第一篇：重组质粒的构建经验~~~
昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下： 1)克隆基因的酶切位点问题 2)载体酶切的问题 3)连接片段浓度比的问题 在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。NcoI4 NdeI6 NheI3 NotI8 PmeI6 SacI3 SalI3 SmaI3 HindIII 3 BstI8 SphI4 XhoI3 XbaI3 SmaI4 案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。大家引以为戒啊。现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。
二、载体酶切的问题
1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择NdeI和HindIII作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。
2、连接反应的对照。在实验中，这步骤属于质粒载体与外源DNA片段的连接反应。成功与否，很大程度上取决于与质粒和DNA片段的酶切效果。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源DNA片段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒DNA必须重新进行双酶切。实验案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。实验案例分析3：本实验室一个号称实验严谨的大博士，用KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。迁怒KpnI，在我不知情下扔掉实验室所有KpnI酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，后经鉴定HindIII位点失效。最后他责备本人暗中保留一手，没
有倾攮相授。呵呵，他不自责自己不思考，只是木着脑袋做实验，反倒咬一口解铃人，再说我在那以前也不知道他遇到什么难题。呵呵，你说冤不冤？这世道啊!也可看出，实验室人员之间相互交流相当重要。两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。
三、连接时两片段浓度比问题 一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。做好“
一、二”，16℃ 10小时后，每次都能有效地连接上。当然还有大肠杆菌感受觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，感觉还不错（特别声明我不是天为公司内线，呵呵）。这里介绍一个估测处DNA浓度的方法：DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法： 1． 取一平皿。
2． 薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固(4 ℃可以存一个星期)。3．平皿背面可以画成小方格。4． 一小格中点1 ul样品。5． 另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相当60 ng)6． 凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1：5至1：10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。
第二篇：基因重组质粒的构建与抽提
基因重组质粒的构建与抽提
摘要....................................................................................................................................................Ⅰ Abstract............................................................................................................................................Ⅱ 引言.......................................................................................................................................................1 1 材料与仪器、用品.........................................................................................................................2 2 原理与方法......................................................................................................................................3
2.1 获取目的基因.......................................................................................................................3
2.1.1提取RNA.................................................................................................................3 2.1.2 RNA反转录为cDNA............................................................................................3 2.1.3 聚合酶链式反应......................................................................................................4 2.2 回收目的基因.......................................................................................................................5
2.2.1 核酸电泳....................................................................................................................5 2.2.2 胶回收........................................................................................................................6 2.3 DNA分子体外连接.............................................................................................................7 2.4 转化.......................................................................................................................................7 2.5 抽提鉴定质粒.......................................................................................................................8 3 讨论...............................................................................................................................................10 3.1试剂.....................................................................................................................................11 3.2 核酸酶................................................................................................................................11 3.3 核酸电泳缓冲液...............................................................................................................11 3.4 胶回收效率........................................................................................................................11 3.5 DNA酶切位点..................................................................................................................11 3.6 转化效率............................................................................................................................11 3.7 试剂盒................................................................................................................................12 参考文献...........................................................................................................................................13 致谢....................................................................................................................