第一篇：初中化学物质分离与提纯的常用方法小结
初中化学物质分离与提纯的常用方法小结
物质的分离是将几种物质通过物理或化学方法分开，提纯则要求把不纯物质中的杂质除去。提纯的原则是： ①不增：即在除掉杂质时不增加新杂质。②不减：即被提纯的物质不能减少或改变。③易分：即操作简便易行，杂质易分离除去。
④最佳：即最好在除去杂质的同时能增加被提纯物质的量。
一、常用的物理方法
1.过滤法：适用于固体与液体的混合物进行分离。
①先将混合物溶于水。
②过滤。
③将滤液蒸发得某溶质。
2、蒸发：适用于可溶性固体溶质与溶剂的分离。
3、降温结晶（重结晶）法：适用于两种可溶性固体的溶解度受温度影响变化明显不同的混合物进行分离。溶解度变化大的那种物质被提纯出来。
可按如下步骤：①在高温下制成饱和溶液，②结晶，③过滤。
4、特殊性质法：利用混合物中某些物质的特性进行物质分离。如：Cu粉中混有Fe粉，可用磁铁吸出铁粉。
二、常用的化学方法
原理：所用试剂能与杂质反应，不能与提纯物反应，把杂质转化成水；气体；沉淀除去，又不能引入新的杂质。
1、沉淀法：即加入一种试剂和杂质反应生成沉淀经过滤而除去。如：HNO3中混有H2SO4，可加入适量的Ba(NO3)2溶液：
2、化气法：即加入一种试剂和杂质反应，使其生成气体而除去。如一般某盐中混有少量碳酸盐、碳酸氢盐等常用此法除去。
如NaCl溶液中混有Na2CO3，可加入适量的稀盐酸：
3、置换法：即在某盐溶液中加入某金属，把盐溶液中的金属置换出来，从而把杂质除去。
如Zn SO4 溶液中含有CuSO4，可加入过量的锌：
4、转化法：即通过某种方法，把杂质转化为被提纯的物质。如CO2气体中混有少量的CO，可将混合气体通过盛有足量灼热的CuO的试管：
第二篇：初三化学物质的分离和提纯知识点总结
初三化学物质的分离和提纯知识点总结
化学常用的物质的分离方法是：
1.溶解过滤法：一种物质易溶于水，另一种物质难溶于水，可以将这两种物质的混合物溶于水，然后过滤，就可以分离出这两种物质。
2.冷却热饱和溶液法：根据两种物质的在水中的溶解度有较大的差异。将这两种物质的混合物配制成混合溶液，然后突然降低温度，溶解度较小的那种物质就结晶析出了，因此，就将这两种物质分离出来了。
3.物质溶解特性法（萃取法）：两种物质的混合物中，有一种物质不容于有机溶剂，而另一种物质易溶于有机溶剂，且这两种物质都不和有机溶剂反应，可根据这种特性，先将其中的一种物质溶解在这种有机溶剂中，产生分层的现象，然后分离出它们。
4.气体沉淀法：两种物质的混合物中，有一种物质能和其它的物质发生反应，产生沉淀或者是气体，而另一种物质不反应，利用这种性质，将这两种物质分离出来。
物质的分离是把原混合物中各成份一一分开，并恢复原样品。物质的提纯（除杂）就是除去物质中混有的杂质，从而得到纯净的某物质，其基本方法有：
一、物理方法
1、过滤法：适用于不溶于液体的固体与液体的分离或提纯。
2、结晶法：适用于可溶性固体与液体的分离和提纯。具体方法有两种。
① 降温结晶法：适用于溶解度受温度变化影响较大的固态物质的分离或提纯。
② 蒸发结晶法：适用于溶解度受温度变化影响不大固体物质的分离或提纯。
二、化学方法：
1、原则：
①“不增、不减、易分”：
不增即最终不能引入新的杂质；
不减是除杂结果不应使所需物质减少；
易分是加入试剂后，使杂质转化为沉淀、气体和水等与所需物质易于分离。
②先除杂后干燥。
2、方法：（以下括号里的均为杂质）
① 吸收法：如一氧化碳混有二氧化碳可用氢氧化钠等碱性溶液吸收；
② 沉淀法：如氯化钾中混有氯化镁可加氢氧化钾溶液，再过滤；
③ 溶解法：如铜中混有氧化铜可加入过量的盐酸，再过滤；
④ 转化法：如铜中混有锌可加硫酸铜溶液再过滤；
⑤ 气化法：如氯化钠中混有碳酸钠可加入过量盐酸，再蒸发结晶；
⑥ 加热法：如氧化钙中混有碳酸钙可高温灼烧；
⑦ 综合法：当含有多种成分的杂质时，分离提纯往往不仅仅使用一种方法，而是几种方法交替使用。
三、知识解析：物质的分离与除杂（提纯）从内容上看，它包含着常见酸、碱、盐及其他重要物质的性质及特殊化学反应的知识；从过程上看，它是一个原理确定、试剂选择与实验方案确定、操作实施的过程。其考查点和趋势是：
1、考查物质的分离和提纯原理。根据除杂质的原则，自选或从题给试剂中选出除杂试剂。判断题给试剂的正误等。
2、考查物质提纯的实验设计。根据物质分离和提纯的原则设计正确的实验方案。
3、考查评价物质分离和提纯的实验方案。对题给试、步骤、操作、效果等进行评价、比较，从中选出最佳方案。
