标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响

第一篇：标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响

标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响

在临床检测中，常常遇到溶血的标本。溶血对ELISA检测乙肝表面抗原（HBsAg）究竟是否有影响，各文献报道很不一致，本文对标本溶血的原因及其对ELISA检测乙肝表面抗原的影响进行简要的讨论。1 标本溶血的原因

溶血是临床检验中最常见的一种干扰和影响因素。溶血可分为体内溶血和体外溶血［1］。体内溶血可由物理因素（如人工心脏瓣膜或大血管手术后）、化学因素（如恶性疟）和药物毒性反应等因素引起。体外溶血可由物理因素（抽血时负压过大、水浴温度过高、冰冻、振荡等机械性破坏）、化学因素（血样接触表面活性剂）和代谢因素（如遗传病引起红细胞脆性增加）引起。

在临床上常见的引起标本溶血的原因包括 ［2］ :由于病人严重脱水、低血容量休克等原因导致穿刺困难造成的溶血;由于抽血器具质量不合格如真空管负压不够或塑料试管质量较差导致的溶血;用干燥管采血为了尽快分离血清用竹签搅拌不当引起的溶血等。2 标本溶血对乙肝表面抗原检测的影响

一些研究没有发现标本溶血对HBsAg检测的影响。李穗芬 ［3］ 对20例HBsAg阴性和10例HBsAg阳性病人的溶血和非溶血标本包括10例OD值在临界值附近的标本进行了对照，结果非溶血和溶血标本的阴、阳性结果完全一致。20例HBsAg阴性和10例OD值在临界值附近的样本，溶血与对应非溶血标本OD值间差异没有显著性;10例HBsAg阳性样品，溶血标本OD值明显大于对应非溶血标本OD值。因此得出结论，标本溶血不影响HBsAg结果的判定，只是使HBsAg阳性标本的OD值提高。许斌等［4］ 对HBˉsAg强阳性样品的非溶血与溶血（Hb浓度为241g/L）标本的A值作了对照后未发现两者有统计学差异，得出结论:溶血对HBsAg的检测没有影响（严格意义上应表述为:溶血对HBsAg强阳性标本的检测没有影响）。单桂秋等［5］ 的研究也显示，HBsAg阳性样品的非溶血与溶血标本的A值间经t检验差异无显著性。

其他的一些研究则发现，溶血对HBsAg的检测有影响。钱厚明等 ［6］发现，在17例溶血标本中，初检的5例HBsAg阳性标本，经重新抽血复检后有2例仍为阳性，另3例转阴。认为是溶血导致了假阳性的出现。刘玉振等 ［7］ 研究发现，溶血对HBsAg的检测有影响，当红细胞浓度>25%造成的溶血可导致假阳性。龙宪和等［8］ 研究发现，无论在健康人还是乙肝病毒感染者中，溶血均导致了ELISA一步法检测HBsAg假阳性结果的出现，而采用二步法则可以保证结果判读无误。标本溶血对乙肝表面抗原检测影响的可能机制

溶血是由于各种原因造成红细胞破坏，胞内血红蛋白（Hb）等物质和细胞内液进入血清。溶血对ELISA的影响主要是反应孔对溶血血清中Hb的非特异性吸附和溶血时细胞内液对血清的稀释作用。单桂秋等［5］ 的实验也证明了溶 血对血清具有稀释作用。

在ELISA试验中，酶标反应板孔包被物的浓度是一个相对定值，抗原抗体反应存在最适比例和后带现象，因此，HBsAg浓度与A值只是在一定的范围内呈一定的线性关系;当HBsAg达到一定浓度时A值的变化进入平台期;当HBsAg浓度太高时，A值反而会降低。因此，溶血可以使HBsAg浓度很高的样品的A值升高（在一定程度上解决了后带现象）;当HBsAg浓度与A值呈线性关系时才会因溶血的稀释作用使A值下降;当HBsAg浓度近临界值时，可能造成假阴性。

Hb具有类过氧化物酶活性，其作用与辣根过氧化物酶类似，如果反应孔非特异吸附Hb而残留，则可催化底物显色，使本底A值升高甚至造成假阳性。如果洗涤质量好，则可能大大减少或排除非特异性吸附的干扰。单桂秋等［5］ 的实验未体现血中Hb非特异性吸附的影响。龙宪和等 ［8］ 采用二步法操作可以排除溶血释出的Hb对HBsAg检测的影响也说明洗板质量在ELISA检测中的重要性。