错误！未定义书签。附录....................................................................................................................................................14
Contents Chinese Abstract............................................................................................................................Ⅰ Abstract.........................................................................................................................................Ⅱ Preface.............................................................................................................................................1 1 Materials and equipment, supplies...............................................................................................2 2 The principle and method.............................................................................................................2 2.1 Acquire target gene...............................................................................................................2 2.1.1 Extraction of RNA........................................................................................................2 2.1.2 RNA transcription for cDNA.........................................................................................3 2.1.3 Polymerase chain reaction..............................................................................................3 2.2 Recycling target gene............................................................................................................5 2.2.1 Nucleic acid electrophoresis...........................................................................................5 2.2.2 Plastic recycling.............................................................................................................4 2.3 Connection of DNA molecules in vitro.................................................................................5 2.4 Transformation......................................................................................................................2.5 Extraction and identification of plasmid...............................................................................6 3 Disguss.......................................................................................................................................10
3.1 Reagent................................................................................................................................11
3.2 Nuclease..............................................................................................................................11
3.3 The nucleic acid electrophoresis buffer...............................................................................11
3.4 Efficiency of plastic recycling.............................................................................................11
3.5 DNA enzyme loci................................................................................................................11
3.6 The efficiency of conversion...............................................................................................11
3.7 Kit........................................................................................................................................12 References.....................................................................................................................................10 Acknowledgement.........................................................................................................................10 Appendix.......................................................................................................................................10
引言
