临床微生物检测行业的现状

第一篇：临床微生物检测行业的现状

临床微生物检测行业的现状、机会与挑战

作为国内比较早进入微生物领域的复星佰珞，我们有幸目睹了国内微生物实验室和微生物检测产品，过去十多年里在技术和规模上的迅猛发展。在此，我们想以从业者的角度，分析和探讨微生物诊断产品的现状、问题和未来可能的行业机会。

一、微生物实验室的地位和作用

国内的临床医院，微生物实验室通常隶属检验科。一部分专业水平比较高的医院，如上海的瑞金医院、北京301医院，微生物科被列为单独的科室，与检验科平级。这种趋势已经和欧美发达国家的情况接近。

微生物实验室最初，也是最基本的工作，是为临床提供及时准确的病原学诊断，包括对病原体的分离、培养、鉴定，以及药敏结果的报告。

随着细菌耐药性的增加，微生物实验室在监管和促进抗菌药物合理使用，以及院内感染的预防和控制中起着越来越重要的作用。

在发达国家，微生物实验室还有一项重要职能，就是参与临床诊断和治疗，为临床提供咨询服务。比如，微生物实验室通常会直接参加对高危和特殊病例的会诊，结合病人的临床指症，提出检测方案，并跟进治疗过程。

二、微生物检测产品的现状和需求

和常规医技项目（如生化、免疫）不同，微生物的检测有一个非常重要也是不可或缺的环节，就是标本处理和培养。只有通过培养得到的各类致病菌，也就是通常所说的阳性标本，才会做进一步的鉴定和药敏检测。

在欧美发达国家，细菌培养的阳性率在35%左右，我们国家阳性率比较低，一般在20-30%。最主要的原因，是标本处理和培养的技术水平比较低，操作不规范。

目前，微生物实验室使用的检测产品，大部分依然以传统方法为基础，首先对标本进行预处理，根据涂片染色的结果，选择合适的培养基进行分离培养；根据菌落特点，选择适当的生化反应或者自动化仪器进行鉴定；药敏则采用纸片法或者直接上自动化仪器进行检测。

无论是国内还是国外，微生物的检测一直是手工、半自动、全自动共存，以基础微生物学方法为主，结合形态学、免疫和分子生物学等辅助手段。这种情况在今后还将长期存在，究其原因，最主要的还是细菌检测，检测的是细菌生长分裂的过程，在技术上无法用自动化仪器取代，尤其是标本处理和培养。

自动化仪器的应用，主要在血培养和鉴定药敏。另外，随着基因技术的发展，不需要培养，能够直接对标本进行检测的快速检测产品逐渐发展起来，这些免疫技术和分子生物学技术的应用，为微生物检测提供了很多辅助手段。

由于方法学的局限，临床对于微生物产品的需求，主要集中在提高速度、减少人工，加强准确性和检测过程的质量控制。另外，对于药敏结果的解释、院感控制和耐药分析也提出了越来越高的要求。

三、制约微生物快速发展的因素

同欧美发达国家相比，国内的微生物实验室无论是技术还是规模，都有着相当大的差距，微生物检测在未来有着非常广阔的发展空间。尤其是最近几年，无论是WHO，还是政府各级卫生主管部门，对于细菌耐药性和抗菌药物合理使用的高度重视，更是为微生物行业的发展创造了有利的大环境。

但是，微生物为什么没有象之前的PCR、化学发光一样，出现一波爆发式的增长呢？ 我们把制约归结为三个问题：人的问题；钱的问题；管理的问题。

所谓人的问题，实际上是临床和实验室沟通的问题。微生物实验室是检验科室中，与临床结合最紧密的检测项目。但是，国内微生物实验室很少具备这种走向临床的能力，大部分医院的情况是，微生物室不懂临床和抗菌药物，而临床医生又不懂微生物。

所谓钱的问题，就是成本核算的压力。微生物室是检验科最不赚钱的部门。成本高、收费低，人力投入大。以最常见的鉴定药敏项目为例，收费不到200元，而一个人份进口试剂的成本就要100元，这还不包括标本处理和辅助试剂的成本，科室的盈利空间非常有限。