总之，溶血对ELISA检测HBsAg有一定的影响，影响的性质及其大小因所使用的试剂、测定方法、标本HBsAg的有无及浓度高低、洗板的质量好坏而异。参考文献 靳敏.溶血对临床生化检验影响的探讨.广西医学，2002，24（9）:1363-1364.2 张小洁，刘建芝.真空采血标本溶血原因分析及预防措施.护士进修杂志，2001，16（3）:180.3 李穗芬.标本溶血对乙肝表面抗原检测的影响.广州医药，2001，32（5）:65.4 许斌，朱虎定.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨.临床检验杂志，2000，18（4）:232.5 单桂秋，苏建婷.溶血及脂浊样品对ELISA检测乙肝表面抗原的影响.临床检验杂志，1999，17（2）:102-103.6 钱厚明，赵江燕，张燕.应重视ELISA检测HBsAg灰区范围内样品的复检.上海医学检验杂志，2002，17（3）:156.7 刘玉振，张淑琴，马宏伟.溶血对抗-HCV、HBsAg等测定结果的影响.中国输血杂志，1999，12（1）:32-33.8 龙宪和，童华诚.溶血对乙型肝炎五项血清标志物检测结果的影响.中华医学检验杂志，1996，19（1）:47-48.作者单位:430061武警湖北总队医院检验科

第二篇：4.28标本溶血对乙肝表面抗原检测的影响

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溶血对乙型肝炎表面抗原检测的影响

乙型肝炎表面抗原的检测是诊断乙肝的主要指标，随着检验技术的不断发展酶联免疫法因其简便，灵敏度高，特异性强，不需要特殊设备的特点，而被广泛应用[1]。溶血是临床检验中最常见的一种干扰和影响因素[2]。除常见的红细胞破坏外，血小板、白细胞等血细胞破坏释放的某些胞内成分也可干扰或影响临床检验结果的判定。由于各种原因造成的溶血，非特异性物质对试验造成影响，致使检验结果出现假阳性，现分析如下 1资料与方法

1．1 一般资料

14例乙肝患者检查，86例健康人体检。

1．2试 剂

乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法 ELISA)，上海科华生物技术有限公司生产。

1．3方法

1．3．1 溶血血清制备，将待测血清放置于低温冰箱(-40℃)内冻20min后,取出融化,以3000r/min离心10mi n，分离溶血血清。溶血和不溶血各1份。

从冰箱取出试剂盒室温放置30min，微孔反应条中每孔加入待测标本50μL，设阴阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照(或阳性对照)各1滴,并设空白对照 1孔。然后每孔加入酶结合物1滴(空白对照除外)，充分混匀，封板，置37℃避光孵育30min，弃孔内液体，洗板5次后拍干。每孔加显色剂A和B各1滴，充分混匀，封板，置37℃避光孵育15min,目测比色，肉眼判断结果：显蓝色为阳㈩，无色为阴性㈠。

1．3．2 最后结果应用统计软件SPSS13.0进行分析。2结果

2．1 14 例溶血和不溶血乙型肝炎阳性结果完全一致。

2．2 68 例溶血和不溶血乙型肝炎表面抗原阴性结果完全一致。

2．3 18 例溶血雨不溶血乙型肝炎表面抗原结果不一致，出现假阳性。经二步法：从冰箱取出试剂盒室温放置30min。微孔的反映条件中各加入50μL待测液，并分阴阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照或阳性对照，各一滴，并设空白对照1孔，37℃避光孵育30min，弃空内液体、洗版5次拍干，每孔加酶结合物1滴（空白组除外），充分混匀，封板，然后在 37℃避光孵育30min，弃空内液体，本文档由www.xiexiebang.com云轩亭论文网整理提供！

洗版5次，拍干，加显色剂A和B各一滴，充分混匀，封板，然后在37℃避光孵育15min,目测比色并判断结果：HbsAg显蓝色为阳性，无色为阴性，结果均为阴性。结果经SPSS13.0分析，见表1：

表1 血液标本ELISA检测结果分析 乙肝患者（人）

检测结果 阳性（﹢）阴性（﹣）

F P 3讨论

3．1 引起溶血的常见原因及对策：

采血时发生的溶血：1注射器和容器不干燥，不清洁；2注射器与针头连接不好；3压脉带捆扎时间过长，淤血过久[3]；4抽血消毒时酒精未干就进行抽血；5穿刺不顺利损伤组织过多；6抽血速度过快针尖在静脉中探来探去；7血液注入容器中时未取下针头，或用力推出产生大量气泡；8在有血肿的地方采集血样；9渗透压的改变；10为了尽快分离血清，用竹签搅拌不当引起的溶血等；11用干燥管采血等。病人自身的因素；1病人自身有溶血性疾病；2由于病人严重脱水、低血容量休克等原因导致穿刺困难造成的溶血。

