第一篇：鲎法测定细菌内毒素影响因素的研究进展
鲎法测定细菌内毒素影响因素的研究进展
董培智（山西省药品检验所太原 030001 peizhid@263.net）
鲎试剂法是利用鲎血细胞溶解物（Limulus Amebocyte Lysate, LAL;Tachypleus Amebocyte Lysate,TAL）与微量（pg/ml级）细菌(主要是革兰氏阴性细菌,G-)的内毒素反应,从而检出被检物中内毒素的一种生物体外检测新技术。因为其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品等优点，自从一九**年美国学者Levin 和 Bang发现此法以来[1]，鲎法正被日益广泛地应用于医药卫生、食品卫生、环境卫生、分子生物学、以及微生物学中。
鲎法大致可分为凝胶法（Gel-colt end point or Gel-colt method,Gelation Assay）、比浊法（Turbridimetric Assay）色原基质法（Chromogenic Substrate method）、以及免疫法（Immunology Assay）等。本文依据文献报道，总结了近年来国内外学者在用这些方法测定细菌内毒素时发现的一些影响因素及其消除方法的研究进展，以供试验者参考。试验条件与操作 培养条件、操作环境可能引起各次实验之间、各实验室之间的结果差异[2]。1.1 时间
鲎试剂在液态时极不稳定, 室温放置太久会影响反应灵敏度，故加样结束后,应立即放入恒温水浴中。[3]延长保温时间，可提高LAL的灵敏度。[4] 有研究者[5]发现细菌内毒素国家标准品和工作标准品的不同混合时间与相对活性之间具有一定的规律，即５分钟时混合点的活性最强，混合时间越长，活性反而降低，但在三十分钟以内的各混合点测定的灵敏度均在规定范围之内。
在显色法中灵敏度与时间有关，故实验过程中既要严格控制每个环节的保温时间，又要严格控制终止时间[2][6][7]。1.2 温度
凝胶试验规定的孵化温度为37℃。但在夏季高温季节，如果同时作几个样，阳性对照不成立的现象时有发生，故应改为冰浴。[3] 郭录平[4]通过实验证明，保温在25-41℃内，随着温度的升高，LAL的灵敏度也随着升高；在41-46℃之间，对灵敏度无明显影响；≥48℃会破坏鲎试剂。
另外在显色法中的灵敏度也与控制温度有关[6][7]。1.3 pH值
高国政等人[8]用动态浊度法详细研究了样品pH 值对细菌内毒素测定的影响，结果发现：样品 pH 在6-8间实验结果稳定；pH ≤3 或≥12时，实验受到抑制，平均回收率≤56.8%。最后得出结论：使用TAL 时，供试品 pH 应预调在6.5-7.5 为好；使用 LAL 时，pH 应预调在6.2±0.1或 6.7-7.8为好。
也有人认为[4][7][9] 鲎试验的 pH 应为6.5-8.5，以7.0-7.5为佳。必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 调节 pH 值[2]。1.4 试验器具
内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度吸管。因为注射器刻度不准，而且,针栓壁磨沙面易吸附内毒素而使其浓度不够,造成凝胶反应不成立[3][10]。
普通玻璃及塑料管也会影响实验结果[2][9]，用硬的玻璃管及AR玻璃管较为合适。一般硼酸玻璃管测得的效价较低,而且LAL的灵敏度愈低，管对测定的结果影响愈大。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰结果。1.5 操作程序
有实验者发现[3][11]：操作次序也影响试验结果。应该先吸取供试品、然后加入阴性对照及阳性对照液，最后按供试品管、阳性对照管、阴性对照的顺序逐一精确加入鲎试剂。未按此程序容易出现阳性反应不成立的现象。1.6 处理作用
Pedersen MR和Hansen EW[12] 将内毒素溶液用玻璃试管干燥，在氧丙环（Ethylene Oxide，EO）450或900mg/l中暴露1-46小时后，内毒素的LAL活性减少至百分之三十。将多粘菌素B（Polymyxin B，PB）加入到内毒素稀释液中会减少其活性百分之七十五。内毒素经过EO处理会减少LAL活性百分之七十，进一步加入PB会减少LAL的活性百分之九十九。EO对内毒素的反应会减少其LAL活性，也会减少其热源反应，增加与PB的亲和性。
Bamba T[13] 等学者研究了平滑型G-细菌的内毒素（Smooth gram-negative bacteria，S-form)经过高温蒸气处理后的灭活效果，观察到不同种细菌的抗热性显著地不同，减弱率与浓度有关。低浓度（10ng/ml）内毒素处理后的活性可降低至可测定的限度下。粗糙型（Rough strains，R-form)细菌的内毒素减弱时间曲线与个别平滑型相似。平滑型，尤其是Rc突变体（Rc mutant）细菌的内毒素灭活性能够被Mg2+，Ca2+等二价阳离子显著影响。
FDA认为不同的产品处理和储存条件可能会引起对某一样品试验的分析误差。Guilfoyle DE [14]等人通过实验发现培养细菌的培养基以及溶剂的储藏温度均不会引起任何问题。然而，因为溶液在瓶中没有充分震荡，溶剂与橡胶塞接触，约有百分之二十到四十的内毒素丢失。解决此问题的方法是应将试剂直立地存放在无污染的瓶中，并规定在内毒素试验之前统一的混合步骤。
姜素云等[15]通过考察细菌内毒素的稳定性后发现，溶解后的细菌内毒素应用液（0.5-1.0Eu/ml）在0-4 ℃ 放置一周活性不变；1.0-20Eu 应用液若置冰箱，可冷冻保藏20天，但反复冻融活性会逐渐降低。2 供试品 2.1 多糖[2] 我们已经知道每毫升含皮克级的内毒素会使鲎试剂呈阳性，而多于10pg/ml浓度的产碱杆菌多糖（1-3-β-D-葡聚糖）（curdlan，1-3-beta-D-glucan）也会使常规的内毒素实验呈阳性，因为LAL中含G因子[16]。
据报道[17][18]，能激活鲎试剂旁路（G 途径）的物质主要是（1-3）-β-D-葡聚糖（包括（1-4）-β-D-葡聚糖和（1-6）-β-D-葡聚糖）以及LAL-RM（LAL-Reaction Material）两类，如真菌多糖（Fugal polysaccharide）、中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪（人工肾，血液透析仪）洗涤液等。实验室常用的酒精，棉球等也含有较多的（1-3）-β-D-葡聚糖。低于一定浓度的（1-3）-β-D-葡聚糖或LAL-RM不
足以使鲎试剂的凝集反应产生阳性结果，但如果有细菌内毒素共同作用的情况下，凝集反应会变得更为激烈和迅速，很容易使反应出现阳性结果。我国已生产出含有能抑制或阻断鲎试剂G因子旁路反应物质的试剂—增抗液（Antienhancement Solution）。
Cooper JF 和 Weary ME[19] 等学者发现商品的LAL试剂对葡聚糖的反应存在很大的差异，所以实验室间LAL实验的结果可能出现矛盾。动态LAL方法（Kinetic LAL methods）对筛选可能被葡聚糖污染了的物质非常有用。葡聚糖在非口服制剂中不常见，只限于被微生物或纤维素物质污染的产品。并设计了一种能确定葡聚糖存在与否的LAL试验方法。
另外，丹麦科学家[20]发现，细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应可被二甲亚砜与多粘菌素B（dimethyl sulfoxide and polymyxin B）合用,或抗鲎C因子的单克隆抗体（monoclonal antibody against Limulus factor C）所抑制。他们还发现β-葡聚糖（beta-glucan）激活途径能完全被昆布糖（laminarin）所阻碍，而不影响内毒素的激活途径。人血浆与LAL反应是通过β-葡聚糖途径激活的，而非内毒素途径。
八十年代后，日本最先研制成功只与内毒素起反应的特异鲎试剂，如：Endospecy，以及只与（1-3）-β-葡聚糖反应的鲎试剂：SLP试剂及Gluspecy。[21] 2.2蛋白
2.2.1阳离子蛋白
