线的辐射能量作用于核酸时，能引起核酸的变化。妨碍蛋白质和酶的合成。紫外线杀菌作用常用于空气消毒和器材物体表面消毒。

2、x、γ射线：x射线不如γ射线，γ射线被空气吸收较少，射程远，穿透力强，可用于食品杀菌。

由于各种射线照射杀菌时不需要高温，所以这类杀菌又称为冷杀菌。

六、超声波与微波

超声波对微生物细胞内含物有强烈的震荡作用，可破坏细胞，另外，水溶液经处理后能产生过氧化氢，因而有杀菌能力，可以用来保藏食品。

微波是利用热效应对微生物有杀灭作用。微波产生热效应的特点是加热均匀，热能利用效率高，加热时间短。目前微波用于食品灭菌。

七、氢离子浓度

pH值对微生物生长影响较大，主要影响菌体细胞膜上的电荷，影响物质的吸收、代谢。每种微生物都有自己适宜的pH值范围。超过此一定范围后，生长就会停止。由于pH值不同会影响微生物的代谢活动，改变物质合成方向。

高浓度氢离子可引起菌体表面蛋白质和核酸的水解，破坏酶的活性。另外，某些有机酸可引起氧化作用，具有杀菌作用。如食品防腐剂苯甲酸和水杨酸等。高浓度的碱具有杀菌作用，如石灰水、氢氧化钠、碳酸钠等作为机器、工具以及冷库等的消毒剂。

八、化学物质

（一）、氧化剂：氧化剂杀菌的效果与作用和浓度成正比关系，杀菌的机理是氧化剂放出游离氧作用于微生物蛋白质的活性基团（氨基、羟基和其他化学基团），造成代谢障碍而死亡。主要有高锰酸钾、过氧化氢、漂白粉、过氧乙酸、碘等。

（二）、甲醛：杀菌机理是与蛋白质的氨基结合而使蛋白质变性至死。

（三）、酚类：机理是蛋白质变性。石炭酸（苯酚）、来苏儿。

（四）、醇类：脱水剂，乙醇：70%的乙醇杀菌能力最强。

（五）、新洁尔灭

（六）、毒性物质：SO2、H2S、CO、CN-。

（七）、染料：结晶紫、孔雀绿、复红、次甲基蓝、孟加拉红对微生物有抑制作用。

（八）、重金属盐类：重金属盐类对微生物都有毒害作用，其机理是金属离子容易和微生物的蛋白质结合而发生变形或沉淀。

第五篇：应用微生物生产实习报告

本次实习以生产实习为主，生产实习是学习应用微生物专业的一项重要的实践性教学环节，旨在开拓我们的视野，增强专业意识，巩固和理解专业课程。实习方式主要是请企业技术人才和老师在以讲解形式介绍有关内容 的前提下，带领同学们参观生产车间，向企业技术生产工作人员学习请教相关知识;由带队老师组织同学们分组讨论、发言，通过交流实习体会方式，加深和巩固实习内容。通过本次实习，我们学到了很多课本上学不到的东西，并对微生物在生产实践上的应用有了更深的认识。酿酒基本原理和过程主要包括:酒精发酵、淀粉糖化、制曲、原料处理、蒸馏取酒、老熟陈酿、勾兑调味等。

（1）酒精发酵

酒精发酵是酿酒的主要阶段,糖质原料如水果、糖蜜等,其本身含有丰富的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等成分,经酵母或细菌等微生物的作用可直接转变为酒精。

酒精发酵过程是一个非常复杂的生化过程,有一系列连续反应并随之产生许多中间产物,其中大约有30多种化学反应,需要一系列酶的参加。酒精是发酵过程的主要产物。除酒精之外,被酵母菌等微生物合成的其他物质及糖质原料中的固有成分如芳香化合物、有机酸、单宁、维生素、矿物质、盐、酯类等往往决定了酒的品质和风格。酒精发酵过程中会产生的二氧化碳会增加发酵温度,因此必须合理控制发酵的温度,当发酵温度高于30～34℃,酵母菌就会被杀死而停止发酵。除糖质原料本身含有的酵母之外,还可以使用人工培养的酵母发酵,因此酒的品质因使用酵母等微生物的不同而各具风味和特色。

