食用菌实验-培养基制作

第一篇：食用菌实验-培养基制作

实验二

母种培养基制作

一、实验目的掌握斜面试管培养基的配制、消毒与灭菌等制作过程，为菌种转管、组织分离制作母种打下基础。

二、常用培养基配方

1．马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)

去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升，pH自然。2.PDA综合培养基

去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，磷酸二氢钾3.0克，硫酸镁1.5克，维生素B10.05克，水1000毫升，pH自然。

三、实验材料和用具

天平、电炉，18×180毫米试管，止水夹。纱布，棉塞，牛皮纸，皮筋，手套、菜板、刀、恒温箱，三角漏斗、支架（每组一套）。手提式高压灭菌锅。马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂等。

四、实验步骤与方法 1．PDA培养基的配制 2．装管、捆把 3．灭菌

锅内加适量水→ 灭菌物品放内锅→

加热 → 压力表0.05Pa 时放气 →压力表1.15Pa(121-126℃)时计时30分钟。

4.摆斜面。灭菌后将试管取出斜放在一根1厘米左右厚的木板条上，使试管内斜面的长度为试管长度的3／5。放置凝固后备用。

五、作业思考题

1．制作PDA培养基过程中，为什么要用牛皮纸将整捆的棉塞部分封盖灭菌? 2．灭菌时，加热水沸后，在锅内压力升至0.5Pa 时，为什么要打开放气阀? 3．写出试管培养基制作的工艺流程。4．消毒与灭菌是同一概念吗?为什么?

实验三

原种培养基制作

原种即二级种，就是将试管中的母种，接入菌种瓶内，等菌丝长满后形成的菌种。

一、实验目的

通过实验初步掌握原种培养基的配料、装瓶(袋)、灭菌、消毒、接种、培养等生产工艺流程。并了解原种培养基的不同配方及不同的制作方法。

二、实验材料和用具 天平，立式或卧式高压灭菌锅，菌种瓶或菌种袋(菌种瓶口径3厘米，容积750毫升)，塑料套环，塑料绳，擦布，锥形捣木。称，大盆

麦粒，麦麸，棉籽壳，不锈钢锅，石膏，碳酸钙，白糖，牛皮纸，皮筋，三、培养基配方

1．木屑米糠培养基(适用于香菇、木耳、猴头菇、杨树菇等木腐生类食用菌)：木屑(锯木屑)78千克，米糠或麦麸20千克，石膏1千克，蔗糖(俗称白糖)1千克。料水比为1：1．4～1．6，使含水量达到60%，即用手握抓材料时指缝现水而不滴水。

2．麦粒培养基(适用于平菇、草菇、猴头、金针菇等)： 麦粒200千克，蔗糖2千克，碳酸钙2千克，水500升。

3．棉籽壳培养基(适于多种食用菌)：

棉籽壳78%，麦麸10%，玉米粉10%，过磷酸钙1%，白糖l%，水料比约1:1.1-1.2。

四、实验步骤与方法 1．培养基的配制

1)木屑米糠培养基的配制：

拌料：根据计划生产原种的数量，计算出各种原料的用量，分别称取后，将不溶性辅料和主料掺拌均匀，将可溶性辅料加入水中溶解，逐渐泼入拌好的主料中，掺拌均匀，继续加水拌料。拌料时，边加水，边测含水量，以便控制水分，不至过多或不足。含水量的测定：拌好料后，用手抓一把培养料在手中紧握，手指缝中有水渗出但不下滴为适宜。料水比约为1:1.2-1.4 装瓶（袋）：将培养料装入750毫升的菌种瓶(或500毫升罐头瓶)中，边装边捣实(但不宜过紧，太紧则透气性差，菌丝生长不良)，以手按结实有弹性为宜，一直装到菌种瓶的瓶肩处。

打孔：培养料装好后，用锥形木棒从瓶中央向下打一个洞，洞深离瓶底部2～3厘米，这样一是可以增加瓶内氧气；二是有助于菌丝沿着洞穴向下蔓延；三是便于固定菌种块，不致游动而影响成活，有利于瓶下部菌丝生长良好。

擦瓶：打洞后，用湿毛巾或湿布多次将瓶口和瓶外粘附的培养料擦净，擦干，以免接种后污染

包扎：塞上棉塞，用牛皮纸将瓶口及棉塞包住，用绳扎紧。也可在瓶口上先放一层牛皮纸，再盖一层聚丙烯塑料薄膜，扎紧瓶口。2)棉籽壳培养基的配制：

棉籽壳原种培养基的配制方法同木屑培养基的相似，只是装瓶时培养料的压实要比木屑的紧，因棉籽壳颗粒较大，且能留有较多的空隙。3)麦粒培养基的配制：

浸料：将小麦粒用水浸4-8小时，煮沸20—30分钟，煮沸的过程中就加入蔗糖。最后使麦粒熟而不开花。滤去水分(滤液可制母种培养基或栽培时拌料用)，摊在通风处晾30—40分钟，使麦粒表皮不湿为宜。

装瓶：加入碳酸钙，拌匀后装瓶。装瓶时要注意边装瓶边将瓶轻轻地扣动，使瓶内培养料松紧度上下一致，装至粒面至瓶肩部。瓶口包扎同前。2．灭菌

包扎好的料瓶（袋）放入高压灭菌锅内进行灭菌。在1．5千克／平方厘米压力下，灭菌2小时即可。如用土蒸锅常压灭菌，须将水烧开后继续蒸10小时，缓慢降温后取出使用。

六、作业思考题

1．原种培养基装满瓶后，为什么要用湿毛巾或湿布多次擦洗瓶外和瓶颈? 2．原种培养基装好后，为什么要在当天及时进行灭菌? 3．原种培养基装瓶后，用锥形捣木在其中内插一个圆洞的目的是什么? 4．原种培养基装满瓶后，其瓶的上部培养料是松一些好，还是紧一些好?为什么? 5．培养料装得过松过紧都将产生什么样的结果?

