HE组织切片制备标准操作程序[精选合集]

第一篇：HE组织切片制备标准操作程序

HE染色标准化操作程序

一、目的

保证病理切片质量，以达到准确的病理诊断。

二、范围

石蜡包埋组织

三、试剂，仪器

酒精、二甲苯、苏木素、伊红、盐酸酒精、脱水机、包埋机、切片机、漂烘仪、染色机。

四、工作流程

（一）制片前

制片前过程从标本送到实验室至包埋结束为止。包括： 1.标本的交接编号记录及检查

（1）实验室人员收检标本时人必须认真执行查对制度，包括：送检标本种类和数量与送检单上填写的是否一致；容器上的联号或姓名与送检单上是否符合；固定液的种类（通常要求为10％中性缓冲甲醛液）和量是否符合要求；送检单是否按规定用墨水笔逐项填写清楚。若发现有错误、疑问或不符合要求时，应立即查询清楚和适当处理，在合格后方可签名接收。如标本已干涸、腐败或其它明显不符则不应接收。接收标本应在初级人员接收后，再由中级人员和主检或具体负责人员复核，以确保没有差错发生。

（2）收到标本后应按标本顺序逐一在申请单上编上病理检查号，并在标本容器外壁贴上相应的号码，然后按号码先后顺序排列放好，再在申请单上打上收到日期。将收检的标本，按申请单逐一向负责处理的医师交代清楚，包括标本种类、数量、临床诊断及有无特殊注意事项等。

（3）取检过程中，实验室人员应认真记录填写好工作单，包括标本号、块（包）数、有无特殊处理、标本名称，如标本全取、标本过小等均应记录在案以备日后查对。对一些易碎、小而少的标本应用尼龙丝小袋或擦镜纸包裹好后再做上机处理，以防丢失。标本的取材块通常控制在2cm×2cm×0.3cm左右。标本取检多于一个包埋块者，在标本病理检查号后缀写-1或-2等，以便于查找校对。取好的标本应及时浸泡在指定的固定液中，来不及取完的标本特别是大标本应缝上号码投入固定池内以备次日再取。标本取检完后，自报告发出之日起，通常规定小标本保留1月以上，大标本保留6月以上。

（4）标本在上机处理之前，必须由初级和中级实验技术人员共同检查标本总数与申请单和工作单是否一致，确定无疑后方可上机处理。

2.标本的处理

利用全自动脱水机处理。（根据组织的大小、分类分别设置程序）

所有试剂由专人负责定时检测定期更换，并做好详细记录。3.标本的包埋

首先清点检查标本，确认完好无缺后方可开始包埋操作，操作时应注意核对标本与工作单记录是否吻合。包埋的石蜡温度应尽量与标本浸蜡温度一致，大约控制在65℃～70℃之间，温度太低会造成包埋平面凹凸不平，尤其是内镜活检等小块标本，易出现切片不完整而发生漏诊现象。包埋时，先取大小合适的不锈钢模型，注入蜡液置于热台上，液面刚好与模型的上缘平齐，不得低于或高于此限。取出包埋盒内的组织，校对正确后用干净的热镊子将所有组织悉数放入模型的底部，待组织与模型内的蜡液充分融合后，按要求排列后迅速移动模型至冷台，至底部石蜡刚开始凝固，用镊子轻压组织数秒，待组织埋平后，迅速盖上包埋盒注上蜡液，约过10s ～15s，包埋盒与模型周边的蜡液凝固后，再次补充注入少许蜡液，以增加包埋盒的稳固性，注意液面高度不得高于包埋盒上缘，加盖包埋盒时一定要保持与模型底部平面平行，无前后左右倾斜的现象。待蜡块在冷冻台彻底冷却后，从模型内取出修去包埋盒周边多余的石蜡。清点包埋好的蜡块总数，按大小类别放好，冷冻备切。

（二）切片

1、将切片刀安装在持刀座上；

2、将蜡块固定于支持器上；

3.、细心移动刀座或蜡块支持器，使蜡块与刀刃接近，旋紧刀座，观察蜡块面是否与刀座相平，如不平须调节支持器，使蜡块面与刀面平行；

4、修块（粗切）：用右手匀速旋转切片机轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块全部切到。修块粗切片的厚度为15-20微米（注意：对于医嘱再次深切片特别是在原切片中发现了有意义病变而进行的深切片应尽量少修块，以尽量好地获得有关病变的连续性）；

5、调节切片厚度调节器（一般为2-4 微米），进行切片。切出的蜡片应连续成带状，完整无缺，厚度适宜（3-5 微米）、均匀，无刀痕、颤痕、皱褶、开裂、缺损、松解等；

6、以专用镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚薄均匀、干净的蜡片，放入漂片机的温水中（40-50℃左右），使切片全面展开；每切完一个蜡块后必须认真清理水面，不得遗留其它病例的组织碎片以免污染。

7、将蜡片附贴于处理过的载玻片上，蜡片应放在载玻片右2/3处的中央，留出载玻片左1/3的位置用于贴附标签；蜡片与载玻片之间无气泡；为防止蜡片滑落，蜡片的一角（远离组织的）可粘在载玻片边缘上；若一片载玻片上捞两片以上的蜡片，必须把蜡片均匀贴附在载玻片上，保持制片的美观。