4、除去混合物中杂质，不仅要考虑反应原理正确可行，而且要考虑实际操作简便易行，同时还要注意实验的安全性和药品、能源的节约等其它问题。
第三篇：中考化学物质的分离和除杂和提纯专题训练(精)
专题六物质的分离、除杂和提纯
一、选择题(每小题只有一个选项符合题意
1、氮气混有少量氢气、二氧化碳和水蒸气,欲获得干燥纯净的氮气,可采取下列操作:①通过浓硫酸,②通过填充氧化铜的加热管,③通过氢氧化钠浓溶液,④通过浓盐酸。最好的组合顺序是(A、①→②→③ B、③→②→④ C、③→②→① D、④→②→③
2、下列各组物质中的杂质(括号内为杂质,只需加入适量稀硫酸就能除去的是(A.NaCl(Na2CO3 B.Fe(Cu C.Na2CO3(CaCO3 D.HCl(BaCl2
3、下列各组物质的溶液,不另加试剂无法一一鉴别的是(A.NaOH HCl CuSO4MgSO4 B.Na2CO3K2SO4BaCl2HCl C.KNO3HCl CaCl2NaOH D.NH4NO3H2SO4NaOH MgCl2
4、分离下列各组物质的方法不正确的是（A.用过滤法分离氧化铜和硫酸铜的混合物 B.用结晶法分离氯化钠和硝酸钾的混 合物
C.用蒸馏法(依据物质沸点的不同分离煤油和水的混合物 D.通过灼热的氧化铜除去CO中的CO2,得纯净的CO
5、下表是各物质所含的少量杂质以及除去 这些杂质所选用的试剂或操作方法,其中正确的是 分离的一组混合物是(A.木炭粉和二氧化锰
B.铁粉和硫酸铜晶体 C.氯化钡和硫酸钾
D.二氧化锰和氯化钠
7、下列实验方案中,能达到预期目的的是 a(A.用NaOH 溶液除去CO 2中混有的HCl 气体 B.用点燃的方法除去CO 中混有的少量CO 2 C.用稀盐酸除去热水瓶胆壁上的水垢[主要成分CaCO 3和Mg(OH2] D.用BaCl 2溶液除去KNO 3溶液中混有的少量K 2SO 4,得到纯净的KNO 3溶液
8、实验操作方法:①称量,②过滤,③蒸发,④结晶;其中可用于混合物分离的是(A.①② B.③④ C.①②③ D.②③④
二、填空题
9、右图所示的装置有多种用途。根
据实验需要,气体既可从a 导入也可以从b 口导入。瓶中既可加入其他物质,也可以加入不同的液体或固体颗粒等。请根据要求将相关内容填入下表,然后结合物理知识回答问题:
结合物理知识,简述在表内第③项中,排水法收集O2操作成功的原理。
10、为除去Na2SO4溶液中含有的杂质Na2CO3,甲、乙、丙三位同学分别选用一种试剂(适量进行实验。请你对他们所选用的试剂进行评价:
11、某课外活动小组通过Internet网上资料得知:废弃的定影液中含有一定量的AgNO3。他们从摄影店收集到一些废弃的定影液,准备将其中的银以单质的形式回收。于是。他们进行了以下实验活动:(1[设计方案] ①加入比银活泼的金属单质②除去金属混合物中的杂质(2[小组讨论] ①选择加入的金属
甲同学认为:向定影液中加入过量的铜粉,则得到的金属混合物含有银和铜;乙同学认为:向定影液中加入过量的铁粉,则得到的金属混合物含有银和铁。你认为
同学的方案更合理,其原因是。该方案的化学方程式为。
②除去银粉中混有的金属
向金属混合物中加入的试剂是,化学方程式
为。
(3[进行实验] 过程如下:
请回答:操作a是,需要用到的玻璃仪器有:烧杯、玻璃棒和;溶液B中溶质的化学式为。
(4[产品验证]请你设计一个简单方法验证得到的银中是否含有铁粉,方法是 专题六物质的分离和除杂和提纯
一、选择题
1、C
2、D
3、C
4、D
5、A
6、D
7、C
8、D
二、填空题
9、①b,空气;②a;③b;④a,NaOH溶液或AgNO3溶液或水;⑤a,浓H2SO4;⑥a,澄清的石灰水或Ba(OH2溶液
10、甲:不行,除去Na2CO3的同时又引入了新杂质NaCl。乙:行,除去Na2CO3的同时增加了Na2SO4,而且没引入新杂质。丙:不行,除去Na2CO3的同时了也除去了Na2SO4,并引入了新杂质NaOH。
11、(2①乙铁
粉比铜粉更易被除去(或更易得到、更经济。2AgNO3+ Fe ===Fe(NO32 + 2Ag ②稀盐酸(或稀硫酸
Fe + 2HCl == FeCl2 + H2↑(或Fe + H2SO4 == FeSO4 + H2↑。(3过滤漏斗FeCl2(或FeSO4。(4用磁铁接触,看银粉是否被磁铁吸引(或取少量滴入稀盐酸或稀硫酸,看是否有气泡放出。混合物的除杂(一知识点
1、除杂的原则:不增,不减,易分。不增----在除掉杂质的同时,不得引入新杂质;不减----被提纯物质不能减少或改变;易分----操作简单易行,杂质容易被分离除去。