管理的问题，虽然，2011年卫生部颁布了史上最严苛的抗菌药物临床管理办法，并启动了为期三年的抗生素专项整治活动，微生物实验室的地位和作用被提到前所未有的高度。但是，在医改的大背景下，医院管理和医药管理的模式尚未解决，政府、医疗保险机构、医院、临床科室和检验科的目标和利益很难达成一致，微生物检测项目依然处在一个两难的境地。

四、如何解决人的问题、钱的问题、管理的问题

微生物检测，最突出的矛盾是缺标本，没标本是因为临床不开单，不开单实验室就没收入，没有收入也就没有投入，实验室配备差，技术水平得不到提高，检测结果对临床没有帮助，医生就更不愿意开单。

所以，在技术上要改变微生物检测的困境、提高标本量，首先要解决人的问题。对微生物室的技术人员、临床医生、采集标本的护士、包括广大患者，都需要进行大量的宣传和教育，提高对微生物检测和抗菌药物合理使用的意识和能力。

人的问题同样体现在院内感染的预防和控制，这其实是微生物室和临床之间的重要媒介。也是提高微生物实验室地位和权威性的重要途径。但是，很多医院的院感依然停留在空气培养等一般性工作上，微生物室的资源和作用并没有很好地得到发挥，也做不到事先预防。

再来看看国外是如何平衡钱的问题。虽然各个国家医疗保障的体系各不相同，但无一例外，都把提高治疗效果、减少住院时间作为降低医疗费用的主要手段。

美国是赢利模式，按病种理赔、按人头收费，病人的治疗时间越短，医疗机构的成本越低，盈利空间越大。微生物检测对合理用药、准确用药致关重要，所以对微生物室的投入很大，尤其是人员。微生物实验室可能赢利不多，甚至不赢利的，却是对医院赢利致关重要的环节。

英国是另外一种公立模式，政府拨款、总量限定，微生物检测能够有效地帮助节约用药费用和住院费用，同样受到重视。

而中国，医院是总量控制下的赢利模式，但是要求各个科室或者小组独立核算，单独赢利。作为需要大量投入的微生物检测，显然达不到这样的赢利要求。

此外，与发达国家相比，在我们的医疗管理和医改过程中，对微生物检测的认识和重视程度远远不够。无论是医保机构，还是政府的政策制定机构，他们的注意力过多地放在医生的处方上，忽视了微生物检测对于合理用药、准确用药的重要作用，甚至一刀切地把本来已经很低的检测收费，进一步地降低，阻碍了微生物实验室的发展。

五、厂家的机遇和挑战

人的问题、钱的问题、管理的问题，制约了微生物检测的快速发展，但是这种局面正在悄悄地发生改变，微生物检测在未来几年实现突破，走向非常广阔的发展空间，已经是不争的事实。

从大环境来看，一个是医疗费用的总量控制，总量控制的关键是药费，而国内药费的主要组成部分是抗菌药物。

其次，抗菌药物的合理使用上升到政策高度，院长成为“第一责任人”。而不是象04年出台抗菌药物指导原则的时候，只有原则没有细则。只有要求，没有落实。

另外，医患矛盾越来越突出，医疗纠纷不短增加，诊断和治疗需要有科学的依据，微生物检测的结果，在处理医疗纠纷、进行理赔时就成为一个重要依据。

当然，这些政策的出台，不可能在短时间内彻底改变所谓人的问题、钱的问题以及管理的问题，广大民众对于抗菌药物合理使用的认识不可能在一夜之间突然提高，我们的医疗制度改革更是一个长期的艰苦的过程。这些都是微生物发展过程中会面临的挑战。

那么，作为厂家，我们应该如何抓住微生物检测未来十年的发展机会呢？

首先，应该致力于开发高品质的、并且适合中国实际情况的产品。

微生物的检测，是个非常严谨的过程，对不同标本、不同细菌都有相应的检测要求，CLSI和UCAST都有非常明确的标准，也是我们微生物检测的根本。

我们国内的一些厂家，出于降低成本的考虑，随意改变药物的浓度梯度和判别标准。有公司在市场上宣传可以按照客户要求，订制药敏试剂，一块板可以同时检测三十多种抗菌药物，可是这些药物当中，很多并没有折点标准，有的甚至根本没有标准品。而他们所谓的订制板条，既没有通过检测，也没有做过临床，当然更不会向SFDA注册申报。

