组织切片技术

第一篇：组织切片技术

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 组织切片技术注意事项

程序步骤

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蜡切片：流水冲洗组织块>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蜡2h>>包埋

冰冻切片：固定后的组织>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的组织>>转入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>贴片>>干燥（37度过夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸馏水3min>>苏木精染色30s—5min>>自来水涮洗>>蒸馏水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊红染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性树胶封片

6、免疫组化（ABC法）

（1）干燥后的石蜡或冰冻切片（冰冻切片需要缓慢复温）脱蜡至水；

（2）双氧水（1%浓度左右）封闭内源性过氧化物酶；

（3）PBS洗涤3×5min；

（4）5%BSA封闭非特异性结合位点，不洗；

（5）滴加适当稀释度的一抗；4度孵育过夜或37度2h；（6）同上洗涤；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗涤；滴加ABC复合物，37度1h；（8）洗涤5遍，每次5min；

（9）配制显色液（DAB显色试剂盒），显微镜下观察显色；（10）切片浸泡于蒸馏水中终止显色；（11）苏木精复染，脱水，封片。

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注意事项

取材

1.组织越新鲜越好，最好于动物处死后10~20min完成取材，时间过久后组织自溶和腐败会影响组织形态。

2.取材组织块不宜过大，一般为5nm以下，2~3nm为宜。如果试验要求采取大块组织，最好采样前注射固定液预固定或采取灌流固定（比如取脑时需灌流固定）。

3.取材使动作轻柔，避免用力夹、捏和拉扯组织，尽可能保持组织原有形态。操作时可用镊子夹取组织的一个边角，避免主要组织损伤。

4.如果是大批量取材，取材时没有时间对组织块大小进行修正，可将组织（可稍大，但不宜过大）先放在固定液中固定，2~4h后进行修块，即用锋利的刀片（刮胡刀片）把组织切至适宜大小。注意不能用剪刀等进行钝性分离。5.如果对不同处理或不同动物的组织进行比较研究，应对所有动物在同一解剖学位置取材（比如十二指肠距胃3cm处，或空肠距胃10cm处）。

6.取材时注意组织的不同断面，可将组织的一面用刀片切平作为标示，以便包埋和切片时选取的断面正确（比如肌肉组织，应区分好横断面和纵断面）。7.一般情况下宰杀动物应放血干净，取材时除去组织周围的附属物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的组织立即固定。冰冻切片组织可先固定后冻存，也可直接冻存，直接冻存一般采取液氮中速冻，然后转入-20度保存，冻存组织应避免反复冻融，且尽快进行切片或用OCT包埋（包埋后可放置较长时间）。未包埋的组织在-20度长期保存的组织会逐渐脱水（比如肌肉），影响形态学观察。

9.理论上免疫组化的组织采取冰冻切片，一般运用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋冻存。但对于抗原表达量大且较易检测的免疫组化，可以采取石蜡切片，但固定时间不能过长，控制在1周以内，长时间固定会引起抗原表位的醛基化和抗原表位构象变化，导致免疫组化检测灵敏度降低。

固定与包埋

1.选择合适的固定液，原则是在良好固定组织并保持形态的前提下尽可能的减小对组织的影响。常用固定液为福尔马林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后两者最为常用，效果也较好。

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鲜配制，新配的固定液固定效果较好。3.固定液体积理论上应为组织体积的20倍以上。

4.一般组织理论固定时间为4~24h，即以固定液完全渗透进入组织的最短时间为宜，实际操作中可延长至数天，但一般控制在1周以内。

5.如果是冰冻切片，固定后的组织最好及时用OCT包埋，能更好的维持组织形态，包埋后的组织可于-20度保存数月。固定后的组织可用蔗糖溶液脱水，方法为直接将组织置于30%蔗糖溶液中，每天换新鲜蔗糖溶液，2-3天组织在蔗糖中沉底即可。一般来说，先固定，然后脱水，再用OCT包埋效果比较理想。6.冰冻切片可以采取后固定的方法。即采得的组织经液氮速冻后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰冻切片后用丙酮等对切片上的组织进行固定。但丙酮固定较为强烈，容易发生掉片。

7.石蜡切片时，固定后的组织包埋前一般对组织进行洗涤，通常用自来水冲洗，洗掉组织中的固定液，因为残留在组织中的固定液可能对染色产生影响。洗涤为可选步骤，我们实验室通常不洗涤，将固定后的组织直接包埋，并不影响HE染色效果。

8.二甲苯透明时间是影响包埋效果的最关键因素，需根据组织种类、组织大小、室温以及二甲苯的新旧程度综合考量，必要的时候需要设置时间梯度进行摸索。此外，组织是否脱水完全、是否浸蜡完全也直接影响包埋效果，原则上在能够完全脱水和浸蜡的前提下，组织在各溶剂中的浸泡时间越短越好。

切片

1.切片成功与否很大程度上取决于组织固定和包埋的好坏。

2.切片厚度：HE等组织学染色一般4~5微米（4微米差不多是石蜡切片的极限），如果切片困难，可适当增加切片厚度（20微米以内越厚越好切），但切片厚度的增加会使得细胞层数增多，影响观察和美观。免疫组化中石蜡切片一般切片5~10微米，冰冻切片大约8~14微米，特别是在检测表达量较少的抗原时，较厚的切片可以增加阳性物质的出现概率。

3.较好的石蜡切片呈均匀连续状，没有空洞和破损，组织完整不碎裂。4.切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。刀片应从一段开始使用，发现刀痕时逐渐移动，以最大限度使用刀片。

5.冰冻切片的主要影响因素有：切片机箱体温度（一般为-25度左右），防卷器位置（太往前切不动，太往后起不到防卷效果）。

6.对免疫组化切片而言，需对玻片进行包被（一般为使其带正电荷，组织带负

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 电荷，通过静电吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太浅起不到粘附效果，包被太深会导致免疫组化非特异性染色。

展片和贴片（捞片）：

1.烧杯中装蒸馏水，置于水浴锅中，温度一般40~45度，温度太低片子展不开，温度太高石蜡会融化。

2.冰冻切片不需要展片，直接将玻片轻靠在组织上，组织便会自动吸附到玻片上。

3.捞片时选取完全展平的片子捞起，宁缺毋滥。一张玻片上可以贴多个组织，最后选染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被过的玻片可重复使用，包被过的玻片贴片后组织很难掉下，不可重复使用。

干燥：

1.干燥可以让组织贴的更结实。石蜡切片37度干燥过夜，或者45~60度干燥数小时。冰冻切片室温晾干（夏天一般5~10min），但不可凉太干，太干也容易掉片，判定标准为组织表面没有明显的液体为宜，如果组织变白说明干燥时间过长。

2.干燥后的石蜡切片可放切片盒中室温保存，如果天气炎热可以放置4度保存；冰冻切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期内试验可以放4度保存。

染色（以HE染色为例）：

1.液体置换要彻底，特别是脱蜡和脱水步骤。

2.伊红一般用醇溶性配方，苏木精配方有很多种，如果用氧化汞方法配制使用前要过滤，因为液体表面容易聚集一层金属离子薄膜，对染色产生影响。3.新鲜配制的伊红染色时间1秒即可，存放时间长的染液可以适当增加染色时间。