8、必须立即在置放了蜡片的载玻片一端（待贴标签处），用铅笔准确清楚地标记其相应的病理号（包括次级号），外借白片，需在每张白片上注明对应的病理号。

9、将置放了蜡片的载玻片呈45度斜置片刻；待载玻上的水分流下后，将其插入专用的染色架中，最后置于恒温箱中烘烤（72℃左右，15分钟），然后即可进行染色。

10、切片注意事项

（1）切片前蜡块要冷冻，这样容易切片（甲状腺、淋巴结及胃镜等特殊组织，必须控制冰冻时间）。

（2）如遇难切的蜡片时，可用与蜡块切面差不多大小的薄纸潮湿后贴在蜡块上切片，然后将附有蜡片的一面朝上放入水中漂片。

（3）如遇易脱片组织（如血凝块、脑组织）时，可用多聚赖氨酸或APES 处理过的玻片来捞片。

（4）总是切不出完整的蜡片，或皱缩或卷片，可能是刀不利。

（5）切出的蜡片总是皱缩，可能是蜡块冷冻时间不够，或是组织脱水、浸蜡效果不好。

（6）切片厚薄不匀或空片，可能是刀未固定紧或蜡块未夹紧，也可能是切片机有问题。

（7）烤片时间与温度有关，一般时间宁长勿短，否则会造成脱片。一般烤片温度控制在62℃，时间为30min左右。

（8）连续切片放入热水漂片时，不要捞取第一、二张蜡片，因为前2 张蜡片厚、组织有空洞（镜下可见）。

（9）用于展片漂片仪的温水必须认真清理水面，不得遗留其它病例的组织碎片以免污染。

（三）HE染色

1、自动染色：见《染色机使用及维护标准操作程序》

2、手工染色（1）脱蜡

①二甲苯Ⅰ 5分钟 ②二甲苯Ⅱ 5分钟 ③100%酒精Ⅰ 1分钟 ④100%酒精Ⅱ 1分钟 ⑤95%酒精 1分钟 ⑥80%酒精 1分钟 ⑦自来水浸洗 1分钟(2)染色

①苏木素染液 6分钟 ②水冼 1分钟

③0.5-1%盐酸酒精分化片刻（颜色由蓝变红即可）④自来水冲冼10分钟左右（颜色由红变蓝）。（然后95%酒精片刻，主要是避免所带的水份稀释以下的伊红酒精，此步可免）

⑤伊红染液浸染

（3）脱水、透明、封固 ①75%酒精 0.5分钟 ②85%酒精Ⅰ 1分钟 ③95%酒精Ⅱ 1分钟 ④100%酒精Ⅰ 1分钟 ⑤100%酒精Ⅱ 1分钟

⑥石炭酸二甲苯(1:3)10秒钟 ⑦二甲苯Ⅰ 透明 1分钟 ⑧二甲苯Ⅱ 透明 1分钟 ⑨取出后用中性树胶封固。

3、H&E染色注意事项

（1）二甲苯脱蜡时间冬季长些，夏季可短些，为防止脱蜡不净影响染色，脱蜡时间宁长勿短。

（2）盐酸酒精分化时间灵活掌握，可以在切片蓝化后镜下观察。

（3）染色后的脱水透明也很重要，若脱水不完全，切片会模糊不清，脱水的乙醇要保持纯度，切片在进入脱水乙醇前尽量把水份去掉。

（4）结束染色的切片用中性树胶封固。操作时用滤纸轻轻吸去组织周围的液体，保持组织切片的轻度湿润，滴少许树胶，用镊子取盖玻片轻轻盖上。注意封片时不能让组织切片干涸，否则会出现人为色素即“中性树胶色素”。封片动作要轻，以防产生气泡或溢胶。树胶浓度要适当，预先可用二甲苯调试好备用。太稠不宜操作，太稀易出现气泡或溢胶。

（四）制片后

制片后过程由封固切片结束到上交切片为止。

1.封固好的切片，由初级实验技术人员按号码顺序排放在切片夹内，与相应的蜡块进行校对，检查切片与蜡块的号码是否一致，有无错号。检查切片与蜡块中组织的形状是否一致，是否切全。仔细粘贴标签后交上级人员复查。

2.上级人员根据申请单或工作单上的记录全面仔细检查切片，评分内容、标准及其分值如下。

外观（5分）：清洁，无溢胶。载玻片及盖玻片完整。

标签（5分）：清洁，号码清晰，粘贴牢固，贴在指定位置。

裱片（5分）：组织裱贴在适当位置上，方向合适。

厚薄（5分）：切片厚薄均匀一致。

平整（7分）：切片平整无皱折。

切痕（8分）：切片完整，无破裂或划痕。

透明（10分）：切片透明，无云雾状，组织固定脱水彻底。

颜色（18分）：核浆着色正，对比度清晰明显。

层次、气泡（5分）：染色有层次，深浅分明，无气泡。

细胞形态（12分）：无挤压、皱缩及膨胀变形。

污染（15分）：无异物或其它组织混入切片。

洁净度（5分）：玻片内无残留染料。如有上述不合格项目，按评分表格标准扣分，总分为100分，90分以上为甲级片，90分～80分为乙级片，80分以下为丙级片。

3.切片检查完毕后登记交接给负责诊断的医师。

五、相关文件

（一）《染色机使用及维护标准操作程序》

（二）《切片设备使用及维护标准操作程序》

（三）中华医学会《临床技术操作规范-病理学分册》

（四）浙江省医疗机构管理与诊疗技术规范丛书《病理诊断与技术规范》

六、相关记录

（一）《组织切片机使用及维护记录表》

（二）《染色机使用与维护记录表》

（三）《病理实验室恒温箱温度记录表》

第二篇：组织切片技术

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 组织切片技术注意事项

程序步骤

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蜡切片：流水冲洗组织块>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蜡2h>>包埋

冰冻切片：固定后的组织>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的组织>>转入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>贴片>>干燥（37度过夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸馏水3min>>苏木精染色30s—5min>>自来水涮洗>>蒸馏水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊红染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性树胶封片

6、免疫组化（ABC法）

（1）干燥后的石蜡或冰冻切片（冰冻切片需要缓慢复温）脱蜡至水；

（2）双氧水（1%浓度左右）封闭内源性过氧化物酶；

（3）PBS洗涤3×5min；

（4）5%BSA封闭非特异性结合位点，不洗；

（5）滴加适当稀释度的一抗；4度孵育过夜或37度2h；（6）同上洗涤；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗涤；滴加ABC复合物，37度1h；（8）洗涤5遍，每次5min；

