第一篇：真菌感染的微生物学实验室检查方法
真菌感染的微生物学实验室检查方法
对真菌的诊断需要了解真菌寄生的部位，完整的病史，包括职业、业余爱好和旅游史。检查一般采用直接镜检和真菌培养两种方法即可确诊。必要时再进行实验、血清学反应或动物接种等。
标本的采集 用无菌操作收集适宜部位的标本，可疑浅部真菌感染应取病变部位的毛发、指（趾）甲屑及皮屑等，可疑深部真菌感染的病人应根据临床症状和体征选取、脑脊液或分泌物、排泄物及痰液等并及时检查，一般不超过1～2小时，以免变质污染。
真菌的直接镜检 皮屑、指（趾）甲和毛发等致密而难以透明的标本应先用10%的KOH微加温处理，溶解角质层和细胞基质，然后进行镜检。脓、痰或血标本可直接涂片镜检。镜下观察是否有孢子、菌丝或假菌丝。若怀疑新生隐球菌等有荚膜的真菌感染，根据所致疾病选取标本，经墨汁负染后镜检，见有芽生菌体外围绕着宽厚的荚膜即可做出诊断。
真菌的分离培养 一般用于直接镜检不能确诊时。病原性真菌培养用沙保弱培养基（pH5.6，不适宜生长）培养，为了防止细菌或腐生性真菌的污染，经常加入放线（菌）酮、青霉素、链霉素或其他抑
制性抗生素。如果是皮肤、毛发和甲屑等标本，需经70%乙醇或2%石炭酸浸泡2～3分钟杀死杂菌，再经无菌盐水洗净后接种于沙保弱培养基上，在25℃～28℃的条件下培养数日至数周，观察菌落特征。
可疑深部真菌感染的标本可接种于血平板、肉渣培养基或硫酸钠肉汤内，分别在室温和37℃培养数日至数周。必要时可在玻片上做真菌小培养，能在光镜下观察真菌的形态和结构的特点及生长发育的全过程，便于鉴别。阴道或口腔粘膜处标本可直接用棉拭子取材，在血平板上分离。血液标本需事先增菌，脑脊液标本则取其沉淀物接种于血平板上，于37℃培养。若疑为假丝酵母菌，可取菌落接种于0.5ml血清试管内，37℃1h后涂片，革兰染色后镜下见有假丝酵母菌细胞长出芽管即可初步鉴定为白假丝酵母菌。
血清学诊断可辅助检查深部真菌感染。通常使用的方法是乳胶凝集和补体结合等试验。用乳胶凝集试验可检测脑脊液或血液中新生隐球菌的荚膜抗原，经有效治疗后，其抗原效价下降；但是在AIDS患者合并新生隐球菌感染时，抗原效价经常会在长时间内维持高水平。但主要问题是多种真菌细胞壁缺乏具有原性的成分。
核酸杂交探针技术 已经用于深部感染真菌的特异性鉴定。从培养物中提取RNA，加入标记化学发光化合物的单链DNA探针。当培养物中出现目的真菌，相应的DNA探针与其RNA杂交。本实验方
法只需要最小量的真菌生长物（通常少于5天），与经典方法比较，更节省时间，可应用于丝状真菌或酵母型真菌的检查。另有检测真菌DNA中的G+C mol%、随机扩增多态性DNA（RAPD）和PCR限制性酶切片长度多态性分析（PCR-RFLP）等技术的应用。与经典方法比较，这些技术敏感、省时，无疑会推动真菌感染性疾病的诊断水平向前发展。
第二篇：真菌鉴定方法
真菌鉴定方法
一般常用的有：
1、直接鉴定法
2、通过筛子检验
3、比重检验法
4、染色检验法
5、洗涤检验法
6、保湿萌芽检验
7、分离培养检验
真菌主要是酵母，霉菌和大型真菌三种，最常用的鉴定方法就是表形观察，霉菌和大型真菌可以通过菌丝的颜色，孢子的形态进行区分，辅以23srRNA就基本ok，酵母可以通过发酵代谢观察辅以23rRNA进行鉴定，真菌鉴定方法。
真菌是细菌的一种吗?