4.封片时中性树胶的量要适度。根据组织的大小选择大小合适的盖玻片，盖玻片以能覆盖住组织为前提，越小越好，太大的盖玻片溶液不平整，显微镜观察时组织可能不在一个平面，需要反复调整焦距。

5.苏木精和伊红染色时，最好摸索染色时间，以寻求最合适和漂亮的颜色搭配，不同的组织染色能力有所差异，比如淋巴组织内淋巴细胞较多，细胞核比较大，染出来可能蓝色居多，肌肉组织中肌显微和细胞质比例高，染出来红色

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6.总体原则是染色宁愿偏浅不要偏深，偏深的染色难以判别细胞形态和结构。

免疫组化注意事项：

1.免疫组化一般以冰冻切片为主，但石蜡切片也可以做免疫组化。

2.冰冻切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰冻包埋）。3.免疫组化步骤繁琐，时间较长，因此用包被过的切片来防止掉片。常用的包埋剂有APES，多聚赖氨酸和明胶等。包被过程相对简单，可购公司的商品包被试剂盒，按照说明书操作。

4.石蜡切片的免疫组化有时需要抗原修复。原因：固定液会对组织的抗原性产生影响，示抗原表位发生构象变化，可以通过化学处理和热处理来还原组织的抗原性。常用的修复液为枸橼酸钠缓冲液，一般采取热修复，即把切片放置在缓冲液中然后加热至沸腾。

5.免疫组化切片厚度一般为8~12微米。6.选择合适的抗体（单抗、多抗）。

7.预实验确定合适的H2O2、封闭液和抗体作用浓度和时间。8.选用包被过的玻片，动作轻柔，防止掉片。9.设置阳性、阴性和空白对照。

10.显微镜下控制显色，放置显色过浅或过深。

11.复染时苏木精浓度可稀释，时间缩短，避免染色过深。

12.遇到问题逐项排除，寻找原因。详细的问题解决和相关技术贴可参照丁香园论坛或生物秀论坛，搜素“免疫组化”可以找到相关资料。

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溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，边加入边加热搅拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促进粉末溶解，完全溶解后HCl调PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 饱和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混匀。

染液

伊红染液：1%醇溶性伊红配方为1g伊红加入到100ml 80%酒精中，溶解。

苏木精染液：

1.哈里新（Harris）苏木紫液：甲液：苏木紫Ig，无水乙醇10ml。乙液：硫酸铝钾（或铵）20g，蒸馏水200ml，加温溶解。甲、乙二液分别溶解后混合，加热煮佛，沸后去火，待溶液不翻腾时即加入氧化汞0.5g（此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢出）。然后染液迅速冷却，冷却后过滤，即可位应用。用时每100ml加冰醋酸4ml；

2.迈尔（Mayer）苏木紫液：将苏木柴0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜，即可应用。染色时间约10~20min；

3.欧立区（Ehrlich）苏木紫：将苏木紫2g溶于无水乙醇100ml中；将硫酸铝钾15g溶于蒸馏水100ml中，加入甘油100ml，将二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混匀后，盛于无色小口瓶内，暴露于日光下，使其自然成熟，约需3个月。染色时间约5~20min。此液贮存愈久，染色力愈强。若在其中加入碘酸钠300mg，使人工成熟，配成后即可应用；

4.卡拉兹（Carrazzi）苏木紫：将苏木紫0.5g溶解于甘油100ml中，将硫酸铝钾25g溶解于蒸馏水350ml中溶解后将二液慢慢混合，并充分摇匀。将碘化钾0.1g放于蒸馏水50ml中，加微温溶解，然后加入苏木紫液中，充分摇匀，翌日可用。

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免疫组化

0.3%~1%双氧水：

商品化30%双氧水溶甲醇稀释到适当浓度。

1~5%BSA（羊血清、脱脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混匀。

第二篇：组织切片技术

组织切片技术

姓名：许莎

班级：生技1学号：12772018

组织切片技术是研究生物组织或细胞形态和结构的重要技术，对于促进细胞生物学和遗传学等研究的发展起着重要作用。最早的制片技术是徒手切片技术，以后发展了利用石蜡进行包埋和切片的制片技术，即石蜡切片技术，该技术由于成本低，操作简单，目前仍在应用，该技术被越来越多的研究工作者应用于发育学、植物细胞学、胚胎学、解剖学等研究领域。

1组织切片技术原理

1.1原理

组织切片技术是研究组织形态学最常用的一项基本技术，在制作胚胎或组织切片时，由于细胞或组织是柔软的或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片很困难。为了能清晰地观察到组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬然后利用切片机将组织切成薄片。根据所用支持剂的种类不同，主要分为石蜡切片、冰冻切片、振动切片、火棉胶切片、塑料切片、碳蜡切片等。

1.2分类

1.2.1石蜡切片

该技术是最重要、最常用的组织切片技术之一，起始于18世纪。此法是用石蜡作为包埋剂，将材料经过固定、脱水、透明后包埋在石蜡中，然后连同石蜡用切片机一同进行切片。石蜡切片的主要优点是不仅可以把材料制成薄的切片，而且还能制成连续切片，这是其他制片技术难以做到的。它的缺点是操作步骤比较复杂，而且材料在脱水、透明过程中会收缩、[1]变硬、变脆，以致不易切片。1.2.2冰冻切片

冰冻切片是利用干冰或液氮等速冻剂使组织迅速冷冻硬化，将组织在冷冻状态下直接用切片机切片的一项技术。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。由于此法不需要经过各级乙醇的脱水、二甲苯的透明和浸蜡等步骤，因而较适合子脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。此种切片的优点是能较好的保存组织的RNA稳定性、较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，缺点是需要较高的设备要求;切片较厚，导致组织结构显示欠佳;通常不能进行连续切片。其主要操作技术和方法与石蜡切片过程和类似。1.2.3振动切片

是用振动切片机把新鲜的组织切成厚20-100pm的切片。此类切片的优缺点类似于冰冻切片。通常在切片后进行免疫染色然后再进行电镜切片,以此来弥补结构显示不清的不足。振动切片机主要用于新鲜或经过固定的动、植物标本的制片，切片时组织标本不需冰冻或包埋。因此.样品片既避免了冰晶破坏，又能保持其活性和细胞良好形态为免疫细胞化学研究以及脊髓和脑薄片的神经生物学研究提供了良好条件。振动式切片机可以对不同的材料进行切片，在应用范围上补充了使用传统切片机的不足，是当代电镜、解剖、组胚、生理、医院化工等实验系统最理想的快速制样切片仪器。1.2.4火棉胶切片

是以火棉胶为包埋剂浸入包埋组织。优点是可以切较硬的组织，缺点是操作比较麻烦费时,切片较厚,不能连续切片。1.2.5塑料切片

用干硬度大的组织标本的包埋。由于塑料包埋组织细胞收缩程度小，切片薄，有利于组织细胞细微结构的观察，加之新型塑料包埋剂的出现和聚合方法的改进使塑料包埋技术得到了更为广泛的应用。塑料包埋使用的包埋剂是各种树脂，未聚合的树脂为勤稠的液体.通过标本组织块的没润，树脂可渗透到组织间隙中。自发或在催化剂和加速剂的作用下，发生分子回的连接形成支架，支撑组织细胞结构，聚合完成后形成固体硬块。其优点是可以切出薄至0.5-2nm的切片，适用于同时作光镜和电镜检测。缺点是处理程序繁多,抗原活性易丢失。1.2.6碳蜡切片