2、除杂方法:(1物理方法①沉淀过滤法:见前面的过滤操作一节的内容。如KCl(MnO2。②结晶法:见前面的结晶操作一节内容。如:KNO3(NaCl溶液滤液滤液精盐回答:(1a、b两种溶液可能分别是(A、BaCl2、Na2CO3 B、Na2CO3、BaCl2 C、K2CO3、Ba(NO32 D、Ba(NO32、K2CO3(2最后一步加入过量的盐酸和蒸干的原因及作用?.3、下列除杂质的方法中正确的是((2003年眉山
中考A、CaO中混有少量的CaCO3(加适量的稀盐酸B、NaCl中混有少量的Na2CO3(加适量的稀盐酸C、CO中混有少量的CO2(将混合气体通过灼热的CuO D、KCl中混有少量的K2SO4(加入适量的Ba(NO32 溶液
4、下列括号中的物质是除去杂质所用的药品,其中错误的是((2002年眉山中考A、氧化钙中含有碳酸钙(盐酸B、二氧化碳中含有少量一氧化碳(石灰水C、氢气中含有氯化氢(氢氧化钠溶液D、硫酸亚铁溶液中混有硫酸铜(铁粉
5、下列除去杂质的方法正确的是:((2001年眉山中考A、除去CO中的少量CO2是将气体通过烧碱溶液B、除去CO2中的少量的氧气,是将混合气体氧化通过灼热的氧化铜C、除去氢氧化钠中的少量Na2CO3,是加入适量的盐酸D、除去CO2中少量的CO,是将混合气体通过灼热的铜网
8、只用一种试剂不能鉴别出来的一组溶液是(A.HNO3 KNO3 KOH B.KNO3 NaCl
Na2CO3 B.Na2SO4 BaCl2 Na2CO3 D.NaOH Ba(OH2 H2SO4
9、甲同学持有食盐、纯碱、胆矾、高锰酸钾和碳酸钙五种固体样品。他把这些物质分别研磨成粉末后,请乙同学鉴别它们。乙同学通过观察物质的颜色,可鉴别出来的物质是______________;(2若要设计最简单的实验、用最少的实验步骤并选取最经济、最常见的试剂将余下的物质鉴别出来,则该实验分_____ 步操作(填数字,所加试剂是_________________。
11、为了除去氯化钠样品中的碳酸钠杂质,兴趣小组最初设计了如下的方案并进行实验。(上海(1写出沉淀A的化学式。
(2加入CaCl2溶液后,分离除去沉淀A 的实验操作方法是。(3同学在实验过程中,又发现了新的问题:此方案很容易引入新的杂质,请写出固体物质B的成分(用化学式表示。(4同学继续探究后又提出新的方案:将混合物溶解,若滴加盐酸至不再产生气体为止,则既能除去Na2CO3杂质,又能有效地防止新杂质的引入。写出有关反应的化学方程式:。
12、(河南分别选用一种试剂,用化学方法除去下列物质中的杂质:(1NaOH溶液中混有少量的
Ba(OH2;(2H2中混有少量的CO2;(3NaCl溶液中混有少量的Na2CO3。
13、(江西粉笔是一种常用的教学用品,已知其主要成分中含有钙元素。小强和小雯同学一起探究粉笔的组成。[提出问题]白色粉笔的主要成分到底是什么?[猜想]小强认为:可能含CaCO3 小雯认为:可能含CaSO4为证明他们的猜想是否正确,请你参与方案的设计并补充完整。(1将少量的粉笔灰放入水中,搅拌后形成浑浊液。取过滤所得滤液和滤渣分别进行实验;(2取少量滤渣与反应,如果观察到的现象,证明小强的猜想是正确的,其化学方程式为;(3另取少量滤液,向其中滴入溶液和稀硝酸,如果观察到的现象,则证明小雯的猜想是正确的。
14、(大连某活动小组从工厂收集到了一些含有硝酸银的废液中,以及废铁屑、废锌屑的混合物。在回收银时,他们将一定量的上述金属混合物加入到含硝酸银的
废液中,充分反应后过滤,得到固体和浅绿色滤液(所含其他杂质不考虑。为了探究滤液中溶质的组成,他们做出下列猜想: 初中化学辅导网：http://www.xiexiebang.com 初中化学辅导网：http://www.xiexiebang.com 初中化学辅导网：http://www.xiexiebang.com 初中化学辅导网：http://www.xiexiebang.com
第四篇：有机物分离和提纯教案
第四节 研究有机化合物的一般步骤和方法
主讲人：黄菊梅 2013/12/4 知识与技能:
1、了解怎样研究有机化合物，应采取的步骤和方法。
2、掌握有机物的分离和提纯的一般方法。过程与方法: 通过多媒体课件和讲授的方式，了解质谱、红外光谱、核磁共振氢谱。情感、态度与价值观: 通过本节的练习，从中体验研究有机化合物的过程和科学方法，提高自身的科学素养。教学重点
研究有机化合物的一般步骤和常用方法。