几位德国科学家[21]发现阳离子蛋白（Cationic proteins）如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G（lysozyme, ribonuclease A, and human IgG）能够与细菌内毒素形成细菌内毒素-蛋白复合体，对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，从而影响用鲎法来测定细菌内毒素。试验证明，苯酚提取法、稀释加热法、以及高氯酸处理（phenol extraction, dilution heating, and perchloric acid treatment）等方法都不能够解除此作用。胰岛素、糜蛋白酶、链酶蛋白酶（trypsin, chymotrypsin, or pronase）等只能回收10%-20%的内毒素，然而如在测定之前，用蛋白酶 K（proteinase K）来消化样品，可使细菌内毒素的回收率达到百分之百。进一步研究还发现，多聚-L-赖氨酸及多聚二甲亚胺（poly-L-lysine and poly ethyleneimine）作为细菌内毒素选择性配位基能够将细菌内毒素从所研究的蛋白上脱去，从而有利于进一步的测定。2.2.2 血蛋白
Roth R与IKaca W 证明[23][24]，血红蛋白能与LPS结合，这种结合会改变LPS的一些物理特性，从而增强了LPS的生物学活性及LPS与LAL的作用。
据报道[2][17][18]：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活 G因子。有学者的研究表明用一般鲎试剂测定的人血白蛋白、球蛋白等血液制品的阳性检出率明显高于用去G因子LAL测定的阳性率,而后者与兔热源检查结果基本一致。2.2.3 免疫蛋白
Baek L[25] 等人通过免疫电泳方法表明，假单孢绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞膜的一些可溶性抗原（Soluble antigens）与LAL能够反应。
有的学者[26]用鼠单克隆免疫球蛋白M抗体E5（mouse monoclonal IgM antibody E5）来测定其抗不同菌种LPS的活性。结果证明，由于细菌种类不同，经E5处理后，LPS活性减弱的程度也不同，一般地0.2mg/ml以上的E5能减少几乎所有被研究菌种的LPS对鲎试剂的活性。
另据报道 [18], 抗血友病球蛋白、免疫球蛋白也可激活 G 因子途径。2.3 离子
离子对细菌内毒素测定结果影响较大[9]，因为一方面离子强度较大会引起内毒素的聚集，加重低浓度内毒素不易散的问题；另一方面LAL中的C因子必须在二价阳离子的参与下才能被激活形成活化C因子。
Guyomard S;Darbord JC [13][27]介绍了用五种内毒素，即2株大肠杆菌、1株沙门氏杆菌、1株灵杆菌、1株霍乱弧菌（Escherichia coli, Salmonella, Serratia marcescens and Vibrio cholerae)与FDA推荐的内毒素EC5作LAL实验的重现性。发现添加Mg2+增强了LAL显色反应（160mmol/l最佳），而Ca2+浓度大于5mmol/l时抑制了此反应，0.3mmol/l的Zn2+会强烈地抑制反应。由Zn2+的部分抑制作用能被增加Mg2+而减弱（160mmol/l）。当在反应的第一步（细菌内毒素与LAL孵育）时添加这些二价阳离子会改变LAL显色反应，而在反应的第二步，即加入生色底物（chromogenic substrate）时这些阳离子则不会改变LAL生色反应。
据报道[7]当鲎血被抽出后，用3% NaCl 充分稀释(1:500)能阻止变形细胞凝集，即使有内毒素存在也不凝聚，但当有钙或镁离子存在时则很快凝固，由此可知钙、镁离子对于鲎试验的作用，但是过量的钙离子又会影响凝聚作用的完成。因此,当溶液中有EDTA等络合剂或肝素钠、柠檬酸钠等抗凝剂存在时，Ca2+，Mg2+离子将失去作用[2][9]，从而影响本法的测定。
有人在研究内毒素的电催化特性对于鲎试验的影响时，证明钍与铁对内毒素的活性有强烈的影响，但由于其在鲎血中的含量甚微，故并不干扰实际测定。[7] 生理盐水中的 NaCl 对显色反应有干扰[28]，但关键在于稀释样品和标准品须用相同的无热源水或无热源生理盐水。
相反,许多药物中含有的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性，可通过加入0.5mg/ml的氯化钙溶液，或22mg/ml的氯化镁溶液来排除干扰。[29] 2.4 有机盐
核酸钠（Sodium Nucleinate，NN）像细菌内毒素的LPS一样能够被LAL试验所检测，有学者[30]还比较了含有NN热原标准品的兔法与LAL法的测定结果。2.5 透析液
Berland Y[31]总结了在文献报导中有关透析液细菌性污染的资料。透析液中的G-小分子热源物质能够透过正常的透析膜。纤维性透析膜(Cellulosic hemodialysis membranes)比合成膜(synthetic membranes)更容易通过内毒素。聚砜膜及聚酰胺膜(Polysulfone membranes and polyamide membranes)在透析液的那一面能够吸收内毒素。所以，鲎试验不能够检出污染透析液的所有细菌性物质。
Laude-Sharp M[32]等人的实验证明:在体内具有生物活性的多种LPS能够通过透析膜，尽管在血液中没有测到LAL反应物质，所以LAL法作为测定生物液(biological fluids)中是否存在LPS的标准不够充分。日本学者 Yoshioka T [33]等人通过使用无G因子的凝集系统证明了从铜氨人造纤维膜(cuproammonium rayon membranes)得到的LAL反应物质不是内毒素，而是通过另一种途径使LAL凝集，此物质在循环中滞留相当长的时间。并发现在急性及慢性血液透析中，此反应物质平均水平为100-400pg/ml。仲卫华[34]等的实验证明，血液透析液有一定的干扰作用，但可通过稀释法消除。以上研究结果说明用鲎试剂来测定透析液中的内毒素的方法还有待于进一步的考察。
2.6 中药成分[21] 许多种中草药成分能够干扰LAL试验[35]，特别是清热解毒类药物[29]。2.7 生化药品[21] 姜素云[2][36]等证明，氨基酸对鲎试剂有较强的抑制作用。
孔祥文[28]通过实验证明，基因工程蛋白类药物生产中常用的 2-巯基乙醇、2-巯疏糖醇和还原性谷胱甘肽对鲎试验呈色反应有干扰作用，当稀释到5.0μmol/l时,抑制作用近乎消除。2.8 其它物质
另据报道[2][9][21][29]：人血中的多种凝血因子、可使蛋白质变性物质（乙醇、苯酚）或灭活的物质（如氧化剂、抗氧化剂、蛋白水解剂、专一失活剂等）、高糖溶液、络合物、电解质、维生素、添加剂、右旋糖酐-40、抗凝血剂如柠檬酸及肝磷脂等等，都可干扰鲎试剂形成凝胶。3鲎试剂与标准品 3．1 鲎试剂内源性因子
Roth RI与Tobias PS[37]在 研究含有能被细菌内毒素激发引起凝集反应的内毒素敏感因子的鲎试剂色析组份（chromatographic fraction of Limulus lysate）时,用了一种光复活性的、易解离的、放射性同位素标记（photoreactive, cleavable, radiolabeled）的沙门氏菌LPS衍生物（derivative of Salmonella minnesota LPS），LPS-（P-叠氮水杨酰胺）-1，3-二硫丙胺（LPS-(p-Azidosalicylamido)-1,3'-Dithiopropionamide，LPS-ASD），来确定LPS-结合蛋白。结果证明LAL组分中较大的82-kDa蛋白是LPS结合蛋白，充当凝集反应的负调节因子，LAL组分中较小的50-kDa蛋白是对LPS敏感的凝集蛋白的选择物。
日本科学家[38][39][40]发现在日本马蹄蟹（horseshoe crab(Tachypleus tridentatus)）血细胞中存在鲎胞间凝集抑制物（Limulus Intracellular Coagulation Inhibitor，LICI）1型、2型、及3型。LICI-1专一性抑制对鲎LPS-敏感的丝氨酸蛋白酶（limulus lipopolysaccharide-sensitive serine protease），C因子（K1=2.5×106 M-1，S-1）；而LICI-2显著抑制鲎凝集酶（limulus clotting enzyme）（K1=4.3×105 M-1，S-1）；LICI-3强烈抑制对（1，3）-β-D葡聚糖敏感的丝氨酸蛋白酶（(1,3)-beta-D-glucan-sensitive serine protease），G因子（K1=3.9×105 M-1，S-1）。因此，鲎血淋巴凝结过程至少由三个内源性因子所调节：LICI-1 是Mr=48，000，有394个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Arg-Ser-;LICI-2 是Mr=42，000，有386个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Lys-Ser-;LICI-3 是Mr=53，000，有392个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点与LICI-1相同。3．2 试剂质量