自噬是一种实现细胞本身代谢需要和某些细胞器更新的生命活动，该活动对于动物机体生长发育具有重要意义。自噬相关基因LC3通过与细菌质粒结合可以大量复制。质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。不同微管之间的差异，主要与结合于微管的非微管结构蛋白有关，它们参与微管结构的组装，维持微管的稳定LC3和微管与其他骨架纤维之间的连接，表现为广泛的功能性作用，该类蛋白被统称为微管相关蛋白，LC3即微管相关蛋白轻链3，作为动物机体的一个自噬相关基因，对于其自噬活动相关微管蛋白质表达具有重要意义，目前国内外对该基因研究逐步增多、不断深入。Vega-Naredo等研究表明LC3 调控对巨噬过程是至关重要的,因为蛋白质LC3-II定位自噬前体和自噬小体,它被认为是一个自噬标记，在其对两性哈德氏腺的实验中，免疫印迹分析显示了LC3-I和LC3-II两个对应波段[1]；Hanqing Dong等的发现表明,LC3 结合可能发生在脂滴表面,导致限制膜形成，在原位分隔脂滴的一部分，其他脂滴的候选识别是脂滴-相关蛋白质；Noboru Mizushima和Masaaki Komatsu的文章叙述了选择性自噬最有特性的基质是p62,它也被称为死骨片1 / SQSTM1，p62是广泛表达的细胞蛋白质,在动物中守恒,但在植物和真菌不是，在分隔膜中通过LC3-作用区域p62直接与LC3相互作用[3]。此次实习实验过程中，将该基因作为目的基因，采用基因克隆技术构建重组基因，并提取出目的基因。提取出的目的基因可成为相关研究、实验的组成环节，例如用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学检验，以及动物机体蛋白质表达控制研究、自噬研究等。
质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子，即细胞附殖粒、又称胞附殖粒。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中，总体多为原核生物。构建重组质粒指将目的基因，即外源基因，与具有自主复制能力的载体在体外人工连接，构建成新的重组DNA，随后抽提质粒可以将目的基因与细菌DNA分离，以获得高纯度的目的基因。笔者通过实验学习、实际动手操作，完成了此质粒的构建和抽提过程，并在文中阐述了获取目的基因后而进行的LC3基因克隆过程，其中使用GFP、RFP载体构建质粒。基因克隆又称为分子克隆，指采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子的过程。其是七十年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可简要叙述为分、切、连、转、选五个步骤。其最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制，即把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入细菌中，建立基因克隆体系。本实验构建含GFP-RFP-LC3基因的重组质粒，GFP、RFP分别为绿色和红色荧光基因；使用的T载体为克隆载体，符合基因工程的载体应具有的基本性质，包括在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，使外源重组的DNA片段得以扩增；分子量小，利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段，且在实验操作中也不易被机械剪切而破
[2]
坏；载体分子中具有两个以上的容易检测的遗传标记，以赋予宿主细胞的不同表型特征；载体具有较多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。
细胞中的RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质，最终获得高纯RNA产物的过程，目前，国内外提取RNA的技术均比较成熟，生产出的有关试剂盒利用分子量比较大的有机溶剂氯仿使有机相和无机相迅速分离，初步获取RNA，并进一步分离纯化。提取RNA后将其反转录并扩增，即可获得用于重组质粒的目的基因。重组质粒过程中利用了聚合酶链式反应（PCR）、琼脂糖凝胶电泳等方法。聚合酶链式反应是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术，它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生微克量的PCR产物。琼脂糖凝胶电泳以琼脂凝胶作为支持物，利用核酸分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。重组质粒构建后，使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒抽提质粒，本实验采取的离心法抽提质粒，即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。最后将得到的质粒送至有关生物公司测序，测序结果分析表明，目的基因片段存在于送检样品中，说明实验成功构建并获取了鸭RFP-GFP-LC3重组质粒。材料与仪器、用品
鸭肝脏组织，液氮，75%酒精，无水乙醇，氯仿，蒸馏水，普通双蒸水，琼脂糖，50倍浓度商品化TAE，2000bpDNA标准参照物（Marker），填充剂（Loading）,氨苄霉素，LB培养液，E.coli DH5a 菌株。
美国Omega RNA提取试剂盒，包含HiBin微型制备管，2毫升收集管，RNA-Solv试剂，RNA Wash 缓冲液 I，RNA Wash 缓冲液 II，DEPC水等。
AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，试剂盒中的试剂包括小量制备 制备管, 2毫升 微量离心管,1.5毫升 微量离心管, RNA酶 A, 缓冲液 S1, 缓冲液 S2,缓冲液 S3,缓冲液 W1, 缓冲液 W2 浓缩液，Eluent洗脱液。
AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，试剂盒中试剂包括缓冲液 W1，缓冲液 W2浓缩液，缓冲液 DE-A，缓冲液 DE-B，Eluent洗脱液。
RNA引物混合液，包含模版RNA，随机引物，无RNA酶双蒸水等。
反转录反应液，包含模版RNA引物变性溶液，随机引物，5倍浓度M-MLV 缓冲液，dNTP混合物，RNA酶抑制剂，RNA酶M-MLV，无RNA酶双蒸水。
一次性口罩，一次性手套，实验工作服，超净工作台，恒温培养箱，制冰机，研钵，移液器，枪头，无DNA酶和RNA酶的收集管，1.5毫升收集管，2毫升收集管,制备管，离心机，恒温水浴锅，振荡器，冰盒，酒精灯，蒸馏设备和用品（50毫升烧杯，蒸馏头，100℃温度计，冷凝管，接引管，三角瓶，铁夹，铁环，酒精灯，沸石，50m量筒，铁架台），PE管，PCR仪，锥形瓶，微波炉，水平电泳槽，电泳仪，电泳仪电源，记号笔，卫生纸，玻璃涂棒。原理与方法
2.1 获取目的基因 2.1.1提取RNA RNA提取的原理就是将细胞破碎裂解，利用一些试剂去除多糖、酚类、蛋白和DNA的污染，通过一系列的抽提、洗涤和沉淀，最终得到纯净的RNA的过程。影响RNA提取质量的因素有很多，尤其是RNA酶的污染。RNA酶无处不在，包括破碎细胞内的RNA酶,实验室空气、实验台上的酶，实验所用试剂中的酶,实验人员身上携带的酶以及实验器材的污染等等，而且RNA酶性质稳定，实验室很难做到完全隔离这个酶的作用[4]。RNA提取试剂盒的通病就是A260/A230普遍偏低，主要是因为RNA样品中易残留RNA酶的变性剂异硫氰酸胍和β-巯基乙醇，细胞裂解不彻底，导致核糖核酸不能完全释放出来。另外，有些细菌的细胞壁坚韧，一般温和的破壁方法很难将其完全破碎，降低了核糖核酸的量[5]。
本实验使用美国Omega RNA提取试剂盒。实验前，酒精充分消毒实验台、实验室空气，戴棉手套取适量液氮置于保温瓶中，将用酒精冲洗过的研钵泡入液氮中，同时将鸭的肝组织泡入液氮中，待两者充分冷冻，在研钵中研碎鸭肝组织。
操作步骤包括取适量组织粉末置于无DNA酶和RNA酶的收集管中，离心，5000转/分钟，5分钟，4℃。加1毫升RNA-Solv试剂，振荡混匀，室温孵化3分钟。加0.2 毫升氯仿（每1 毫升 RNA-Solv与组织混合液加0.2 毫升氯仿），盖好管盖，用手剧烈振荡15秒，冰上孵育10分钟。随后4°C，12000转/分钟，离心10分钟，离心后混合物分三层，RNA存在于最上层水相。将五分之四的RNA水层置于新的收集管，加三分之一收集管的无水乙醇。轻微混匀并离心后，小心吸出不大于700 微升的上层RNA水层液体于无RNA酶的制备管中，振荡混匀沉淀，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。重复上一步骤，再次离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。将制备管置于新的2毫升收集管，加400微升RNA Wash 缓冲液 I，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。用同一收集管，加500微升RNA Wash 缓冲液 II，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液，随后用空收集管离心，13000转/分钟，2分钟，20℃，完全干燥。干燥可使用的方法亦有用移液器将离心管内残余的液体吸出，打开管盖，将沉淀于超净台上晾5分钟；或将装有沉淀的管子盖紧盖子后，放进一次性手套中，然后打开管盖，稍微包扎手套后，于50°C烘箱中放置3分钟。最后洗提RNA，将制备管置于新的1.5毫升收集管，加入40微升的DEPC水，确保加入到制备管中央，随后室温静置2分钟，离心，13000转/分钟，1分钟，20℃。得到的RNA保存在超低温冰箱。2.1.2 RNA反转录为cDNA 反转录是以RNA为模板,通过反转录酶催化,以dNTP为原料，合成DNA的过程，是DNA
生物合成的一种特殊方式。反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶，即以RNA为模板催化DNA链的合成，合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′末端上，按磷酸到五碳糖(5'-3')的方向方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程[