以碳蜡为包埋剂，优点是组织固定水洗后不需脱水透明,可以直接浸碳蜡包埋,切片方法于石蜡切片相同，缺点是夏季温度较高时切片困难。

1.3制备方法

以石蜡切片为例，介绍切片标本的制备方法。

1.取材：根据科研和教学目的选择新鲜材料，然后进行适当的切取、分割。样品块要尽量小，以便于下一步固定。

2.固定：将选取的新鲜材料立即投人到固定液中，迅速杀死细胞以保持组织及细胞的原有结构。一般固定液的最少用量为所固定材料总体积的20倍。固定液的选择视材料的性质及制片的目的而定，一般要求尽快杀死并固定细胞和组织。石蜡切片常用的固定液有FAA固定液、卡诺固定液，此外，还有多聚甲醛、戊二醛、乙醇、乙酸等。

3.洗涤：材料固定后，用洗涤剂将材料中的固定液洗掉，以便进行切片的染色或制片，常用的洗涤剂有水或乙醇。

4.脱水：因为固定和洗涤后的材料含有大量的水分，而水和透明剂、包埋剂(石蜡)不相溶，所以必须经过脱水逐步、彻底除去材料中的水分，才能进行透明和包埋。常用的脱水剂是乙醇，另外还有乙醇、正丁醇、丙酮、环氧丙烷等。脱水过程应由低浓度到高浓度逐级进行，不可太快。否则会使细胞收缩或材料损坏。

5.透明：透明是脱水与浸蜡、脱水与封藏之间的桥梁。材料经脱水后，组织内部已没有水分，但脱水剂不能与石蜡相溶，致使石蜡不能进人细胞与组织。因此，需要一种既能与脱水剂混合又能与包埋刘石蜡相混合的溶剂来处理。透明在制片中很重要。如果组织不透明，表明脱水不彻底，必须重新返工，但返工效果往往不好，常用的透明剂有二甲苯、氯仿、冬青油等。

6.浸蜡：浸蜡是将石蜡包埋剂慢慢溶于浸有材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡逐渐渗人到材料的组织细胞中，最后使透明剂被石蜡取代。进人组织细胞中的石蜡，在熔点以下很快凝固成固体，凝固后的石蜡起支撑作用，使切片后的细胞组织固定在原位。

7.包埋:将透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡块。操作过程：包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。

8.切片:已包埋好的石蜡材料，在进行切片之前需先进行修快、固着。修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在干净黑纸上。切片操作时应注意随时关好停刀轧，不能对着蜡带讲话以免吹散蜡带;切片完毕，将刀取下擦净。涂上润滑油，放人盒内保存。9.粘片、展片：通过粘贴剂把合格蜡带贴在载玻片上，在贴的同时，借助水的张力使蜡带完全伸展、平贴在载玻片上，粘片和展片是在载玻片上同时完成的步骤。常用的粘贴剂有蛋白粘贴剂和明胶甘油粘贴剂两种

10.脱蜡、透明：在染色之前，需要用脱蜡剂溶去组织和细胞的石蜡，进一步清洗脱掉的石蜡，使细胞、组织透明清晰，用于脱蜡和透明的试剂是二甲苯。

11.染色：为了使植物组织和细胞各部分显像清楚，必须进行染色。运用不同的染色方法和选用不同的染色剂，使组织或细胞某一部分染上颜色，另一部分不染上颜色成为背景;或将不同部分染成不同的颜色，可使组织细胞在光学显微镜中显像清晰，便于观察。

12封片：切片染色后用胶类物质将其封固，以利于长期保存。

2切片技术的应用

2.1石蜡切片技术的应用

石蜡切片虽然是经典的方法但随着新的仪器和研究技术的不断问世，出现了与其他新的[2]技术方法相结合，从而开辟了许多新领域，增加了许多新的研究、观察内容，使组织学的观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察，定量计测，使细胞组织的形态、功能及代谢三结合，从而达到定性可靠、定位准确及定量可测，最终阐述了生命活动的最基本规律。

2.1.1三维重建

重建技术在阐明生物体组织结构与生理功能之间的关系以及在形态学、比较解剖学、细胞化学定位等领域的研究中有着重要的意义。早在1958年，Sjostrand就论证了这种方法的[3]可行性和可靠性，是最早报道利用组织切片进行骨二维重建的学者，随后LUCZ也用同样的方法进行了尝试，但是，由于当时的切片技术和计算机技术都较落后，故效果不如人意。4]直到2000年Mason[再次用同样的方法进行了三维重建。随着计算机技术的不断发展，这项技术在国际上正在继续进行广泛深入的研究，在国内也引起了广泛的研究兴趣，例如对血

[5]管大鼠松质骨、中国虚拟人行切片后三维重建，同时也对方法进行了很多研究。特别是目前正在研究的“中国虚拟人1号”，表明我国是继美、韩之后世界上第三个用人体切片合成虚拟人的国家。2.1.2免疫组化

组织制片技术与免疫学技术结合构成免疫组织化学技术，利用抗原与抗体的特异性结合原理，检测组织切片中细胞组织的多肽及蛋白质等大分子物质的定性和定位观察研究。冰冻切片手续简便，制片过程中抗原活性丢失少，但组织细胞形态较差;石蜡切片步骤繁多。一般石蜡包埋的组织切片用于检测胞浆或核内的抗原，不宜做表面抗原染色，乙醇、丙酮等固定剂对抗原破坏较轻，但结构保存较差。2.1.3原位杂交

随着分子生物学的发展，在Southern blot, Northern blot等分子杂交技术基础上建立了原位杂交技术。原位杂交技术具有高度的准确性和敏感性，它能在细胞甚至亚细胞的水平上定位特异性核酸分子序列。因而，这一技术是目前研究分子细胞生物学、发育学等方面的重要[6][7]手段。例如，在心肌石蜡切片中检测克山病(KSD)RNA ,在乳腺癌石蜡切片中检测ER mRNA, [8][9][10] PR mRNA，在骨组织石蜡切片中检测整合素R 1-mRNA，在肝组织中检测丙型肝炎病毒RNA2.1.4原位PCR

原位PCR技术是直接在细胞或组织标本上原位扩增目的DNA或RNA片断，并在原位检测其扩增产物的技术，它兼有PCR的敏感性和原位杂交的特异性。2.1.5组织芯片

组织芯片是将成百上千的小组织整齐排列在某一载件上从而组成的微缩组织切片。该技术利用并行化处理原则、微量化检测的优点，结合分子生物学和形态学原理，具有经济、简便快捷、信息量大的特点，能够在DNA,RNA和蛋白质水平检测基因表达。2.1.6检测凋亡

检测凋亡的方法很多，形态学观察是判断细胞凋亡的基本方法。可用于体内外细胞凋亡的研究，既可用于组织切片的原位检测，也可对培养细胞通过细胞涂片或切片的检测，特别是在常规石蜡组织切片中，可对凋亡细胞进行原位检测，监测某一或某些处理因素引起体内组织细胞凋亡的动态变化。