不同批号的鲎试剂标示值相同，但试验结果不尽相同，尤其是近效者的灵敏度有明显下降的趋势。所以在更换批号或者用近效期鲎试剂的时候，应对灵敏度进行复核。以确定本批鲎试剂的实际灵敏度。[3] 有的同志发现[11]：使用不同厂家生产的溶解水来溶解鲎试剂，结果会导致假阳性的出现，而使用同厂生产的鲎试剂及溶解水均符合规定。
另外，还有试验者发现[41][42][43]：不同厂家与批号的细菌内毒素工作标准品的灵敏度有很大的差别,有的竟低于50% 以下。支与支之间差异竟达50%。[10] 高丽云[44]在实验中发现如放置半年后重新标定, LAL灵敏度会下降,细菌内毒素工作标准品的效价低于标示量。这可能与细菌内毒素的处方、pH值、冷冻干燥过程以及冻干标准品中加入的如人清蛋白、乳糖、聚乙二醇等添加剂影响细菌内毒素的稳定性有关[2]。参考文献： Levin，J，and Bang, F.B.Bull Johns Hopkins Hosps.265-274(1964)2 陈菡芬 申蕴如 内毒素检查方法研究进展 国外医学药学分册 1992.19(5)3 陈雪梅 用鲎法检查内毒素阳性对照反应不成立时的浅见 中国药检药理工作通讯 1990；2（2）4 郭录平浅谈影响鲎试验的因素 中国药学杂志 1996.31(3)5 苑庆华 孙淑莲 叶志 细菌内毒素标准品溶解时不同混合时间对其活性的影响研究 第三届中日药品分析技术研讨会论文摘要集 1996.10 6 刘敏等 显色基质法测定输液中内毒素含量 中国药事 1996.10(6)7 李菊芬 鲎试剂对热源的检测及有关研究的进展 中国药检药理工作通讯 1991，3（2）8 高国政 颜锦 pH 值影响细菌内毒素测定的实验研究中国药学杂志 1998，33（3）James F.Cooper Resolving LAL Testing Interferences J Parent sci Tech 1991 44(1)13-15 10 侯庆源 鲎试验系统工程化 中国医院药学杂志 1997.17(1)11 姜锦发 用鲎法检查细菌内毒素时影响实验结果因素的探讨 中国药检药理工作通讯 1995，7（1）12 Pedersen MR;Hansen EW Inactivation of B.subtilis spores and E.coli endotoxin by ethylene oxide.J Clin Pharm Ther 1989 Oct;14(5):373-80 13 Bamba T;Matsui R;Watabe K Effect of steam-heat treatment with/without divalent cations on the 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第二篇：无菌药品生产中细菌内毒素控制措施
细菌内毒素控制措施
1.水
注射用水既是注射剂等药品制备中的一种重要原料，也是灌装无菌产品的包装容器、生产中使用的相关设备、管道、工器具等的最后洗涤用水，其水质好坏，对无菌产品质量的影响是至关重要的。注射用水水质最大污染风险是微生物和热源。
注射用水水质的污染包括外源性和内源性污染。外源性污染包括进料水、排气口或由于系统存在泄漏而与外界污染接触所致；内源性污染是系统运行中产生的，可能是水处理设备单元储存于分配系统的设计、选材、安装、运行、维护和使用不当产生利于微生物生存、繁殖的生物膜所致。
注射用水系统的水质保证体系包括硬件、软件和人员。即硬件方面的合理设计、精心安装、严密验证、达标运行、有效监控和及时维护，只有在具有一定素质的人员，严格按相关软件要求去认真操作和管理，才能制造出合格的注射用水。2.原料
用无菌过程生产的药品可能被一种或多种成分，在使用中可能受到微生物或内毒素的污染。应优先选择无菌原料药，无菌原料药精制工艺用水及直接接触无菌原料药的包装材料的最后洗涤用水应符合注射用水质量标准；其它原料药精制工艺用水应符合纯化水质量标准。于可能夹带内毒素的每批组分应有书面操作步骤及适当的接收或拒收标准。任何组分不符合规定的内毒素标准者都应该拒收。如果无法保证原料药中内毒素限度，应尽量制定企业内控标准。
常见的去除原料药内毒素的方法有离子交换法、有机溶剂析晶法、超滤法、吸附法和高温灭菌法等。
国外流行的的是无炭化生产。国内一般采取在药液配制时，采用0.1%活性炭吸附除去热原，达到控制内毒素的目的。试验表明，活性炭只能除去80~90%除热原，而且还容易带入很多不可知杂质。按照目前的条件，大多数厂家还是用的它，只是对于不耐热只能无菌灌装的药液，药液的温度不是活性炭除热源的理想温度，所以效果弱些。这时活性炭除热源可以按照少量多次的方法来进行，比一次加入全量效果要好。3.辅料 注射剂的辅料选择应遵循以下原则：①必须使用是前提（如稳定剂、增溶剂等）；②优先采用符合注射规格的辅料；③所用辅料的种类及用量应尽可能少；④应尽可能采用制剂剂常用的辅料（吐温80等）
对于非注射用辅料应严格控制，未批准供注射用的辅料：①在国外上市注射剂中已使用的进口辅料（原生产企业）。关注国外药用依据、执行标准及检验报告；②有注射使用依据，尚无符合注射用标准产品生产或进口的辅料。关注精制工艺及其选择依据、内控注射用标准的制定依据及其执行标准及检验报告；③必要时应关注其相关安全性试验资料。
对于非注射剂辅料，国内一般采取配制时，采用0.1%活性炭吸附除去辅料中的热原，达到控制内毒素的目的。4.工器具及包材 4.1 工器具的清洗
对于无热原的非胃肠道用药容器和密封件应该规定为无菌。使用加工方法的类型首先取决于容器和/ 或密封件材料的性质。这些过程的验证试验应适当地说明使得材料无菌和无热原的能力。书面程序应该规定这些过程再验证的频率,以及保持容器和密封件无菌、无热原的时间限度。
玻璃容器预灭菌准备通常涉及一系列的洗涤（如氢氧化钠溶液、纯化水）和冲洗（纯化水、注射用水）循环。这些循环在除去异物方面起了很重要的作用。冲洗用水必须高纯度，以免污染容器。对于非胃肠道用药,最后的冲洗水应该符合注射用水的标准。
除热原过程的适当性评价使用已知内毒素量的接种容器或密封件，然后测定其去热原后的内毒素含量。实施挑战性试验用重新标定的内毒素溶液，它可以直接放在表面上，并风干。阳性控制应该用于测定用测试方法回收的内毒素百分比。验证试验数据应该能够说明内毒素经过处理后减少了至少99.9 %。
玻璃容器一般用干热灭菌方法进行消毒灭菌和去热原。干热灭菌和去热原的验证应该包括适当的热分布和加热强度(热穿透)试验，以及用最差状态过程，容器特性(如质量)，负载配置等试验以体现实际的生产情况。
塑料容器的热原通常用多次注射用水冲洗除去。塑料容器也可以用适当的气体，辐射或其他适当的方法灭菌。气体灭菌可以用环氧乙烷，应该规定和密切注意环氧乙烷灭菌过程的参数和限度(如温度，压力，湿度，气体浓度，灭菌时间，除去气体，测定残留量)。在表示环氧乙烷和气体气体灭菌过程的有效性时，生物指示剂具有特别重要的作用。
胶塞(如:塞子和针芯)在最后蒸汽灭菌前要进行反复多次的洗涤冲洗循环清洁。至少最初洗涤过程冲洗的用水应该是纯水，为了把内毒素含量降低到最少，非胃肠道药品最后要用注射用水冲洗。一般通过多次用热的注射用水冲洗去热原。洗涤，干燥(如果需要时)，灭菌之间的时间应该尽量短，因为在塞子上残留的水分有利于微生物生长和产生热原。由于橡胶是热的不良导体，特别要注意验证过程中热量的利用，使之能够穿透胶塞负载。洗涤程序的验证应该能证明成功地把内毒素从橡胶制品中除去。胶塞硅化可能的污染源。制造胶塞时使用的硅应该符合适当的质量控制标准，对安全，质量，药品纯度不得产生负作用。委托生产单位的容器和密封件灭菌和/ 或去热原也应该符合自己生产同样的GMP 要求。生产成品药生产商负责审查和批准受委托单位的验证计划和最后的验证报告。4.2 容器/ 密封系统的检查