第二篇：食用菌培养基原料及处理

食用菌培养基原料及处理

食用菌培养基原料及处理

一、培养基主料及处理

原则上凡不含有毒有害物质和特殊异味的农林副产品都可以作为食用菌栽培的培养料，一些富含木质纤维素的野生材料也可作为培养料。农副产品如稻草、麦秸、玉米芯、玉米秸、高粱秸、棉籽壳、废棉、棉秸、豆秸、花生秸、花生壳、甘蔗渣、麦麸、稻糠、高粱壳、果园剪枝枝条、玉米皮、豆饼、花生饼、油菜饼、芝麻饼、棉仁饼等；林业副产品如树枝、树杈、树墩、树根、刨花、木屑等；野生材料如类芦、象草、皇竹草等。另外，轻工业生产的副产品也可以作为食用菌栽培的培养料，如糠醛渣、酒糟、醋糟、废纸浆等。

1、棉籽壳

棉籽壳成本较高，但棉籽壳栽培食用菌，明显具有容易操作、发菌保险、产量稳定等优势，相比而言，尤其对于初次栽培者来说，效益稳定，让人放心。

基本配方：棉籽壳250千克，过磷酸钙5千克，尿素1千克，石膏粉3.5千克，食用菌三维营养精素120克（完成发酵后再加入并拌匀，下同）；4～9月份播种时，加入石灰粉5千克。

2、玉米芯

玉米芯由于该原料可作为木糖醇、糠醛等工业原料，故其近年来身价倍增，较之棉籽壳相差不大，其生物学效率也不相上下。其质地疏松，粉碎后粒度较均匀、合适，富含糖分，非常适合菌类生产，用来生产常规菌类，其转化率可达100%~150%。

玉米芯的营养很丰富，据测定，干玉米芯含粗脂肪0.7％，粗纤维28％，无氮浸出物58.4％，灰分2.0％，钙0.1％，磷0.03％，是栽培平菇等食用菇的极好原料。基本配方：

（1）玉米芯250千克，豆饼粉5千克，石灰粉5千克，石膏粉2千克，过磷酸钙6千克，尿素1千克，菇病消5袋，食用菌三维营养精素120克。

（2）玉米芯250公斤、豆饼粉10公斤、石灰粉10公斤、石膏粉5公斤、过磷酸钙10公斤、尿素2公斤、食用菌三维营养精素(拌料型)120克。

（3）玉米芯150公斤，豆秸粉100公斤，豆饼粉5公斤，石灰粉10公斤，石膏粉5公斤，过磷酸钙10公斤，尿素1公斤，草木灰5公斤，食用菌三维营养精素120克。（4）选无霉的干玉米芯粉碎成小粒（比黄豆小），晒2天，然后在清水中浸泡一夜，捞出沥干后分别加入1％的石膏粉、硫酸胺、过磷酸钙和0.1％多菌灵（加入水中）拌匀，PH为5.4～7，含水量60％～70％（手握料指缝有水而不滴下）。（5）玉米芯粉100斤，石膏粉1斤，石灰3两，含水量65％左右。

（6）玉米芯 78%、麸皮或米糠 20%、石膏粉 1%、蔗糖 1%，适于制作草菇、平菇、木耳、猴头菇等木腐菌菌种。（7）玉米芯 80%、米糠 10%、玉米粉 8%、石膏粉 1%、复合肥1%(制原种改用0.2%磷酸二氢钾)，适于制作平菇等菌种。

3、大豆秸秆

该原料含氮素物质在所有秸秆类原料中是最高的。将其与玉米芯等混合使用，栽培效果十分理想。不足之处是质地较硬，需经粉碎之后使用为佳，其粉碎粒度控制于2~4mm，加大料水比至1:1.6~1.7，可使常规菌类转化率达120~160%。基本配方是：玉米芯100千克，豆秸150千克，石灰粉5千克，石膏粉2千克，过磷酸钙6千克，菇病消5袋，食用菌三维营养精素120克。

4、花生壳

易于粉碎，含氮量高，不足之处是组织纤维化程度高，不利于菌丝分解利用，可加入30%的棉壳，并经发酵处理，可取得与棉壳相仿的效果。基本配方：

（1）花生壳 40%、玉米芯 38%、麸皮 20%、蔗糖 1%、石膏粉 1%，适于制金针菇菌种。

（2）花生壳 78%、米糠 20%、石膏粉 1%、蔗糖 1%，适于制作平菇、香菇、木耳、猴头菇、灵芝等木腐菌菌种。

5、稻、麦秸

麦草、稻草类该类原料多用于栽培草菇、双孢菇、姬松茸等品种，少有用于平菇、猴头菇等生产的，这不是说完全不可取，而是说该材料起码不是最佳选择，尤其木腐菌中的香菇、猴头、木耳等，发菌时间及出菇时间较长，作为草料，其成分多为纤维素，木质素含量偏低，难以被菌丝长时间进行分解而保持基本满袋状，故尽量用其生产草腐菌类。因其表层附生一层蜡质层，不利于菌丝的吸收，可采用氧化钙液浸泡的方式去除，用于侧耳类，转化率可达90%~100%；用于耳类生产，可达100%左右。

栽培双孢菇配方：麦草或稻草3000千克，牛粪粉3000千克，过磷酸钙60千克，尿素60千克，石灰粉80千克，石膏粉80千克，碳酸钙90千克，食用菌三维营养精素（拌料型）1440克。

栽培草菇基本配方：麦草或稻草225千克，麦麸25千克，过磷酸钙8千克，尿素1.5千克，石灰粉12千克，石膏粉4千克，菇病消5袋，食用菌三维营养精素120克。

6、棉秆屑

棉秆屑营养丰富，富含食用菌生长的各种营养成分，含粗蛋白5.6%、粗脂肪2.7%、粗纤维42.9%，再添加适量的营养配方，菌丝生长质量、产量可与棉壳相媲美。用棉秆屑栽培平菇、香菇、金针菇、鸡腿菇、木耳、银耳、杏鲍菇、茶树菇生物转化率最低达120%，高达200%以上。粉碎后的棉秆屑，透气性好，吸水性强。培养的菌丝洁白浓密粗壮，生长快而结实。

该原料与木屑类有点相似，并含有大量韧皮组织，十分有利于食用菌菌丝生长。绝大多数菇农不愿使用它，是因为粉碎困难，普通粉碎机对其无可奈何，只有使用木片机械切碎，而后才能进行打碎。

栽培平菇、鸡腿菇配方：棉秆粉（0.5厘米以下）220千克，麦麸30千克，三元复合肥3千克，石灰粉10千克，石膏粉5千克，菇病消5袋，食用菌三维营养精素120克。用于栽培香菇时，可将其作为木屑对待进行配方。但是，时下的棉花多为转基因品种，所以，用棉秆粉栽培的产品，不可用于出口。