2.1.7石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析

石蜡包理组织切片与流式细胞术结合使用来测量DNA含量及倍体分析。由于制备样品技术的原因，过去许多流式分析资料仅限于采用鲜组织标本，Hedley等1983年首先报导了FCM分析石蜡包埋组织切片制备分散细胞悬液技术来进行DNA含量的检测，从组织切片中能获得足够数量的单个细胞，且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似，目前国内也在逐步开展这方面的研究。

2.2塑料切片技术的应用

2.2.1塑料切片技术在水稻生殖发育研究中的应用

利用塑料切片技术对水稻花粉、胚囊发育、受精和胚胎发生、胚乳发育以及突变体等进行深人研究，例如，以7022LR为包埋剂，塑料切片技术观察水稻IR36的胚胎发育过程。

参考文献：

[1] 梁化印，郭瑞峪.杜双存 等塑料切片技术介绍[1]临床与实脸病理学杂志.2004.20(5).[2] 刘能保，王西明.现代实用组织学与组织化学技术[M1湖北:湖北科学技术出版壮.[3] 王伯法，李玉松.黄高升等病理学技术 北京:人昆卫生出版社,2000

[4] 北京未来新世纪教育科学研究所主编,生物知识探讨,远方出版社,2006.01,第10页 [5] 李希平,夏寅,韩德民,等.基于虚拟中国人数据集的鼻部及颗骨解剖结构三维重建.中 国临床解剖学杂志,2004,22(4)[6] Delellis RA，etal.New teehoique singene Produetanalysis.ArehPatholLabMed 1987 [7] 任立群,赵志涛,孙波,等.石蜡包埋组织切片原位核酸杂交研究.白求恩医科大学学报, 2001 27(3)[8] 陆良勇,黄伟达,刘尚廉,等.应用RNA原位核酸杂交检测乳腺癌石蜡切片中ER rnRNA、PR1llRNA表达.中国组织化学与细胞化学杂志,2002,3,11(1):92, 97 [9] 刘少华,程刚,李声伟,等.石蜡包埋骨组织切片核酸原位杂交研究.临床口腔医学杂志, 2002,10,18(5)[10] 王春杰,胡沛臻,王文亮,等.原位杂交检测石蜡包埋组织中丙型肝炎病毒RNA.中国组 织化学与细胞化学杂志,1995,9,4(3)

第三篇：病理组织切片制作技术

病理组织切片制作技术

病理组织切片常用的制作方法有三种。即石蜡切片法，冰冻切片法和火棉胶切片法。以石蜡切片法为代表，切片的基本制作过程是：

组织取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→组织包埋→组织切片→展片附贴→切片脱蜡→染色→脱水→染片透明→封固。

以上基本过程是互相联系的，任何一环节出现问题，都将使整个切片制作归于失败。因此应细致、耐心、认真负责，并事先做好计划安排。

一、取材

采取病料，要刀剪锐利，剪切时不可挤压，扯拉病料，以防人为损伤。切取的工具要清洁。采取病料越新鲜越好，一般不超过死后24小时。应选择病变部与可疑病变部切取，切取时要由表及里，有浅入深并包括周围正常组织一部分。特殊病料应根据器官的结构特点切取。管状，囊状和皮肤组织应注意垂直切取（横切）。带有薄膜的组织，要防止切时薄膜分离和脱落。

切取组织块大小，以1.5×1.5×0.3厘米为宜，最厚不宜超过0.5厘米。组织块病变一面应平整光滑，另一面可不平整，以便包埋时辨认。切取后，放入事先准备好的装有固定液的磨口玻璃广口瓶中，并做好标记。

二、固定

固定的目的是迅速将组织细胞杀死，使细胞中的蛋白质，糖，脂肪等凝固，从而保持与活组织相似的结构状态。材料取下后，应迅速固定。固定液数量应为病理组织块的5到20倍。由于一般把组织块浸入固定液后数小时，固定液渗入组织液的深度只达2到3厘米。因此，可以放置冰箱内固定，使组织内酶失去作用，细菌也能停止滋生。

最常用的固定液是10%的福尔马林溶液：使用时，用40%的甲醛饱和水溶液10毫升，加水90毫升配成。

三、冲洗

固定后的组织块，应将固定液洗去。一般均用流水（自来水）冲洗12到24小时左右。及时冲洗尚有停止固定的作用，防止固定过度，有利于制片染色。

冲洗时如不方便用流水冲洗，也可用较大容器盛装水浸洗，每隔相当时间换水一次。整个浸洗时间比流水冲洗应稍长一些。酒精固定的组织材料不需冲洗。

四、脱水

经过固定的组织，冲洗后要进行脱水。脱水的目的在于将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，为石蜡等其他包埋剂浸入组织创造条件。常用的脱水剂为酒精。由于酒精可以任何比例与水结合，对组织穿透力强，又能使组织硬化，因而不能将组织从水中直接移入浓度高的酒精中，应从低浓度逐渐到高浓度。脱水必须充分，否则给浸蜡造成困难。

除用酒精作脱水剂外，还可以用正丁醇（N—Butyla alcohol）。正丁醇微溶于水，能与各种浓度酒精混合，也能直接溶解石蜡。故组织经正丁醇脱水后，不须经二甲苯透明。用正丁醇作脱水剂，组织块收缩减低，也不会过硬，故比酒精优越。

五、透明

透明的目的是将组织内的酒精用矿物油或植物油置换出来，并溶解石蜡，帮助石蜡浸透组织。由于经过透明剂处理的组织块用肉眼观察呈透明状，故称这一过程为透明。常用的透明剂为二甲苯（Xylol），因其穿透力较强，因而组织在二甲苯中停留时间不宜过长，一般透明时间在30分钟左右即可。

六、浸蜡 浸蜡是指组织经过透明作用以后，放入溶化的石蜡中浸渗，使石蜡浸入组织块中，冷却后，才能进行切片。

通常选择熔点在52～56℃之间的石蜡，并视切片时环境的气温而选择。室温高则选用熔点稍高的石蜡，反之，则选用熔点较低的石蜡，这样可防止切片时石蜡太软或易碎裂。浸蜡的过程是：

二甲苯石蜡混合液（1：1）

1小时 二甲苯石蜡混合液（1：2）

1小时

石蜡（1）

1小时30分 石蜡（2）

1小时30分

上述过程可在56℃～58℃恒温箱中进行，含二甲苯的混合液可用磨口小瓶盛装。

七、包埋

包埋就是将已浸渗好的组织包埋于浸渗剂中。根据需要，包埋的方法常有石蜡包埋法和火棉胶包埋法。石蜡包埋法：

（1）先将熔化的石蜡倒入包埋框，用加热的镊子将欲包埋的组织块在蜡液内放置好。注意各组织块之间的距离和每个组织块的位置和方向。

（2）迅速第二次往平皿内倾倒蜡液，淹没组织块。待蜡液出现凝固层后，即轻轻放入冷水盆中或冰箱中使其凝固。石蜡完全凝固后，倒出冷缩的蜡块片，用加热的外科刀，按组织块位置修整蜡片待用。

对于实验动物（狗和兔等）组织，一般的脱水透明和浸蜡时间如下： 处理步骤处理时间（min）处理步骤处理时间（min）① 75%酒精长短不定二甲苯Ⅰ、Ⅱ⑥ 30 ② 85%酒精 120－300 二甲苯Ⅲ⑦ 60