能够让空气和微生物进入的容器密封系统是不适合用于无菌产品的。在检查最终密封产品时应该查出并剔除破损和有缺陷的产品。应该要有安全措施以保证产品的运送不会影响容器密封系统的完整性,并导致失去无菌性。设备的适当性问题或接收的容器或密封件的缺陷已经引起了密封系统的完整性丧失。例如:由于设备缺陷或由于半成品运送失当，没有检查出西林瓶的碎片。导致药品召回。如果破损没有检查出来导致容器密封系统完整性破坏,应该迅速修改程序防止和检测出这些缺陷。给药装置(如:针筒缺陷,给药体积)的功能性缺陷也可能导致产品质量问题,应该通过适当的中间控制测试监控。在中间控制和最终检查中查出的任何缺陷或超过规格范围的结果都应该进行调查。5.人的影响 5.1 人员：
无菌过程的良好设计可以将人员的影响降低到最小。因为无菌过程作业中操作人员的活动增加,成品无菌的危险性也增加。为了保证维持产品的无菌性,涉及无菌作业的操作人员应该在任何时候都要遵守基本的无菌技术原则。
任何人在允许进入无菌生产区和进行操作前都应该适当培训。这些培训应该包括无菌技术、洁净室行为准则、微生物学、卫生、着装、非无菌产品对病人安全性的危害、无菌生产区操作等专门书面程序。经过初步培训,人员还需要根据经常性培训计划进无菌过程的良好设计可以将人员的影响降低到最小。因为无菌过程作业中操作人员的活动增加,成品无菌的危险性也增加。
为了保证维持产品的无菌性,涉及无菌作业的操作人员应该在任何时候都要遵守基本的无菌技术原则。任何人在允许进入无菌生产区和进行操作前都应该适当培训。这些培训应该包括无菌技术、洁净室行为准则、微生物学、卫生、着装、非无菌产品对病人安全性的危害、无菌生产区操作等专门书面程序。
经过初步培训,人员还需要根据经常性培训计划进行定期新内容的培训。管理人员要定期评价在实际操作中操作人员是否遵守书面程序的规定。同样,质量控制部门也要定期监察生产作业中是否符合规定的书面程序,基本的无菌技术。维护无菌物品和表面无菌性的技术包括: ◆只可用无菌仪器接触无菌物品
无菌仪器(如镊子),经常用于处理无菌物品。在使用间歇,仪器只应该放置在无菌容器中。需要时仪器可以在整个操作中替换。初步更衣后,无菌手套应该定期消毒,以尽可能减少污染危险。人员不得直接接触无菌产品,容器,密封件或关键表面。
◆缓慢,小心移动
快速移动会导致关键区域不可接受的湍流。这样的移动影响了无菌区域,使得挑战性试验不符合洁净室的设计和控制参数。缓慢,小心移动的原则适用整个洁净室。
◆保持整个身体不在单向空气流中
◆单向流设计用于保护无菌设备表面,容器、密封件和产品。在无菌生产区中,人员不得中断单向流通路。
◆进行合理操作以不影响产品的无菌性。
为了保证无菌产品周围环境的无菌性,人员应在产品的边上操作,不要在产品垂直单向流上操作。操作人员接近无菌生产线时,不得说话。◆保证适当的着装控制。
在无菌作业前和整个无菌生产过程中,操作人员不得有任何对服装会造成污染的活动。只有合格的,着装适当的人员才能允许进入无菌生产区。无菌生产区着装应为人体和暴露的无菌产品之间提供屏障,防止人体产生的微粒和微生物污染。服装应该无菌,没有碎屑,覆盖整个皮肤、头发(面罩,头罩,胡须罩,防护眼镜,弹力手套,洁净室靴子和鞋套为着装中的常用物品)应该有详细的书面程序说明用无菌方法穿着这些服装、部件的方法。着装各个部分之间应该重叠,以形成适当的屏障(如手套覆盖在衣袖上面)。如果着装有撕裂或破损时,应该立即更换。应指定计划定期评价或审计人员和相关无菌生产的符合性。应有无菌着装验收计划以评价洁净室操作人员在执行着装程序后保证着装质量的能力。着装验收应包括在着装表面取样点上的微生物取样(如:手套手指部分,口罩,前臂,脸颊及其他部位)。除了着装的最初评价,以后要定期再验收,并在一定时间后,监测不同的着装部位,以保证无菌着装技术持续的可接受性。对于自动化操作,半年一次或一年一次作再验收已经足够。因为人员没有涉及。为了保护暴露的无菌产品,人员应该保持着装的质量,严格执行无菌方法。应有适当的书面程序说明人员在什么情况下应重新培训、重新上岗或调离无菌岗位。5.2 监督计划
人员能够严重影响无菌产品生产的环境质量。应该建立警惕和负责的人员监督计划。通过每位操作人员每天或每个批号手套表面取样分析来进行监督。取样过程应对其他战略性选择的着装位置规定适当的取样频率。质量控制部门应该给劳动强度特别大的操作人员建立完整的监督计划。(如:需要重复和复杂无菌作业的人员)。
无菌对于无菌生产过程是最基础的。无菌生产区生产人员必须自始至终在整个操作过程中维持手套无污染。就在取样前进行手套消毒也是不适当的,因为它可能影响在无菌操作中的微生物回收。如果操作人员超过规定限度,或者有不良趋向,应该立即进行调查。并包括增加取样,增加观察,重新培训,重新验收着装,在某些情况下重新安排人员到无菌生产区以外工作。微生物趋向系统和非典型性趋向影响评估的详细讨论见Ⅺ实验室控制。6.生产环境
无菌生产设施必须有隔开的操作区域,它可以适当控制以获得操作性质所要求的不同质量水平的空气。规定区域的设计应该基于满足设备、成分、产品在该区域操作中对微生物和颗粒的要求。无菌生产的关键区域和控制区域应该根据验收试验中获得的有关微生物和颗粒数据分级和支持。虽然,最初的洁净室验收应该包括在空态(as2built)和静态条件下空气质量的评价,最后的洁净室和洁净区域的分级应该按照动态数据(即有人员存在,设备到位,操作在运行)。无菌生产工厂监督系统也应该评价规定洁净区域在动态条件下日常运作时的符合性。具体可参考GMP无菌制剂要求。
第三篇：影响土壤真菌多样性的土壤因素及土壤真菌研究进展
土壤真菌多样性研究及真菌分类方法研究进展
陈秋君 201231142005 经济管理学院12级20班
摘要：简述了土壤真菌的多样性以及影响土壤真菌多样性的因子，介绍了土壤真菌分类方法近年来的研究进展。
关键词：土壤真菌 多样性 影响因子 研究方法
0 引 言
真菌是一类种类繁多、分布广泛的真核微生物.真菌多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供大量未开发的生物资源方面起到了重要作用.真菌构成了土壤的大部分微生物生物量, 具有分解有机质, 为植物提供养分的功能, 是生态系统健康的指示物.在农业中, 真菌既降低粮食产量, 又为控制植物病虫害和其他真菌生物防治提供一条有效途径.对根际真菌结构和多样性的了解将有助于更好的了解真菌对病原菌的抑制功能.在林业中, 丛枝真菌与植物相互共生作用, 为植物提供养份, 使植物能耐受干旱或贫养的条件, 同时也提高了植物的多样性.在草地生态系统中, 分解者生物量总体中78% ~ 90%是真菌.20 世纪60 年代以来, 微生物生态学研究发展较快, 推动了土壤真菌学研究的发展, 人们对探究土壤中真菌存在的形式、数量、活性以及它们在物质转化中的重要作用等方面充满兴趣。70 年代以后人们更进一步认识到土壤真菌是微生物区系的主要成分, 并具有较高的生物活性。80 年代至今, 由于逐渐采用新的研究技术和手段, 土壤真菌研究的发展进入了一个新时期。
虽然真菌在陆地生态系统中有很重要的作用, 但是人们对自然界的真菌多样性了解还很少.受到全球气候变化、环境污染和人类活动等诸多因素的影响, 自然环境中真菌的种类和数量、分布都发生了显著的变化.土壤真菌研究越来越受到人们的重视。土壤真菌多样性
1.1 物种多样性
通常真菌被描述为具有真核, 能产生孢子、无叶绿素的有机体, 以吸收方式获得营养, 普遍以有性和无性两种方式进行繁殖, 菌丝通常是由丝状、分枝的枝细胞构成, 并典型地被细胞壁所包裹.真正意义的真菌包括四大类群, 壶菌门、接合菌门、子囊菌门、担子菌门.已知的壶菌约100 属, 1 000种.最新研究估计全世界的真菌种类约有150 万, 但至今已被正式描述的只有5%~ 10%[ 18~ 20] , 绝大多数是未知的.其原因一方面在于对真菌分离培养技术的依赖, 不能从少量材料中分离出目标生物, 缺少对所有真菌群落生物都适应的培养基和培养条件;另一方面在于对真菌生活环境缺乏全面了解, 不能准确地评价不同地域(特别是热带雨林地区)真菌群落的结构组成.1.2 生境多样性
真菌广泛分布在各种各样的土壤环境中, 包括农田、林地、草地、沼泽湿地、温泉热土、冻土层等.由于不同环境因子的影响, 使土壤真菌在其生活环境中形成独特的群落种类、组成和分布规律.例如在林地中外生菌根真菌的种类、数量较多, 而在草地生态系统中丛枝菌根真菌的分布比较广泛.在一些极端环境, 如南北极的冻土层中则分布着丰富的子囊菌门生物, 而在温泉热土中则与其他土壤例如林地的优势种类几乎完全不同.一些真菌的生活环境仍然没被完全的报道,真菌能否像细菌一样生活在一些极端环境中? 这有待我们进一步去发现新环境中新的种类, 并探索其生理机制.1.3 功能多样性