棉秆粉250公斤、豆饼粉10公斤、石灰粉12公斤、石膏粉5公斤、过磷酸钙10公斤、尿素2.5公斤、食用菌三维营养精素(拌料型)120克。

7、泥炭

日本研究成功一种以２０％至３０％泥炭和含油脂的谷物（均以干物质计）为主的混合培养基栽培食用菌的方法。在栽培前，把泥炭中的长纤维切断、切碎，并加入可以有效地增加通气量的大麦外皮、米糠、木屑混合物，然后装瓶、灭菌、接种。配方合宜时每瓶平菇采收率达５５％，比单用木屑、米糖培养基栽培平菇采收率增加３０％。生长期可从５０天至５６天缩短到４０天。该培养基也适合栽培金针菇等食用菌。

8、麦壳

麦壳有两种，一种是小麦壳，一种是燕麦壳。都是工厂的下脚料，麦壳里面有不低5%麦仁，燕麦壳有一层可溶性膳食纤维，碳氮比为20：1。营养高，所以不用添加麦麸或玉米粉。可以用来栽培平菇、茶树菇、金针菇、姬菇。以麦壳为主料培养料具有成本底、透气性好、发菌快、产量高的特点。

以麦壳为主料栽培平菇配方：麦壳70%、木屑28%、生石灰1%、复合肥1%。发酵时间比棉籽壳为主料的要多一天。用甘蔗渣代替木屑效果更好。其他方面按以棉籽壳为主料栽培方法。

以麦壳为主料栽培茶树菇配方：麦壳90%、茶籽粉8%、生石灰1%、复合肥1%。茶树菇分解蛋白能力强，分解木质素能力弱。所以不能用木屑。

9、油菜秆

油菜秆壳含粗蛋白3.14％、粗脂肪0.45％、粗灰分6.2％、氮1.5％、磷0.37％、钾4.3％，是栽培食用菌的良好培养料。油菜秆壳培育食用菌时，事先应仔细剔除发生霉变的部分，曝晒2～3天后，粉碎成绿豆大小，放冷水中浸泡12～24小时，天热时间可短些，天冷时间稍长些，然后根据不同的食用菌品种。基本配方：

（1）草菇：油菜秆壳90％，石灰3％，草木灰5％，麦麸或米糠2％，含水适量。

（2）香菇：油菜秆壳78％、麦麸20％，石膏1％、糖1％、含水适量。

（3）平菇：①油菜秆壳98％、石膏1％、过磷酸钙1％；②油菜秆壳与塘泥1∶1混合，另加入过磷酸钙0.8％，磷酸二氢钾0.1％；③油菜秆壳95.5％、石膏粉2％、过磷酸钙2％、尿毒0.5％；④油菜秆壳91％、米糠5％、石膏2％、过磷酸钙2％。

10、水葫芦

水葫芦粉碎渣栽培竹荪、大球盖菇等单核菌丝类食用菌，还可以种植出双核菌丝类的银耳。产量与现行用木屑、稻壳、刨花等为培养基的种植方式基本相同；但用水葫芦粉碎渣作培养基因其易腐烂，生长期可提前约一个月。

11、野草

（1）几种适宜栽培食用菌的野草

①芦苇是一种多年生水生禾本科植物，植株高大，适应性广，耐涝。营养成份高于木屑。

②芒箕（别名鸡脚茅）适应性和生活能力强，耐旱，耐酸，自然资源丰富。其所含营养成份比杂木高，一年四季均可割。③五节芒（别名巴茅）属禾本科高大野草，我国大部分地区均有分布，营养成份高于木屑，用来栽培食用菌应在抽穗老化期采割。

（2）野草的采割加工

芦苇，五节芝属于禾本科植物，植株高大，不易干燥。应在抽穗扬花时采割，经充分晒干后粉碎。芝箕庆在连续三至五个晴天后采割，晒干粉碎。粉碎野草宜选用２．２至２．８毫米孔径的筛片，粉碎后的在原料需彻底干燥后防霉贮藏。（3）野草培养料配方

①五节芝、蒌芝箕４０％、麦麸１８％、白糖１％、石膏１％、多菌灵０．１％。

②芦苇４５％、五节芝３８％、麦麸１５％、糖１％、石膏粉１％、多菌灵０．１％。

③芦苇３０％、芝箕２５％、五节芝３０％、麦麸１５％、糖１％、碳酸钙１％。

④五节芝５０％、芝箕２５％、麦麸１５％、玉米粉７％，碳酸钙２％、尿素０．５％。

以上第一方和第二适宜栽培平菇、香菇、鸡腿菇等，第三方和第四方适宜栽培木耳和金针菇。

12、松杉木屑

松、杉屑资源丰富，但因其含有烯萜类和芳香油类物质，对菌丝有抑制作用。以下方法可解决这个问题。

（1）石灰水浸泡法：用2％～5％澄清石灰水浸泡松、杉木屑12～24小时。捞起后用清水冲洗至无混浊，沥干水分，或晒干即可。

（2）水煮法：将松、杉木屑放入大锅内加1％～2％石灰水煮沸，不断用木棒搅拌。2小时后，捞起，用清水冲洗干净。（3）发酵法：将松、杉木屑拌入2％～3％石灰水，使含水量达65％，堆积发酵。当料温升至60℃以上时翻堆，以后每隔4～5天翻堆1次。共翻3～4次，历时20多天。发酵好的料，没有芳香气味，手感柔软，含水量达60％左右，拌料时基本不用加水。

以上方法处理过的松、杉木屑，掺入1/3阔叶木屑后栽培多种食用菌，效果更佳。

13、沼渣

沼渣180公斤、秸秆颗粒70公斤、石灰粉10公斤、石膏粉6公斤、三元复合肥1公斤、食用菌三维营养精素120克。

14、中药渣 中药渣130公斤、玉米芯100公斤、麦麸20公斤、石灰粉8公斤、石膏粉6公斤、尿素2.5公斤、过磷酸钙5公斤、食用菌三维营养精素120克。

中药渣120公斤，木屑100公斤，麦麸30公斤，石灰粉7公斤，石膏粉6公斤，尿素2.5公斤，过磷酸钙5公斤，食用菌三维营养精素120克。

15、酒糟

酒糟(以干重计)200公斤、棉籽壳和木屑各25公斤、豆饼粉2公斤、过磷酸钙5公斤、尿素1.5公斤、磷酸二氢钾2公斤、石灰粉6公斤、石膏粉5公斤、食用菌三维营养精素120克。