1、蒸馏、重结晶等分离提纯有机物的实验操作
2、通过具体实例了解某些物理方法如何确 【教学过程】
【引入】从天然资源中提取有机物成分或者是工业生产、实验室合成的有机化合物不可能直接得到纯净物，因此，必须对所得到的产品进行分离提纯，如果要鉴定和研究未知有机物的结构与性质，必须得到更纯净的有机物。我们已经知道，有机化学是研究有机物的组成、结构、性质、制备方法与应用的科学。那么，该怎样对有机物进行研究呢？一般的步骤和方法是什么？ 这就是我们这节课将要探讨的问题。
【板书】 第四节 研究有机化合物的一般步骤和方法
从天然资源中提取有机物成分，首先得到的是含有有机物的粗品。在工厂生产、实验室合成的有机化合物也不可能直接得到纯净物，得到的往往是混有未参加反应的原料，或反应副产物等的粗品。因此，必须经过分离、提纯才能得到纯品。如果要鉴定和研究未知有机物的结构与性质，必须得到更纯净的有机物。下面是研究有机化合物一般要经过的几个基本步骤： 【板书】
首先我们结合高一所学的知识了学习第一步——分离和提纯。【板书】
一、分离、提纯
提纯混有杂质的有机物的方法很多，基本方法是利用有机物与杂质物理性质的差异而将它们分离。接下来我们主要学习三种分离、提纯的方法。【板书】
1、蒸馏
蒸馏是分离、提纯液态有机物的常用方法。当液态有机物含有少量杂质，而且该有机物热稳定性较强，与杂质的沸点相差较大时（一般约大于30ºC），就可以用蒸馏法提纯此液态有机物。【演示实验1-1】含有杂质的工业乙醇的蒸馏
所用仪器：铁架台（铁圈、铁夹）、酒精灯、石棉网、蒸馏烧瓶、温度计、冷凝管、接受器等。如图所示：
【蒸馏的注意事项】
(1)注意仪器组装的顺序：“先下后上，由左至右”；(2)不得直接加热蒸馏烧瓶，需垫石棉网；
(3)蒸馏烧瓶盛装的液体，最多不超过容积的2/3；不得将全部溶液蒸干；需使用沸石；
(4)冷凝水水流方向应与蒸气气流方向相反（逆流：下进上出）；
(5)温度计水银球位置应与蒸馏烧瓶支管口齐平，以测量馏出蒸气的温度； 【演示实验1-2】（要求学生认真观察，注意实验步骤）【板书】
2、重结晶
（1）冷却法：将热的饱和溶液慢慢冷却后析出晶体，此法适合于溶解度随温度变化较大的溶液。
（2）蒸发法：此法适合于溶解度随温度变化不大的溶液，如粗盐的提纯。（3）重结晶：将以知的晶体用蒸馏水溶解，经过滤、蒸发、冷却等步骤，再次析出晶体，得到更纯净的晶体的过程。
重结晶的首要工作是选择适当的溶剂，要求该溶剂：（1）杂质在此溶剂中的溶解度很小或溶解度很大，易于除去；（2）被提纯的有机物在此溶剂中的溶解度，受温度的影响较大。【思考与交流】
1、已知KNO3在水中的溶解度很容易随温度变化而变化，而NaCl的溶解度却变化不大，据此可用何方法分离出两者混合物中的KNO3并加以提纯？
2、重结晶对溶剂有何要求？被提纯的有机物的溶解度需符合什么特点？
3、重结晶苯甲酸需用到哪些实验仪器？
4、能否用简洁的语言归纳重结晶苯甲酸的实验步骤？ 【概括】高温溶解、趁热过滤、低温结晶
【补充】
1、洗涤沉淀或晶体的方法：用胶头滴管往晶体上加蒸馏水直至晶体被浸没，待水完全流出后，重复两至三次，直至晶体被洗净。
2、检验洗涤效果：取最后一次的洗出液，再选择适当的试剂进行检验。
【板书】
3、萃取（1）所用仪器：烧杯、漏斗架、分液漏斗。
（2）萃取：利用溶液在互不相溶的溶剂里溶解度的不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂组成的溶液中提取出来，前者称为萃取剂，一般溶质在萃取剂里的溶解度更大些。
分液：利用互不相溶的液体的密度不同，用分液漏斗将它们一一分离出来。注意事项：
1、萃取剂必须具备两个条件：一是与溶剂互不相溶；二是溶质在萃取剂中的溶解度较大。
2、检查分液漏斗的瓶塞和旋塞是否严密。
3、萃取常在分液漏斗中进行，分液是萃取操作的一个步骤，必须经过充分振荡后再静置分层。
4、分液时，打开分液漏斗的活塞，将下层液体从漏斗颈放出，当下层液体刚好放完时，要立即关闭活塞，上层液体从上口倒出。
练习1 下列每组中各有三对物质，它们都能用分液漏斗分离的是 A 乙酸乙酯和水，酒精和水，植物油和水 B 四氯化碳和水，溴苯和水，硝基苯和水 C 甘油和水，乙酸和水，乙酸和乙醇 D 汽油和水，苯和水，己烷和水
练习2 可以用分液漏斗分离的一组液体混和物是 A 溴和四氯化碳 B 苯和溴苯 C 汽油和苯 D 硝基苯和水
当堂检测
1)．下列属于分离、提纯液态有机物的操作的是（）A．蒸馏 B．蒸发 C．重结晶 D．过虑