（2）淀粉糖化

糖质原料只需使用含酵母等微生物的发酵剂便可进行发酵；而含淀粉质的谷物原料等,由于酵母本身不含糖化酶，淀粉是由许多葡萄糖分子组成，所以采用含淀粉质的谷物酿酒时,还需将淀粉糊化,使之变为糊精、低聚糖和可发酵性糖的糖化剂。糖化剂中不仅含有能分解淀粉的酶类,而且含有一些能分解原料中脂肪、蛋白质、果胶等的其他酶类。曲和麦芽是酿酒常用的糖化剂，麦芽是大麦浸泡后发芽而成的制品,西方酿酒糖化剂惯用麦芽；曲是由谷类、麸皮等培养霉菌、乳酸菌等组成的制品。一些不是利用人工分离选育的微生物而自然培养的大曲和小曲等，往往具有糖化剂和发酵剂的双重功能。将糖化和酒化这两个步骤合并起来同时进行，称之为复式发酵法。

（3）制曲

酒曲亦称酒母,多以含淀粉的谷类(大麦、小麦、麸皮)、豆类、薯类和含葡萄糖的果类为原料和培养基,经粉碎加水成块或饼状,在一定温度下培育而成。酒曲中含有丰富的微生物和培养基成分,如霉菌、细菌、酵母菌、乳酸菌等,霉菌中有曲霉菌、根霉菌、毛霉菌等有益的菌种,“曲为酒之母,曲为酒之骨,曲为酒之魂”。曲是提供酿酒用各种酶的载体。中国是曲蘖的故乡,远在3000多年前,中国人不仅发明了曲蘖,而且运用曲蘖进行酿酒。酿酒质量的高低取决于制曲的工艺水平,历史久远的中国制曲工艺给世界酿酒业带来了极其广阔和深远的影响。

中国制曲的工艺各具传统和特色,即使在酿酒科技高度发展的今天,传统作坊式的制曲工艺仍保持着原先的本色,尤其是对于名酒,传统的制曲工艺奠定了酒的卓越品质。

（4）原料处理

无论是酿造酒,还是蒸馏酒,以及两者的派生酒品,制酒用的主要原料均为糖质原料或淀粉质原料。为了充分利用原料,提高糖化能力和出酒率,并形成特有的酒品风格,酿酒的原料都必须经过一系列特定工艺的处理,主要包括原料的选择配比及其状态的改变等。环境因素的控制也是关键的环节。

糖质原料以水果为主,原料处理主要包括根据成酒的特点选择品种、采摘分类、除去腐烂果品和杂质、破碎果实、榨汁去梗、澄清抗氧、杀菌等。

淀粉质原料以麦芽、米类、薯类、杂粮等为主，采用复式发酵法，先糖化、后发酵或糖化发酵同时进行。原料品种及发酵方式的不同,原料处理的过程和工艺也有差异性。中国广泛使用酒曲酿酒，其原料处理的基本工艺和程序是精碾或粉碎，润料(浸米)，蒸煮(蒸饭)，摊凉(淋水冷却)，翻料，入缸或入窖发酵等。