弄清楚了溶血的常见原因，在临床上，我们就要积极的避免这些因素的发生，定位准确因素，对症下药，规范要求，熟练操作，避免人为因素导致溶血的发生，从而使检测更加的准确。

3．2 溶血标本采用酶联免疫法（ELISA）检测

乙型肝炎表面抗原易出现假阳性分析原因．可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋 白中的亚铁血红素），能与聚 乙烯孔内预包被的抗原或抗体结合，在洗涤过程难以完全洗脱；也可能是谷胱甘肽等过氧化物酶的作用，谷胱甘肽广泛存在于人体组 织和细胞中，当溶血时，细胞内的过氧化物酶进入血浆，并大量吸附于细胞碎片及纤维蛋白原上，从而增加加样后微孔板洗涤的难度[4]，同辣根过氧化物酶作用相似，其可使过氧化氢释放出原生态氧，从而催化底物甲联苯胺生成可溶性物质显色，使乙型肝炎表面抗原易出现假阳性。由于一步法洗涤步骤往往难以完全洗脱，残留的过氧化物酶催化底物四甲基联苯胺显蓝色，使

Ag产生假阳性。二步法首先将血清洗掉，残留的过氧化物酶含量极微。温

健康人（人）溶血 18 68

1284.44 0．000

不溶血 0 86 溶血 14 0-2．4 溶血对阴性标本检测易出现假阳性，阳性标本无影响。本文档由www.xiexiebang.com云轩亭论文网整理提供！

育过程中不会与酶结合物所含抗原与抗体结合，再经第二次洗涤，大大降低了残留的可能性，保证了结果的准确无误。

3．3 对待结果要严谨

经过统计分析，见表1，我们可以看出，对于HbsAg阳性的标本检测溶血与不溶血的检测没有差别；对于健康者的检测，溶血与不溶血的检测，P<0.001,结果有统计学意义，说明两者间存在差异，这就要求我们的检验医师在对“健康者”的检测时，要慎重，出现假阳性后，建议采用二步法进一步检测，而对于新兵体检等要求严格的体检来说，直接采用 二步法检测；对于乙肝表面抗原阳性的溶血标本，其结果一定要慎重，务必做到准确无误，否则，会给患者带来极大的痛苦，造成极大的经济损失和精神压力。

参考文献：

第三篇：乙肝表面抗原ELISA检测程序

乙型肝炎病毒表面抗原ELISA法检测程序

1检验目的及原理

1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验

用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen以及Schuurs进行描述的。在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。HBsAg在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。

本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。方法性能参数

2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验(1)敏感性：

样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。(2)特异性：

使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。

标本

3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。3.2血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

3.3采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

3.4严重脂血、严重溶血原则上不会影响检测结果，但洗涤一定要彻底、干净。检测系统

4.1 组成

乙型肝炎病毒表面抗原两步夹心ELISA试验试剂盒(英科新创科技有限公司)主要组成成份：包被HBsAb的预包被微孔板、HRP标记抗体、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、HBsAg样品稀释液（含BSA缓冲液）、浓缩PBS-T缓冲液、底物A（含H2O2）、底物B（含TMB）、终止液（含2 M H2SO4）、封板膜，自封袋。

试剂信息：以上构成仅对英科新创（厦门）科技有限公司的试剂盒有效，批准文号（国药准字S10910148），试剂储存于2-8℃避光保存，有效期六个月。4.2 试剂配制

（1）PBS-T缓冲液：取浓缩PBS-T缓冲液若干，以蒸馏水或去离子水按照20倍稀释成应用液。

试剂保存：室温。4.3主要仪器

Tecan Sunrise酶标仪、汇松PW-960酶标洗板机、20～200 ul可调式微量移液器、25～56℃可调式气浴恒温振荡器。校准

可调式微量移液器由武汉市技监局校准完成，酶标仪、酶标洗板机、气浴恒温振荡器均由仪器生产厂家的技术支持部门负责每年一次技术校准。检验程序

6.1 操作步骤

6.1.1、平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18～25℃），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。