16、糠醛渣

糠醛渣250公斤，豆饼粉10公斤，石灰膏20公斤，石膏粉5公斤，复合肥2公斤，赛百5袋，食用菌三维营养精素1袋。

糠醛渣100公斤，豆饼粉5公斤，熟石灰4公斤，石膏粉2公斤，复合肥2公斤。

17、甘蔗渣

甘蔗渣200公斤，棉子壳50公斤，豆饼粉3公斤，石灰粉3公斤，石膏粉2公斤，过磷酸钙3公斤，尿素0.4公斤，磷酸二氢钾1公斤。

木糖渣100公斤，豆饼粉5公斤，草木灰5公斤，熟石灰4公斤，石膏粉2公斤，过磷酸钙3公斤，尿素1公斤。

19、几点说明

第一，秸秆类原料，由于含碳量高、粉碎后颗粒偏细碎、吸水率高、通透性差，因此，生料栽培时易发烧，所以应发酵处理或熟料栽培。

第二，凡是熟化过的原料，比如中药渣、酒糟类原料，一般适合大场地晾晒处理，如果处理不及时，会很快发生杂菌，影响原料质量，最好是做熟料栽培。

第三，沼渣类原料，质量很不同，要根据沼气发酵原料予以科学配方，比如，户用型沼气一般采用畜禽粪便及人粪尿等为发酵原料，该种沼气池产出了沼渣，营养很丰富，用于栽培后的效果很理想；大型沼气工程使用的原料如酒糟等，产出的沼渣营养较差，配料时应予科学设计配方，合理调配辅料组分，否则，同为沼渣，生产效果会相差很大。

二、培养基常用辅料

食用菌培养基的组成除了棉子壳、秸秆、木屑等主料外，还要添加一些必需的辅料，约占培养基的5%—10%。其主要作用是：补足培养料中的营养成分，调节碳氮比例和酸碱度，改善培养基的理化性状，促进堆料中微生物的活动和繁殖，提高堆料发酵质量等。

1、饼肥

是一类含氮量高、营养丰富的有机物质。常用的有豆饼、菜子饼、棉子饼、花生饼等。是一种常用的富氮辅料，能促进菌丝生长，增强长势，提高产量。尤其是在以秸秆、木屑等为主料栽培食用菌时使用多。

2、麸皮与米糠

它以提供氮源为主，也含有能促进菌丝蔓延所必须的大量维生素等营养物质。陈旧的麸皮或米糠营养物质大幅下降，并易孳生螨虫，造成不良后果，因此要力求新鲜。

3、熟石灰

又叫消石灰、氢氧化钙。其作用是：加快主料软化；促进主料分解；调节酸碱度；补充钙元素；降解培养料中农药残留；此外，石灰是常用的消毒剂、杀菌剂和防潮剂，被誉为蘑菇的“万金油”。熟石灰吸收二氧化碳后，一部分变成轻质碳酸钙。熟石灰调节培养料酸度的能力比碳酸钙强，比石膏速。熟石灰不能与铵态氮肥混用，也不能与水溶性磷肥混用。

4、石膏

又叫硫酸钙，其作用是：使秸秆脱脂软化；可直接补充培养基中硫、钙的不足；能使气态氮固定成化合态氮，利于游离在堆肥中氨气的稳定，减少氮素损失；加速培养料中基质分解，促进料中可溶性磷、钾的释放，供给菌丝吸收利用等。石膏属中性弱酸盐，虽不能快速轿正培养料的酸碱度，但具有缓冲作用，使培养料pH值不致发生大的变化。生产中其添加量一般为培养料干重的1%—2%。

5、糖

在培养料中添加糖分，主要是作培养初期碳源的补充，便于菌丝直接利用，并诱导纤维素酶的产生。生产上常用的糖有红糖和白糖之分。红糖较为经济，而且葡萄糖含量高出白糖10—20倍，并能满足菌丝体在生长过程中对铁、锰、锌等微量元素的需求。但红糖易结块、反潮，在高温高湿下酵母菌会在其上大量繁殖，易使培养料发酸。

6、尿素

是一种含氮素较高的速效性化学肥料。培养料中添加尿素是补充氮素不足，提高产量的措施之一。其用量一般为原料干重的0.3%以下。尿素添加量忌过高，否则不仅会杀伤菌丝，还会造成菇体生理失水，萎缩黄死。

7、过磷酸钙

可弥补培养料中磷素、钙素的不足，同时促进微生物的分解活动，利于培养料的发酵腐熟。它是一种缓冲物质，可使堆料中酸碱度不致变化过激，还具有改善培养料理化性状的作用，磷本身又是子实体生长发育不可缺少的物质，有促进菌丝健壮生长的效果。其用量一般为1%。

8、碳酸钙

蘑菇菌丝在含水较多的基质中生长并不断排出二氮化碳，而二氧化碳与碳酸钙生成碳酸氢钙，从而不断为蘑菇提供钙质营养。其用量一般为培养料干重的1%—2%。

第三篇：食用菌栽培实验

《食用菌栽培学》实验一 斜面制作

一、实验材料：马铃薯300g，琼脂20g，二、实验药品：葡萄糖20g，三、实验工具：水果刀、试管40支、漏斗

5、铁架台

5、止水夹

5、纱布三层、报纸若干、胶皮管

5、玻璃棒

1、锅、电炉、天平、1000ML量筒、PH试纸、棉花塞（皮棉非脱脂棉）、皮筋或长绳若干、高压锅（手提式）、干净毛巾、培养皿2个

《食用菌栽培学》实验二 母种接种

一、实验材料：实验一制作出的无污染的试管斜面、食用菌专业母种（平菇）、二、实验药品：75%酒精棉球

三、实验工具：镊子

5、棉花若干、接种针（接种锄）、酒精灯、火柴或火机、超净工作台、恒温培养箱、冰箱 注：恒温培养一周左右待菌丝体长满斜面转入冰箱冷藏室内储存

《食用菌栽培学》实验三 食用菌菌丝体观察

一、实验材料：由实验二转管的母种

二、实验工具：显微镜12台、酒精灯、接种针、蒸馏水、载玻片

15、盖玻片20 《食用菌栽培学》实验四 食用菌栽培实验（出菇实验）一

一、实验材料：玉米芯6.8KG、棉籽壳1KG、麸皮2KG、石膏粉0.1KG、碳酸钙0.1KG

二、实验工具：水桶、胶皮手套

12、聚丙烯袋（15CM*15CM）、绳子若干、高压锅、《食用菌栽培学》实验四 食用菌栽培实验（出菇实验）二

一、实验材料：由出菇实验一所得高压消毒的料袋、实验二制作的母种、二、实验工具：无菌室、酒精灯、75%酒精棉球、透气的盖子（食用菌专用若干），干净的房子用作培养。定期进行观察，消过毒葡萄酒实验室的框子4个