（9）配制显色液（DAB显色试剂盒），显微镜下观察显色；（10）切片浸泡于蒸馏水中终止显色；（11）苏木精复染，脱水，封片。

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注意事项

取材

1.组织越新鲜越好，最好于动物处死后10~20min完成取材，时间过久后组织自溶和腐败会影响组织形态。

2.取材组织块不宜过大，一般为5nm以下，2~3nm为宜。如果试验要求采取大块组织，最好采样前注射固定液预固定或采取灌流固定（比如取脑时需灌流固定）。

3.取材使动作轻柔，避免用力夹、捏和拉扯组织，尽可能保持组织原有形态。操作时可用镊子夹取组织的一个边角，避免主要组织损伤。

4.如果是大批量取材，取材时没有时间对组织块大小进行修正，可将组织（可稍大，但不宜过大）先放在固定液中固定，2~4h后进行修块，即用锋利的刀片（刮胡刀片）把组织切至适宜大小。注意不能用剪刀等进行钝性分离。5.如果对不同处理或不同动物的组织进行比较研究，应对所有动物在同一解剖学位置取材（比如十二指肠距胃3cm处，或空肠距胃10cm处）。

6.取材时注意组织的不同断面，可将组织的一面用刀片切平作为标示，以便包埋和切片时选取的断面正确（比如肌肉组织，应区分好横断面和纵断面）。7.一般情况下宰杀动物应放血干净，取材时除去组织周围的附属物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的组织立即固定。冰冻切片组织可先固定后冻存，也可直接冻存，直接冻存一般采取液氮中速冻，然后转入-20度保存，冻存组织应避免反复冻融，且尽快进行切片或用OCT包埋（包埋后可放置较长时间）。未包埋的组织在-20度长期保存的组织会逐渐脱水（比如肌肉），影响形态学观察。

9.理论上免疫组化的组织采取冰冻切片，一般运用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋冻存。但对于抗原表达量大且较易检测的免疫组化，可以采取石蜡切片，但固定时间不能过长，控制在1周以内，长时间固定会引起抗原表位的醛基化和抗原表位构象变化，导致免疫组化检测灵敏度降低。

固定与包埋

1.选择合适的固定液，原则是在良好固定组织并保持形态的前提下尽可能的减小对组织的影响。常用固定液为福尔马林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后两者最为常用，效果也较好。

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鲜配制，新配的固定液固定效果较好。3.固定液体积理论上应为组织体积的20倍以上。

4.一般组织理论固定时间为4~24h，即以固定液完全渗透进入组织的最短时间为宜，实际操作中可延长至数天，但一般控制在1周以内。

5.如果是冰冻切片，固定后的组织最好及时用OCT包埋，能更好的维持组织形态，包埋后的组织可于-20度保存数月。固定后的组织可用蔗糖溶液脱水，方法为直接将组织置于30%蔗糖溶液中，每天换新鲜蔗糖溶液，2-3天组织在蔗糖中沉底即可。一般来说，先固定，然后脱水，再用OCT包埋效果比较理想。6.冰冻切片可以采取后固定的方法。即采得的组织经液氮速冻后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰冻切片后用丙酮等对切片上的组织进行固定。但丙酮固定较为强烈，容易发生掉片。

7.石蜡切片时，固定后的组织包埋前一般对组织进行洗涤，通常用自来水冲洗，洗掉组织中的固定液，因为残留在组织中的固定液可能对染色产生影响。洗涤为可选步骤，我们实验室通常不洗涤，将固定后的组织直接包埋，并不影响HE染色效果。

8.二甲苯透明时间是影响包埋效果的最关键因素，需根据组织种类、组织大小、室温以及二甲苯的新旧程度综合考量，必要的时候需要设置时间梯度进行摸索。此外，组织是否脱水完全、是否浸蜡完全也直接影响包埋效果，原则上在能够完全脱水和浸蜡的前提下，组织在各溶剂中的浸泡时间越短越好。

切片

1.切片成功与否很大程度上取决于组织固定和包埋的好坏。

2.切片厚度：HE等组织学染色一般4~5微米（4微米差不多是石蜡切片的极限），如果切片困难，可适当增加切片厚度（20微米以内越厚越好切），但切片厚度的增加会使得细胞层数增多，影响观察和美观。免疫组化中石蜡切片一般切片5~10微米，冰冻切片大约8~14微米，特别是在检测表达量较少的抗原时，较厚的切片可以增加阳性物质的出现概率。

3.较好的石蜡切片呈均匀连续状，没有空洞和破损，组织完整不碎裂。4.切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。刀片应从一段开始使用，发现刀痕时逐渐移动，以最大限度使用刀片。

5.冰冻切片的主要影响因素有：切片机箱体温度（一般为-25度左右），防卷器位置（太往前切不动，太往后起不到防卷效果）。

6.对免疫组化切片而言，需对玻片进行包被（一般为使其带正电荷，组织带负

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 电荷，通过静电吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太浅起不到粘附效果，包被太深会导致免疫组化非特异性染色。

展片和贴片（捞片）：

1.烧杯中装蒸馏水，置于水浴锅中，温度一般40~45度，温度太低片子展不开，温度太高石蜡会融化。

2.冰冻切片不需要展片，直接将玻片轻靠在组织上，组织便会自动吸附到玻片上。

3.捞片时选取完全展平的片子捞起，宁缺毋滥。一张玻片上可以贴多个组织，最后选染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被过的玻片可重复使用，包被过的玻片贴片后组织很难掉下，不可重复使用。

干燥：

1.干燥可以让组织贴的更结实。石蜡切片37度干燥过夜，或者45~60度干燥数小时。冰冻切片室温晾干（夏天一般5~10min），但不可凉太干，太干也容易掉片，判定标准为组织表面没有明显的液体为宜，如果组织变白说明干燥时间过长。

2.干燥后的石蜡切片可放切片盒中室温保存，如果天气炎热可以放置4度保存；冰冻切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期内试验可以放4度保存。

染色（以HE染色为例）：

1.液体置换要彻底，特别是脱蜡和脱水步骤。

2.伊红一般用醇溶性配方，苏木精配方有很多种，如果用氧化汞方法配制使用前要过滤，因为液体表面容易聚集一层金属离子薄膜，对染色产生影响。3.新鲜配制的伊红染色时间1秒即可，存放时间长的染液可以适当增加染色时间。