（5）蒸馏取酒

所谓蒸馏取酒就是通过加热,利用沸点的差异使酒精从原有的酒液中浓缩分离，冷却后获得高酒精含量酒品的工艺。在正常的大气压下,水的沸点是100℃，酒精的沸点是78.3℃,将酒液加热至两种温度之间时,就会产生大量的含酒精的蒸汽，将这种蒸汽收人管道并进行冷凝,就会与原[FS:PAGE]来的科液分开，从而形成高酒精含量的酒品。在蒸馏的过程中，原汁酒液中的酒精被蒸馏出来予以收集，并控制酒精的浓度。原汁酒中的味素也将一起被蒸馏，从而使蒸馏的酒品中带有独特的芳香和口味。蒸馏过程中乙醇蒸汽的逃逸，会严重影响测定结果的准确性。因此蒸馏前必须仔细检查仪器各连接处是否严密。若蒸馏中出现漏气，必须重新测定。

蒸馏时，应先小火加热，待溶液沸腾后再慢慢用大火焰。对于易产生泡沫的酒样加少量消泡剂。但是加过消泡剂的试样蒸馏残液，不能用来作浸出物的测定。

（6）酒的老熟和陈酿

酒是具有生命力的，糖化、发酵、蒸馏等一系列工艺的完成并不能说明酿酒全过程就已终结，新酿制成的酒品并没有完全完成体现酒品风格的物质转化，酒质粗劣淡寡，酒体欠缺丰满，固以新酒必须经过特定环境的窖藏。经过一段时间的贮存后，醇香和美的酒质才最终形成并得以深化。通常将这一新酿制成的酒品窖香贮存的过程称为老熟和陈酿。

（7）勾兑调味

勾兑调味工艺，是将不同种类、陈年和产地的原酒液半成品(白兰地、威士忌等)或选取不同档次的原酒液半成品(中国白酒、黄酒等)按照一定的比例，参照成品酒的酒质标准进行混合、调整和校对的工艺。勾兑调校能不断获得均衡协调、质量稳定、风格传统地道的酒品。

酒品的勾兑调味被视为酿酒的最高工艺，创造出酿酒活动中的一种精神境界。从工艺的角度来看，酿酒原料的种类、质量和配比存在着差异性，酿酒过程中包含着诸多工序，中间发生许多复杂的物理、化学变化，转化产生几十种甚至几百种有机成分，其中有些机理至今还未研究清楚，而勾兑师的工作便是富有技巧地将不同酒质的酒品按照一定的比例进行混合调校，在确保酒品总体风格的前提下，以得到整体均匀一致的市场品种标准。