真菌在土壤生态系统中发挥着多种多样的功能, 包括降解纤维素、半纤维素、木质素、胶质、还原氮、溶解磷、螯合金属离子、产生青霉素等一些抗生素等.功能基因多样性又使我们对真菌功能多样性有了更进一步的理解, 使我们认识到真菌生物功能的差异是通过功能基因多样性来体现的.科学家通过从纯培养物和环境样品中扩增漆酶基因序列, 研究了美国东南部沼泽湿地中有木质素降解潜在功能的子囊菌漆酶序列多样性.独特的序列类型显示出真菌群落中这一功能基因的高度序列多样性.虽然这方面的研究受到许多因素的限制, 处于刚刚起步阶段, 但不失为我们未来发展的一个方向.真菌多样性分布影响因子的分析
2.1 种植年限对真菌多样性的影响
蔬菜种植年限对真菌的影响没有一定的规律性，总的说来，棚龄较短的较棚龄长的，土壤真菌的数量和种类都要多，但棚龄超过5 a 以后，真菌数量显著减少，不过一定周期后土壤真菌的数量又会逐渐增多，但只是少数种类真菌数量的增多，这可能与之适应了土壤环
境有关。种植年限对真菌种类的影响与对数量的影响趋势基本相同，到一定年限后，真菌种类呈现减少的趋势。
2.2 土壤碱解氮对真菌多样性的影响
土壤碱解氮含量的高低影响到土壤真菌的种类和数量。随着土壤碱解氮增多，土壤真菌的数量基本呈现出下降趋势，当土壤碱解氮低于50 mg/kg 时，真菌数量最多，达到29.49×104 cfu/g 土，高于300 mg/kg 时，真菌数量最少，仅为17.33×104 cfu/g 土。当碱解氮含量在100~300 mg/kg 之间时，真菌的种类最多，分别为44 种和35种。
2.3 土壤有效磷对真菌多样性的影响
土壤有效磷含量与土壤真菌的种类和数量之间相关性不大（表5），土壤中有效磷含量在10~50 mg/kg 之间时，土壤真菌的数量最多，极显著高于其他磷含量土样中的真菌数
量。有效磷含量为50~100 mg/kg 时，真菌种类最多，为46 种。而其他磷含量不同的土样中的真菌种类差异不大。
2.4 土壤速效钾对真菌多样性的影响
速效钾含量在250~350 mg/kg 之间时真菌数量和种类均最多，分别为21.49×104 cfu/g 土和40 种，显著高于其他土样中的真菌的种类和数量。
2.5 有机肥对真菌多样性的影响
随着土壤有机肥含量的升高，土壤真菌的种类和数量也在上升，当有机质高于40 g/kg，土壤真菌的种类和数量均最高，分别为22.86×104 cfu/g 土和55 种，经过分析得出，有机肥含量与土壤真菌的数量和种类的相关系数分别为0.976和0.960。
2.6 土壤含水量对真菌多样性的影响
土壤含水量在10%~25%之间适宜真菌的生存和繁殖，在这其间真菌的数量差异不大，土壤含水量过高或过低，真菌数量均明显下降。同样，土壤含水量对真菌种类的影响也如此，土壤含水量在10%~30%之间，土壤真菌种类较多，其中含水量在15%~20%之间真菌种 类最多，为50种。
2.7 土壤质地对真菌多样性的影响
土壤质地对真菌的种类和数量影响较大，轻壤土中真菌数量最多，为23.98×104cfu/g 土，极显著高于其他类型土壤中的真菌数量。但中壤土真菌种类最多，为68种，其次是轻壤土中的真菌种类，但中壤偏重和砂壤偏轻土壤中真菌种类最少，仅为1种。关于影响土壤真菌多样性因子的讨论
土壤真菌的数量和种类受耕作制度、土壤层次、气候变化及土壤类型等诸多因素影响，轮作与连作对土壤细菌数、真菌数和放线菌数均有较大影响，设施栽培条件下，轮作有利于土壤微生物群落的多样性和稳定性的提高，有利于土壤生态环境的改善。
施肥能不同程度地促进或抑制土壤微生物数量，影响根际土壤生理活性，尤其是有机肥能够促进蔬菜根际真菌的繁殖。
种植的蔬菜种类也影响土壤真菌的数量和种类。保护地种植年限的延长后，土壤中病原菌如镰孢菌、致病疫霉、链格孢、丝核菌的数量得到累积，一旦发病条件适宜就会造成病害的流行，给蔬菜生产带来巨大的损失。
但土传病害的抑制在一定程度上是土壤微生物的群体作用，土壤微生物群落结构越丰富，物种越均匀，多样性越高时，对抗病原菌的综合能力就越强，这也是单一或少数拮抗菌往往难以成功拮抗病原菌的原因之一。由于土壤条件复杂，微生物之间的作用关系微妙，而化学农药的大量施用，又会杀掉许多有益微生物，破坏土壤生态系统平衡，使病害更加猖獗，因此应采取各种农业综合措施，如通过施肥和轮作等来改善土壤条件，调整和优化土壤微生态结构，使土壤中病原菌数目下降到不至于引起作物病害造成经济损失程度。真菌分类技术在土壤真菌研究中的应用和发展
早在数千年前真菌就已被人类认识和利用,但对真菌的系统研究却只有200 多年的历史。此间, 主要依据形态特征描述和鉴定真菌的属和种,并且在比较形态学的基础上建立了一些分类系统。随着人类整体科学技术水平的不断提高, 真菌分类研究技术也得到了不断的发展、完善和补充, 大大推动了真菌分类研究的进展。到目前为止, 已被描述的真菌约有1 万多属, 12 万多种, 而且还不断有新的真菌属、种被陆续发现。
4.1 传统分类方法
经过多代真菌分类学家们200 多年的不懈努力, 已形成了比较完善的真菌分类体系, 对科学研究和生产实践起着重要的指导作用。
到目前为止, 由以形态学为主的传统分类方法为基础, 建立的分类系统在分类学界仍占据着举足轻重的作用, 99%的真菌属、种级分类单位仍然是建立在传统分类研究基础上的, 并仍在为人类认识真菌物种、了解和利用真菌资源发挥着重要作用。不同真菌分类学家对一些分类特征的认识和理解不同, 提出的真菌分类系统就不同。具有较大影响的真菌分类系统有以Ainsworth为代表的分类系统、Hawksworth分类系统、Kirk分类系统、Alexopoulos分类系统及Kendrick分类系统等。上述分类系统都基本上是基于主要形态学为依据的传统分类方法。传统分类方法主要依据真菌的形态、生理和生化特征等对真菌进行分类。
尽管传统分类方法有一定的局限性, 但是, 目前仍是相当有效而且可靠的方法, 是大多数分类专家所乐于采用和接受的, 仍然是发展其它现代分类方法的重要基础。离开传统分类系统和方法这个基础, 真菌分类学就会成为无源之水, 无本之木。况且, 传统分类方法本身也正处于不断发展和完善的新阶段, 并不排除采用分子生物学、生理学、生态学和生物化学等学科的新进展和新方法,来不断地改进和提高真菌分类研究工作。生物分类研究的目的是认识物种和客观地反映其系统演化关系, 无论将来的分类系统和方法多么先进, 都无法摒弃以简明、节约为主要优点, 并在很大程度上反映客观实际的传统分类方法。
4.2 现代分类技术在土壤真菌研究中的应用
传统的分类方法主要依据于真菌的形态特征及细胞生理和生化等特性, 尤其是有性生殖阶段的形态特征。其主要困难是, 在许多情况下某些真菌的表型性状相对贫乏, 难于透过现象认识其遗传本质。许多真菌有性生殖极少发生, 难以通过检查生殖隔离来界定物种。
近年来多门新兴学科和技术的发展, 尤其是分子生物学技术的兴起极大地促进了真菌分类学的发展。一些已经或即将用于真菌分类研究的分子生物学技术指标日渐显示出重要的分类潜能。利用各种分子生物学手段、特殊探针和特定序列鉴定真菌种类是这一领域深入发展的前提和基础。
2000 年, Muriel等采用非培养条件下, 对ITS 基因直接扩增,克隆和对ITS 区段进行限制性酶切和序列分析的方法尝试检测了土壤真菌的多样性。通过从土壤中直接提取总DNA 和从相同的土壤中分离培养真菌、鉴定后提取其DNA 两种方法来尝试、对比。
从土壤中得到67个真菌分离物, 从土壤中提取的总DNA中得到51个扩增子, 进行ITS 扩增、酶切并比较, 共得到了58 个ITS-RFLP 图谱。可培养真菌与土壤中扩增子的ITS-RFLP 图谱差异很大,仅有一种图谱是共有的, 其他的都不相同。同样的, 培养真菌和土壤中扩增子的ITS 序列也差别很大, 58 个ITS 序列同已知序列进行比较, 结果显示所有从土壤中分离培养得到的真菌几乎都是子囊菌, 只有一种为担子菌, 而在土壤总DNA 得到的扩增子中, 除了大部分为子囊菌外, 还有一种担子菌, 一种接合菌, 和几种分别属于藻物界的卵菌(Oomycota)和原生动物界的根肿菌(Plasmodiophoromycota), 可见PCR 直接扩增获得的真菌的范围明显广于培养获得的。与传统方法相比, 它们可以揭示更多的从未检测到的微生物的多样性,并为理解自然状况下土壤真菌的组成和功能提供更加客观可靠的依据。现代科学技术的发展, 尤其是以揭示某些核酸和蛋白质等分子生物学性状来探索真菌的种、属、科、目、纲、门等分类阶元的进化的研究日渐增多, 大大开阔和延伸了人们认识真菌遗传本质的视野。现代分类技术主要包括: 真菌次生代谢产物的应用、可溶性蛋白质凝胶电泳、同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳[ 38]、DNA 水平上的真菌分类学(DNA 中G+ Cmol%含量测定、基于聚合酶链反应(PCR)基础上的DNA 多态性分析、DNA 基因位点的序列分析、多位点酶电泳、脉 冲电泳核型分析、DNA-DNA 杂交和DNA-rRNA 杂交)及数值分类分析等等。