6、7]。
操作步骤包括收集管中配制模版RNA引物混合液，为6微升体系，包含模版RNA2微升，随机引物1微升，无RNA酶双蒸水3微升。70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。离心数秒种使模版RNA引物的变性溶液聚集于收集管底部。在收集管中配制反转录反应液，为10微升体系，包含上述模版RNA引物变性溶液6微升，随机引物1微升，5倍浓度M-MLV 缓冲液2微升,dNTP混合物0.5微升，RNA酶抑制剂0.25微升，RNA酶M-MLV0.5微升，无RNA酶双蒸水0.75微升。因为本实验使用随机引物，所以先于30℃恒温水浴锅保温10分钟，然后42℃保温60分钟。70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA做好标记并保存于超低温冰箱。2.1.3 聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，它的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加[8]。聚合酶链式反应是利用DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地进行控制以得到多量脱氧核糖核酸[
9、10]。
本实验第一次聚合酶链式反应是用两对引物分别扩增cDNA为DNA,目的是判断哪一对引物扩增效果好，选择其进行DNA扩增。准备步骤包括制作双蒸水，首先取蒸馏水200 微升，于超净台点燃酒精灯，安装设备对蒸馏水再次蒸馏，PE管分装后放置于-20℃保存，注意操作完成后用酒精棉擦拭双手，禁用双手触碰PE管口。RNA引物获取，是将目的基因送至博士生物公司，由其进行引物的设计与合成；合成的引物经过真空冷冻干燥，呈薄膜状附在离心管中，盛有引物的离心管经过离心后开启，随后加入规定量的双蒸水合上管盖充分振荡使其溶解，备用。
操作步骤包括准备四个PE管，并分别标记为1-
1、1-
2、2-
1、2-2，将两对引物分别加入两个模版中，配制25微升体系，每管加入r-Tag酶12.5微升，上下游引物各0.25微升，dNTP1微升,模版3微升，双蒸水11微升。将所有PE管振荡，并瞬时离心一次，使管壁没有残留混合液，随后摆到双面板上；使用PCR扩增仪进行RNA扩增，打开电源开关，设置运行条件为94℃、5分钟，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分钟,72℃、10分钟，4℃、保存时长，循环30次。
2.2 回收目的基因
2.2.1 核酸电泳
核酸电泳，其中利用了琼脂糖凝胶，琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度[11]。将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA[12]，一般来说，需要分离的目的基因片段越大，琼脂糖浓度越小，凝胶密度越小，反之亦然。样品加入量加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散。每孔点样的体积一般少于25微升，吸取每一个样品时，操作需谨慎，没有颜色的样品需要加入填充剂。另外，电泳系统须加入适宜DNA标准参照物进行判定，过大或过小的标准参照物姐不利于判定结果。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳准备步骤包括核酸用琼脂糖凝胶制作，配制1%的琼脂糖凝胶，首先称取1.000g琼脂糖加入锥形瓶中，倒入100毫升电泳缓冲液TAE(50倍浓度TAE20毫升加1升水，混匀)，摇晃混匀后用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热两三分钟，在水龙头上冲凉冷却至60℃左右后加入10微升EB替代染料，在此过程中注意自身防护。同时用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子，将配好的琼脂糖凝胶液体倒入电泳槽，凝固约20分钟。溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块，倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
将完全凝固的琼脂糖凝胶放置在加有缓冲液的电泳槽，缓冲液一定要没过凝胶，由负极到正极电泳；琼脂糖加样时用移液抢将样品加至点样孔，动作稳重注意不要戳破凝胶导致滤液，点样是每孔加50微升样品混合液，标准参照物加10微升；接通电泳仪电源，调节电流为120A，电压为120V，开始电泳；约20分钟后样品跑到五分之四凝胶宽度，取出电泳胶，观察结果，以确定扩增目的基因引物为第一对或第二对(图1)。
图1 引物选择PCR结果
Figure 1 The result of PCR for primer choice 2.2.2 胶回收
cDNA扩增引物选择结果显示引物2的扩增效果较引物1好，因此选择引物2进行目的基因扩增。加入第二对引物进行第二次的聚合酶链式反应扩增DNA并回收产物，扩增使用高保真的连接酶。配制50微升体系，每管加入缓冲液15微升，高保真酶La Tag0.3微升，上下游引物各1.2微升，dNTP5微升,模版3微升，双蒸水24.3微升，随后将PE管振荡，并瞬时离心一次，使管壁没有残留；使用PCR扩增仪进行RNA扩增，运行条件为94℃、5分钟，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分钟,72℃、10分钟，10℃、保存时长，循环40次。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，配胶过程同上，点样时，每孔加50微升样品混合液和5微升Loading，然后接通电泳仪电源，调节电流为120Ma，电压为120V，开始电泳。约20分钟跑胶完成，观察结果（图2）。为对琼脂糖凝胶电泳的某一核酸条带做进一步分析，可对DNA进行胶回收
[
13、14]。
图2 cDNA扩增结果
Figure 2 cDNA amplification results 本实验使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒对目的片段切胶回收。准备步骤包括缓冲液 W2浓缩液中加入一定体积的无水乙醇，原因是此为第一次使用凝胶回收试剂盒。准备无核酸或核酸酶污染的Tip头、离心管。准备75℃水浴。试用前，检查缓冲液 DE-B是否出现沉淀，如出现应于70℃水浴加热并溶解。
操作步骤包括戴上防护帽在紫外灯下切下含有目的基因的DNA的琼脂凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎，计算凝胶重量，用加入凝胶后称量重量减去提前记录的1.5毫升离心管重量，该重量作为一个凝胶体积。加入3个凝胶体积的缓冲液 DE-A，混合均匀后于75℃加热，每而两三分钟间断混合，直至凝胶完全融化。加0.5个缓冲液 DE-A体积的缓冲液 DE-B，混合均匀。吸取上一步中的混合液，转移到DNA制备管，制备管置于2毫升离心管，离心，12000转/分钟，1分钟，弃去滤液。制备管置回2毫升离心管，加500毫升 缓冲液 W1，离心，12000转/分钟，0.5分钟，弃去滤液。制备管置回2毫升离心管，加700毫升 缓冲液 W2，离心，12000转/分钟，0.5分钟，弃去滤液。以同样的方法加700毫升缓冲液 W2洗涤一次，离心，12000转/分钟，0.5分钟，弃去滤液。制备管置回2毫升离心管，离心，12000转/分钟，1分钟，弃去滤液。将制备管置于洁净的1.5毫升离心管中，在制备膜中央加30微升 Eluent或去离子水，室温静置1分钟，离心，12000转/分钟，1分钟，洗脱DNA。得到的DNA保存至超低温冰箱。2.3 DNA分子体外连接
本实验采用卡那霉素抗性T载体连接，此步骤即重组DNA分子，为目的基因导入细菌细胞并复制的必要条件。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后，酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h过夜，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
T载体连接操作时，首先于小PCR管中配制50微升体系，包括Solution I 5微升，回收产物4.5微升，T载体0.5微升。随后混匀并于16℃连接过夜，连接时间至少8小时。2.4 转化
外源 DNA 与载体分子的连接即为 DNA 重组技术，这样重新组合的 DNA 分子叫做重组子。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过抗生素筛选法筛选出重组子，并可通过限制性核酸内切酶酶切，电泳，根据DNA Maker标准判断阳性重组子中是否含有目的基因。感受态细胞制作原理为细菌在0°C氯化钙低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态[15]。转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，即原核细胞或者真核细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法[16]。基因克隆中的转化过程原理为质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，可以在含抗菌素的培养基中生长，从而鉴别选择出转化子。
准备步骤包括配制LB培养基、LB固体培养基、含抗生素LB培养基。首先，每升LB培养基，需在超纯水中加入蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，溶解混匀；LB固体培养基是在每升LB培养基中加入15克琼脂糖，混匀加热溶解；制作含氨苄霉素培养基，称量固体LB微波炉加热3分钟，冲冷水至不烫手，按1：1000比例加入氨苄霉素，倒薄薄的一层于培养皿中，待其凝固，盖上培养皿盖子，倒置并标记。