2).下列各组混合物中，可以用分液漏斗分离的是（）
A.溴苯和水 B.乙酸和乙醇 C.酒精和水 D.溴苯和苯
3).现有三组混合液，①乙酸乙酯和乙酸钠溶液 ②乙醇和丁醇 ③溴化钠和单质溴的水溶液，分离以上各混合液的正确方法依次是（）
A.分液、萃取、蒸馏 B.萃取、蒸馏、分液 Ｃ.分液、蒸馏、萃取 Ｄ．蒸馏、萃取、分液
4)．下列物质中的杂质（括号中是杂质）分别可以用什么方法除去。（1）酒精（水）（2）壬烷（己烷）（3）KNO3（NaCl）（4）乙酸乙酯（乙醇）（5）甲烷（乙烯）（6）NaCl（泥沙）（7）溴水（水）（8）CO2（HCl）
第五篇：乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
12级临本二班 吕梦月 许力飞
王雅琦 王明华 马翔 张宇 王帅
实验目的：乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量 实验原理：
分离：加蛋白质抑制剂：竞争性或非竞争性抑制蛋白酶活性；防止蛋白酶分解；除核酸：利用核酸和蛋白质在链霉素磷酸酶中溶解度不同除去核酸；去盐 ：超滤液筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过度介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤液膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。等电点测定法的原理：在等电点时蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子静电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互作用之间的作用减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
提纯：醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
鉴定：乙醇脱氢酶可将乙醇分解生成乙醛
定量：SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：1.在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。2.在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS(阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。3.蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。
实验试剂与器材：
器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐 缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，、.交联葡聚糖G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。
甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。、保存液：液体石蜡、定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。
实验步骤：
分离：1.细胞破碎：将10g肝组织用剪刀剪碎，放入研钵中,加入0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液4ml研磨成糊状，再加2ml0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液,搅匀，然后将所得的物质过滤，取滤液。2.添加蛋白质抑制剂：在盛有研磨液的试管中加入5ml磷酰胺素，震荡40度水浴中保温30min。3.除核酸：逐滴加入1%~2%的链霉素硫酸盐，直至沉淀不再产生。进行过滤除去沉淀。4.盐析：逐滴加入硫酸铵溶液直至蛋白质不再沉淀。进行过滤取其沉淀部分，并加入适量磷酸盐缓冲液直至蛋白形成6ml糊状物。5.去盐：将上述溶液放入超滤装置中，使蛋白质和小分子物质分离开，将大分子物质分离开并加入一定量磷酸盐缓冲液直至糊状物形成6ml。6.等电点沉淀法：在上述溶液中加入一定量0.02mol/L盐酸边加入边搅拌，一边用PH剂测量使其PH值调至5.4，然后倒置离心机中6000r/min离心15分钟，倒掉上清液，再在此溶液中加入6ml去离子水，震荡使下部的沉淀重新溶解，并以0.1mol/mL的氢氧化钠将其PH值调至8.6.重复进行两次。