土壤真菌中, 无性态真菌(半知菌)占很大比重。无性态真菌中又以丝孢纲真菌所占份额最大。由于基本上无法通过生殖隔离试验来测定无性态真菌成员之间的亲缘关系, 在培养过程中, 真菌的形态特征和性状, 如菌落的颜色、分生孢子的形态和菌丝的颜色等都易受培养基的类型、光照、温度、培养时间的长短等条件的影响而发生变化。
因此, 在传统分类研究的基础上, 采用现代分类技术, 特别是分子生物学手段来研究此类真菌的分类问题就显得更为迫切和必要。
以传统分类为基础, 不断探求以现代生物技术为手段的综合分类研究方法, 实现传统分类方法与现代分类技术的有机结合, 是未来真菌分类研究的必由之路。
参考文献
1、《土壤真菌研究进展》张 伟,许俊杰 ,张天宇
2、《土壤真菌研究方法及人为干扰对森林土壤真菌群落影响研究进展》陈晓，刘勇，李国雷，孙巧玉，张硕，许飞
3、《土壤真菌多样性及分子生态学研究进展》张 晶，张惠文，李新宇，张成刚
第四篇：热脉冲法测定土壤热性质的研究进展
热脉冲法测定土壤热性质的研究进展
本文综述了土壤热性质的计算模型及研究现状，重点针对近年来国内外研究土壤热性质的新方法 热脉冲法的理论和技术发展，及其在土壤水和其他物理性质应用方面的进展。
土壤热性质是决定土壤热状况的内在因素，研究土壤热和温度的变化规律以及调节土壤热状况时必须首先了解土壤的热性质。已有研究表明，导热过程受土壤水和其他物理化学特性的影响[ 1，2]，土壤热性质与土壤水分状况之间存在明确的定量关系。因此研究土壤热性质还有助于从土壤热运动规律方面获取土壤水分信息。目前已有不少研究者对土壤水和土壤热性质的关系进行了探讨，并找出了一些规律，这对于土壤热性质的深入研究及其在土壤水分管理的应用方面无疑具有重要作用。
本文就近年来国内外土壤热性质研究的新方法热脉冲方法在理论和实验上的发展及应用进展进行介绍，并与常规方法进行对比，以期对其推广和进一步研究起到参考作用。土壤热性质参数及其模型1 反映土壤热性质的相关参数
不同土壤吸收一定热量后，其温度增减的幅度不同，即各种土壤贮热和导热能力不同，这是因为土壤的热性质不同所致。土壤热性质指标主要有土壤热容量、土壤导热系数、土壤热扩散率等。
单位体积土壤的热容量 Cv可用下式计算:Cv= XsCs XwCw XaCa(1)式中，Xs、Xw和 Xa分别是土壤中固体物质、水和气体的体积;Cs、Cw和 Ca分别是它们的比热容。土壤导热率 是在标准条件下通过土壤传导热量的量度，为各组分导热率的加权平均。导热率与体积热容量之比即为土壤热扩散率:Dq= / Cv(2)式中，Cv为土壤体积热容，J m-3K-1;为土壤导热率，J m-1K-1s-1;Dq为土壤热扩散率，m2s-1。
1.2 土壤导热率的计算模型
土壤热性质与土壤中各相的组成及比例有关。在上述三个土壤热性质中，土壤热容量的计算较简单，可根据土壤总孔隙度及土壤中不同组成成分的热容量求得[ 1];而土壤热扩散率的计算基于式(2)求出，因此获取土壤热性质的方法便集中在了导热率的计算模式上。导热率计算模型可分为物理模型和经
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验模型两类。其中物理模型以 de Vries(1963)的最具代表性，该模型以临界含水量为界，不同的土壤含水量范围有不同的表达形式。在此，临界含水量是当土壤中液态水失去连续性时的含水量，也有研究者把压力势为-55 kPa 时的含水量作为临界含水量计算值[ 1]。若以k表示临界含水量，当k时，导热率由下式计算[ 1]:=!ni= 1(kixi i)/!ni= 1kixi(3)式中，xi为组成成分i 的体积比例;i为组分 i 的导热率;ki表示颗粒组分i 的权重系数，它与颗粒形状和接触角以及各成分导热率有关;模型中考虑了 5种组分(n= 5)，包括: 液态土壤水，湿润土壤空气，石英，其他土壤矿物和土壤有机质。
1.3 土壤热性质常规研究方法的研究进展
国内外对热性质的研究已表明，土壤热性质受土壤水分状况的影响。Parikh(1969)用非稳定方法测定了 250 m 的玻璃珠和粉壤土的导热率和扩散率随含水量变化特征[ 3]。Wierenga 等(1969)分析了Yolo 粉壤土的热性质，发现表观导热率为土壤含水量的函数，且用 de Vries 模型进行计算的结果与测定值较吻合[ 4]。Ghuman 等(1985)研究发现，土壤导热率和热扩散率都随质地和初始含水量的改变而变化，含水量增大则导热率也增大，而且在不同含水量范围内，粘性土壤的导热率比沙土的低[ 5]。Persaud和Chang(1985)根据两个深度的温度值计算了表观导热率，并采用四种不同方法进行了对比，结果表明不同方法计算的导热率是有差异的[ 6]。Kaune 等(1993)测定了扰动的结构性黄土的温度，研究了团聚体对土壤热性质的影响[ 7]。
除含水量之外，土壤中含盐水平、容重及有机质含量也影响导热性质。早在 van Rooyen 和 Winterkorn(1959)的研究中，浓度为 0.18 mol kg-1的 CaCl2溶液，或是浓度达到0.34mol kg-1的NaCl 溶液对石英的导热率并无明显影响[ 8]。但 Globus 和 Rozenshtok(1989)对 0.25 mol kg-1的 KOH 湿润过的石英进行导热率测定，结果表明其导热率比水湿润过的石英砂的低[ 9]。Noborio 和McInnes(1993)发现从 0.1 molkg-1到溶解度范围内，土壤表观导热率随 CaCl2、MgCl2、NaCl、Na2SO4等盐分浓度的增加而降低[ 10]。
在运用不同模型及其与实测值的对比方面，Bachmann 等(2001)将斥水土壤与吸水土壤做对比，利用模型计算出的结果和实测值进行比较发现，吸水土壤的导热率比斥水土壤的大得多，实测法与计算模型等不同方法得出的导热率差异很大，其中 deVries 模型对吸水土壤导水率的计算值比实测值低0.5 W m-1K-1以上;对斥水土壤的计算值也比实测值小，而 Campbell 模型计算的导热率在低饱和度时偏小。此外，两模型计算干土或者饱和含水量下的导热率值均很精确[ 11，12]。
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贺康宁等(2000)采用自记土壤温度计连续测定土温，并根据温度观测值计算土壤热性质，给出了光滑坡面、光滑 地衣坡面及自然坡面等不同坡面处理的土壤热性质平均值[ 13]。李毅等(2003)在研制了热性质实验系统的基础上，根据实测土壤温度资料，用非稳态法测定土壤温度，并采用有限差分法离散热传导方程来计算热扩散率[ 14]:D q=(Tk 1，j-2Tk，j Tk-1，j)!t(!x)2(Tk，j 1-T k，j)(6)式中，T 为温度;x 为距离坐标;t 为时间坐标;下标k 和j 分别代表差分离散后的位置点和时间点。李毅等根据土壤孔隙分布确定土壤热容量，得到了不同质地土壤的导热率。同时还将导热率与土壤水吸力和土壤盐分浓度建立联系，研究了土壤水、盐、热性质的内在关系。热脉冲法测定土壤热性质的理论基础及其应用
2.1 测定原理
土壤热性质的测量有不同的方法，传统方法是在观测位置上设置输入热源，根据温度的升降直接测定。近年来研究者提出了土壤热性质测定的新方法 热脉冲方法。该方法自 Byrne 等(1967)提出后，最初多应用于矿业，引入土壤研究中仅 10 多年，但在 国外已 引起重 视并进 行了一 系列相关 研究[ 15~ 24]。该方法成本低，对土壤扰动小，测试时间短，不易引起非饱和土壤中水分的重新分布，而且所需样品体积小，能够在田间进行自动连续定位测量，并且不断有研究证实其测量精度较高[ 20~ 24]，因而在国外得到了大量应用。自热脉冲方法提出以来，其技术方面在不断改进和更新，理论研究也逐渐深入，并且在土壤水分测定方面得到了较多应用。由于经济力量和技术等各方面原因，热脉冲技术在我国的应用还很有限。