操作步骤包括准备冰盒，打开42℃水恒温浴锅，将无抗LB提前放入37℃预热；从超低温冰箱取出E.coli DH5a 感受态菌株，将商品化DH5a 感受态细胞快速且温柔取于冰中，待其于冰中融化；在超净工作台作业，吸取10微升载体连接产物，缓慢加入感受
态中，反复抽吸三次混匀，动作需轻微，防止产生气泡，放入冰盒30分钟；将样品放入42℃中热激90秒，此为转化必须环节；冰浴2分钟，使其停止转化过程；将预热的无抗LB8微升加入样品中，放入摇床45分钟至60分钟，复苏感受态细胞；将涂菌棒用酒精灯灭菌，从冰箱取出培养基放入37℃温箱预热；将摇好后的样品4000g离心5分钟，弃去上清600微升，余200微升，目的是使得细菌浓度升高，将剩余200微升样品混匀，加到培养板上，用灭菌放凉的涂菌棒涂匀；涂菌后的培养基保存于37℃恒温箱过夜。
培养大肠杆菌，在培养基上37℃恒温培养大肠杆菌过夜，长出的菌落呈乳白色大圆点状菌，表面和背面颜色一致，菌落边缘整齐均匀，表面光滑湿润,分散分布于整个培养皿（图3）。随后挑菌、摇菌、获得菌液，用于筛选、抽提鉴定质粒。挑菌时在细菌间超净工作台作业，取10只试管标号，依次摆到试管架上，灼烧试管盖和镊子，用镊子拔下试管盖后，在此灼烧试管口和试管盖，倒入约三分之一的氨苄抗性LB，用镊子夹枪头挑去细菌，连同枪头扔进试管，灼烧管口和试管口，在火焰中盖上试管盖。摇菌是在37℃摇床，过夜后就得到了菌液。余下的菌落用封口膜封上放入4℃冰箱中保存。
图3 转化后大肠杆菌培养结果
Figure 3 The result of the e.coli bacteria after transformation 2.5 抽提鉴定质粒
质粒是在细菌细胞中染色体之外能够自主复制的共价闭合环状双螺旋的分子或遗传因子。质粒抽提原理即去除 RNA，且将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒[
17、18]。
本实验采用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒抽提质粒。
准备步骤包括RNA酶 A全部加入缓冲液 S1中并4℃贮存。准备无核酸或核酸酶污染的Tip头、离心管。缓冲液 W2浓缩液中加入指定体积的无水乙醇，原因是第一次使用试剂盒。试用前，检查缓冲液 S2是否出现沉淀，如有沉淀应于37℃水浴加热并溶解。
操作步骤包括取2毫升在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转/分钟,离心1分钟，弃尽上清。加250微升缓冲液 S1悬浮细菌沉淀，悬浮需要均匀，不能够有小的菌块，确认缓冲液W2中已加入无水乙醇。加250毫升，温和并充分地上下翻转6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤需要控制在5分钟之内。使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的和中的中和，降低溶菌效率。避免剧烈摇晃，否则可能导致基因组DNA的污染，此步骤需要控制在5分钟之内。采用离心法纯化质粒，吸取上一步骤中的离心上清并转移到制备管，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；将制备管置回离心管，加500微升 缓冲液 W1，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；加700微升 缓冲液 W1，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；加700微升 缓冲液 W1，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；将制备管置回2毫升离心管中，12000转/分钟,离心1分钟。将制备管移入新的1.5毫升离心管中，在制备管中央加80 微升的Eluent或去离子水，室温静置1分钟，12000转/分钟,离心1分钟，将Eluent或去离子水加热至65℃能提高洗脱效率。随后，质粒测序鉴定目的基因是否插入。菌液PCR后使用随机引物进行通测，引物合成及测序由北京华大生物公司完成（图4、5）。
图4 质粒基因组碱基序列
Figure 4 Plasmid genome base sequence
图5 质粒基因组测序峰
Figure 5 Plasmid genome sequencing 3 讨论
本文构建的目的基因LC3有关自噬活动，近年来，自噬在癌症免疫因素感染炎症和神经退行性变等领域的研究不断增加，准确地检测自噬基因对于研究自噬的生物学功能至关重要，根据LC3的特点构建重组质粒，从而获取大量LC3基因可作为自噬研究的组成环节。
本实验采用反转录的方法获取cDNA后，依据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳效果显示第二对引物扩增的条带比较清晰,由此选择第二对引物进行扩增，得到相应目的基因。采用T载体连接方法，将目的基因引入感受态大肠杆菌，进行基因克隆。转化子扩增后，将转化成功的质粒提取出，进行电泳、测序等进一步鉴定。转化后质粒的琼脂糖凝胶电泳结果显示出现约600bp的明亮条带,为目的基因条带，说明目的基因成功导入细菌质粒并复制，进一步的基因测序鉴定结果表明实验完成了鸭RFP-GFP-LC3重组质粒的构建。最后使用试剂盒提取并纯化质粒，得到多量目的基因LC3。
整个过程的每个环节中皆包含影响实验结果的因素，各个因素稍有变化既可能对实验结果造成量或质的影响，现将需要注意的几个重要因素及其影响讨论如下： 3.1试剂
试剂使用前应当仔细阅读说明书。如用于提取RNA的Omega RNA提取试剂盒，其中的缓冲液 W2 浓缩液在提取开始或贮存在室温条件前，必须用无水乙醇稀释，如果使用了未经处理浓缩液，则无法充分洗涤RNA，使得最后产物中存在大量杂质。3.2 核酸酶
注意保证实验环境中RNA酶量最小化，操作过程应迅速且谨慎，始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染用具；避免在操作中说话聊天，戴口罩以防止引起RNA酶污染；配制溶液用的酒精、异丙醇等应采用未开封的新瓶，使用专门配制的无RNA酶制备管、收集管。酶如果没有被充分隔绝，将减少甚至提取不出RNA。3.3 核酸电泳缓冲液
琼脂糖核酸电泳的缓冲系统在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的选择和浓度，而且不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响，凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，否则将导致实验结果参照不准。3.4 胶回收效率
将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶融化时间，从而提高回收率；勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外灯对DNA造成的损伤；融化凝胶时应当完全，避免残留降低回收率，以及阻塞制备管滤膜影响后续步骤也会降低回收效率。3.5 DNA酶切位点
基因克隆时选择载体DNA酶切位点时应注意两个酶切位点的距离不应过小，否则影响限制性内切酶识别切点；目的基因片段内部不应含有所选的酶切位点；实验后继应用的所有载体都尽可能含有所选的酶切位点，并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）[20]；选择较常用的酶切位点，两个酶切点至少隔上3个碱基；使用酶切效率高，且双酶切有共同缓冲液的酶。3.6 转化效率
为了提高转化效率, 实验中要考虑细胞生长状态和密度，不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液；细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制，DH5α菌株的OD600 为0.5 时,这时比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。
质粒的质量和浓度方面应注意用于转化的质粒DNA 应主要是超螺旋态DNA，转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低，1纳克的超螺旋态DNA 即可使50微升的感受态细胞达到饱和，一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的二十分之一[
18、19]。
试剂的质量方面应注意所用的试剂,如氯化钙等均需是最高纯度的，并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处；防止杂菌和杂DNA 的污染，整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管,Tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染[20], 否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。3.7 试剂盒
本实验使用了若干试剂盒，例如AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、美国Omega RNA提取试剂盒，使操作能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程，试剂盒中配备有相应使用说明书，按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果，使用试剂盒时要根据自己的实验需要选取专用提取试剂盒，如果不是专用试剂盒，提出的RNA不能确保其质量以及完整性，会影响RT-PCR、基因克隆、抽提质粒等后续实验的结果。