随着生活水平的逐渐提高，人们的卫生防病意识也在不断加强。大多数人知道细菌可以导致疾病，并习惯用“有病菌”或“有细菌”来形容一个脏的环境或物品。那么，真菌又是怎么回事，是细菌的一种吗?的确，真菌也很微小，也能使人生病，但它和细菌有着本质的区别。
我们知道，植物和动物都是由细胞组成的，细胞内都有细胞核，鉴定材料《真菌鉴定方法》。而微生物中只有真菌具有真正的细胞核和完整的细胞器，故又称真核细胞型微生物;细菌仅有原始核结构，无核膜和核仁，细胞器很少，属于原核细胞型微生物;而病毒则没有细胞结构，属于原生微生物。
真菌在自然界中分布极广，有十万多种，其中能引起人或动物感染的仅占极少部分，约300种。很多真菌对人类是有益的，如面粉发酵，做酱油、醋、酒和霉豆腐等都要用真菌来发酵。工业上许多酶制剂、农业上的饲料发酵都离不开真菌。许多真菌还可食用，如蘑菇、银耳、香菇、木耳等。真菌还是医药事业中的宝贵资源，有的可以用于生产抗生素和维生素以及酶类;有的本身就可以入药用于医治疾病，如中药马勃、茯苓、冬虫夏草等。
真菌还可引起动、植物和人类的多种疾病，在人类主要有三种类型：①真菌感染;②变-态反应性疾病;③中毒性疾玻
霉菌
亦称“丝状菌”。属真菌。体呈丝状，丛生，可产生多种形式的孢子。多腐生。种类很多，常见的有根霉、毛霉、曲霉和青霉等。霉菌可用以生产工业原料(柠檬酸、甲烯琥珀酸等)，进行食品加工(酿造酱油等)，制造抗菌素(如青霉素、灰黄霉素)和生产农药(如“920”、白僵菌)等。但也能引起工业原料和产品以及农林产品发霉变质。另有一小部分霉菌可引起人与动植物的病害，如头癣、脚癣及番薯腐烂病等。
酵母菌
属真菌。体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。通常以出芽繁殖;有的能进行二等分分-裂;有的种类能产生子囊孢子。广泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各种果品和蔬菜上更多。是重要的发酵素，能分解碳水化合物产生酒精和二氧化碳等。生产上常用的有面包酵母、饲料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。有些能合成纤维素供医药使用，也有用于石油发酵的。
啤酒酵母(Saccharomyces)
属酵母菌属。细胞呈圆形、卵形或椭圆形。以出芽繁殖，能形成子囊孢子。在发酵工业上，可用来发酵生产酒精或药用酵母，也可通过菌体的综合利用提取凝血质、麦角固醇、卵磷脂、辅酶甲与细胞色素丙等产品。
红曲霉素(Monascuspurpureus)属于囊菌纲，曲霉科。菌丝体紫红色。无性生殖时，茵丝分枝顶端形成单独的或一小串球形或梨形的分生抱子。有性生殖时，产生球形、橙红色的闭囊果，内生含有八个子囊孢子的子囊。红曲霉可制红曲、酿制红乳腐和生产糖化酶等
第三篇：泌尿系统感染的检查方法
泌尿系统感染的检查方法
一般来说，泌尿系统感染多与卫生不良有关，大约50%的女性至少患过一次泌尿系统感染，20%的女性则有多重感染——许多女性一年患1—2次，是很常有的事。通常在阴道时，这些细菌无大碍，问题开始于它们进入尿道时。那些患尿道感染的妇女，其体内结构和其他女性并无两样。就某些不明原因，某些女性较易受感染。致病菌引起的泌尿、男生殖系统炎症称泌尿、男生殖系统感染。致病菌是泌尿、男生殖系感染的先决条件，当泌尿、男生殖系统存在病理基础时，既减弱了机体的防御机制，而易于诱发感染。
还有一些女性泌尿系统感染是在性交中受到挫伤的结果;男性也会得此病，但较为罕见，男性泌尿系统感染通常是由性病所引起。非特异性尿道炎及淋病两种性病最常引起尿道和膀胱炎症。
诊断检查
1。新生儿多为血行感染，男多于女，症状不典型。应注意有无发热或体温过低、哭闹、吐泻、黄疸、拒奶、体重不增、烦躁、抽搐及泌尿道畸形等情况。
2。婴儿发病率较高，女多于男。常有高热、寒战、面色灰白、恶心、频繁呕吐、惊厥、尿频、尿痛或腹痛、尿液混浊。注意外阴部卫生情况和男婴的包皮过长。
3。学龄前后患儿，应注意寒战、发热，单侧或双侧腰痛或叩击痛，尿频、尿痛、尿急、血尿、排尿困难以及遗尿症。