6.1.2、编号：取所需要数量微孔固定于支架，按序编号。6.1.3、稀释：每孔加入20 ul样品稀释液。

6.1.4、加样：分别在相应孔中加入100 ul待测样本血清、阴阳性对照血清或质控血清。6.1.5、温育：置37℃温育60分钟。

6.1.6、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。

6.1.7、加酶：在每一微孔中加入酶标记抗体50 ul。6.1.8、温育：置37℃温育30分钟。

6.1.9、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。

6.1.10、显色：每孔加底物A、底物B各50 ul，轻轻振荡混匀，37℃暗置30分钟。

6.1.11、终止：每孔加入终止液50 ul，混匀。

6.1.12、测定：用酶标仪双波长法450nm/630nm测定每一微孔OD值，记录结果。6.2 结果判断

6.2.1、临界值Cut off（CO）的计算：CO = 阴性对照OD均值×2.1 阴性对照OD均值低于0.05时，以0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。

6.2.2、样品OD值S / CO ≥ 1者，结果阳性

样品OD值S / CO ＜ 1者，结果阴性

6.2.3、如果阴性对照OD均值 >0.1或阳性对照OD均值< 0.4时，则表明不正常的操作或试剂盒已经变质损坏不能使用，需要重新试验，若问题仍然存在，应该立即停止使用该批号产品，并与试剂厂商联系。

6.2.4、注意：

A.通过以上检测阴性的样品，由于方法学以及其他不可控因素影响，不能绝对保证样本中没有低滴度抗原的存在，不能完全排除HBV感染的可能。

B.过以上检测阳性的样品，应通过人Anti-HBs的中和试验予以确认。如果样品在确证试验中发生中和，则该样品可以视为HBsAg呈阳性，无需进一步检测。质量控制

7.1 室内质量控制

室内质量控制血清的两个浓度值分别为：1 ng/ml、2 ng/ml，均购自卫生部临床检验中心，每批次试验加入两个水平质控血清各一孔，同其他待测样本一同记录S/CO值。

7.2室间质量控制：每年参加卫生部、湖北省以及武汉市临床检验中心乙型肝炎病毒表面抗原的质量评价。

7.3尽可能排除干扰因素对试验的影响。干扰因素及变异的潜在来源

以下类型的冻融过的样品可能会引起本实验结果的假阳性：含高滴度免疫球蛋白（IgG 骨髓瘤，IgM骨髓瘤，怀孕前3个月的妇女，流感疫苗受体），大肠杆菌抗体，抗-CMV阳性，抗-EBV阳性，抗-HSV阳性，风疹抗体阳性，霉菌感染，抗核抗体阳性，梅毒阳性，类风湿因子及弓形虫抗体阳性。结果计算及测量不准确度

无结果计算及测量不确定度 生物参考区间

无 患者检验结果可报告区间

阴阳性 警告/危急值

阳性为警告 安全性预警措施

13.1所有样本、试剂和各种废弃物应按传染物处理，潜藏有传染成分。目前尚没有已知的方法，能够确保人源制品或灭活微生物无传染性。因此，所有取自人源材料必须视为潜在的污染物质。

13.2强烈建议严格按照有关血液滋生病原体的标准对检测系统所使用试剂和人源标本进行处理。对于含有或怀疑含有污染物的制剂材料适用生物安全2级或其他相应的生物安全措施。这些预防措施应包括但不局限于以下内容：

A.处理样本或试剂时，佩戴手套。B.不要用嘴吸液。

C.不要在处理这些材料的区域内吸烟，吃东西，饮水，使用化妆品或戴取隐形眼镜。D.使用杀菌消毒剂，如0.5％次氯酸钠、84或其他相应的消毒剂，对样本或试剂的所有溢出物进行清洁和消毒。

E.按照当地政府规定，对所有样本，试剂和其他潜在传染材料进行去污和处理。13.3安全预防措施：终止液含有较低浓度H2SO4,对皮肤、眼睛有损伤。如果溶液不慎接触眼睛，立即用清水冲洗。如果刺激依然存在，则请求医护人员帮助。临床意义

乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科。完整的病毒称为Dane颗粒，直径42 nm，球形，其外层包膜即HBsAg，由病毒S基因编码，是病毒衣壳蛋白，包括S、前S1和前S2蛋白；HBsAg是病毒感染的主要标志。除Dane颗粒外，感染者血液中还存在16 – 25 nm的球状和杆状体，是病毒组装过剩的HBsAg。