《食用菌栽培学》实验四 食用菌栽培实验（出菇实验）三

待料袋菌丝长满后一周左右打开袋口进行浇水、观察处菇情况

第四篇：实验教案 培养基的制备

实验一 培养基的制备

一目的要求 明确培养基的配制原理 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤 二 基本原理

不同培养基中含有不同的微生物生长所需要的营养物质，其可供微生物生长繁殖用，为微生物提供C源、能源、N源和维生素。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96度溶化，实际应用时，一般在沸水中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免烧焦，琼脂在40度时凝固，通常不被微生物分解利用，固体培养基中琼脂含量根据琼脂的质量和气温的不同有所不同。牛肉膏蛋白胨培养基：

牛肉膏：3.0g,蛋白胨10.0g,NACl5.0g,水1000ml,pH 7.2-7.4.马铃薯培养基是霉菌的基本培养基，培养基配方如下： 马铃薯 100g 蔗糖 10g 琼脂 10g 水500ml pH 自然 三器材：

1试剂或溶液：马铃薯、蔗糖、琼脂、蒸馏水。

2仪器或其它用具：试管、三角瓶、烧杯、玻璃棒、天平、牛角勺，纱布、麻绳、牛皮纸、高压灭菌锅 四操作步骤 1称量：

依次称取马铃薯块、蔗糖、，切碎的琼脂放入三角瓶中并加入500ml蒸馏水 2 把三角瓶放入锅中，锅盖好后放在电热炉上加热，等琼脂溶解后取出三角瓶 3过滤：趁热用多层纱布过滤，去除里面的杂质 4分装：将配制好的培养基分装入试管。

5加塞：分装完后在试管口塞上塞子，以阻止外界微生物进入培养基造成污染，并保证有良好的勇气性能。

6包扎：用牛皮纸再包扎瓶口，以防灭菌时弄湿棉塞。7灭菌：用高压蒸汽锅在0.1MP下灭菌20min 8搁置斜面：趁热将试管里的培养基斜面，注意斜面的长度大约为试管长度的1/2 9无菌检查 五：注意事项

1培养基配制后，必须立即灭菌

2分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾在塞子上而引起污染

实验二

革兰氏染色法

一目的要求

1学习并初步掌握革兰氏染色法

2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性 二基本原理

革兰氏染色法是1884年丹麦病理学家christain Gram 创立的而后作了些改进，革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脱色，最后用复染剂复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌。如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而细菌染上复染剂的颜色，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色，碘作为媒染剂，它能结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力，当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖的网状结构孔径缩水，透性降低，从而合结晶紫-碘复合物不易被洗脱，而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂 的蓝紫色，革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。三器材

1菌种 大肠杆菌

2染色剂：革兰氏染色液

（1）草酸铵结晶紫：A 液：结晶2g：95%乙醇20ml;

B 液：草酸铵0.8g;蒸馏水80ml;

混合AB两液，静置48h后使用（）(2)卢戈氏碘液

碘片1g;碘化钾2g;蒸馏水30ml;(3)95%乙醇

（4）番红复染液：番红25g;95%乙醇 100ml 取上述配好的番红乙醇溶液10ml和 80ml蒸馏水混匀即成。3仪器或其他用具

显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 蒸馏水 四 操作步骤 1制片

（1）涂片：取载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，有接种环无菌操作挑取菌苔于水滴中，混合 并涂成薄膜。（2）干燥：室温自然干燥

（3）固定：涂面朝上，通过2~3次 2 初染

滴加结晶紫染色1-2Min,水洗 3 媒染

用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，水洗 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在魄背景下，用滴管流加95的乙醇脱色，直到流出的乙醇无紫色时，立即水洗，脱色时间一般20-30min 5复染

用番红复染2min,水洗。并用吸水纸吸干玻片上的残水。6镜检

干燥后，用显微镜观察。

菌体被当成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的革兰氏阴性菌。实验三

酵母菌的形态观察及死活细胞的的鉴别

一目的要求

1观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活的实验方法 2 掌握酵母菌的一般特征及其与细菌的区别 二基本原理

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，共大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖有性繁殖通过接合产生子囊孢子，本实验 通过美蓝染水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈现蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型 变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。三器材

1菌种：酿酒酵母培养约2天的纯培养物 2溶液或试剂：吕氏碱性美蓝染色液

3仪器或其他用具：显微镜，载玻片 盖玻片 四操作步骤

1美蓝浸片的观察

（1）在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接中环挑取水量酵母菌放在染液中，混合均匀。

（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其不着边际在菌液上

（3）将制片放置约3分钟，镜检。先用低倍镜，然后用高倍镜观察酵母的形态，和出芽情况。并根据颜色区别死活细胞。

（4）染色约0.5小时后再次进行观察，注意死细胞的数量是否增加。2 水—碘液浸片的观察

在载玻片中央加一小滴革兰氏染液用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水—碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。五实验结果

观察的酵母菌的形成特征：

实验四 霉菌的形态观察

一实验目的

1学习并掌握观察霉菌的形态的基本方法 2了解甲类常见霉菌的基本形态特征。二实验原理

霉菌可产生复杂的分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长 到一寂阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多。常是细菌菌体的几倍到几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列三种：直接制片观察法、载玻片培养观察法，玻璃纸培养观察法。三实验器材

1菌种：黄典霉 青霉 产黄青霉 黑根霉 2溶液与试剂：吕氏美蓝染色液 蒸馏水

3仪器或其他用具：显微镜 载玻片 盖玻片 接种环 滤纸 四实验步骤

1在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量霉菌放在吕氏碱性美蓝染色液中，混合均匀。

2用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。3将制片放置约3MIN后镜检，先用低倍镜，后用高倍镜，观察霉菌的形态。五结果

六思考：霉菌的孢子有哪些形态。

实验五

微生物的分离纯化

一目的要求

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术 二基本原理

从混杂的微生物群体中获得只含一种工某一株微生物的过程为微生物的分离与纯化。常用的方法有：

1简易单细胞挑取法

它需要特制的显微镜操纵器或其它显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需要显微单孢操纵器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法，它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滳，将只含有一个萌发孢子的微滴放在一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落，再将微菌落转移2到培养基中，即可获得公由单个孢子发育而成的纯培养。2平板分离法

该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理包括两方面：

（1）选择适合待分离微生物生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可以通过挑取单菌落而获得一种纯培养，获取单个菌落的方法，可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。三器材