提纯：醋酸纤维膜电泳：1电泳槽与薄膜的制备（1）醋酸纤维素薄膜的湿润与选择：用钝头镊子取一片薄膜，在薄膜无光泽面上，距边2cm处用铅笔各划一条直线此线为点样标志区。小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s—30s内迅速湿润，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜湿润缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应舍去，以免影响电泳结果，将选好的薄膜用竹夹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后方可用于电泳。（2）电泳槽的准备：根据电泳槽的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部浸润后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。
2、点样用钝头镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液，无光泽面向上平放在点样板上，点样时用点样器沾少许经分离的肝脏研磨液，再将点样器轻轻印在点样区内，样品线长度一般为1.5cm，宽度一般不超过3mm.使经分离的肝脏研磨液完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线，用同样的方法对标准乙醇脱氢酶溶液进行点样。
3、电泳 用钝头镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。如图1-2-9所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，如一电泳槽同时安放几张薄膜，则薄膜之间应隔几毫米，盖上电泳槽盖使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，调旋钮调到每厘米电流强度为0.3mA（8块薄膜则为4.8mA）。通电10min—15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50min—60min。电泳后调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源或自然风干。
4、染色与漂洗用钝头镊子取出电泳后的薄膜，无光泽面向上，放在含有0.5％氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min。取出后用自来水冲去多余染料，然后放到盛有漂洗液的培养皿中，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出后放在滤纸上，用电吹风的冷风将薄膜吹干。凝胶层析法：1.凝胶准备 称取5g交联葡聚糖G-25,倾入锥形瓶中,加蒸馏水约60ml溶胀,搅动后静置.待凝胶沉积后,用倾注法除去浮于表面的细粒,重复3次.将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜,以达平衡.2.装柱 取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支,垂直装好.加入缓冲液,打开出口,将气泡赶出,关闭出口.然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高,将 2