③ 95%酒精Ⅰ和Ⅱ 120－300 56－58℃石蜡⑧ 30 ④无水酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 30 56－58℃石蜡⑨ 60－120 ⑤无水酒精Ⅲ 60－120 56－58℃石蜡⑩ 120－180

注：摘自病理学技术，人民卫生出版社，王伯，李玉松，黄高，张远强主编。

八、组织切片

不同的切片制备方法，其切片方法也有较大差别，组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡包埋半薄切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀仪器等。以下分别加以叙述。

（一）石蜡切片法

组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。为现在病理诊断常用的制作切片的方法。在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为修块）但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。一般切4－6μm的切片，特殊情况可切1－2μm。要观察病变的连续性，可制作连续切片。除此之外，石蜡包埋的组织便于长期保存，因此石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用，最普遍的一种方法。

1．切片前的准备

（1）固定后的标本经脱水、透明、浸蜡和包埋后，制成蜡块。高质量的蜡块和锋利的切片刀是保证切片质量的关键环节。检查切片刀是否锋利，简便的方法是用头发在刀锋上碰一下，如一碰即断，说明刀锋锋利。用显微镜观察可确定刀口是否平整，有无缺口。

（2）准备充足的经过处理的清洁载玻片和恒温烤片装置，大中号优质狼毫毛笔和铅笔（用于在载玻片的粗糙端写号），如用普通载玻片，可用碳素墨水和蛋白甘油按3：1体积混合后书写。

2．切片制作过程

（1）将预先修好的组织块先在冰箱中冷却，而后装在切片机固定装置上。将切片刀装在刀架上，刀刃与蜡块表面呈5℃夹角。将蜡块固定，调整蜡块与刀至合适位置，并移动刀架或蜡块固定装置，使蜡块与刀刃接触。

（2）切片多使用轮转式切片机，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，但小标本注意不要修得太多，以免无法切出满意的用于诊断的切片，标本应注意切全。切出蜡片后，用毛笔轻轻地托起，尔后用眼科镊夹起，正面向上放入展片箱（展片温度根据作用的石蜡熔点进行调整，一般低于蜡熔点10～12℃），待切片展平后，即可进行分片和捞片。切片经30%的酒精初展后，再用载玻片捞起放入展片箱更易展平。为减少切片刀与组织块在切片过程中产生的热量，使石蜡保持合适的硬度，切片时可经常用冰块冷却切片刀和组织块，尤其在夏季高温季节更为必要。（3）轮转式切片机切取组织，是由下向上切，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端（如皮肤组织，应将表皮部分向上。而胃肠等组织，应将浆膜面朝上）。

（4）捞片时注意位置，要留出贴标签的空间，并注意整齐美观。捞起切片后，立即写上编号。

（5）切片捞起后，在空气中略微干燥后即可烤片。一般在60℃左右烤箱内烤30min即可，也可用烤片器烤片。血凝块和皮肤组织应及时烤片。但对脑组织待完全晾干后，才能进行烤片。否则，可能产生气泡影响染色。

3．注意事项

（1）组织的取材和固定 取材时，组织块的大小厚薄应适当，过大、过厚的组织，固定液不易渗透，易引起固定不良。过小、过薄的组织，在固定和脱水的过程中易变硬或产生弯曲扭转，同样影响切片质量。陈旧、腐败和干枯的组织不宜制作切片。用陈腐组织制成的切片，往往核浆共染，染色模糊，组织结构不清，无法进行观察。固定不及时和固定不当的组织，染色时常出现核质着色较浅，轮廓不清，出现不同程度的片状发白区。组织固定时，固定液的量应充足，至少要在4倍以上，同时注意组织块不要与容器粘连。至于组织固定的时间，根据具体情况加以掌握。有关固定时应注意的事项，可参见有关章节。（2）组织脱水、透明和浸蜡组织脱水用的各级酒精，应保证相应浓度，以便组织脱水彻底。但无水酒精中，组织块放置时间不宜过长，否则组织过硬，切片困难。遇到此情况，可将组织浸在香柏油中软化，用二甲苯洗去香柏油后，再重新浸蜡和包埋。脱水酒精，尤其是无水酒精中混有水分，则组织脱水不干净。经二甲苯时，组织也无法透明，呈现浑浊。此时应将组织在新的酒精中重新脱水。二甲苯透明也应充分，否则不利于石蜡的浸透。但组织在二甲苯内的时间应严格掌握，时间过长组织易碎，也无法切出好的切片。时间不足，则石蜡不易浸透。浸蜡的温度也不宜过高，时间长短也应加以控制。总之，组织脱水、透明和浸蜡对于切片质量都有一定影响，组织脱水、透明和浸蜡过度，组织块变硬变脆，因此对于小块组织或小动物标本应注意时间。但若时间不够，组织块硬化不够，也不利于切片和染色，因此，应注意各具体环节的操作，并注意保证各种试剂的质量。

（3）切片切片刀要求锋利且无缺口，切片自行卷起多由切片刀不锋利所致，切片刀有缺口时，易造成切片断裂破碎和不完整。骨组织切片时，用重型刀较好。全钢刀或单面钨刀也适合石蜡或火棉胶包埋的骨组织。

（4）切片刀和切片机切片刀放置的倾角以20－30℃为好。倾角过大切片上卷，不能连在一起。过小则切片皱起。应注意维护切片机，防止因螺丝松动产生震动，切片时会造成切片厚薄不均。遇硬化过度的肝、脑、脾等组织时，应轻轻切削，防止由于震动产生空洞现象。（5）特殊要求切片的制作 石蜡切片虽然有很多优点，但制片过程中要经过酒精和二甲苯等有机溶剂处理，因此很易造成组织内抗原性的丧失，在用于免疫组织化学染色时影响结果的准确性。因而有人采用冷冻干燥包埋法，即将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机在真空和低温条件下除去组织内的水分，然后用甲醛蒸汽固定干燥后的组织，而后在进行浸蜡、包埋和切片。此法可保存组织内的可溶性物质，防止蛋白质变性和酶的失活，减少抗原的丢失。用于免疫荧光标记、免疫酶标记和放射自显影。

（二）冰冻切片法

冰冻切片在组织学技术中应用广泛，对临床快速病理诊断尤其具有重要意义。另外，因冰冻切片制作时不经各级酒精的脱水，二甲苯的透明等过程，因此对脂肪和类脂的保存较好，在进行脂肪染色和神经组织髓鞘的染色常用。冰冻切片多用于新鲜组织，甲醛固定的组织和低温冰箱冷藏的组织块等。组织不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后进行切片。

1．恒冷箱切片 将组织块在恒冷箱的切片机上切片。恒冷箱切片机的种类较多，可根据实际情况加以选用。一般调节温度为－25℃左右。箱内温度下降后，打开观察窗，将组织固着器放置到速冻台上，先放少量OCT或羧甲基纤维素，待冻结后将组织块放上，并在其周围加适量包埋剂，将组织块包埋。组织冻结后，将组织固着器装到切片机上，调整组织的切面与刀刃平行并贴近刀刃，将厚度调至适当位置后，关闭观察窗。初步修出组织切面后，放下抗卷板，开始切片。切出切片用载玻片贴附后，进行吹干或固定。这种切片用于科研和教学的连续切片，效果较好。在切片前，应预先启动进行预冷，同时准备多个冷却台，用于多块组织切片。