4.封片时中性树胶的量要适度。根据组织的大小选择大小合适的盖玻片，盖玻片以能覆盖住组织为前提，越小越好，太大的盖玻片溶液不平整，显微镜观察时组织可能不在一个平面，需要反复调整焦距。

5.苏木精和伊红染色时，最好摸索染色时间，以寻求最合适和漂亮的颜色搭配，不同的组织染色能力有所差异，比如淋巴组织内淋巴细胞较多，细胞核比较大，染出来可能蓝色居多，肌肉组织中肌显微和细胞质比例高，染出来红色

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6.总体原则是染色宁愿偏浅不要偏深，偏深的染色难以判别细胞形态和结构。

免疫组化注意事项：

1.免疫组化一般以冰冻切片为主，但石蜡切片也可以做免疫组化。

2.冰冻切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰冻包埋）。3.免疫组化步骤繁琐，时间较长，因此用包被过的切片来防止掉片。常用的包埋剂有APES，多聚赖氨酸和明胶等。包被过程相对简单，可购公司的商品包被试剂盒，按照说明书操作。

4.石蜡切片的免疫组化有时需要抗原修复。原因：固定液会对组织的抗原性产生影响，示抗原表位发生构象变化，可以通过化学处理和热处理来还原组织的抗原性。常用的修复液为枸橼酸钠缓冲液，一般采取热修复，即把切片放置在缓冲液中然后加热至沸腾。

5.免疫组化切片厚度一般为8~12微米。6.选择合适的抗体（单抗、多抗）。

7.预实验确定合适的H2O2、封闭液和抗体作用浓度和时间。8.选用包被过的玻片，动作轻柔，防止掉片。9.设置阳性、阴性和空白对照。

10.显微镜下控制显色，放置显色过浅或过深。

11.复染时苏木精浓度可稀释，时间缩短，避免染色过深。

12.遇到问题逐项排除，寻找原因。详细的问题解决和相关技术贴可参照丁香园论坛或生物秀论坛，搜素“免疫组化”可以找到相关资料。

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溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，边加入边加热搅拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促进粉末溶解，完全溶解后HCl调PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 饱和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混匀。

染液

伊红染液：1%醇溶性伊红配方为1g伊红加入到100ml 80%酒精中，溶解。

苏木精染液：

1.哈里新（Harris）苏木紫液：甲液：苏木紫Ig，无水乙醇10ml。乙液：硫酸铝钾（或铵）20g，蒸馏水200ml，加温溶解。甲、乙二液分别溶解后混合，加热煮佛，沸后去火，待溶液不翻腾时即加入氧化汞0.5g（此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢出）。然后染液迅速冷却，冷却后过滤，即可位应用。用时每100ml加冰醋酸4ml；

2.迈尔（Mayer）苏木紫液：将苏木柴0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜，即可应用。染色时间约10~20min；

3.欧立区（Ehrlich）苏木紫：将苏木紫2g溶于无水乙醇100ml中；将硫酸铝钾15g溶于蒸馏水100ml中，加入甘油100ml，将二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混匀后，盛于无色小口瓶内，暴露于日光下，使其自然成熟，约需3个月。染色时间约5~20min。此液贮存愈久，染色力愈强。若在其中加入碘酸钠300mg，使人工成熟，配成后即可应用；

4.卡拉兹（Carrazzi）苏木紫：将苏木紫0.5g溶解于甘油100ml中，将硫酸铝钾25g溶解于蒸馏水350ml中溶解后将二液慢慢混合，并充分摇匀。将碘化钾0.1g放于蒸馏水50ml中，加微温溶解，然后加入苏木紫液中，充分摇匀，翌日可用。

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免疫组化

0.3%~1%双氧水：

商品化30%双氧水溶甲醇稀释到适当浓度。

1~5%BSA（羊血清、脱脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混匀。

第三篇：组织切片必看

1.组织的取材

取材时要注意及时快速固定，避免剪刀镊子损伤组织，组织要取全。全盘考虑进行病理切片的组织类型，病变可能累及的部位，组织包埋需要的剖面。2.组织的固定

在组织病理学中，不管是组织切片乃至电镜还是大体标本的保存，都必须进行及时的适当的和有效的固定。组织只有经过固定，才能完成随后的一系列的制作，直至切片的最后完成。

固定的作用：从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。

固定的目的

①能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。

②保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖元等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。

③使组织硬化，便于切块。刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。

④对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。病理标本、种类繁多，成份复杂，各种病例都有，具有传染性的病种也不少，如结核、肝炎、麻风、性病等等。对于此类标本，应进行彻底的固定后，再行取材，如结核球，固定时间应在3-5天。

⑤可增强染色的作用。组织经过及时的固定，最终可见到切片有鲜艳的染色，而些时如果有一批未经及时固定的组织，将看到最终的结果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得结论，固定可以增强染色的作用。

固定的注意事项：

①组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地固定，这是最好的。根据实验，如果要获得某些酶的染色，固定最好在组织离体后30秒至1分钟。对于其它达不到些要求是越快越好。原则上动物死亡后半个小时内取完并及时固定组织。

②组织固定，组织块不宜过大。凡是需要固定的组织，都不应该太大太厚，这是因为所有的固定液穿透力不够强，浸透度不够快的缘故。如果较大厚的组织，不经处理就进行固定，那么待固定液进入至中间对可能这些组织早就发生自溶了。因此，对于较大的组织，必须先进行处理，切成制片材料再行固定，这是最佳的处理方法，如遇到胃肠的器官，则应将其剪开，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因这类组织、粘膜和肌层容易分开，没固定时，难以取得最佳制片材料，对于产酶类的器官如肝、肾、脾等，更要处理好，否则更容易出现自溶现象。

③对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。固定剂的种类繁多，成份复杂，对组织的作用不尽相同。在我们的日常工作科研中，对于组织的固定，应有针对性的选择，方能获得满意的效果。对于肾，睾丸等泌尿系统和新生仔鼠应选择Bouin氏固定液。免疫组化可以选择多聚甲醛和中性缓冲甲醛；我病理室一般选择中性缓冲甲醛，它可以兼顾常规染色和免疫组织化学。