1菌种：米曲霉

2培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 马铃薯培养基 3溶液或试剂：试管、三角瓶、琼脂

4仪器或其他用具：无菌玻璃棒、无菌吸管、接种环、无菌培养基、样品 四操作步骤平板划线分离法

1倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称，样品编号和实验日期。2划线：在近火焰处左手拿皿底，右手拿接种环，挑取样品悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成 单个菌落。常用的划线方法有下列二种：

（1）用接种环以无菌操作挑取样品悬液一环，先平板培养基的一边作第一次平等划线3~4条，再转动培养基约70度角，并将接种环上的剩余烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线 和第四次交平行划线。划线完毕后，盖上培养皿，倒置于温箱培养。

（2）挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置下载培养箱中。

（3）挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。五思考题。

第五篇：微生物实验室培养基制作个人总结

一．培养基的制备

仪器材料 微波炉、高压灭菌器、玻璃器皿、三角瓶，PH试纸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氢氧化钠。操作方法

１． 肉汤培养基制作 ⑴成分

肉浸膏（0.3%牛肉膏）500ml 蛋白胨 5g 氯化钠 2.5g 磷酸氢二钾 0.5g ⑵准备工作 配制调节PH用的0.1M氢氧化钠和1M氢氧化钠溶液。⑶操作

①称取牛肉膏，放入玻璃皿中，另入适量蒸馏水配成0.3%。②按比例加入适量蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾搅拌。③搅拌加热至完全溶解。

④PH值调至7.8，煮沸10min，站足水分。

⑤待冷至40～50℃时，过滤。滤液分装于无菌试管内（达试管的1/3）或每管加4-5ml。塞好棉塞。

⑥置高压灭菌器内高压灭菌（121.3℃，20分钟即可）2．普通琼脂培养基制作

⑴成分 肉汤培养基 500ml 琼脂 8-15g ⑵制法

①先矫正肉汤培养基PH值。

②加入适量琼脂煮沸溶解，矫正PH值至7.4～7.6。③灭菌后使杂质沉淀。

④取其上清液灭菌后分装。倒入无菌平皿内凝固即成普通琼脂平板。

二、平板划线接种法 【方法】

1． 在平板底面上用记号笔作好标记，如菌种、班级，姓名、接种日期等，并在平板底面边缘作一原划线标记。

2．右手拿接种环，烧灼灭菌并冷却后，取混合菌液少许。3．左手斜持（45°角）琼脂平板，略开盖，平板在乙醇灯火焰左前上方约5～6cm距离。右手持已取标本的接种环在琼脂平板表面之一侧边缘，作原划线，见图5-2A。

4．接种环烧灼灭菌，冷却后自原划线末端沾取少许标本，使接种环与平板表面成30～40°角，运用腕力将接种环在平板上来回划线，见图5-2B。划线要密但不能重叠，充分利用平板的表面积，不要划破琼脂表面，并注意无菌技术，避免空气中细菌的污染。也可用分区划线法，即从原划线末端沾取标本后只划平板的1/5～1/4，划毕烧灼灭菌接种环，冷后同样划线，共计4～5次。接种环烧灼灭菌后方可放下（图5-2C、D、E）。

三.细菌在培养基中生长特性的观察 1.琼脂培养基 ⑴大小

⑵形状：圆形、不整形、针尖状、露滴状、同心圆状、颗粒状。⑶边缘：整齐、波浪状、锯齿状、卷发状。

⑷表面性状：光滑、粗糙、同心圆状、放射状、皱状、颗粒状。⑸湿润度：湿润、干燥。

⑹隆起度：表面隆起、轻度隆起、中央隆起、扣状扁平。

⑺色泽及透明度：无色、白色、黄色、橙色、红色；透明、半透明、不透明。⑻质地：坚硬、柔软、粘稠。

⑼溶血性：α型溶血 菌落周围有透明溶血环。

β型溶血 半透明带绿色溶血环。

γ型溶血 不溶血。

药物敏感试验

基本原理

细菌对抗菌药物的敏感试验，通常简称为细菌的药敏试验。在给患传染病动物进行治疗时，测定细菌对药物的敏感性，不仅有助于选择合适的药物，而且可为药物的用量提供依据。某种细菌对药物的敏感度，是指抑制该细菌生长所需的最低药物浓度。细菌在体外的敏感度和临床的疗效大体是符合的，但也有不一致者。目前供药敏试验的方法很多，可归纳为两大类，即稀释法和扩散法。有的以抑制细菌生长为评定结果的标准，有的则以杀灭细菌为标准。一般可报告为某菌对某抗菌药物敏感、轻度敏感或耐药。

稀释法是将抗菌药物稀释为不同的浓度，作用于被检菌株，定量测定药物对细菌的最低抑菌浓度(minimal inhibition concentration, MIC)或最低杀菌浓度(minimal bacteriocidal concentration, MBC)，可在液体培养基或固体培养基中进行。

扩散法（diffusion method）是将抗菌药物置于已接种待测细菌的固体培养基上（或内），抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感菌的生长，从而出现抑菌环（带）。药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度就越低，故可根据抑菌环的大小，判断细菌对药物的敏感度。抑菌环（带）边缘的药物含量即该药物的敏感度。此法操作简便，容易掌握，但只用于定性。因受纸片含药量不均及接种量等多种因素影响，结果不够准确，因此试验时应同时设立已知敏感度的标准菌株作为对照。

器材准备

1．菌种 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌。

2．药敏试纸 含青霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素、磺胺嘧啶等药敏试纸，分装于灭菌平皿中。

3．培养基 普通肉汤、普通琼脂平板培养基。

4．其他 95％酒精、小镊子、麦氏比浊管、1mL刻度吸管、橡皮胶头等。

实验步骤

1．试管双倍稀释法

（1）抗生素原液的配制及保存：将抗生素制剂无菌操作溶于适宜的溶剂如蒸馏水、磷酸盐缓冲液中，稀释至所需浓度。抗生素的最初稀释剂通常用蒸馏水，但是有些抗生素必须用其它溶剂作初步溶解。常用抗生素原液的溶剂和最初稀释剂见表6-1。若制剂中可能含有杂菌，配制后宜用细菌滤器过滤除菌（可用玻璃滤器或微孔滤膜，孔径0.22m，但不可用纤维垫滤器）。分装小瓶，在－20℃冷冻状态下保存，可保存3个月或更久，每次取出一瓶保存于4℃冰箱，可用1周左右。