2．半导体制冷冰冻切片法 组织块放置在半导体制冷台上，加少许蒸馏水，调好切片的厚度。接通循环流水后，再接通电源，而且在使用的全过程中流水不能中断，关闭电路后，才能停水。还应注意电源正负极不能接反，用整流电源控制温度。冰冻组织周围的水不宜过多，用手检查组织块的硬度，当可切成厚薄一致的切片时，即可切片。切片用毛笔展平后，立即用载玻片贴附，待切片刚要融化时，即刻入固定液内固定1min。已固定的组织切片，收集于清水中。根据目的进行染色。暂时不染色的切片，用载玻片吸附。

3．甲醇制冷器 制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装置，其冷却速度较快，属开放式，做一般常规冰冻切片用。

4．二氧化碳冰冻法 将组织块用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，关闭二氧化碳，即可切片。组织冷冻过硬易碎，若冷冻不够，组织块硬度不足，切片呈粥糜状，无法成片，应用间歇冷却法继续冷却。硬度一般在刚开始解冻时最适合，应迅速切片。

5．冰冻切片粘片法冰冻切片粘片法基本按石蜡切片的粘片处理，但烤片温度不宜超过40℃。烤干后立即取出，温度过高，时间过长，则切片易碎。烤干后用70%酒精和自来水略洗后即可染色。

九、苏木精－伊红染色方法

苏木精-伊红染色方法，简称HE染色方法，是生物学和医学的细胞与组织学最广泛应用的染色方法。在病理学实验室中称为常规染色方法。病理细胞和组织学的诊断，教学和研究都是用HE染色方法观察正常和病变组织的形态结构。因此病理学工作者必需学习和掌握这种染色方法。

（一）HE染色的基本原理

1．细胞核染色的原理

细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精硷性染料以离子键或氢键结合而染色。苏木精在碱性染料中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

2．细胞浆染色的原理

细胞浆内主要成分是蛋白质，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。伊红是细胞浆的良好染料。

随着科学技术快速发展和电子计算机的广泛应用，染色自动仪器的出现，许多实验室已用全自动染色机代替人工染色。

（二）人工操作苏木精伊红染色方法

1．染色步骤 二甲苯I脱蜡10min.二甲苯II脱蜡5min。

无水乙醇洗去二甲苯1min×2次。

95%酒精1min。

90%酒精1min。

85%酒精1min。自来水洗2min。

苏木精染色1min至5min。自来水洗1min。

1%盐酸酒精分化20s。自来水洗1min。

稀氨水（1%）反蓝30s。自来水洗或蒸馏水洗1min。伊红染色20s至5min。自来水洗30s。

85%酒精脱水20s。

90%酒精30s。

95%I酒精1min。

95%II酒精1min。无水乙醇I 2min。无水乙醇II 2min。二甲苯I 2min。二甲苯II 2min。二甲苯III 2min。

中性树胶或加拿大树胶封片。

2．染色结果

细胞核呈蓝色，细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色。

（三）自动染色机苏木精伊红染色程序

1．二甲苯I 10min。

2．二甲苯II 10min。

3．无水乙醇1min。

4．无水乙醇1min。

5．95%酒精I 1min。

6．95%酒精II 1min。

7．90%酒精I 1min。

8．80%酒精1min。

9．自来水洗1min。

10．苏木精染色1至5min。

11．自来水洗1min。

12．1%盐酸酒精分化30s。

13．自来水洗5min。

14．伊红染色30s至5min。

15．自来水洗30s。

16．85%酒精20s。

17．90%酒精30s。

18．95%酒精1min。

19．95%酒精1min。

20．无水乙醇I 2min。

21．无水乙醇II 2min。

22．二甲苯I 2min。

23．二甲苯II 2min。

24．二甲苯III 2min。

25．中性树胶或加拿大树胶封片。

（四）冰冻切片苏木精伊红染色

1．恒冷箱冰冻切片，粘贴在载玻片上，用95%酒精95ml和冰醋酸5ml的混合固定液固定1min。自来水洗。

2．苏木精染色1～2min。

3．自来水洗30s。

4．1%盐酸酒精分化20s。

5．自来水洗20s。

6．稀氨水30s。

7．自来水洗20s。

8．伊红染色20s～1min。

9．自来水洗10s。

10．85%酒精20s。

11．90%酒精30s。

12．95%酒精1min。

13．无水乙醇I 1min。

14．无水乙醇II 2min。

15．二甲苯I 1min。

16．二甲苯II 2min。

17．二甲苯III 2min。

18．中性树胶或加拿大树胶封片。

（五）染色液的配制

1．苏木精（素）

苏木精是一种纯天然染料，是从苏木素树提炼出来的，苏木树主产墨西哥的坎偑切，苏木精的染色性能差，经过一百多年精心加工配制，现用的苏木精配方，染色性能好，保持时间长，是世界上唯一的常规细胞核染料，2．苏木精的配制

苏木精的配方很多，可根据不同需要选用，Harris配方最常用。（1）Harris苏木精的配制 苏木精1g 硫酸铝钾15g 无水乙醇10ml 蒸馏水200ml

先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。（2）Mayer苏木精改良配法

A液 苏木精2g

无水乙醇40ml

B液

硫酸铝钾100g 蒸馏水600ml

稍加热使硫酸铝钾在水中溶解，将苏木精溶于酒精中，再将A液与B液混合煮沸2min。用蒸馏水补足600ml，加入400mg碘酸钠充分混匀，苏木精染液呈紫红色。（3）Gill改良苏木精染液的配制 苏木精2g

无水乙醇250ml 硫酸铝钾17g 蒸馏水750ml 碘酸钠0.2g 冰醋酸20ml

先将苏木精溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠待苏木精氧化成紫红色，再加入冰醋酸。

3．伊红溶液的配制（1）水溶性伊红 伊红Y0.5－1g 蒸馏水100ml

先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤，每100ml加冰醋酸1滴。（2）乙醇性伊红液的配制 伊红Y 0.5～1g

90%酒精100ml

先将伊红溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。用乙醇性伊红液染细胞浆后不可经水洗直接用85%酒精脱水。

4．盐酸酒精分化液的配制 浓盐酸0.5～1ml

75%酒精99ml

此液用一段时间后需要延长或更换液体，新液分化时间要短。

5．染色中注意事项（1）脱蜡 石蜡切片必需经过脱蜡后才能染色，脱蜡前切片要经烘烤，这样使组织与玻璃片粘贴牢固。组织切片脱蜡应彻底，脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间，所有的时间都是指新的二甲苯在室温25℃以下时，如果二甲苯是用过一段时间，切片又比较厚，室温低应增加脱蜡时间，脱蜡不净是影响染色不良的重要原因之一。（2）染色

石蜡切片经水洗后放入Harris苏木精染色，一般情况下在新配的苏木精溶液中只需要染1min左右，应根据染片的多少，逐步把染色时间延长。苏木精染色后，不宜在水中和盐酸酒精停留过长，切片分化程度应在镜下观察，分化过度，应水洗后重新在苏木精中染色，再水洗分化和使切片在自来水或稀氨水中充分变蓝。