参考文献
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附录1：离心力和离心转速换算计算公式
RCF= 1.118 ×10-5×N2 ×R RCF表示相对离心力，单位为g N表示转速，单位为rpm（转/分）R表示离心半径，单位为cm。
本实验使用的离心机离心力和离心转速换算如下： 12000rpm=13205rcf 13000rpm=15497rcf
附录2：试剂稳定性
AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，试剂稳定性及贮存条件如下：
RNA酶 A，室温可以贮藏6个月，长期贮存于-20℃；缓冲液 S1为细菌悬浮液，加入RNA酶 A后，混合均匀，4℃贮存；缓冲液 S2为细菌裂解液，室温密闭贮存；缓冲液 S3为中和液，室温密闭贮存；缓冲液 W1为洗涤液，室温密闭贮存；缓冲液 W2为浓缩液或去盐液，使用前，按照试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存；Eluent为洗脱液，室温密闭贮存。的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，试剂稳定性及贮存条件如下：
缓冲液 W1为洗涤液，室温密闭贮存；缓冲液 W2 为浓缩液，又称去盐液，使用前，按照试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存；Eluent为洗脱液，室温密闭贮存；缓冲液 DE-A为凝胶融化剂，含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解，室温密闭贮存；缓冲液 DE-B为结合液，室温密闭贮存。
第三篇：质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析
涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？
参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：
1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！
【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：
1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】
未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解：
1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。
7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。
9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。
细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？ 参考见解：
1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。
2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。
3、判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。
4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意）另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂志。
为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出来的条带几乎没有，但是RNA很亮（没加RNA酶）？
溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解：
1、可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO2失效。RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较DNA明显的条带。
2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下．
3、可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高．如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提；或者买试剂盒提．用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的ＲＮＡ酶。
4、如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化（数量变多），很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等),然后使用一般的发放。
5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。
加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？ 裂解不完全,参考见解：
1、问题可能是发生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀？
2、可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。
3、可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。抽提DNA去除蛋白质时，为什么要是酚/氯仿混合使用？怎样使用酚与氯仿较好？ 参考见解：酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？
参考见解：保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以使用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？
参考见解：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，可以降低抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。加入酚/仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高？
乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的（PEG纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。参考见解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次检测溶液III反应完成后的离心上清pH是否在8.0左右？有时由于溶液III配置的问题，会出现溶液III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大的现象，这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开? 参考见解：
1、确认酶的有效性。
2、平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的）。
3、是否不小心吸入了痕量的酚。
4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。
5、乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切）。
碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时，看到的三条带分别是什么？ 参考见解：碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。提取质粒中RNA没有去除？ 可能是RNase失效或效率不高。参考见解：
1、更换RNase A，并保证其储存条件是正确的
2、手工提取质粒的，可单独增加一步去除RNA的步骤，溶液III反应后，在离心的上清中加RNase，室温下去除RNA 10min～30min（需要保证RNase A是经过失活DNase的），同时较高温度（如50℃）会更加快速完全的去除RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。
提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？ 参考见解：
1、质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象，如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。
2、当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。
3、可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚-氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿主菌再切。
4、NaOH的浓度过高，会出现火箭状的结果。
用碱裂解法提取质粒，裂解5分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒DNA15min。双酶切后跑胶一条带都没有，原因是什么？ 参考见解：