（2）培养基：一般采用普通肉汤培养基。如细菌生长缓慢，可加入0.25％～1％葡萄糖或5％～10％血清。

（3）方法：被测菌种悬液的制备：将较多量的菌种移种于肉汤培养管中，置37℃温箱中培养6h（生长缓慢者可培养过夜），使生长浊度达9×108个/mL（相当于麦氏比浊管第3管）。

抗生素溶液的双倍连续稀释：取13×100mm灭菌带棉塞试管13支（管数多少可依具体需要而定）。另将上述菌液作1︰10 000倍稀释（生长缓慢的细菌可稀释1︰1 000或更少），除第1管加入稀释菌液1.8mL外，其余各管均各加1.0mL。继于第1管加入抗生素原液0.2mL，混合后吸出1.0mL加入第2管中，用同法依次稀释至第12管，弃去1.0mL。第13管为生长对照。

表6-1 抗生素原液的溶剂和稀释剂

抗生素

丁胺卡那霉素 氯苄青霉素 杆菌肽 羧苄青霉素 头孢羟唑 头孢唑林 头孢甲氧霉素 头孢菌素I 氯霉素 氯洁霉素 多粘菌素B或E 红霉素

溶剂 蒸馏水

0.1mol/L PBS（pH值8.0）

蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水

0.1mol/L PBS（pH值8.0）

甲醇 蒸馏水 蒸馏水 甲醇

稀释剂 蒸馏水

0.1mol/L PBS（pH值8.0）

蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水

0.1mol/L PBS（pH值8.0）庆大霉素 卡那霉素

新青霉素I、II、III 青霉素G 萘啶酸 链霉素 四环素 妥布霉素 万古霉素

蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 0.1mol/L NaOH

蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水

蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水

培养及结果观察：置37℃培养16～24h，观察结果。凡药物最高稀释管中无细菌生长者，该管的浓度即为MIC。

MBC的测定：从无细菌生长的各管取材，分别划线接种于琼脂平板培养基，于37℃培养过夜（或48h），观察结果。琼脂平板上无细菌生长而含抗生素最少的一管，即为MBC。也可将上述各管在37℃继续培养48h，无细菌生长的最低浓度即相当于该抗生素的MBC。

结果报告：一般以MIC作为细菌对药物的敏感度，如第1～8管无细菌生长，第9管开始有细菌生长，则把第8管抗生素的浓度报告为该菌对这种抗生素的敏感度；如全部试管均有细菌生长，则报告该菌对这种抗生素的敏感度大小为第1管中的浓度或对该药耐药；如除对照管外，全部都不生长时，则报告为细菌对该抗生素的敏感度等于或小于第12管的浓度，或高度敏感。

2．扩散法（K-B法）

（1）含药滤纸片的制备：含有各种抗菌药物的滤纸片是扩散法中应用最多的。目前，我国生产含药滤纸片的单位不多，购买较为困难，即使购买也易过期失效，所以一般可应用自制的药敏滤纸片。其方法如下：

滤纸片：选用新华1号定性滤纸，用打孔机打成直径为6mm的小圆片，根据需要将数片包成一纸包或放入带棉塞的小瓶或小平皿内，121℃灭菌15min，置100℃干燥箱内烘干备用。

药液的配制：常用药物的配制方法及所用浓度见表6-2。

表6-2 药敏纸片的制备及含药浓度

药 物 青霉素 剂 量 注射用粉剂

制备方法

20mg加pH值6.0 PB缓冲液15.5mL，取1mL加PB缓冲液9mL

20mg加pH值6.0 PB缓冲液20mL 20mg加pH值7.8 PB缓冲液 8mL 以pH值7.8 PB缓冲液作100倍稀释 以pH值6.0 PB缓冲液稀释 20mg加水20mL溶解

药液浓度（g/mL）

200 1 000 2 500 2 500 1 000 1 000

纸片含量（g）10 25 25 10 10 新青霉素 注射用粉剂

注射用粉剂

链霉素

注射用针剂 注射用针剂

氯霉素

口服粉剂 土霉素 口服粉剂或片剂

25mg粉末，加2.5mol/L HCl 15mL 溶解后，以pH值6.0 PB缓冲液或水稀释 000 1 000 1 000 1 000 1 000 1 000 1 500 3 000 3 000 1 000 3 000 1 000 1 000 1 000 1 000 10 000 10 000 1 000 10 000 10 000 10 000 125 10 10 10 10 10 10 30 30 10 300 10 10 10 10 100 100 100 100 100 100 1.25 四环素 口服粉(片)

同土霉素

剂

注射用粉剂 口服片剂

以生理盐水稀释 同土霉素

以pH值3.0 PB缓冲液溶解后以pH值6.0 PB缓冲液稀释

以pH值8.2 PB缓冲液溶解后稀释 以水溶解，以pH值7.8 PB缓冲液稀释 同红霉素

以pH值7.8 PB缓冲液稀释 以pH值7.8 PB缓冲液稀释 以pH值7.2 PB缓冲液稀释 以pH值7.8 PB缓冲液稀释

以1mol/L NaOH 1mL溶解1片，用pH6.0 PB缓冲液稀释 以1mol/L NaOH 1mL溶解1片，用pH6.0 PB缓冲液稀释

以二甲基酰胺或丙酮溶解 以水稀释

以水或pH值8.2 PB缓冲液稀释 100mg加2.5mol/L HCl 1.25mL，加水至5mL，以pH值6.0 PB缓冲液稀释 100mg加水1mL，浓HCl 0.7mL溶解，以pH8.2 PB缓冲液稀释

100mg加水2mL，浓HCl 0.5mL溶解，以pH8.2 PB缓冲液稀释

100mg加浓HCl 1mL，溶解后以pH6.0 PB缓冲液稀释

1片研碎后加水2mL，浓HCl 0.25mL，以pH值6.0及7.8 PB缓冲液稀释 金霉素

口服粉剂

新霉素 红霉素 口服片剂 注射用粉剂 注射用粉剂

卡那霉素

注射用针剂

庆大霉素 注射用针剂 多粘菌素 注射用粉剂 万古霉素 注射用粉剂 呋喃妥因 粉剂或片剂 呋喃西林 粉剂或片剂 痢特灵 磺胺嘧啶片剂

粉剂或针剂

钠

磺胺二甲基针剂

嘧啶

长效磺胺 片剂 周效磺胺 片剂 磺胺甲基异恶唑

磺胺5-甲氧嘧啶

磺胺增效剂

片剂 片剂 片剂

含药纸片的制备：将灭菌滤纸片用无菌镊子摊布于灭菌平皿中，以每张滤纸片饱和吸水量为0.01mL计，每50张滤纸片加入药液0.5mL，不时翻动滤纸片，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30min即可。然后取出含药纸片置于一纱布袋中，以真空抽气使之干燥。或直接将滤纸片摊于37℃温箱中烘干，烘烤的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。对青霉素、金霉素等纸片的干燥宜用低温真空干燥法。干燥后，立即装入无菌的小瓶中加塞，置于干燥器内保存，也可将纸片贮藏于－20℃或家用冰箱冰冻。少量供工作用的纸片从冰箱中取出后应在室温中放置1h，使纸片温度和室温平行，防止冷的纸片遇热产生凝结水。