以大曲酒的酿造为例，其具体流程可用图表解析如下：

┌—→出窖堆放———┐

│↓

│ 大曲发酵酒醅高粱谷糠 水

│ ↓│↓│

│ 打碎│破碎│

│ ↓│↓

│ 碾细│润料清蒸

│ ↓│↓│

│ 过筛│预蒸│

│ ↓│↓│

│ 大曲粉└———→配料←——————┘

│ │↓

│ │装甑┌——→ 酒头（作调味酒等）

│ │↓│

│ │蒸粮、蒸酒———┼——→ 蒸馏酒（入库）

│ │││↓

│ └———————┐↓│贮存

││出甑│↓

││││勾兑

│↓↓↓↓

└————入窖发酵←加曲 ← 加水尾酒包装

↑│↓

一、酿酒用水

酒的酿制与水有密切的联系，古人云：水为酒之血，曲为酒之骨，名酒产地必有名泉。

国酒茅台：用赤河水，“集灵泉于一身，汇秀水而东下”。

湘西酒鬼：用“三眼泉”水，此三泉为“龙”“凤”和“寿”泉。

洋河大曲：用当地“美人泉”水，有人称赞：洋河美人泉，佳酿醉神州。

郎酒：用四川古蔺县的郎泉水，“冬季蒸腾，暖如春水，夏季水寒彻骨，凉爽宜人，遇雨不浊，遇旱不涸。”“明如镜，碧如玉，甘如露”之说。

杜 康 酒：用河南伊县皇得地村的“黑虎泉”和“白虎泉”。曹操赞称：何以解忧，惟有杜康。

二、酒窖： 窖址的选择，窖区走向，空间高度，透气性能，窖泥的培养等等都具有科学性，俗话说：窖泥培养人人都知，也人人都不知，其中奥妙无穷。

三、酒曲： 酿酒与酒曲的选择有密切关系，酿制不同的酒，选择酒曲的种类也不同。

（1）、大曲：用含淀粉质的粮食为培养基，微生物为霉菌和醇母菌混合。

特点：大曲酒味醇厚，曲香浓郁，但生产周期长，用曲量多，出酒率低和耗粮高。

（2）、小曲：用大米或米糠为培养基，微生物有霉菌和醇母。

特点：小曲酒口味较醇厚，香气较清淡，出酒率高，耗粮低。

（3）、红曲：用大米、籼米、糯米为培养基，微生物是红曲霉菌，同时产生红色素，兼有糖化和发醇作用。

特点：酒色鲜艳，香气浓郁，出酒率高。

（4）、变曲：用麦作培养基，有糖化和生香作用。用于黄酒生产。

特点：产黄酒，味鲜较淡。

（5）、麸曲：用麸皮作培养基，糖化剂，原料价廉，但香味不足，糖化功能

└—

——————————————┘成品酒

生产工艺

①原料配比及处理

甘薯或碎米、高粱等100kg，细谷糠80kg，麸皮120kg，水400kg，麸皮50kg，砻糠50kg，醋酸菌种子40kg，食盐3.75~7.5kg(夏多冬少)。

将薯干或碎米等粉碎，加麸皮和细谷糠拌合，加水润料后以常压蒸煮1h或在0.15MPa压力下蒸煮40min，出锅冷却至30~40℃。

②发酵

原料冷却后，拌入麸曲和酒母，并适当补水，使醅料水分达60%~66%。入缸品温以24~28℃为宜，室温在25~28℃左右。入缸第二天后，品温升至38~40℃时，应进行第一次倒缸翻醅，然后盖严维持醅温30~34℃进行糖化和酒精发酵。入缸后5~7d酒精发酵基本结束，醅中可含酒精7%~8%，此时拌入砻糠和醋酸菌种子，同时倒缸翻醅，此后每天翻醅一次，温度维持37~39℃。约经12d醋酸发酵，醅温开始下降，醋酸含量达7.0%~7.5%时，醋酸发酵基本结束。此时应在醅料表面加食盐。一般每缸醋醅夏季加盐3kg，冬季加盐1.5kg。拌匀后再放两天，再经2d后醋醅成熟即可淋醋。

③淋醋

淋醋工艺采用三套循环法。先用二醋浸泡成熟醋醅20~24h，淋出来的是头醋，剩下的头渣用三醋浸泡，淋出来的是二醋，缸内的二渣再用清水浸泡，淋出三醋。如以头淋醋套头淋醋为老醋；二淋醋套二淋醋3次为双醋，较一般单淋醋质量为佳。

④陈酿及熏醋

陈酿是醋酸发酵后为改善食醋风味进行的储存、后熟过程。陈酿有两种方法，一种是醋醅陈酿，即将成熟醋醅压实盖严，封存数月后直接淋醋。或用此法贮存醋醅，待销售旺季淋醋出厂。另一种是醋液陈酿，即在醋醅成熟后就淋醋，然后将醋液贮入缸或罐中，封存1~2个月，可得到香味醇厚、色泽鲜艳的陈醋。有时为了提高产品质量，改善风味，则将部分醋醅用文火加热至70~80℃，24h后再淋醋，此过程称熏醋。

⑤配兑和灭菌

陈酿醋或新淋出的头醋都还是半成品，头醋进入澄清池沉淀，调整其浓度、成分、使其符合质量标准。除现销产品及高档醋外，一般要加入0.1%苯甲酸钠防腐剂后进行包装。陈醋或新淋的醋液应于85~90℃维持50min杀菌，但灭菌后应迅速降温后方可出厂。一般一级食醋的含酸量5.0%，二级食醋含酸量3.5%。