由于病毒变异和感染者机体免疫状态的差异，少数血清HBsAg阴性者，也可检出HBV DNA。

第四篇：溶血标本对部分生化指标的影响

溶血标本对部分生化指标的影响

在工作中往往因各种原因导致标本溶血，而血清标本溶血时主要影响哪些指标，测定结果是否真实可靠，是所有检验工作者需要了解的问题。为了能及时客观地分析指标的变化是否具有临床意义，应当详细了解标本溶血对各项生化指标的影响。本文观察了部分常用生化指标在标本溶血前后检测结果的变化，旨在为标本溶血时血液生化结果分析提供一定的参考依据，尽量增加生化测定数据的可利用性。1资料与方法

1.1 与试剂 HITACHI 7070全自动（日本）。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、胆固醇（CHO）、血糖（GLU）生化分析试剂盒，均购自北京康大泰科医学科技有限公司。

1.2 溶血的血清标本的制备

健康体检者50人，禁食不禁水12h，各抽取静脉血4ml，分别注入两支干燥试管各2ml。其中一支让其自然凝固，另一支在血液凝固前用金属棒搅拌使其溶血，然后以3000r/min离心10min，去上清液分别为未溶血和溶血的血清标本。

1.3 生化指标的测定

用己糖激酶法测定血清葡萄糖（GLU），连续检测法测定谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST），重氮法测定总胆红素（TBIL），尿素酶—GLDH法测定尿素氮（BUN），苦味酸法测定肌酐（CRE），氧化酶法测定胆固醇（CHO），以上指标均用HITACHI 7070全自动生化分析仪测定。结果

溶血后AST、TBIL、ALT的值比溶血前的值高；CRE的值比溶血前的值低；GLU、BUN、CHO的值在溶血前后未见明显改变。讨论

3.1 谷草转氨酶（AST）

人红细胞中AST活性约为血浆中的40倍［1］。当标本溶血时，势必引起血清中AST活性的升高，从而使溶血标本的结果明显高于未溶血标本。AST主要是作为肝损伤的敏感指标，测定结果的偏高会导致假阳性的产生。故出现溶血标本应当在报告中注明。

3.2 谷丙转氨酶（ALT）

细胞内ALT含量比血浆中高约7倍，因此溶血后ALT含量测定的增高主要来源于细胞内ALT的大量释放。可见与AST相比，ALT受溶血影响轻些，故对标本的要求低一些，但在分析结果时要注意考虑溶血的影响。

3.3 总胆红素（TBIL）

笔者使用的试剂盒是用重氮法测定总胆红素的，最后生成紫红色的偶氮胆红素，主要在波长为540～560nm处有光吸收。而血红蛋白在波长540～550nm处有光吸收［2］，恰与偶氮胆红素的比色波长相近。因此溶血后红细胞破裂时大量血红蛋白进入血清，势必造成总胆红素测定值的升高，是总胆红素的正向干扰因素。此外，由于血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，溶血对重氮法测定胆红素同时存在负向干扰，使测定结果偏低，但该作用较轻微［3］，因此溶血后由于血红蛋白对测定结果的干扰，胆红素的测定结果往往偏高。

3.4 肌酐（CRE）

笔者使用的试剂盒是采用苦味酸法测定CRE的，而苦味酸特异性较差，易受其他还原性物质影响，主要是维生素C、酮体、丙酮酸等假肌酐干扰［4］。假肌酐物质也可与苦味酸形成颜色反应，导致测定值偏差。这种假肌酐物质红细胞中最多，血清中较少，故溶血后红细胞中假肌酐物质是造成测定值发生偏差的主要原因。

3.5 溶血原因及防止

高亚英［5］等认为溶血的原因主要是操作不当和抽血器具不合格造成的。结合我们日常工作分析造成溶血的可能原因主要包括：（1）由于抽血困难，采血时定位进针不准、针尖在血管中探来探去造成血肿等而发生溶血。（2）注射器和针头连接不紧，采血时空气进入，在抽取的血标本中混有泡沫，这种混有泡

沫的血标本，放置一定时间后泡沫破裂或迅速干燥，造成血细胞破坏而发生溶血。（3）血标本在运输过程中过度震荡或贮存不当。（4）不合格的塑料制品会因聚合不完全而具有毒性，这种毒性可造成溶血。（5）试管质量粗糙。因此，在采血、检验过程中必须注意细心操作，并注意注射器、针头和试管的质量。在报告检测结果时要注意溶血的影响，并在数据中加以标注。

【参考文献】 Thomas L,Haemolysis as influence and interference factor.The Journal of The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,1999,13(4).2 张敏，蒲彦武，阚玫.不同溶血度下20项生化试验结果分析.西北国防医学杂志，1997，18（4）：273-274.3 邱谷.溶血对重氮法血清胆红素测定的干扰分析.上海杂志，2000，15（6）：350.4 李影林.中华医学检验全书（上卷）.北京：人民卫生出版社，1997，641-860.5 高亚英，王晓明，蒋冬青，等.血液标本溶血原因分析及控制.交通医学，2002，16（1）：84.