④组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。固定时间应根据取材大小、性质以及类型有关，视具体情况而定；时间太短，就不能很多的固定组织，因为不管组织大小，固定液浸入组织之中，都需要有一定的时间，时间太短，就会影响组织固定的效果，对以后一系列关系的处理都有影响，切片质量难以保证，固定时间太长，也不好。组织长时间的固定，福尔马林会产生一种酸，影响核的染色。对于固定很长时间的陈列性标本制片后切片染色不鲜艳，显得非常陈旧。另外，长时间的固定往往会出现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本，更应注意。固定时间过长，可降低抗原的活性。一般小鼠组织固定24h即可。

⑤固定液的量要充分。固定液量的足够与否决定着组织固定的成败。一般固定液和组织体积比为10：1~20：1之间。

⑥特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。一般的病例标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液来固定。但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可选择无水酒精或丙酮来固定组织。

3.常规石蜡切片制片过程

组织经系列酒精的脱水，经透明剂的作用，经熔化的石蜡的浸渍，包埋后所切成的切片称为石蜡切片。制片过程的每一步每一环节处理不好都会影响切片质量。

组织脱水：

把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。不管是正常的组织，还是有病变的组织，都含有不同程度量的水分。据测定，人体的物质组成约含水55~67%，蛋白质15~18%，脂类10~15%，无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。如果不把这些水分脱去，石蜡切片将无法进行，因为石蜡和水不能混合在一起，所以除去组织中的水分成为制片中的关键，至今为止，国内常用的都是酒精。因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合，所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。酒精脱水力强，对组织又有硬化和易脆的不良影响。在使用时，通常是从低浓度至高浓度，浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，组织经过这一系列处理后，基本可达到脱水的目的。

每一步的组织脱水都需要控制好脱水时间，一般根据组织块大小和组织类型而定。短了脱水不干净，长了会使组织切片时易脆。组织的透明：

组织脱水后，要经过一个浸蜡前的中间溶剂透明过程；才能进行浸蜡。透明的目的：组织经脱水后、浸蜡前必须经过某些既能与脱水剂相混合又能溶解石蜡的中间溶剂处理。组织在中间溶剂时，组织间隙内存留的脱水剂完全为中间溶剂所取代时，组织就呈现透明状态，此时即可进行浸蜡。透明液多采用二甲苯，组织经无水乙醇脱水后转入二甲苯透明，组织的大小、厚薄不同，透明时间也不同。透明时间短了，透明不完全，导致切不了片，透明时间长了，透明过度，导致切片易粉易碎。组织浸蜡：

用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低（56～58℃），低温浸蜡对保存组织细胞内的抗原免疫活性，避免组织收缩和变硬变脆有帮助，以尽量清除二甲苯蜡渗透到组织中起支撑作用，切片时才能把完整的组织和蜡一起完整切下来。不同大小和厚薄的组织浸蜡时间有所不同，一般为1～3小时。浸蜡温度过高，浸蜡时间过长或不够均可导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。组织包埋：

组织经浸蜡后即可进行包埋。包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高（约3~5℃），否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。组织包埋要选择所需要的组织切面。组织切片：

组织切片厚薄要适宜，薄的切片细胞不会重叠，易于观察。切片的厚度应为3～4μ，组织蜡块过硬，切片刀或蜡块没固定好，会出现跳刀、切片成一截厚一截薄的现象。优质的组织切片要求切片较薄，平整，无刀痕，皱褶。切片太厚或呈波浪状厚薄不匀。贴片烤片：

烤片时间短，会造成染色时切片从载玻片上脱落或脱蜡不净，染的切片会着色浅、不上色或灰染；烤片时间长，会造成对组织的损伤。染色：

染色染色的程度包括脱蜡、浸水、染色、分化、促蓝、脱水、透明等过程。切片经过脱蜡至水，HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。要求组织结构清晰，色彩鲜艳，细胞核/细胞质对比分明。

组织病理切片质量的影响因素

2009-08-19 编辑： 【打印】 【关闭】

第四篇：组织切片课程设计

生物制片技术课程论文—

—鲤鱼脾脏组织结构

摘要：组织切片方法是教学、科研、病理检验工作中广泛应用的一种实验技术,所谓组织切片，即取动物某一实体器官上的组织块用包埋剂包埋，然后进行切片及染色的制片过程。在整个制片过程中，包括有取材与固定，脱水与透明，浸蜡与包埋，切片与粘片，染色与封固五大步骤。石蜡切片是组织切片方法中最为简单和常用的切片方法，本实验选择石蜡切片法制作鲤鱼肝脏组织切片。制作时需对每一步都必须认真对待，否则将达不到预期效果，甚至导致制片工作的彻底失败。本文就传统的石蜡组织切片方法进行了全面地改进试验研究，使组织固定完全，脱水彻底，透明适度，浸蜡充分，切片较薄，染色良好；不仅缩短时间，简化程序，节省药液，而且提高了组织切片的质量。

关键词：动物组织；HE染色；石蜡切片

Production and observation of the spleen tissue of fish Abstract: Tissue slice method is a kind of experimental technology.which widely used in teaching, scientific research and pathological examination.So called tissue slices, that is, the body of a solid organ on the tissue piece with paraffin embedded, and then slice and dyeing of the production process.In the entire production process, including the material and the fixation, dehydration and the transparency, the immersion wax and the embedding, the slicing and the sticky piece, the dye and the seal five big steps.Production, every step must be taken seriously, otherwise it will not achieve the desired results, and even lead to the failure of the production work.In this paper, the traditional method of tissue slicing has been comprehensively improved, which makes the tissue fixed, dehydrated, transparent and appropriate, the dip wax is sufficient, the slice is thin, and the dyeing is good.Key words: animal tissue;HE staining;Paraffin slice