药敏纸片的鉴定：取制好的纸片3张，以标准敏感菌株测其抑菌环，大小符合标准者则为合格。纸片的有效期一般为4～6个月。

（2）操作方法：K-B法是用含有一定量抗生素的药敏纸片，贴在已接种试验细菌的琼脂平板上，经37℃培养后，抗生素浓度梯度通过纸片上弥散作用而形成，在敏感抗生素的有效范围内，细菌的生长受到抑制，在有效范围外，细菌能够生长，故能形成一个明显的抑菌环。以抑菌环的大小来判定试验菌对某一抗生素是否敏感及敏感程度。

用接种环挑取菌落4～5个，接种于肉汤培养基中，置37℃培养4～6h。

菌液稀释：用灭菌生理盐水稀释培养液使浊度相当于硫酸钡标准管（配制方法：1.175％氯化钡0.5mL、1％硫酸溶液99.5mL，充分混匀，将此溶液置于与肉汤培养基相同的试管中，用前充分振摇）。

用无菌棉拭子蘸取上述肉汤培养液，在管壁上挤压，除去多余的液体，用棉拭子涂满琼脂表面，盖好平皿，在室温下干燥5min，待平板表面稍干即可放置含药纸片。

用灭菌镊子以无菌操作取出含药纸片贴在涂有细菌的平板培养基表面。一个直径9cm的平皿最多只能贴7张纸片，6张纸片均匀地贴在离平皿边缘15mm处，一张位于中心。贴纸片时要轻轻按压，以保证与培养基密切接触。将平皿放37℃恒温箱，培养16～18h，观察结果（如图6-1）。结果判定：观察含药纸片周围有无抑菌环，量取其直径（包括纸片直径）大小，用毫米数记录，按抑菌环直径的大小报告敏感、中度敏感和耐药，具体标准见表6-3。

表6-3 抗菌药物的抑菌环与敏感标准

抗菌药物 丁胺卡那霉素 肠杆菌、肠球菌 葡萄球菌和青霉素敏感细菌 嗜血杆菌 杆菌肽 肠杆菌科 绿脓杆菌 先锋霉素I 氯霉素 氯林可霉素 粘菌素

复方甲氧异恶唑 红霉素 每片含药量(g)

耐药 10 10 10 10 100 100 30 30 2 10 25 15

≤11 ≤11 ≤10 ≤19 ≤8 ≤17 ≤13 ≤14 ≤12 ≤14 ≤8 ≤10 ≤13

抑菌环的直径（mm）

中等敏感 12～13 12～13 12～23

9～12 18～22 14～16 15～17 13～17 15～16 9～10 11～15 14～17

敏感 ≥14 ≥14 ≥24 ≥20 ≥13 ≥23 ≥17 ≥18 ≥18 ≥17 ≥11 ≥16 ≥18 庆大霉素 卡那霉素 甲氧苯青霉素 萘啶酸 新霉素 呋喃妥因 苯唑青霉素 青霉素G 葡萄球菌 其他细菌 30 5 30 30 300 1 10 10 300 10 300 300 10 30 2

≤12 ≤13 ≤9 ≤13 ≤12 ≤14 ≤10 ≤20 ≤11 ≤8 ≤11 ≤12 ≤12 ≤11 ≤9 ≤14

13～14 14～17 10～13 14～18 13～16 15～16 11～12 21～28 12～21 9～11 12～14 13～16 13～18 12～13 10～11 15～16

≥15 ≥18 ≥14 ≥19 ≥17 ≥17 ≥13 ≥29 ≥22 ≥12 ≥15 ≥17 ≥19 ≥14 ≥12 ≥17 多粘菌素B 链霉素 磺胺 四环素 妥布霉素 万古霉素 氯洁霉素

注意事项

1．稀释法

（1）接种量：接种细菌量的多少与MIC有一定关系。如用敏感的葡萄球菌对氯苄青霉素进行检测时，接种量增加1 000倍，MIC只略有增加，但对甲氧苯青霉素的敏感度则因接种量的不同而有较大变化，即使同一菌株，接种量小时为敏感，接种量增大时，其MIC则增加许多倍。

（2）培养基成分及培养条件：培养基的组成成分应保持恒定，外观清晰透明，pH值适宜。为了观察方便，还可向各管中加入葡萄糖及指示剂，以指示剂颜色的改变判定其是否生长。同时要注意选择适宜的培养温度，一般在12～18h观察药敏试验结果。如时间过长，细菌将会在高浓度的药物中生长。其原因，一是由于被轻度抑制的细菌开始繁殖，另一方面则是因为有些抗生素在37℃情况下不稳定，在其被破坏之后，受抑制的细菌也会再次生长繁殖。

（3）对于一些色泽深或本身呈混浊的中草药，其试管培养后不易观察细菌的生长情况。可从培养管移至平板培养基上，观察各管中的细菌是否被杀死。这种方法只能测定药物的最低杀菌浓度。

抑菌圈图示

含药纸片

抑菌圈

细菌菌苔（4）稀释时，每一个稀释度均应更换吸管。菌液及抗生素的加量要准确。

2．扩散法

（1）K-B纸片扩散法必须使用Mueller-Hintion（MHA）培养基，因其解释度的数据是用此培养基积累的，MHA培养基普通冰箱可保存2～3周，用前须放37℃10min，以使形成的水雾干燥。此培养基适合于快速生长的细菌，生长缓慢的细菌或厌氧菌，不宜采用K-B技术及其解释标准。

（2）接种用的菌液浓度必须标准化，以细菌在平板上的生长恰呈融合状态为标准，接种后应及时贴含药纸片和放入35℃（或37℃）培养。

（3）培养的温度要恒定，时间为16～18h，结果不宜判读过早。因培养过久，细菌能恢复生长，使抑菌环变小。培养时不应增加CO2，以防某些抗菌药物形成的抑菌圈大小发生改变及影响培养基的pH值。