根据热传导定律，在一个无限大的均匀等温介质中，线性热源发射的热脉冲呈放射状向周围传导。使用热脉冲方法测量时，最简单的是用单探头方法进行测量。对于初始温度场均匀的介质，基于热传导方程，可将温度表示为时间的函数。假设温度与时间的对数值呈线性关系，则对两个时刻温度可得出下式[ 15]:=(q / 4)ln[(t2/ t1)(t1-th)/(t2-th)] / [ T(t2)-T(t1)](7)式中，T 为温度;q 为热源的强度，定义为 q =q / Cv，其中 q 是单位长度加热丝在单位时间内释放的热量;th为传感器冷却时间;t1、t2分别为测定的两个时刻。
实际测定和应用中采用更多的是双探头热脉冲法。其测量设施上装有两个距离为 r 的平行不锈钢探针，其中一个探针含有线性加热源，另一个装有温度测量元件(如传感器或热电偶)。将双探头设备插入土壤时，通电后加热探头产生热脉冲，而另一探头可记录温度的时间变化。这些观测资料可直接用于确定包括导热率在内的热性质参数。对于土壤中的某一点，其温度随时间的变化表示为[ 11，广州市深华生物技术有限公司
16]:!T(t，r)=q 4 CvDqEi-r24Dq(t-t0)-Ei-r24Dqtt > t0(8)式中，!T(t，r)为温度变化量，t 为加热设备开启后的时间，t0为开始发射热脉冲的时刻，r 为线性热源的径向距;Cv和 Dq分别是介质的体积热容和热扩散率，1。Ren 等对沙土、砂壤和黏壤等不同质地土壤测定 MDTD，结果表明对上述土壤 MDTD与通量之间的关系均为近似线性关系，砂土实测值和计算值较接近，而砂壤和粘壤则误差较大。此外，由于热 TDR 可同时测定土壤含水量，因此在获得土壤水分通量 J 后，可进一步得到孔隙水流速值(J/)。Ren 等的方法克服了前人测定土壤水分通量时不能同时测定热性质的缺陷，但关于该方法在不同土壤上的适用性方面，今后还需更多的工作去检验;此外，式(11)的积分形式使得MDTD的计算偏于复杂而不便于应用。
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为了解决 Ren 等(2000)的方法中表达式过于复杂的问题，Kluitenberg(2001)引入渗漏含水层井函数的概念，并将该函数中的指数部分进行麦克劳林级数展开，得到了形式上较为简单的近似解，从而仅用简单函数就表达了 Ren等的解析解[ 24]:W(u，#)=!nm = 0(-1)mm!#24umEm 1(u)(13)Em 1(u)=1m[ exp(-u)-uEm(u)] m= 1，2，%(14)式中，Em 1(u)为井函数。但Kluitenberg 的方法在实际计算中也是不易应用的。为寻求更简便的方法，Wang 等(2002)对热脉冲测定土壤水分通量进行了理论分析，找出了线性热源上、下游温度增加比的自然对数与土壤水分通量之间的简单线性关系，由于其表达式在形式上较简单，因此在土壤水分通量的测定方面，更适于应用热脉冲传感器方法。热流方程写为[ 25]:Tt= Dq2Tx2 2Ty2-VTx(15)式中 V 可根据式(12)确定。Wang 等基于热流方程得出的上、下游温度增加比与时间的关系为:上游: V2=4Dqt0lntu-t0tu x2u(tu-t0)tu(16)下游: V2=4Dqt0lntd-t0td x2d(td-t0)td(17)联立上两式，消去 V，则热扩散率 Dq可根据下式计算:Dq=t0x2d(t d-t 0)t d-x2u(t u-t 0)tu4ln(t u-t 0)(td-t 0)t ut d(18)将计算所得的 Dq值代入式(16)或(17)可得 V，再与式(12)联解可得出土壤水分通量值。Wang 等理论分析适用的水分通量测定范围为 1 &10-4~1&10-7ms-1。
2.3 应用研究现状
热脉冲方法提出之初多用于测定土壤热性质，由于土壤热性质与土壤水及其他物理性质(如孔隙度、密度、饱和度)之间密不可分的联系，因而该方法也逐渐用于包括土壤水分在内的其他物理性质的测定，这对于进一步探索土壤热与土壤物质属性的联系及更深入的理解热性质特征具有重要意义。
Ochsner 等(2001)采用热脉冲方法，以砂壤、粘壤、粉壤和粉质粘壤四种典型土壤为例，采用室内土柱装土，以热 TDR 为观测工具，针对目前还很少涉及的充气孔隙度对热性质的影响进行了研究。对不同土壤导热率及与土壤中水、固体颗粒和充气孔隙体积比例的研究结果表明，充气孔隙体积百分比增加时，几种土壤的热性质均呈线性递减趋势，作者认为土壤热性质与充气孔隙的联系比它与含水量的关系更密切。为检验该方法的精确性，Ochsner 等还用de Vries 的导热率模型，运用不同的充气孔隙度进行计算，并与实测值做了对比，表明热脉冲方法测定的导热率基本在模型计算出的最大值和最小值范围内[ 26]。
Ochsner 等(2001)采用热 TDR 测量热和电磁波，完成了对砂壤土的土壤含水量、充气孔隙和容重的同时测定，他们在式(1)的基础上，结合土壤电介质常数的经验公式，进一步计算了土壤饱和度和固相密度。其中电介质表示为土壤含水量 和土壤固相体积百分比vs的函数[ 16]:K0.5=(K0.广州市深华生物技术有限公司
5w-1)(K0.5s-1)vs 1(19)式中，K 为土壤介电常数，Km及 Ks分别为测定温度和频率下的水和土壤固相的介电常数。
忽略土壤中空气的贡献，且土壤的体积含水量表示为重量含水量和容重的乘积，则式(1)写为:Cv= XsCs Cw(20)整理可得含水量 的表达式: =(Cv-XsCs)/(Cw)。若对烘干土壤进行热脉冲法测定，则因含水量为零，土壤固体的比热可直接由式 Cv= X s Cs 计算。Ren 等(2003)基于上述原理，采用热脉冲方法测定了沙土、粉壤土和粉质粘壤土的含水量值和土壤固相比热[ 27]。采用热 TDR 测定含水量是间接方法，其值取决于仪器测定不同参数的各种误差，因而 Ren 等测定含水量值比重力法的偏小。此外，他们测定的沙土、粉壤土和粉质粘壤土固体比热值分别为 881、913和 973Jkg-1K-1。其研究结果还表明，用热脉冲方法测定固体比热容从而进一步测定含水量可减少测定误差。
此外，Ren 等(2003)将热 TDR 方法用于包气带土壤水分、温度、电导、热容量、热扩散率及导热率的测定，用该方法检验前人的资料并进行了 6 种不同质地土壤的热 TDR 测量，所得结果表明，热TDR对于土壤含水量、电导率、导热率及充气孔隙度的测定结果较合理，但对容重的测量误差较大[ 28]。结 语
热脉冲方法目前在国外已得到了大量应用，但由于技术力量的欠缺和经济实力的差异，在国内的应用还非常有限。热脉冲方法自动化程度较高，读数间隔通常为 1s，数据的连续性较好。近几年热TDR技术实现了同一时间、相同体积土壤上各参数的连续定位测定，因此最大程度地避免了土壤时空变异性对测定结果的影响。目前研究者已逐渐开始考虑土壤含盐对热性质的影响，但还不够深入。到目前为止，用热脉冲方法获得土壤水分资料方面已有若干研究成果。由于土壤热性质与土壤水、孔隙分布、土壤盐分浓度及其他土壤物理化学性质之间[ 29，30]具有直接或间接的联系，热 TDR 将更多地应用于相关研究中，其技术亦将日臻成熟。热脉冲方法在今后土壤水分中的研究方面将发挥更大的作用，尤其对土壤中水、热、溶质耦合运移的研究有重要的意义。
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第五篇：护理人员职业疲劳状况及其影响因素的研究进展
护理人员职业疲劳状况及其影响因素的研究进展
【摘要】：
随着经济的发展和医疗制度的不断改革，护理模式的更新和新的医疗法规的出台，护理工作面临更大的压力。护士职业疲劳与个体特征、人力资源配备、职业压力、人际交往受限等因素有关。职业疲劳不仅损害自身健康，影响护理质量，同时威胁着患者的安全，并有可能引起情绪激化。
【关键词】：护理人员、职业疲劳、职业病、影响因素、措施
【正文】：
职业疲劳是由于长期过重的工作压力和精神高度紧张、过度劳累、睡眠不足等因素导致的综合征，主要表现为对工作丧失热情、同情心和责任感，对工作产生反感。（13）随着现代化的发展，竞争越来越激烈，人们所面临的职业压力越来越大，身体和心理上的疲劳感也越来越严重。护士是疲劳发生的高危群体，有研究表明,91.27%的护理人员有被疲劳困扰的经历,远高于其他人群的发生率。
（8）护士的疲劳不仅损害自身健康还影响了护理质量。目前，护理人员的职业疲劳现状越来越受到社会的关注，对于职业疲劳的影响因素也分析的越来越全面，因此，职业疲劳的干预措施也越来越完善。