一、实验目的

1,、通过对鲤鱼的结构观察，了解鱼类的主要特征以及鱼类适应于水生生活的形态特征。

2、了解生物制片主要方法；

3、掌握石蜡切片和H·E染色技术。基本设备及常用试剂

二、基本设备

1、显微镜：光学显微镜

2、切片机：轮转式、滑动式（平推式）、冰冻式、振动式。均有三组部件安装在牢固稳定的切片机身上：①刀架。②组织块夹具。③微动调节器。

3、恒温箱或干燥箱

恒温箱是切片不可缺少的设备，主要供浸蜡、烤片、烘烤清洗后的玻璃器皿及某些需要加温60℃以上时应用

4、冰箱 用于保存染液、试剂和药品并提供切片用冰

5、离心机

可供脱落细胞及染色体技术用

6、切片刀、天平、酸度计、定时钟、一般手术器械、染色缸、染色架、载玻片、盖玻片、常用玻璃器皿、毛笔、酒精灯等。

三、常用试剂

1、洗液

重铬酸钾300g 浓硫酸 300ml 自来水 3000ml，即重铬酸钾、硫酸与自来水之比为1：1：10。

先将重铬酸钾溶于水，如加热须待冷后，再缓缓加入浓硫酸，边加边搅。不准将水倒入浓硫酸内！另外，清洁液只能用于玻璃仪器的清洗，不能浸泡金属器械。

2、蛋白甘油：蛋清打泡，静置、过虑，加入等量甘油，充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。

3、盐酸-酒精：作分色用，100ml的70%酒精加入0.5或1ml浓盐酸。

4、酒精稀释液：用95%酒精稀释使用。如将95%酒精稀为70%酒精时，可取70ml的95%酒精加水至95ml即成，依次类推。

5、碱性水：0.1%氨水或1%碳酸锂水溶液6、10%福尔马林：

商品甲醛 10ml

水 90ml

7、苏木精溶液： 甲液：苏木精2g

无水酒精20ml 乙液：甲矾40g

蒸馏水400ml 丙液：高锰酸钾1g

蒸馏水16ml 三液分别溶化，然后将甲液注入乙液，再加丙液6ml，时时搅拌，加温至煮沸0.5-1 min，使速冷却后即可使用。

四、实验步骤

实验材料：新鲜的鲤鱼一条

1.杀死与取材：用手术刀和镊子按要求迅速找到鱼的脾脏，然后取出，要求动作迅速。

2.固定：使用小块组织固定法，取下的小块组织，立即置入10%福尔马林固定液中进行固定。

3.洗涤：因为小组织可不冲洗，所以本实验需要多次换水浸泡即可。4.脱水：先放入70%酒精中30min，然后80%酒精30min，95%酒精30min, 95%酒精30min, 无水酒精30min, 无水酒精30min，5.透明：比例为1:1的无水酒精和二甲苯混合（30min），二甲苯20min, 二甲苯10min.6.浸蜡与包埋：比例比1:1二甲苯和石蜡（30min）,石蜡30min，石蜡30min，包埋。

7.切片：将熔化好的石蜡倒入包埋框或包埋盒，用加温的镊子将组织块切面朝下放入，做好标记，冷却。完全凝固后，修整蜡块。将切片机准备好，调整好角度，固定好刀架、刀片和蜡块，切片厚度：6-8μm；转速：40至50次/min。8.染色：二甲苯（5 '）→1:1二甲苯+无水酒精（5'）→无水酒精（2'）→95%酒精（2'）→80%酒精（2'）→70%酒精（2'）→苏木精（15'）→自来水洗（2'）→1%盐酸酒精（30''）→自来水蓝化（15'）→蒸馏水（2'）→70%酒精（2'）→80%酒精（2'）→伊红（1'）→95%酒精（2'）→95%酒精（2'）→无水酒精（2'）→无水酒精（2'）→二甲苯（2'）→二甲苯（2'）

9.封固：切片经染色透明后，取出切片，滴一滴中性树胶，将盖玻片盖于切片上。贴上标签注明名称、编号。10.观察

五、总结与讨论

石蜡切片实验是细胞生物学实验的重要部分，迄今为止石蜡切片仍然是疾病诊断，尤其是病变性质判断的重要手段。石蜡切片过程中，最易受到操作人员实验技术影响的步骤是浸蜡、包埋，而且包埋效果直接影响到实验结果的好坏。正确应用动物组织切片技术与完成动物组织切片染色标本的制作好坏关系重大。

六、参考文献

[1] 刘育艳.制作优质实验动物组织切片的有效方法.山西医科大学学报.2001，21（3）：275-276.[2] 任成林，田勇，梁淑珍.动物组织HE染色石蜡切片技术的改进, 河北北方学院学报.2007，23（1）:41-45.[3] 袁广明，胡黎平，李燕，陈大堤，谢富康.成年斑马鱼石蜡连续切片的制作和苏木精-伊红染色.解剖学研究, 2006，28（1）:73-74.[4] 李华.浅谈制作实验动物组织石蜡切片的方法和体会.2011年全国病理技术新进展研讨会论文汇编.2011:171-173.[5] 何书海，陈宏智，焦凤超.动物病理组织切片制作方法的改良.动物医学进展 2011,32（11）:130-132.[6] 高书堂.在教学和科研中应用动物组织切片技术的体会.湖北教育学院学报.1992，(2).[7] 弯雪燕．常规石蜡切片中浸蜡包埋方法的改进[J]．诊断病理学杂志，2000，7(4)：303-304．

[8] 杨捷频．常规石蜡切片方法的改良[J]．生物学杂志，2006，23(1)：4546．

第五篇：组织切片技术

组织切片技术

姓名：许莎

班级：生技1学号：12772018

组织切片技术是研究生物组织或细胞形态和结构的重要技术，对于促进细胞生物学和遗传学等研究的发展起着重要作用。最早的制片技术是徒手切片技术，以后发展了利用石蜡进行包埋和切片的制片技术，即石蜡切片技术，该技术由于成本低，操作简单，目前仍在应用，该技术被越来越多的研究工作者应用于发育学、植物细胞学、胚胎学、解剖学等研究领域。

1组织切片技术原理

1.1原理

组织切片技术是研究组织形态学最常用的一项基本技术，在制作胚胎或组织切片时，由于细胞或组织是柔软的或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片很困难。为了能清晰地观察到组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬然后利用切片机将组织切成薄片。根据所用支持剂的种类不同，主要分为石蜡切片、冰冻切片、振动切片、火棉胶切片、塑料切片、碳蜡切片等。