4。慢性或反复发作者，应注意面色苍白、消瘦、精神不振、生长迟缓。久病者注意肾功能不全表现。
检验血、尿常规。尿细菌镜检(中段尿一滴，不离心，滴于玻璃片上，烘干，亚甲蓝或革兰染色，油镜下每视野见一个或更多细菌，表示尿内细菌>10万/ml)。清洁中段尿细菌培养(男性尿细菌计数>1万菌落/ml;女性尿>10万菌落/ml，80%为真性细菌尿;女性1万～10万菌落/ml为可疑)。尿浓缩功能试验。必要时进行有关的肾功能检查。
6。肾超声波检查，必要时行肾图、CT或磁共振、肾扫描、静脉肾盂造影及膀胱尿道造影等检查。
来源：中国青年网健康频道
第四篇：微生物实验室真菌检查质量控制流程
微生物实验室真菌检查质量控制流程
一、目的
规范微生物实验室管理程序，确保临床报告的质量。
二、适用范围
微生物实验室的各类真菌检测。
三、职责
实验室检验人员均必须熟知并遵守本程序。
四、程序
(一)临床样本的采集与处理
1.皮屑
边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片。
2.甲屑
用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，作KOH涂片。
3.毛发
取病发（变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5根作直接镜检。
4.脓液
无菌采集，注意颗粒，用无菌蒸馏水稀释后寻找。可作革兰染色，常规的KOH涂片。5.CSF
采集于无菌试管3～5ml，立即送检。置冰 箱不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检。
6.血液
无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中，BHIB:血标本量为培养基量的1/10，37℃5～7d出现浑浊或菌团，挑取镜检同时移种SDA（注：每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。不作直接检查，因其直接检查阳性率低。
7.体液、痰液、尿液、粪便
①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养。②晨痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后)，挑取黏液或脓性部分：KOH涂片培养。③早晨中段尿或清洁尿10ml，离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养（SDA每管种0.5ml）。④拭子：一般尽量不用，缺点：A.不能得到足量的标本；B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来;C.容易干竭。采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养。⑤纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分KOH涂片培养（加抗生素）注：单纯培养阳性，不一定有临床意义，KOH涂片发现菌丝，有诊断意义。
8.组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1～2mm的小块，KOH 涂片培养。
(二)涂片染色和直接镜检的质控
1.氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。
2.胶纸粘贴法：用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则影响观察。
革兰染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择革兰染色方法，染色后，以油镜观察。
3.染液的质量控制
（1）革兰染液每次新配置和使用中每周一次进行质控，并进行记录。（2）氢氧化钾/复方氢氧化钾每周进行一次质控。(三)真菌鉴定质量保证