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内,再打开出口,使液体流出,继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液,柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止.床面上覆盖3ml缓冲液,关闭出口,在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸,使层析柱稳定5～10min后,接储液瓶,打开出口,用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡,最后关闭出口.3..上样,洗脱 打开平衡好的层析柱出口,使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口.吸混合物样品0.5ml左右,在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品,切勿搅动床面.然后打开出口,使样品进入床内,直至床面重新露出.同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小,而样品又完全进入床内),当少量洗脱液将流入床面时,加入多量的洗脱液,但注意切勿搅动床面凝胶,连接储液瓶进行洗脱.4.分部收集 根据电泳方法进行的结果可得乙醇脱氢酶为第N条带，用自动部分收集器,以5滴/min,5min/管的速度进行收集.并且观察柱上的色带,待第N柱液体流下时,再继续收集两管透明的洗脱液作为空白,关闭出口.即可收集到提纯后的乙醇脱氢酶。再进行醋酸纤维膜电泳进行一遍看看是否纯净，若不纯净则重复进行凝胶交换柱层析法进行提纯。
鉴定：将提纯后的乙醇脱氢酶中放入一定量酒精，并加入氧化亚铜并加热，观察是否有砖红色沉淀。
定量：1.安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意事项：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。
2.配胶：根据待测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶和浓缩胶浓度，按下表配制：
3.制备凝胶板： ①分离胶制备： 按表配制12%分离胶。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液。混匀后用注射器抽取3.2~3.5ml凝胶液，加至长、短玻璃板间的缝隙内(立即清洗注射器及针头)。再用滴管取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入约3~4mm高，以进行水封。30~60min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。②浓缩胶的制备：按表配制3%浓缩胶(待分离胶聚合后再加AP/TEMED)，混匀后用注射器加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合。
待凝胶凝固后，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将Tris-Gly电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。4.样品处理及加样 蛋白质标样及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/ml，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用(处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合)。一般加样体积为10~15l。如样品较稀可适量增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部(双手操作，避免伤及凝胶)，待所有样品槽内都加完样品后即可开始电泳。5.电泳将直流稳压电泳仪开关打开，将电流调至10~20mA(稳流)开始电泳。待蓝色染料(溴
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
酚蓝)迁移至距凝胶底部约1cm时关闭电源。6.染色及脱色取出玻璃板，先用注射器取水从两侧小心冲洗使之松动，再用取胶板轻轻将短玻璃板撬开移去(必要时同时用水冲洗)，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。7.相对分子量计算用直尺分别量取各蛋白质条带中心以及溴酚蓝条带中心距分离胶顶端的距离，按下式计算：相对迁移率 = 样品迁移距离(cm)/ 染料迁移距离(cm)以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