新配的伊红染色快，切片染色不宜过长，应根据染切片的多少逐步延长染色时间，切片经伊红染后，水洗时间要短。（3）脱水

切片经过染色后，通过各级酒精脱水，首先从低浓度到高浓度，低浓度酒精对伊红有分化作用，切片经过低浓度时间要短，向高浓度时逐步延长脱水时间；脱水不彻底，使切片发雾，在显微镜下组织结构模糊不清。（4）透明与封片

石蜡组织切片染色经过脱水后必须经二甲苯处理，使切片透明，才能用树胶封片。常用切片封片胶有国产的中性树胶，光学树胶，加拿大树胶和合成树脂（DPX）。在封片时，树胶不能太稀或太稠，不能滴加的太多或太少，太稀或太少切片容易空泡，树胶也不可太多，不要使树胶溢出玻片四周太多。标签要附贴牢固。封片中不能对着切片呼气。（5）常规石蜡切片和HE染色标本的质量标准（全国统一评定标准）①切片完整，厚度4－6um，薄厚均匀，无褶无刀痕。②染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。

第四篇：组织切片必看

1.组织的取材

取材时要注意及时快速固定，避免剪刀镊子损伤组织，组织要取全。全盘考虑进行病理切片的组织类型，病变可能累及的部位，组织包埋需要的剖面。2.组织的固定

在组织病理学中，不管是组织切片乃至电镜还是大体标本的保存，都必须进行及时的适当的和有效的固定。组织只有经过固定，才能完成随后的一系列的制作，直至切片的最后完成。

固定的作用：从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。

固定的目的

①能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。

②保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖元等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。

③使组织硬化，便于切块。刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。

④对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。病理标本、种类繁多，成份复杂，各种病例都有，具有传染性的病种也不少，如结核、肝炎、麻风、性病等等。对于此类标本，应进行彻底的固定后，再行取材，如结核球，固定时间应在3-5天。

⑤可增强染色的作用。组织经过及时的固定，最终可见到切片有鲜艳的染色，而些时如果有一批未经及时固定的组织，将看到最终的结果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得结论，固定可以增强染色的作用。

固定的注意事项：

①组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地固定，这是最好的。根据实验，如果要获得某些酶的染色，固定最好在组织离体后30秒至1分钟。对于其它达不到些要求是越快越好。原则上动物死亡后半个小时内取完并及时固定组织。

②组织固定，组织块不宜过大。凡是需要固定的组织，都不应该太大太厚，这是因为所有的固定液穿透力不够强，浸透度不够快的缘故。如果较大厚的组织，不经处理就进行固定，那么待固定液进入至中间对可能这些组织早就发生自溶了。因此，对于较大的组织，必须先进行处理，切成制片材料再行固定，这是最佳的处理方法，如遇到胃肠的器官，则应将其剪开，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因这类组织、粘膜和肌层容易分开，没固定时，难以取得最佳制片材料，对于产酶类的器官如肝、肾、脾等，更要处理好，否则更容易出现自溶现象。

③对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。固定剂的种类繁多，成份复杂，对组织的作用不尽相同。在我们的日常工作科研中，对于组织的固定，应有针对性的选择，方能获得满意的效果。对于肾，睾丸等泌尿系统和新生仔鼠应选择Bouin氏固定液。免疫组化可以选择多聚甲醛和中性缓冲甲醛；我病理室一般选择中性缓冲甲醛，它可以兼顾常规染色和免疫组织化学。

④组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。固定时间应根据取材大小、性质以及类型有关，视具体情况而定；时间太短，就不能很多的固定组织，因为不管组织大小，固定液浸入组织之中，都需要有一定的时间，时间太短，就会影响组织固定的效果，对以后一系列关系的处理都有影响，切片质量难以保证，固定时间太长，也不好。组织长时间的固定，福尔马林会产生一种酸，影响核的染色。对于固定很长时间的陈列性标本制片后切片染色不鲜艳，显得非常陈旧。另外，长时间的固定往往会出现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本，更应注意。固定时间过长，可降低抗原的活性。一般小鼠组织固定24h即可。

⑤固定液的量要充分。固定液量的足够与否决定着组织固定的成败。一般固定液和组织体积比为10：1~20：1之间。

⑥特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。一般的病例标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液来固定。但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可选择无水酒精或丙酮来固定组织。

3.常规石蜡切片制片过程

组织经系列酒精的脱水，经透明剂的作用，经熔化的石蜡的浸渍，包埋后所切成的切片称为石蜡切片。制片过程的每一步每一环节处理不好都会影响切片质量。

组织脱水：

把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。不管是正常的组织，还是有病变的组织，都含有不同程度量的水分。据测定，人体的物质组成约含水55~67%，蛋白质15~18%，脂类10~15%，无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。如果不把这些水分脱去，石蜡切片将无法进行，因为石蜡和水不能混合在一起，所以除去组织中的水分成为制片中的关键，至今为止，国内常用的都是酒精。因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合，所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。酒精脱水力强，对组织又有硬化和易脆的不良影响。在使用时，通常是从低浓度至高浓度，浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，组织经过这一系列处理后，基本可达到脱水的目的。

每一步的组织脱水都需要控制好脱水时间，一般根据组织块大小和组织类型而定。短了脱水不干净，长了会使组织切片时易脆。组织的透明：

组织脱水后，要经过一个浸蜡前的中间溶剂透明过程；才能进行浸蜡。透明的目的：组织经脱水后、浸蜡前必须经过某些既能与脱水剂相混合又能溶解石蜡的中间溶剂处理。组织在中间溶剂时，组织间隙内存留的脱水剂完全为中间溶剂所取代时，组织就呈现透明状态，此时即可进行浸蜡。透明液多采用二甲苯，组织经无水乙醇脱水后转入二甲苯透明，组织的大小、厚薄不同，透明时间也不同。透明时间短了，透明不完全，导致切不了片，透明时间长了，透明过度，导致切片易粉易碎。组织浸蜡：

用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低（56～58℃），低温浸蜡对保存组织细胞内的抗原免疫活性，避免组织收缩和变硬变脆有帮助，以尽量清除二甲苯蜡渗透到组织中起支撑作用，切片时才能把完整的组织和蜡一起完整切下来。不同大小和厚薄的组织浸蜡时间有所不同，一般为1～3小时。浸蜡温度过高，浸蜡时间过长或不够均可导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。组织包埋：

组织经浸蜡后即可进行包埋。包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高（约3~5℃），否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。组织包埋要选择所需要的组织切面。组织切片：

组织切片厚薄要适宜，薄的切片细胞不会重叠，易于观察。切片的厚度应为3～4μ，组织蜡块过硬，切片刀或蜡块没固定好，会出现跳刀、切片成一截厚一截薄的现象。优质的组织切片要求切片较薄，平整，无刀痕，皱褶。切片太厚或呈波浪状厚薄不匀。贴片烤片：

烤片时间短，会造成染色时切片从载玻片上脱落或脱蜡不净，染的切片会着色浅、不上色或灰染；烤片时间长，会造成对组织的损伤。染色：

染色染色的程度包括脱蜡、浸水、染色、分化、促蓝、脱水、透明等过程。切片经过脱蜡至水，HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。要求组织结构清晰，色彩鲜艳，细胞核/细胞质对比分明。