1.对酵母样真菌如念珠菌或隐球菌在常规临床细菌室已有较成熟的方法学，可用显色培养基。
2.常规鉴定丝状真菌主要依赖于其生长过程中形态变化和特点，所以要求从事丝状真菌检测的检验人员应作专业短期培训；任何实验室都应建立规范的涂片鉴定方法，要正确区分酵母样真菌或丝状真菌、毛霉菌和曲霉（有顶囊），对不常见的真菌不要轻易作为污染菌报告。(四)结果报告
1.药敏岗位检验人员综合真菌鉴定和药敏结果形成检验报告并签名，微生物实验室负责人或指定人按照相关抗菌药物试验标准操作规程核对药敏结果，尤其注意异常和少见结果。
2.告病人结果之前，应确定质控在可接受范围。3.经双人双核后的报告单交报告发放员分发到各病房或门诊病人，注意签收并记录。缺乏审核者得报告结果，应由微生物实验室负责人或指定人在 24 小时内进行评估。
4.血培养阳性涂片为真菌和脑脊液墨汁染色发现隐球菌的初步报告经核实后，按《三级报告程序》报告。5.完成分析后的微生物标本，检验人员应按照《检验后标本保存程序》安全保管标本和平板，要求有明确标识以备复查。3-5 日后，由废弃物处理岗位人员按照《废弃物处理程序》处理。
遇到来自临床或病人对检验结果的抱怨，应按照《投诉与抱怨处理程序》处理。
第五篇：医学微生物学实验室四种菌种保存方法的比较
医学微生物学实验室四种菌种保存方法的比较
摘要：目的 ： 探索一种经济、方便、长期的保存常用微生物菌种的方法。方法： 将21种细菌分别用半固体、甘油、脱脂牛奶、微孔珠进行保存及复苏鉴定，比较4种菌种保存方法的保存效果。结果： 通过2年的实验证明用甘油、脱脂牛奶、微孔珠保存法保存时间长，且未发生形态结构、生物学特性的变异。结论： 甘油、脱脂牛奶、微孔珠保存法操作简便易行，长期保存的存活率高，菌种的变异率低，适用于一般微生物学实验室菌种的保存工作。
关键词：半固体；甘油；脱脂牛奶；微孔珠；菌种保存
基金项目：湖南省“十二五”综合改革试点项目，湖南省教育厅教改项目（编号： 2010516）
微生物学实验教学中，典型的菌种是实验教学能否成功开展和达到满意的教学效果的关键因素。菌种因受到外界环境及自身代谢的影响，长期在培养基上移种和传代后，其形态、菌落、毒力均易发生变异，而成为不典型的菌株甚至死亡[1]。因而菌种保存工作在微生物学实验教学工作中变得尤为重要。我们通过反复实验试图寻求既操作简便又可保持菌种的存活率，降低菌种的变异率，适用于医学微生物学实验室的菌种保存方法。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，25922）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis，26104）、腐生葡萄球菌（S.saprophyticus，27101）、甲型溶血性链球菌（α-hemolytic streptococcus，32212）、乙型溶血性链球菌（β-hemolytic strepto-coccus，32210-4a）、肺炎链球菌（S.pneumoniae，31002-16）、脑膜炎奈瑟菌（N.meningitides，29019）、大肠埃希菌（Escherichia coli，44101）、肺炎克雷伯菌（K.peumoniae）产气肠杆菌（E.aerogenes，45103）、变形杆菌（P.mirabilis，49006）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi，50402）、甲型副伤寒沙门氏菌（S.paratyphi A，50001）、乙型副伤寒沙门氏菌（S.paratyphi B，50602）、痢疾志贺菌（S.dysenteriae 51252-8）、福氏志贺菌（S.flexneri，51573）、宋内志贺菌（S.sonnei，51334-21）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa，10102）、蜡样芽胞杆菌（B.cereus，63301）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis，63501）、白色念珠菌（C.albicans）。以上菌种中，肺炎克雷伯菌、白色念珠菌由湖南医药学院附属一医院分离，甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌购自北京生物制品检定所，其余均购自湖南省疾控中心。