护理人员职业疲劳的发生率及现状
李胜利等通过对318名护士调查研究表明护士中有疲劳者占69．1l％，这说明疲劳在护士中普遍存在，其中、重度疲劳者占31．41％。（15）许梅等也将护士应对方式与疲劳做相关分析，发现疲劳与积极应对的相关系数未-0.39,呈负相关；与消极应对的系数为0.42，为正相关。（16）
职业疲劳影响因素
1.个体特征 个体特征差异的不同与护士疲劳状态有一定的关系。不同年龄、护龄、学历水平、职称等级、婚姻状况的护士在疲劳程度上也存在比较大差异。有调查显示随着护龄增加及其年龄的增长其疲劳程度呈先升后降的趋势。<=25岁年龄护士由于刚入职经历旺盛年轻力壮其工作活力水平上升，31~35岁护士由于工作新鲜感退去，重复性增加，工作热情和积极性下降（7）。.王治英等认为低年资护士工作时间短，临床经验不足，却承担着大量的治疗及基础为护理工作所承担的工作压力也相对较大，加之病人对低年资护士缺乏信任，使其心理及体力负荷随之日趋繁重，对工作的氛围和环境不满意，对管理者的信任度较低工作中无所适从。（10）学历水平越高的护士疲劳感越低，职称不同的护理人员则呈现中间低两边低中间高的曲线变化，即护师的疲劳感最高，护士、主管护师和副主任护师以上的护理人员疲劳程度则降低。（1）徐朝艳等认为由于护理人员在工作和家庭中扮演着多种角色，既要当好医生的助手，病人的好护士，又要做贤惠的妻子，慈爱的母亲与孝顺的女儿。当多种角色发生冲突并出现矛盾时，便会产生一定的心理压力。同时她们又必须不断学习新理论、新知识，在体力和脑力上付出较多，所面临的职业紧张及疲劳感自然较高。（12）
2.科室人力资源配置不足 不同科室的护士由于病人病情程度、工作量不同，其所致的职业疲劳状况就有所差异。工作量大的科室，由于人力资源配置不足，护理人员的疲劳程度就越大。ICU的护士疲劳程度相较其它科室来说是最大的。由于ICU的病人都是危重患者，随时需要抢救，需要严密的观察。护理人员的夜班轮换快，饮食和睡眠都无规律，极易造成护理人员的疲劳。手术室护士在工作当中的时间并不稳定，根据不同的病症情况可能会出现长时间手术，如10h以上的手术治疗，且很多患者的手术都为急诊手术，这也容易造成护士在工作中出现长时间、高负荷的连续工作，长此以往容易使护士出现疲劳情况精神科、急诊科、儿科等科室也很容易引发职业疲劳。（11）
3.职业压力 由于受传统观念的影响，认为医生普遍受到社会的尊重和承认，而护士则被认为是医生的助手，甚至有人认为是保姆而不是专业人员。护士即使遇到被歪曲事实被患者责骂，也要保持冷静和平和，理解患者的心情，甚至要做到打不还手骂不还口，这使患者的感情受到伤害，人生安全得不到保障，护士就会辞职或调换工作岗位。（9）护患关系信任度在近年来越发紧张，使得护士在忙
绿工作的同时还要处理与患者的紧张关系，越发加重了护理人员的疲劳程度。（6）近年来，医院床位都有不同程度扩展，医院为提高经济效益，减少开支，最先考虑的是尽可能地少用护理人员，但同时整体护理的开展，模式病房的建立，新仪器、新设备在医疗上的广泛应用，护士的工作量急剧上升，使得一些护士长期处于超负荷状态。使护士工作时间不固定，使护士的生物钟被打乱，给家庭生活造成影响，若得不到家人的理解与支持，会加重心理压力。长此以往必然会导致心身疾病。（19）
4．人际交往受到限制护理人员工作环境相对独立，大部分护理人员需要
频繁倒班，尤其是夜班，打乱了人体正常的生理规律，给护士心理、生理功能、家庭生活和社交活动造成不良影响。（9）由于护理人员的人际交往圈变得狭窄，其感情宣泄受到限制，心理压力增加，导致其身心疲劳感增加。
职业疲劳的不良影响
护理人员长期的职业疲劳如果调试不当或适应不良会严重损害身心健康，导致一系列问题，使护理质量下降，甚至还会导致护理纠纷。李淑芳等认为护士整日围绕着病人的生理、心理及社会等问题进行工作，加上自身的社会地位较低、待遇低、生活压力大等现实问题，使得不少护士常感到身心疲惫，职业倦怠。而且护士的多以女性居多，在体力上应对各个层次的病人会比较吃力，因此患职业病的几率比较大。（2）田素斋等认为由于护士在工作中身体经常处于弯腰或其他腰部受限的体位，从而导致了护士职业性腰背痛的高发生率。（5）另外静脉曲张、腰椎间盘突出静脉曲张、腰椎间盘突出也是护士最常见的职业病。胃病、肾结石、泌尿系疾病比较“偏向”手术室、ICU病房的医生、护士，在无菌操作的空间里工作，手术一做十几个小时是常事，其间不能吃饭，不能喝水，不能上厕所。在这些需要无菌操作的空间里，医护人员每去一次洗手间都意味着要脱衣、穿衣、消毒等一系列程序。时间长了，胃病、肾结石、泌尿系统疾病就找上门来。（17）由于护士疲劳感加重，在上班期间精神不佳，也会导致职业暴露的发生。近年来，随着乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等具有血液传播途径传染病患病率的上升，护士因职业暴露所引发血源性疾病感染的潜在危险也日趋加重，从而又加重了护士离职率的增加。此外，工作疲劳感高者因急躁不耐导致了工作内外的冲突，经常回避与朋友的交往．导致和工作对象、朋友的关系紧张。
护士疲劳干预措施
（一）医院管理阶层的支持
1.1.完善科室人员配置与护士排班制度 实行弹性排班，尽可能做到新老搭配，工作能力强于工作能力较弱的搭配。同时要增加夜班护士补助，为护士的身心健康提供保障，使护士充分认识到自我在医院中的重要作用。（4）为降低护士超负荷状态，医院应当配备足够的护士，优化排班与工作流程，降低护士的工作负荷减少延迟下班等超负荷状况的发生，以减轻其付出—获得不平衡感与超负荷状况，让护士在付出自己的劳动后，得到相应的奖励，尊重和认可，获得归属感与成就感，提高护士工作满意度。(3)
1.2.内部推行人性化管理，建立有效的支持网络 护理管理者应注意动用管理艺术，切实关心护士的思想工作于生活，创造良好的工作环境，对于护士在检查考核中出现的失误，不要一味的批评和处罚而应帮助其共同剖析原因，探索问题的症结，寻找解决的方法。利用计算机网络建立医护、家庭与医院的联系网、护士俱乐部网等支持网络。以随时了解护士的心理动态，提供探讨、交流的平台。
(4)
1.3加强护理人员的素质教育护理管理者应组织相关的培训，如新理念培训、压力管理培训，不断提高护士的应对能力和综合业务素质。给护士提供继续教育的机会，开展各种形式的活动，如健康教育沟通演示、文艺会演、爱岗敬业演讲等。及时传递医院信息，减轻护士的职业压力。（20）
（二）护士自身方面的调整
2.1.自我调节，释放自身压力护士必须加强自身修养，重视心理素质的锻炼，保持旺盛的精力，精神集中，心情愉快。稳定的情绪可促使工作有条不紊的展开。提高T作效率，使自己处于最佳心理状态，发挥最佳水平。（15）护理人员还要要学会自我调节心态释放内心压力，可选择合适的时机、合适的对象、合适的场景来宣泄内心的不快，也可以通过定期短期旅游来缓解心神。护士良好的心理健康状态，对工作积极正性的态度和情感也能预防职业疲劳的发生。（14）
2.2.养成良好的生活习惯由于频繁上夜班造成的营养缺乏、胃肠功能紊乱、睡眠障碍等，应加强营养，多摄入一些富含维生素、蛋白质的食物。对减轻疲劳有明显效果。加强体育锻炼，可有效缓解疲劳，提高身体抵抗力。加速生物钟的尽快适应。（18）良好的生活习惯可以保持身心愉悦，使护理人员在工作中职业幸福感增加，从而降低其职业疲劳的发生。
提高护理人员的社会支持
由于传统的观念使大多数人对护理人员还存在误解。社会舆论导向对护理工作者有强大的影响，护士的心理健康需要全社会的关注。应借助各种大众媒体向社会广泛宣传护理专业的重要性及多元性，宣传护士的学习、工作及生活，使社会公众对护理工作和护士的价值有真实了解，纠正对护士只会打针、发药、量体温“三大常规”的片面、错误认识，提高护士的社会地位。（20）同时政府可以增加对护理人员的保护政策，加强护理人员的人身安全感。只要全社会形成尊重护士、重视护士的良好风尚，将有利于激发护士的自豪感、责任感，进而消除护士的自卑感和职业疲劳。
【小结】
护理人员职业疲劳是由于长期过重的工作压力、精神紧张、人际关系限制等因素导致的。不仅影响护理人员产生的身心健康还对护理工作的质量产生影响。
针对护理疲劳发生的因素，医院、社会、护理人员本身都应该采取一定措施来预防职业疲劳的发生。目前，医院大多以女性护理人员为主，男性护理人员较少，因此，职业疲劳多针对女性护理人员来探讨。缺乏男性相关内容研究。
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