实验结果：
由此次实验可推理的，将乙醇脱氢酶提纯纯净，则可得其可乙醇进行脱氢生成醛，且可得此物质的相对分子质量为141000.实验讨论：
1.并非所有蛋白质都能用此法测定其分子量。已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的，包括电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1本身带有大量正电荷，尽管结合有正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响：其分子量是21,000，但用本法测定的结果却是35,000。因此有必要至少用两种方法来测定未知样品的分子量，以便互相验证。2.有许多蛋白质是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如-胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，本法测定的只是其亚基或单条肽链的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，以便与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。3.此次实验为推理实验，则不知是否纯正，所以要进行检测，而检测的方法是醋酸纤维蛋白膜进行检测即可知道含有几种蛋白质，用标准液进行对比就可知道乙醇脱氢酶的排列顺序是什么，则就知道在凝胶交换柱层析法的分离顺序，如若分离不彻底即要反复进行。就可分离出较纯正的乙醇脱氢酶。然后进行检测其活性和相对分子质量。
注意事项：
1进行研磨操作时，研钵应放在不易滑动的物体上，研杵应保持垂直。研钵中盛放固体的量不得超过其容积的1／3。洗涤研钵时，应先用水冲洗，耐酸腐蚀的研钵可用稀盐酸洗涤。研钵上附着难洗涤的物质时，可向其中放入少量食盐，研磨后再进行洗涤。2.加入链霉素磷酸盐时要适量，不要大量一次加入。3.装柱后要检查柱床是否均匀,若有气泡或分层的界面时,需要重新装柱.4.流速不可太快,否则分子小的物质来不及扩散,随分子大的物质一起被洗脱下来,达不到分离目的.附：本次实验思路
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
原料选取：饥饿24小时后的肝脏
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分离：细胞破碎（捣碎）→添加蛋白质抑制剂（丝氨酸蛋白质抑制剂）→除核酸（沉淀法
1％-2％的链霉素硫酸盐）→盐析（硫酸铵）→去盐（超滤）→等电点沉淀法（PI=5.4-5.8）↓
提纯：检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净看乙醇脱氢酶的带的顺序、凝胶交换柱层析法提纯、检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净再进行提纯
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鉴定：加入乙醇分解鉴定
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定量：SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
实验清单
实验试剂与器材：器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐 缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，、.交联葡聚糖G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。
甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。、保存液：液体石蜡、定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。
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