1、溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室RNase不同，这个条件是不同的。在溶解的过程要涡旋处理促进溶解。
2、确认一下酶切过程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切体系的Buffer或者是水，特别是水中；其次是酶切体系的问题；建议再把提取的产物用70%酒精重新洗涤一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。
3、也可能在用乙醇洗时把质粒倒掉了。
4、没有用RNase消化，不要用放久的 RNase否则会有DNA酶的污染；
5、在没有进行酶切时,把所提的质粒跑一下核酸电泳看看,如果是提核酸的问题那这一步电泳结果应该没有大于三千的条带,这样可以先排除核酸提取的问题.若是没有酶切时间过长等其他问题的话可以那可以检查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的问题，建议将超纯水换成TE。
用碱裂解法提取的质粒,取3ul转化感受态大肠杆菌涂amp抗性平板，却出现阳性克隆较少（含绿色荧光蛋白，阳性克隆应该显绿色，在紫外灯下非常明显，就几十个菌落）大部分菌落不发绿，这些菌落比发绿的菌落小一些的现象，为什么？ 参考见解：
1、做一次阴性对照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生长,说明amp过期,一般这种情况不多见。一般粉末状的amp不容易失效,如果amp有效的话,可以配制远高于标准的浓度,如果细菌耐药的话,也能生长良好,如不耐药,则放置数天仍不见细菌生长。
2、拿阴性和阳性的细菌各取数个放于高浓度的amp液体培养基中,如能生长,说明空白菌中带有耐药菌,建议换菌.3、提质粒的菌受污染了，重新划线挑单克隆。
培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒？
参考见解：如果是氨苄抗性的，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长，导致培养基中的beta-内酰胺酶过多，作用时间过长，同时培养基pH值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。|||谢谢楼主,还有什么专题也要贴出来啊!|||谢谢分享
到一个小tips。转帖过来和菜鸟分享。大虾凭手感就可以了,我们还是要学学的,受益匪浅
1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-„R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3.溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：
NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。
5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？
加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。
7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？
在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
8．如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？
采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最终PEG浓度为12％。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。
9．抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？
酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
10．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
11．为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？
因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
第四篇：质粒DNA抽提实验报告
质粒DNA抽提实验报告
一．实验目的：
1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCR扩增等。
2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度，构型，含量和分子量大小。
二．实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三．实验仪器及试剂：
1.5mlEP管、高速离心机、移液枪
溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶
溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．实验步骤:
1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min，去上清液（重复一次）
2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞
3、加200μl溶液Ⅱ，轻轻摇匀，放置5min
4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min
5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min
6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min 7、70%乙醇洗涤沉淀2次，风干
8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存备用
五．实验结果：得到大肠杆菌质粒DNA
PCR以及电泳实验报告
一．实验原理：
PCR：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
电泳：琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。
二．实验仪器及试剂：
EP管、离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪、移液枪、紫外透射检测仪等 DNA模板、与特定DNA模板结合的引物、去离子水、商业化的DNA聚合酶以及缓冲液、dNTP、DNA荧光染料溴化乙锭、琼脂糖凝胶
三．PCR反应体系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl
四．操作步骤 1、94℃预变性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循环7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循环23次 3、72℃，10s
4、电泳检测
五．实验结果分析
分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表：
如右图所示：实验所用的琼脂糖凝胶浓度为1.3%，实验的DNA条带位置在500bp-750bp之间，接近500bp，证明实验是成功的
2000bp 1000bp
750bp 500bp 250bp 100bp 实验组
对照组
第五篇：构建“学习型”企业文化经验材料
构建学习型企业文化
在实践中，逐步感到企业文化建设和创建型组织两级工作在基本属性、实现目标和操作手段上具有较强的一致性，形成了学习型企业文化的构想，在进行可行性论证的基础上，制定了构建工作的三年规划。重点从四个方面开展了构建工作。
一、把握构建学习型企业文化的正确方向
企业的学习型企业文化，是指体现学习型组织特征，具有自身特色的企业文化。
一是把普及知识、更新构建学习型企业文化的先导。举办领导干部培训班，聘请专家授课，参观国内知名企业，进行新理念、新知识的灌输。同时编印下发了《创建学习型企业文化之路》、等普及读物，并通过内部报刊、局域网、有线电视等宣传载体，加强学习型企业文化知识的普及力度，形成了构建工作的良好氛围。
二是把研讨论证的过程作为统一思想、形成共识的过程。单位领导班子定期对构建工作进行专题进行研究，多次组织机关处室和基层单位党政正职座谈研讨，广泛征求广大干部职工和意见和建议。同时在13个基层单位进行试点，利用简报推广交流构建的经验做法。通过多层次的研讨论证和实践，使构建工作既符合实际，又具有科学性和可操作性。
三是以提高认识来保证构建工作的正确定位。由于长期受计划经济体制的影响，单位的管理理念、思想观念相对滞后。因此，我们始终把解决认识问题作为构建学习型企业文化的关键环节。构建之初，主要是克服干部职工中存在的赶时髦、无用论金鼓齐鸣认识和畏难情绪；构建当中，重点解决构建工作政治化、口号化、文体化、表象化、僵硬化等倾向性问题；试点过程强调先进管理理念的培育和渗透。在实践中注意把复杂问题简单化，把简单问题理性化，提出了坚持以先进文化为引领、以促进企业发展为目的、继承与创新相统一等六条构建原则，保证了构建工作的正确定位。
二、搭建学习型企业文化操作平台
首先建立组织保证系统。单位分别成立了学习型企业文化领导委员会，明确了党政共同策划，第一管理者亲自主抓，班子成员以及各个部门分工负责，党政工团合力共建的领导格局，成立了推进办公室，加强对构建工作的总体策划、督查指导和力量协调；建立了联席会议制度，及时研究解决构建过程遇到的问题；组建了以部门领导牵头、分管部门参加的推进指导小组，促进构建工作的全面开展。其次是整合操作方法系统。综合运用系统思考、典型引路、领导示范、教育启迪、渗透灌输、规范养成、环境熏陶、借风造势、团队学习、深度汇谈等方法和途径，确保构建工作的稳步推进。再次是强化动力支持系统。把构建工作定位于一把手工程，纳入党政正职的岗位职责和考核，形成强大的牵引动力；选树先进，运用案例，发挥典型的引领动力；把职工作为构建的主体和动力源泉，体现全员参与的群体动力；充分好挥社会舆论、新闻媒体的监督作用，借助强大的舆论动力，推动工作的全面开展。