1.2分类

1.2.1石蜡切片

该技术是最重要、最常用的组织切片技术之一，起始于18世纪。此法是用石蜡作为包埋剂，将材料经过固定、脱水、透明后包埋在石蜡中，然后连同石蜡用切片机一同进行切片。石蜡切片的主要优点是不仅可以把材料制成薄的切片，而且还能制成连续切片，这是其他制片技术难以做到的。它的缺点是操作步骤比较复杂，而且材料在脱水、透明过程中会收缩、[1]变硬、变脆，以致不易切片。1.2.2冰冻切片

冰冻切片是利用干冰或液氮等速冻剂使组织迅速冷冻硬化，将组织在冷冻状态下直接用切片机切片的一项技术。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。由于此法不需要经过各级乙醇的脱水、二甲苯的透明和浸蜡等步骤，因而较适合子脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。此种切片的优点是能较好的保存组织的RNA稳定性、较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，缺点是需要较高的设备要求;切片较厚，导致组织结构显示欠佳;通常不能进行连续切片。其主要操作技术和方法与石蜡切片过程和类似。1.2.3振动切片

是用振动切片机把新鲜的组织切成厚20-100pm的切片。此类切片的优缺点类似于冰冻切片。通常在切片后进行免疫染色然后再进行电镜切片,以此来弥补结构显示不清的不足。振动切片机主要用于新鲜或经过固定的动、植物标本的制片，切片时组织标本不需冰冻或包埋。因此.样品片既避免了冰晶破坏，又能保持其活性和细胞良好形态为免疫细胞化学研究以及脊髓和脑薄片的神经生物学研究提供了良好条件。振动式切片机可以对不同的材料进行切片，在应用范围上补充了使用传统切片机的不足，是当代电镜、解剖、组胚、生理、医院化工等实验系统最理想的快速制样切片仪器。1.2.4火棉胶切片

是以火棉胶为包埋剂浸入包埋组织。优点是可以切较硬的组织，缺点是操作比较麻烦费时,切片较厚,不能连续切片。1.2.5塑料切片

用干硬度大的组织标本的包埋。由于塑料包埋组织细胞收缩程度小，切片薄，有利于组织细胞细微结构的观察，加之新型塑料包埋剂的出现和聚合方法的改进使塑料包埋技术得到了更为广泛的应用。塑料包埋使用的包埋剂是各种树脂，未聚合的树脂为勤稠的液体.通过标本组织块的没润，树脂可渗透到组织间隙中。自发或在催化剂和加速剂的作用下，发生分子回的连接形成支架，支撑组织细胞结构，聚合完成后形成固体硬块。其优点是可以切出薄至0.5-2nm的切片，适用于同时作光镜和电镜检测。缺点是处理程序繁多,抗原活性易丢失。1.2.6碳蜡切片

以碳蜡为包埋剂，优点是组织固定水洗后不需脱水透明,可以直接浸碳蜡包埋,切片方法于石蜡切片相同，缺点是夏季温度较高时切片困难。

1.3制备方法

以石蜡切片为例，介绍切片标本的制备方法。

1.取材：根据科研和教学目的选择新鲜材料，然后进行适当的切取、分割。样品块要尽量小，以便于下一步固定。

2.固定：将选取的新鲜材料立即投人到固定液中，迅速杀死细胞以保持组织及细胞的原有结构。一般固定液的最少用量为所固定材料总体积的20倍。固定液的选择视材料的性质及制片的目的而定，一般要求尽快杀死并固定细胞和组织。石蜡切片常用的固定液有FAA固定液、卡诺固定液，此外，还有多聚甲醛、戊二醛、乙醇、乙酸等。

3.洗涤：材料固定后，用洗涤剂将材料中的固定液洗掉，以便进行切片的染色或制片，常用的洗涤剂有水或乙醇。

4.脱水：因为固定和洗涤后的材料含有大量的水分，而水和透明剂、包埋剂(石蜡)不相溶，所以必须经过脱水逐步、彻底除去材料中的水分，才能进行透明和包埋。常用的脱水剂是乙醇，另外还有乙醇、正丁醇、丙酮、环氧丙烷等。脱水过程应由低浓度到高浓度逐级进行，不可太快。否则会使细胞收缩或材料损坏。

5.透明：透明是脱水与浸蜡、脱水与封藏之间的桥梁。材料经脱水后，组织内部已没有水分，但脱水剂不能与石蜡相溶，致使石蜡不能进人细胞与组织。因此，需要一种既能与脱水剂混合又能与包埋刘石蜡相混合的溶剂来处理。透明在制片中很重要。如果组织不透明，表明脱水不彻底，必须重新返工，但返工效果往往不好，常用的透明剂有二甲苯、氯仿、冬青油等。

6.浸蜡：浸蜡是将石蜡包埋剂慢慢溶于浸有材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡逐渐渗人到材料的组织细胞中，最后使透明剂被石蜡取代。进人组织细胞中的石蜡，在熔点以下很快凝固成固体，凝固后的石蜡起支撑作用，使切片后的细胞组织固定在原位。

7.包埋:将透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡块。操作过程：包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。

8.切片:已包埋好的石蜡材料，在进行切片之前需先进行修快、固着。修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在干净黑纸上。切片操作时应注意随时关好停刀轧，不能对着蜡带讲话以免吹散蜡带;切片完毕，将刀取下擦净。涂上润滑油，放人盒内保存。9.粘片、展片：通过粘贴剂把合格蜡带贴在载玻片上，在贴的同时，借助水的张力使蜡带完全伸展、平贴在载玻片上，粘片和展片是在载玻片上同时完成的步骤。常用的粘贴剂有蛋白粘贴剂和明胶甘油粘贴剂两种

10.脱蜡、透明：在染色之前，需要用脱蜡剂溶去组织和细胞的石蜡，进一步清洗脱掉的石蜡，使细胞、组织透明清晰，用于脱蜡和透明的试剂是二甲苯。

11.染色：为了使植物组织和细胞各部分显像清楚，必须进行染色。运用不同的染色方法和选用不同的染色剂，使组织或细胞某一部分染上颜色，另一部分不染上颜色成为背景;或将不同部分染成不同的颜色，可使组织细胞在光学显微镜中显像清晰，便于观察。