第五篇：血清标本溶血对血液生化指标的影响

血清标本溶血对血液生化指标的影响45

血清标本溶血对血液生化指标的影响；李大磊1，史文华1，刘志峰1,2；1山东省天然药物工程技术研究中心；2烟台大学药学院山东省烟台市264005；摘要：目的探讨血清标本溶血对血液生化检验结果的影；关键词：溶血；生化检验；；Theinfluenceofhemolysiso；LIDa-lei1，SHIWen-hua1，LI；1．ShandongEngineerin

血清标本溶血对血液生化指标的影响 李大磊1，史文华1，刘志峰1,2 1山东省天然药物工程技术研究中心 2烟台大学药学院 山东省烟台市 264005 摘要：目的 探讨血清标本溶血对血液生化检验结果的影响，为药物安全性评价的长期毒性试验数据的分析提供一定的依据。方法 采用全自动生化分析仪检测10份正常大鼠血液标本在溶血前和溶血后血清葡萄糖(GLU)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐（Cre）、尿素氮(BUN)、胆固醇(CHO)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、钙（Ca++）、镁（Mg++）、钠（Na+）、钾（K+）、氯（Cl-）的值，并进行了比较和统计分析。结果 溶血后AST、TBIL、ALT、K+的值比溶血前的值高，具有统计学意义；Cre的值比溶血前的值低，统计差异显著；GLU、TP、ALB、BUN、CHO、ALP、Ca++、Mg++、Na+、Cl-的值溶血前后未见明显统计学意义的改变。结论 溶血对血清AST、TBIL、ALTK+、Cre有明显的干扰影响，提请在分析测定结果时注意溶血情况。

关键词：溶血；生化检验；

The influence of hemolysis on sericem biochemical tests LI Da-lei1，SHI Wen-hua1，LIU Zhi-feng1,2 1．Shandong Engineering Research Center for Natural Drugs, Yantai, Shandong 264003 2．School of Pharmacy, Yantai University, Yantai, Shandong 264005 Abstraet：Aim To observe the influence of hemolysis on the results of biochemical tests.Methods The blood collected from the rat divided into 2 samples, one of which is to process hemolysis serum, the other is to process normal serum.The serum biochemical data were detected respectively, which include glucose(GLU), alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), total protein(TP), albumin(ALB), creatinine(Cre), Blood uric nitrogen(BUN), cholesterol(CHO), alkaline phosphal ase(ALP), total bilinibin(TBIL), calcium(Ca++), magnesium(Mg++), natrium(Na+), kalium(K+), chlorin(Cl-).The data were treated with paired-test.Resluts The level of serum AST, TBIL, ALT and K+ increased in hemolysis samples than normal.The level of serum Cre in hemolysis samples is lower than normal.There is no significant difference in serum GLU, TP, ALB, BUN, CHO, Ca++, Mg++, Na+ and Cl-.These results indicate that hemolysis could interfere the results of serum AST, TBIL, ALT, K+ and Cre.The significance of hemolysis on serum biochemical analysis should be regarded in drug safety evaluation.Key words ：Hemolysis；Biochemical analysis 在新药安全性评价的长期毒性试验中，血液生化指标的分析对药物毒性作用的了解和毒作用靶器官的判断具有重要的意义，是评价药物毒性的重要依据之一。

长期毒性试验的血液生化分析具有其特殊性，例如动物尤其是小动物的采血是不可重复的；血液生化测定结果的统计分析受数据资料数的限制等。在工作中往往因各种原因导致标本溶血，溶血样本不参与结果分析往往使统计资料数偏少，因此血清标本溶血时主要影响哪些指标，测定结果是否可以参与统计数据的分析，是所有药物安全性评价工作者需要了解的问题。为了能及时客观地分析生化指标的变化是否具有临床意义，应当详细了解标本溶血对各项血液生化指标的影响。目前国内尚未见标本溶血对药物安全评价所要求的十几项血清生化指标影响的报道，本文观察了药物安全评价长期毒性试验中需要测定的生化指标在标本溶血前后检测结果的变化，旨在为标本溶血时血液生化结果分析提供一定的参考依据，尽量增加生化测定数据的可利用性。材料与方法 1.1 动物来源 SD大鼠，清洁级。由山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：鲁动质字D20021133。