组织病理切片质量的影响因素

2009-08-19 编辑： 【打印】 【关闭】

第五篇：组织切片课程设计

生物制片技术课程论文—

—鲤鱼脾脏组织结构

摘要：组织切片方法是教学、科研、病理检验工作中广泛应用的一种实验技术,所谓组织切片，即取动物某一实体器官上的组织块用包埋剂包埋，然后进行切片及染色的制片过程。在整个制片过程中，包括有取材与固定，脱水与透明，浸蜡与包埋，切片与粘片，染色与封固五大步骤。石蜡切片是组织切片方法中最为简单和常用的切片方法，本实验选择石蜡切片法制作鲤鱼肝脏组织切片。制作时需对每一步都必须认真对待，否则将达不到预期效果，甚至导致制片工作的彻底失败。本文就传统的石蜡组织切片方法进行了全面地改进试验研究，使组织固定完全，脱水彻底，透明适度，浸蜡充分，切片较薄，染色良好；不仅缩短时间，简化程序，节省药液，而且提高了组织切片的质量。

关键词：动物组织；HE染色；石蜡切片

Production and observation of the spleen tissue of fish Abstract: Tissue slice method is a kind of experimental technology.which widely used in teaching, scientific research and pathological examination.So called tissue slices, that is, the body of a solid organ on the tissue piece with paraffin embedded, and then slice and dyeing of the production process.In the entire production process, including the material and the fixation, dehydration and the transparency, the immersion wax and the embedding, the slicing and the sticky piece, the dye and the seal five big steps.Production, every step must be taken seriously, otherwise it will not achieve the desired results, and even lead to the failure of the production work.In this paper, the traditional method of tissue slicing has been comprehensively improved, which makes the tissue fixed, dehydrated, transparent and appropriate, the dip wax is sufficient, the slice is thin, and the dyeing is good.Key words: animal tissue;HE staining;Paraffin slice

一、实验目的

1,、通过对鲤鱼的结构观察，了解鱼类的主要特征以及鱼类适应于水生生活的形态特征。

2、了解生物制片主要方法；

3、掌握石蜡切片和H·E染色技术。基本设备及常用试剂

二、基本设备

1、显微镜：光学显微镜

2、切片机：轮转式、滑动式（平推式）、冰冻式、振动式。均有三组部件安装在牢固稳定的切片机身上：①刀架。②组织块夹具。③微动调节器。

3、恒温箱或干燥箱

恒温箱是切片不可缺少的设备，主要供浸蜡、烤片、烘烤清洗后的玻璃器皿及某些需要加温60℃以上时应用

4、冰箱 用于保存染液、试剂和药品并提供切片用冰

5、离心机

可供脱落细胞及染色体技术用

6、切片刀、天平、酸度计、定时钟、一般手术器械、染色缸、染色架、载玻片、盖玻片、常用玻璃器皿、毛笔、酒精灯等。

三、常用试剂

1、洗液

重铬酸钾300g 浓硫酸 300ml 自来水 3000ml，即重铬酸钾、硫酸与自来水之比为1：1：10。

先将重铬酸钾溶于水，如加热须待冷后，再缓缓加入浓硫酸，边加边搅。不准将水倒入浓硫酸内！另外，清洁液只能用于玻璃仪器的清洗，不能浸泡金属器械。

2、蛋白甘油：蛋清打泡，静置、过虑，加入等量甘油，充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。

3、盐酸-酒精：作分色用，100ml的70%酒精加入0.5或1ml浓盐酸。

4、酒精稀释液：用95%酒精稀释使用。如将95%酒精稀为70%酒精时，可取70ml的95%酒精加水至95ml即成，依次类推。

5、碱性水：0.1%氨水或1%碳酸锂水溶液6、10%福尔马林：

商品甲醛 10ml

水 90ml

7、苏木精溶液： 甲液：苏木精2g

无水酒精20ml 乙液：甲矾40g

蒸馏水400ml 丙液：高锰酸钾1g

蒸馏水16ml 三液分别溶化，然后将甲液注入乙液，再加丙液6ml，时时搅拌，加温至煮沸0.5-1 min，使速冷却后即可使用。

四、实验步骤

实验材料：新鲜的鲤鱼一条

1.杀死与取材：用手术刀和镊子按要求迅速找到鱼的脾脏，然后取出，要求动作迅速。

2.固定：使用小块组织固定法，取下的小块组织，立即置入10%福尔马林固定液中进行固定。

3.洗涤：因为小组织可不冲洗，所以本实验需要多次换水浸泡即可。4.脱水：先放入70%酒精中30min，然后80%酒精30min，95%酒精30min, 95%酒精30min, 无水酒精30min, 无水酒精30min，5.透明：比例为1:1的无水酒精和二甲苯混合（30min），二甲苯20min, 二甲苯10min.6.浸蜡与包埋：比例比1:1二甲苯和石蜡（30min）,石蜡30min，石蜡30min，包埋。

7.切片：将熔化好的石蜡倒入包埋框或包埋盒，用加温的镊子将组织块切面朝下放入，做好标记，冷却。完全凝固后，修整蜡块。将切片机准备好，调整好角度，固定好刀架、刀片和蜡块，切片厚度：6-8μm；转速：40至50次/min。8.染色：二甲苯（5 '）→1:1二甲苯+无水酒精（5'）→无水酒精（2'）→95%酒精（2'）→80%酒精（2'）→70%酒精（2'）→苏木精（15'）→自来水洗（2'）→1%盐酸酒精（30''）→自来水蓝化（15'）→蒸馏水（2'）→70%酒精（2'）→80%酒精（2'）→伊红（1'）→95%酒精（2'）→95%酒精（2'）→无水酒精（2'）→无水酒精（2'）→二甲苯（2'）→二甲苯（2'）

9.封固：切片经染色透明后，取出切片，滴一滴中性树胶，将盖玻片盖于切片上。贴上标签注明名称、编号。10.观察

五、总结与讨论

石蜡切片实验是细胞生物学实验的重要部分，迄今为止石蜡切片仍然是疾病诊断，尤其是病变性质判断的重要手段。石蜡切片过程中，最易受到操作人员实验技术影响的步骤是浸蜡、包埋，而且包埋效果直接影响到实验结果的好坏。正确应用动物组织切片技术与完成动物组织切片染色标本的制作好坏关系重大。

六、参考文献

[1] 刘育艳.制作优质实验动物组织切片的有效方法.山西医科大学学报.2001，21（3）：275-276.[2] 任成林，田勇，梁淑珍.动物组织HE染色石蜡切片技术的改进, 河北北方学院学报.2007，23（1）:41-45.[3] 袁广明，胡黎平，李燕，陈大堤，谢富康.成年斑马鱼石蜡连续切片的制作和苏木精-伊红染色.解剖学研究, 2006，28（1）:73-74.[4] 李华.浅谈制作实验动物组织石蜡切片的方法和体会.2011年全国病理技术新进展研讨会论文汇编.2011:171-173.[5] 何书海，陈宏智，焦凤超.动物病理组织切片制作方法的改良.动物医学进展 2011,32（11）:130-132.[6] 高书堂.在教学和科研中应用动物组织切片技术的体会.湖北教育学院学报.1992，(2).[7] 弯雪燕．常规石蜡切片中浸蜡包埋方法的改进[J]．诊断病理学杂志，2000，7(4)：303-304．

[8] 杨捷频．常规石蜡切片方法的改良[J]．生物学杂志，2006，23(1)：4546．