12封片：切片染色后用胶类物质将其封固，以利于长期保存。

2切片技术的应用

2.1石蜡切片技术的应用

石蜡切片虽然是经典的方法但随着新的仪器和研究技术的不断问世，出现了与其他新的[2]技术方法相结合，从而开辟了许多新领域，增加了许多新的研究、观察内容，使组织学的观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察，定量计测，使细胞组织的形态、功能及代谢三结合，从而达到定性可靠、定位准确及定量可测，最终阐述了生命活动的最基本规律。

2.1.1三维重建

重建技术在阐明生物体组织结构与生理功能之间的关系以及在形态学、比较解剖学、细胞化学定位等领域的研究中有着重要的意义。早在1958年，Sjostrand就论证了这种方法的[3]可行性和可靠性，是最早报道利用组织切片进行骨二维重建的学者，随后LUCZ也用同样的方法进行了尝试，但是，由于当时的切片技术和计算机技术都较落后，故效果不如人意。4]直到2000年Mason[再次用同样的方法进行了三维重建。随着计算机技术的不断发展，这项技术在国际上正在继续进行广泛深入的研究，在国内也引起了广泛的研究兴趣，例如对血

[5]管大鼠松质骨、中国虚拟人行切片后三维重建，同时也对方法进行了很多研究。特别是目前正在研究的“中国虚拟人1号”，表明我国是继美、韩之后世界上第三个用人体切片合成虚拟人的国家。2.1.2免疫组化

组织制片技术与免疫学技术结合构成免疫组织化学技术，利用抗原与抗体的特异性结合原理，检测组织切片中细胞组织的多肽及蛋白质等大分子物质的定性和定位观察研究。冰冻切片手续简便，制片过程中抗原活性丢失少，但组织细胞形态较差;石蜡切片步骤繁多。一般石蜡包埋的组织切片用于检测胞浆或核内的抗原，不宜做表面抗原染色，乙醇、丙酮等固定剂对抗原破坏较轻，但结构保存较差。2.1.3原位杂交

随着分子生物学的发展，在Southern blot, Northern blot等分子杂交技术基础上建立了原位杂交技术。原位杂交技术具有高度的准确性和敏感性，它能在细胞甚至亚细胞的水平上定位特异性核酸分子序列。因而，这一技术是目前研究分子细胞生物学、发育学等方面的重要[6][7]手段。例如，在心肌石蜡切片中检测克山病(KSD)RNA ,在乳腺癌石蜡切片中检测ER mRNA, [8][9][10] PR mRNA，在骨组织石蜡切片中检测整合素R 1-mRNA，在肝组织中检测丙型肝炎病毒RNA2.1.4原位PCR

原位PCR技术是直接在细胞或组织标本上原位扩增目的DNA或RNA片断，并在原位检测其扩增产物的技术，它兼有PCR的敏感性和原位杂交的特异性。2.1.5组织芯片

组织芯片是将成百上千的小组织整齐排列在某一载件上从而组成的微缩组织切片。该技术利用并行化处理原则、微量化检测的优点，结合分子生物学和形态学原理，具有经济、简便快捷、信息量大的特点，能够在DNA,RNA和蛋白质水平检测基因表达。2.1.6检测凋亡

检测凋亡的方法很多，形态学观察是判断细胞凋亡的基本方法。可用于体内外细胞凋亡的研究，既可用于组织切片的原位检测，也可对培养细胞通过细胞涂片或切片的检测，特别是在常规石蜡组织切片中，可对凋亡细胞进行原位检测，监测某一或某些处理因素引起体内组织细胞凋亡的动态变化。

2.1.7石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析

石蜡包理组织切片与流式细胞术结合使用来测量DNA含量及倍体分析。由于制备样品技术的原因，过去许多流式分析资料仅限于采用鲜组织标本，Hedley等1983年首先报导了FCM分析石蜡包埋组织切片制备分散细胞悬液技术来进行DNA含量的检测，从组织切片中能获得足够数量的单个细胞，且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似，目前国内也在逐步开展这方面的研究。

2.2塑料切片技术的应用

2.2.1塑料切片技术在水稻生殖发育研究中的应用

利用塑料切片技术对水稻花粉、胚囊发育、受精和胚胎发生、胚乳发育以及突变体等进行深人研究，例如，以7022LR为包埋剂，塑料切片技术观察水稻IR36的胚胎发育过程。

参考文献：

[1] 梁化印，郭瑞峪.杜双存 等塑料切片技术介绍[1]临床与实脸病理学杂志.2004.20(5).[2] 刘能保，王西明.现代实用组织学与组织化学技术[M1湖北:湖北科学技术出版壮.[3] 王伯法，李玉松.黄高升等病理学技术 北京:人昆卫生出版社,2000

[4] 北京未来新世纪教育科学研究所主编,生物知识探讨,远方出版社,2006.01,第10页 [5] 李希平,夏寅,韩德民,等.基于虚拟中国人数据集的鼻部及颗骨解剖结构三维重建.中 国临床解剖学杂志,2004,22(4)[6] Delellis RA，etal.New teehoique singene Produetanalysis.ArehPatholLabMed 1987 [7] 任立群,赵志涛,孙波,等.石蜡包埋组织切片原位核酸杂交研究.白求恩医科大学学报, 2001 27(3)[8] 陆良勇,黄伟达,刘尚廉,等.应用RNA原位核酸杂交检测乳腺癌石蜡切片中ER rnRNA、PR1llRNA表达.中国组织化学与细胞化学杂志,2002,3,11(1):92, 97 [9] 刘少华,程刚,李声伟,等.石蜡包埋骨组织切片核酸原位杂交研究.临床口腔医学杂志, 2002,10,18(5)[10] 王春杰,胡沛臻,王文亮,等.原位杂交检测石蜡包埋组织中丙型肝炎病毒RNA.中国组 织化学与细胞化学杂志,1995,9,4(3)