1.2 仪器与试剂

AUTOLAB全自动生化分析仪（AMS，意大利）。血清电解质分析仪(MEDICA，美国，EASYLYTE PLUS)，试剂原装。血糖（GLU）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）、胆固醇（CHO）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、镁、钙血液生化分析试剂盒，均购自中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 溶血的血清标本的制备

取SD大鼠10只，雌雄各半。禁食不禁水12小时，用水合氯醛麻醉后腹主动脉取血6ml，分别注入两支干燥试管各3ml。其中一支让其自然凝固，另一支在血液凝固前用金属棒搅拌

使其溶血，然后以3 000 r*min-1离心10min，取上清液分别为未溶血和溶血的血清标本。

1.4 生化指标的测定

用葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖(GLU)、连续监测法测定谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)、双缩脲法测定总蛋白(TP)、溴甲酚绿法测定白蛋白(ALB)、苦味酸法测定肌酐（Cre）、两点动力法测定尿素氮(BUN)、酶比色法测定胆固醇(CHO)、连续监测法测定碱性磷酸酶(ALP)、重氮法测定总胆红素(TBIL)、邻甲酚酞络合酮比色法测定Ca++、二甲苯胺蓝法测定Mg++的值，以上指标均用AUTOLAB全自动生化分析仪测定。用EASYLYTE PLUS测定血清电解质Na+、K+、Cl-的值。结果

溶血后AST、TBIL、ALT、K+的值比溶血前的值高；Cre的值比溶血前的值低，GLU、TP、ALB、BUN、CHO、Ca++、Mg++、Na+、Cl-的值在溶血前后未见明显改变（表1）。

Table 1 The influence of sample hemolysis on biochemical tests（X±SD）biochemical datum AST(IU/L)ALT(IU/L)T-BIL(mg/dl)K+(mmol/l)ALP(IU/L)Cre(mg/dl)GLU(mg/dl)Cl-(mmol/l)TP(g/L)ALB(g/L)BUN(mg/dL)CHO(mg/dl)Ca++(mg/dl)Mg++(mg/dl)Na+(mmol/l)3 讨论

3.1.谷草转氨酶(AST)人红细胞中AST活性约为血浆中的40倍[1]。当标本溶血时，势必引起血清中AST活性的升高，从而使溶血标本的结果明显高于未溶血标本。AST主要是作为肝损伤的敏感指标，Normal Serum 131.5±19.5 42.8±8.5 0.13±0.05 4.6±0.3 255.5±112.4 0.83±0.18 105.5±22.4 107.4±3.7 60.2±4.6 17.2±1.8 20.5±3.8 48.7±6.9 18.8±7.2 1.5±0.8 133.8±1.9 Hemolysis serum 247.7±27.4** 49.9±6.3** 0.49±0.18** 5.9±0.5** 243.1±108.9** 0.61±0.19** 98.7±21.5* 109.0±2.6* 61.2±2.9 17.2±1.3 21.6±4.9 50.7±6.0 20.9±7.8 1.7±0.7 134.9±4.4 % 91.7 18.9 315.0 27.2-5.1-27.7-5.1 1.5 2.1 0.8 4.9 4.6 27.0 42.1 0.8 Compared with normal serum *P<0.05;**P<0.01.测定结果的偏高会导致假阳性的产生，严重影响了药物毒性的判断。故溶血标本AST的测定结果不能用于统计结果分析，若出现溶血标本，应当在报告中注明。

3.2 谷丙转氨酶(ALT)细胞内ALT含量比血浆中高约7倍，因此溶血后ALT含量测定的增高主要来源于细胞内ALT的大量释放。可见与AST相比，ALT受溶血影响轻些，故对样品的要求低一些，如果标本溶血不很严重，可以参与统计资料的处理，但在分析结果时要注意考虑溶血的影响。