三、发挥创建学习型组织的驱动作用
学习型组织持续学习，勇于创新，不断超越的基本特征，为学习型企业文化赋予新的内涵，提供了强大驱动作用，这是我们构建工作的特色所在。
一是形成持续学习的导向。不断改进学习组织形式，探索创新以个人自学为基础、以知识共享为特征，集中学习与自学相结合、学习与实践反思相结合的团队学习方法。建立了政治理论政策法规学习、岗位专业知识学习、学历系统学习等多层次、多渠道、全方位的学习体系。整合教育资源，形成了分局职工培训中心、业务系统骨干技能基地和站段职工技能培训基地相配套的教育培训格局。把学习引人工作，使学习与工作有机结合，使干部职工树立工作学习化，学习工作化的理念，在分局上下形成了学习是岗位的职责、学习是工作的重要内容、学习是成长进步的唯一选择的共识。
二是建立勇于创新的机制。围绕管理创新、科技创新、文化创新，建立课题立项攻关责任机制，并将政治工作纳入软科学课题立项攻关，加大政治工作的文化含量。以民主、公正、公平、公开为原则，不断优化干部岗位职务化管理和公开招聘、竞争上岗机制，营造了干部能上能下，优秀人才脱颖而出的良好环境。在完善排队抓尾、竞争上岗和离岗培训制度的基础上，发挥工资杠杆作用，建立三工(优秀职工、合格职工、待岗职工)并存，动态转换机制。探索建立具有岗位特色的职工岗序管理体系，为职工创造一个事业需求和发展的空间，为职工职业生涯设计创造良好的氛围。
三是营造自我超越的氛围。自我加压、永不自满是我分局企业文化建设的一个鲜明特征，它推动分局的各项工作不断完善、不断进步，分局的企业文化建设由不自觉到自觉，由自发到有组织，由零散到逐步系统，每一步都是自我超越的结果。分局在确定核心价值体系时，一个重要的标准就是要体现自我超越的内涵。把自我超越作为一种工作导向，已经渗透到全分局干部职工的行为当中，成为激励干部职工努力工作、不断创新的行为理念。
四、强力打造四大文化体系
我们在精心培育一切为了旅客货主的企业价值观、人讲称职，事争一流的企业精神、实施三高(建设高素质的职工队伍，营造高品位的文化环境，提供高质量的运输服务)企业战略的基础上，本着头顶学习型组织和企业文化理论的天，脚踏石铁分局的地的指导思想，从实际出发，选准突破口，建设安全、服务、经营、管理四大文化体系。
以提高安全管理水平为重点，建设安全文化体系。为了加强对安全规律的认识和把握，针对安全生产的难点，成立了6个安全文化课题组，提炼了安全成在基础，贵在从严、听就听清，走就走到，说就说全，干就干实等十大安全基本理念，以让安全理念成为行为规范为主题，在职工中开展了我为安全誓句作画、画里话外征集活动。同时坚持以人为本的管理思想，广泛开展安全亲情化教育，创建自控型班组，选树十大安全标兵，使分局安全管理由传统的经验型向更加科学，更具人情味、人性化的方向转变。裁至2003年12月31日，胜利实现了第十个安全年，创建局以来的最好水平。
以打造诚信石铁为重点，建设服务文化体系。通过开展树立新理念、提供新服务、塑造新形象的教育活动，树立大服务的观念，形成后勤单位、两级机关为生产一线服务，一线单位为旅客货主服务的服务链。通过开展树名人、创名车、建名站活动，选树了客货服务十佳明星，培育了**站十心服务法、**客运段十项个性化服务措施等诚信品牌。
以推行精细管理为重点，建设管理文化体系。
在以人为本，以严治路，以诚兴企，以质取胜的管理理念指导下，我们对有关管理制度进行整合，在主要运输单位普遍开展了IS09凹0质量体系认证工作；探索制定涵盖每个部门、每个专业、每个工种、每个岗位的标准管理制度和岗位规范：强化逐级负责制的落实，建立完善各级管理人员在生产、安全、经营中的岗位职责和管理制度；在既有标准的基础上，逐步实施生产设施、办公场所、环境装饰等方面的识别规范，制定使用管理标准。
以扩大营销为重点。建设经营文化体系。开展营销知识的学习培训。把先进经营理念渗透到客货营销行为中。在增收节支攻坚战和节支降耗活动中，培育勤俭持奉，节俭办一切事情的经营理念。加强对货物运输的组织，保证均衡运输，为重点企业当好总调度长。大力挖掘运输潜能，扩大运输市场份额，开办第二货场，实行开放式服务，实现企业效益与社会效益的最大化。选树营销十大状元、增收节支十大能手，形成良好的经营工作导向。
全面推进学习型城区建设
在创建学习型城市工作中，**基本形成了领导重视、组织有力、形式灵活、载体多样的学习型城区创建格局，初步构建起高起点、多样化、开放性、广覆盖的学习型城区整体框架，有力推动了经济和社会事业的发展。
()区委成立了建设学习型城区指导委员会，聘请专家教授、知名学者组成建设学习型城区顾问团。组建了创建办公室，设专职副主任抓这项工作。建立了创建工作联席会制度，常委会定期分析、研究和部署创建工作。区委、区政府的领导都建立了各自的创建联系点。设立了学习型城区建设专项经费，每年投入100万元，13个街道也相应建立了1030万元的创建专项基金；配备完善中央党校远程教育C级接收设备；设立了50万元的干部学习奖励基金和50万元的干部培训基金；建成了4600多平方米的少儿图书馆和700多平方米的区史馆。
区委制定了《关于建设学习型常委班子的意见》、《党委中心组学习30条规定》等10多项学习制度，每月专题学习1至2次，每半年交流1次学习体会，每月向区委中心组成员推荐一篇理论文章和一本好书，每年编辑一部区级领导理论学习文集。分别在区委党校、区科技发展中心和区法院等处建立6个常委学习教育基地，定期开展专题讲座，激活学习兴奋点，提高学习质量。
我们把学习成果转化为发展的思路和行动。在思想观念上，实现了四个创新蛇6新地域发展现，树立小城区、大发展的意识；创新人才使用观，树立我用即我有意识；创新政策观，树立只要政策法规不限制就允许的意识；创新服务观，树立有限管理、无限服务的意识，推进服务型政府建设。在经济发展战略上，确立了跨越式发展思路和目标，加大招商51资力度。在精神文明建设上，促进各级领导班子和机关作风的转变，坚持从群众满意的事情做起，从群众不满意的事情改起，针对群众不满意的事成立专项治理组进行整顿，坚持每年为群众办几件实事。
搭建多元化的学习的平台，构筑社会化学习网络，建设没有围墙的学校，创造方便的学习条件，鼓励干部群众通过多种渠道和形式参与学习，最终形成人人学习、处处学习、终身学习的良好氛围，是我区建设学习型城区的基本环节。在组织机关干部和居民开展外语学习中，我们编印了市民外语100句和机关办公外语100句读本。从各学校抽调一批外语老师担任外语学习辅导员，开办英语沙龙，举办市民英语100句比赛和外语演讲比赛，并在出租车、交警、饭店、环卫等行业开展学习行业外语100句活动。在奥林匹克广场开设了规模宏大的市民外语角，每周六下午举办英语、日语、俄语等会话活动和外语节目展演、外语对话比赛，举办外国友人联欢会、外语学习成果展示等活动，现已举办了40多期。区四套班子领导多次参加外语角活动，也吸引了一些外籍教师和外国友人参与。同时我们发挥奥林匹克广场外语角的辐射作用，在全区69个社区全部建立了外语角，全区从周一到周日，每天都有外语角学习活动，使群众性的外语学习活动蓬勃开展起来。我们还制定了机关干部、社区居民和下岗职工学习计算机和网络知识的培训计划，分层次、多形式地开展学习活动。
在充分发挥区史馆、图书馆、社区教育学院、市民文化学校等主阵地作用的同时，全区13个街道都建立了文化教育阵地和街史馆，确定了学习教育基地和青少年教育基地。从机关、学校和共建部队抽调了224名同志组成兼职辅导员队伍，为每个社区配备了政治学习指导员、理论教育和文化学习辅导员，还为每个街道配备了一名社区教育专干。从大学招聘400名大学生志愿者，担任社区外语、计算机学习辅导员。还成立了时事政治讲师团、公民道德教育报告团、十六大报告辅导团、三个代表重要思想宣讲团、《市民文明公约》宣讲团，在机关、企业、学校、社区巡回报告。
为满足不同层次居民的学习需求，我们设计推出了四大学习载体：一是开办社区学习超市。根据不同层次、不同对象的学习要求，在社区推出不同内容的学习科目，供居民选择。举办适合老年人需求的书法绘画、营养保健和老年常见病的防治等讲座；针对青少年对科学文化知识的需求，51导和组织学生参加计算机、航模培训、科技夏令营和青春自护等活动；针对下岗职工再就业的渴望，举办一系列职业技能培训，使全区5000余名下岗职工实现了再就业。二是设立学习型城区宣传日，举办学习节。确定每年3月份最后一周为学习型城区宣传日，10月份最后一周为全民学习节。精心组织一系列学习讲座、报告会及其他教育文化活动，营造了浓厚的学习氛围。三是深入开展十进社区活动，即道德、科技、文体、卫生、法律、计生、城管、再就业、学习型组织、数字化进社区。把十进社区活动作为居民思想道德教育、法制教育和科学知识教育重要载体，结合开展丰富多彩的广场文化体育活动使居民群众既强健了体魄，又受到艺术熏陶。四是组织高层论坛。围绕全区经济建设和社会事业发展中的重大课题，举办**区新世纪发展论坛，请国内有关专家、学者和有关方面领导参加研讨交流，为加快我区现代化发展出谋划策，为区委区政府决策提供咨询。
（二）为把学习型城区创建活动长期坚持下去，激发和保持干部群众的学习积极性，我们建立了长效学习机制，规范创建工作。建立了辖区建设学习型城区联席会制度，整合利用辖区教育资源，开展同驻共建活动，做到优势互补，资源共享。辖区内学校、单位的文化场馆、阶梯教室、语音室、俱乐部等设施通过建的形式，最大限度地向社会开放。我们与市图书馆联办社区图书流通站，每月1000册新书在69个社区中流动周转；与**工人大学、广播电视大学联合创力、了社区大学、军人学历培训中心，满足了干部、群众和驻区士兵开展学习活动的需要。
我们把学习型城区创建工作纳入创建文明城区总体规划和我区精神文明建设金银铜奖的考评之中，强化对创建工作的考评。建立了各类学习型组织创建标准，进行分类指导；制定了学习型城区创建工作责任制，明确各有关部门的职责，确保学习型城区建设各项工作落到实处。
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