1.1.2培养基
半固体培养基、营养肉汤、血清肉汤、脱脂牛奶培养基、普通营养琼脂、血琼脂培养基、巧克力琼脂、沙氏琼脂，培养基均用常规方法配制、灭菌。
1.1.3微孔珠保存管
甘油（分析纯）分装于玻璃试管中经121.3℃灭菌30min。保存管为购自珠海贝索生物技术有限公司，主要组成是冷冻保存管内有微孔珠（10粒）、培养基（胰蛋白胨、NaCl、甘油）。
1.2方法
1.2.1菌种的纯化
甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌在血琼脂培养基纯化；脑膜炎奈瑟菌在巧克力琼脂上纯化；白色念珠菌在沙氏琼脂纯化；其余菌种在普通营养琼脂上纯化。
1.2.2甘油保存法
纯化后，挑取甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌于血清肉汤培养基中，置普通培养箱37℃培养12～18h；挑取脑膜炎奈瑟菌于血清肉汤培养基中，5%～10%CO2环境37℃培养12～18h；其余菌种分别接种于营养肉汤培养基中，置普通培养箱37℃培养12～18h。将以上培养物与等量的已灭菌的甘油充分混匀后，分装于微量无菌离心管或细胞冻存管中，每个菌种均分装20支，并分成2组。置-20℃保存。
1.2.3脱脂牛奶保存法
将灭菌脱脂牛奶培养基分装于无菌的微量离心管或细胞冻存管中，挑取纯化后的菌种（菌落尽量多）于分装好的牛奶培养基中，每个菌种均分装20支，并分成2组。充分混匀后置-20℃保存。
1.2.4半固体保存法
挑取纯化后甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌接种于血清半固体培养基中，其余菌种分别接种于半固体培养基中，每个菌种均接种20支，并分成2组。置普通培养箱37℃培养12～18h后加一层1cm厚的无菌液体石蜡，置4℃冰箱保存。
1.2.5微孔珠保存法
3.讨论
菌种是微生物实验室中不可缺少实验标本，为了保证实验教学的需要，对菌种必须妥善保存和保管。保存菌种不仅要求不死，还要求其生物学性状、生理特性、抗原性等方面不发生变异，这是保存菌种的重要环节。真空冷冻干燥保存法是目前菌种保存最有效的方法之一，但是此方法操作过程繁琐，且需要专用的设备（冷冻真空干燥机），成本较高，普通微生物学实验室难以实现。因此，我们需要既有效，又方便、经济适用的菌种保存方法用于微生物学实验教学。我们近2年来用甘油、脱脂牛奶、半固体、微孔珠对21种菌株分别进行保存试验的比较，结果表明，半固体保存法虽然操作简单，菌种复苏方便，但不适用于对营养要求特殊的链球菌和奈瑟氏菌等菌株，且菌种需3～6个月转种一次，菌种在多次传代转种过程中易发生变异。甘油、脱脂牛奶、微孔珠保存法相对来说操作简单、运行成本低廉，20个菌种包括链球菌也能保存至少24个月，且无变异现象产生[4]。而脑炎奈瑟氏菌在以上4中保存方法中存活率的很低，这可能是因为陈旧培养物中细菌自身所产生的有害代谢产物过多，使其在保存过程中容易死亡，因此，在以后的工作中需要继续摸索和寻找脑炎奈瑟氏菌保存的简便和有效的方法。总之，除半固体保存法外，其余三种方法均适用于微生物学教学和科研常用菌种的保存。
参考文献：
[1] 吴茂红，吴时耕.菌种的保存方法介绍[J].江西医学检验，2004，22（6）：545
[2] 王娅，金志雄，裴德翠，等.几种简易的菌种保存方法[J].青岛医药卫生，2009，41（6）：451-452
[3] 车萍，张颖颖，田洪波.形态学实验室菌种保存的实验方法改革[J].现代医药卫生，2013，29（6）：912
[4] 钟志宏，李启星，唐小异，等.甘油保存菌种方法的改良[J].实用预防医学，2005，12（3）：670-671
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