3.3 总胆红素(TBIL)中生北控生物科技股份有限公司的测定试剂盒是用重氮法测定总胆红素的，最后生成红紫色的偶氮胆红素，主要在波长为540nm～560nm处有光吸收。而血红蛋白在波长540nm～550nm处有光吸收[2]，恰与偶氮胆红素的比色波长相近。因此溶血后红细胞破裂时大量血红蛋白进入血清，势必造成总胆红素测定值的升高，是总胆红素测定的正向干扰因素。此外，由于血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，溶血对重氮法测定胆红素同时存在负向干扰，使测定结果偏低，但该作用较轻微[3]，因此溶血后由于血红蛋白对测定结果的干扰，胆红素的测定结果往往偏高。

3.4 钾（K+）

钾是细胞内液的主要阳离子，约98％的钾存于细胞内，红细胞内钾浓度约为105mmol/L，而血清中仅有3.5 mmol/L～5.4 mmol/L[4]。因此溶血造成血清钾测定的增高主要来源于红细胞内中钾的大量释放。有报道表明血清游离血红蛋白在 2.5～2.8g / L时血清钾增高14%～16%，血清游离血红蛋白达 6.6g / L时血清钾增高可达41%[5]，因此在分析血清钾的结果时引起注意。

3.5 肌酐（Cre）

中生北控生物科技股份有限公司的测定试剂盒是采用苦味酸法测定Cre的。而苦味酸特异性较差，易受其它还原性物质影响，主要是维生素C、酮体、丙酮酸等假肌酐干扰[4]。假肌酐物质亦可与苦味酸形成颜色反应，导致测定值发生偏差。这种假肌酐物质红细胞中最多，血清中较少，故溶血后红细胞中假肌酐物质的释放是造成测定值发生偏差的主要原因。

3.6 血清葡萄糖(GLU)中生北控生物科技股份有限公司的测定试剂盒是采用葡萄糖氧化酶法测定GLU，葡萄糖氧化酶法的特异性较强，干扰物较少，而过氧化氢酶易受到其它物的影响，如维生素C、谷胱苷肽均因能竞争H2O2而导致负偏差[4]。3.7碱性磷酸酶(ALP)中生北控生物科技股份有限公司的测定试剂盒是采用连续监测法测定ALP的。连续监测法测定ALP是通过在405nm处连续监测生成的黄色对硝基酚氧离子，根据单位时间内吸光度的增加来算出ALP的活力，因此排除了血红蛋白在波长540nm～550nm处光吸收的影响。故溶血样本ALP测定结果降低的原因可能是红细胞破裂逸出了抑制ALP或底物反应的物质。

3.8 氯（Cl-）

血浆中氯约为103mmol/L，红细胞中氯约为49~54mmol/L。溶血会导致细胞内的氯离子转移到血清中，从而引起了血清氯离子测定值得升高。[4] 3.9溶血后对测定结果无明显影响的项目主要包括总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、胆固醇(CHO)、Ca++、Mg++和Na+。溶血后测定结果与未溶血时比较无统计学差异（P>0.05）。可能原因是这些项目的测定方法受溶血影响不大，因此在新药的安全评价时可以列入统计资料中进行统计分析和结果判定。

3.10 溶血原因及其防止

高亚英[6]等认为溶血的原因主要是操作不当和抽血器具不合格造成的。结合我们日常工作分析造成溶血的可能原因主要包括：（1）由于抽血困难，采血时定位进针不准、针尖在血管中探来探去造成血肿等而发生溶血。（2）注射器和针头连接不紧，采血时空气进入，在抽取的血标本中混有泡沫，这种混有泡沫的血标本，放置一定时间后泡沫破裂或迅速干燥，造成血细胞破坏而发生溶血。（3）血标本在运输过程中过度振荡或贮存不当。（4）不合格的塑料制品会因聚合不完全而具有毒性，这种毒性可造成溶血；（5）试管质量粗糙。

因此，在采血、检验过程中必须注意细心操作，并注意注射器、针头和试管的质量。样本发生溶血后血清谷草转氨酶(AST)不能参与统计结果的处理，其他指标在参与统计结果处理时，注意分析溶血的影响，并在数据中加以标注。

参考文献

1.Thomas L, Haemolysis as influence and interference factor.The Journal of The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine[J]，1999,13(4)２． 张敏，蒲彦武，阚玫． 不同溶血度下２０项生化试验结果分析． 西北国防医学杂志[J]，1997,18(4):273-274.3.邱谷．溶血对重氮法血清胆红素测定的干扰分析．上海医学检验杂志[J]，2000,15(6):350.4.李影林． 中华医学检验全书（上卷）[M] ． 北京：人民卫生出版社，1997,641-860.