还有一些实验室，过分迷信全自动的进口产品。事实上，不同地区的细菌种类和耐药特性会有很大差异。在本世纪初，我们国内的微生物专家，象陈民均教授、倪语星教授，就注意到了国内外的这种差异，呼吁要建立中国自己的微生物标准和药敏折点。对我们国内企业来讲，这是一个很好的市场机会。

我们复星在开发微生物鉴定药敏系统时，引进的是美国BIOLOG公司的专有技术。作为全球数一数二的微生物专业公司，BIOLOG的鉴定技术在最近10年，一直被逢为表型检测的金标准。

但是，我们在产品开发之初，就考虑到国内和国外，在细菌种类和特性上的差异，并没有照搬美国人的技术，而是花了几年时间，搜集上万株临床细菌，在BIOLOG公司的帮助下，对数据库进行优化和调整。所以，我们的产品虽然比进口产品晚进入市场好几年，还是能够有自己独特的优势，能够直接和进口产品竞争。

除了产品开发，作为厂家，还应该不遗余力地推广规范操作，建立技术壁垒。而不是一味地迎合客户不规范的操作习惯。

我们发现，大部分用户在微生物当中遇到的问题，不是如何操作仪器，而是没有形成好的操作习惯，得不到符合要求的标本。

在教育和培训方面，外资几家大公司做的非常好，值得我们学习和借鉴。但是我们觉得，推广和教育工作还应该更加深入和细致，而不是仅仅停留在微生物室和专家层面。

我们曾经对一家医院呼吸科的护士进行标本采集的培训，这家医院以诊治呼吸道疾病见长。但是，呼吸科标本送检的阳性率不到10%，我们通过对标本采集过程的跟踪，发现问题是出在采样的护士身上，不知道如何采集到符合要求的痰标本。送到微生物室的标本，超过70%都是不合格的，根本无法进行检测。

所以，我们厂家的教育和培训，要跨出检验科和微生物室，充分利用医院层面，对临床医生、护士、实验室操作人员甚至是病人，进行推广和教育。

复星佰珞从2010年开始，对新装机的用户，都会提供免费临床推广的服务。我们发现，医院和临床对这样的培训非常欢迎。很多时候是大院长亲自坐镇，临床科室主任全体参加。当然，这样的医院培训之后的效果通常也最好，临床重视，送检率提高，标本量明显增加，微生物实验室的操作水平得到锻炼，收入也迅速提高。

未来十年，可能是微生物发展的黄金十年。微生物行业的发展，就象细菌的生长一样，需要一个过程，还可能遭遇很多困难，就象细菌，也不是每次都能顺利地培养出来。但是，只要坚持、有耐心，方法得当，最终一定会得到好的结果。

对企业而言，微生物是最有可能站在全球致高点的诊断产品，希望我们的企业，都能够从中找到适合自己的发展机会，专业、专注，实现企业和行业的共同发展！

第二篇：临床微生物标本检测和细菌耐药监测

红河州第四人民医院

临床微生物标本检测和细菌耐药监测制度

1.根据临床微生物标本检测结果合理选用抗菌药物，接受抗菌药物治疗住院患者微生物检验样本送检率不低于30%(相关指标计算方式见附件5)。

2.感染管理部门应对本院细菌耐药情况进行监测，每三个月定期分析、评估监测数据并发布相关信息，提出干预和改进措施，建立细菌耐药预警机制，配合医务部门监督实施。

3.医疗机构抗菌药物管理工作组针对不同的细菌耐药水平必须采取相应应对措施。

(1)对主要目标细菌耐药率超过30％的抗菌药物，及时将预警信息通报医务人员。

(2)对主要目标细菌耐药率超过40％的抗菌药物，慎重经验用药。(3)对主要目标细菌耐药率超过50％的抗菌药物，参照药敏试验结果选用。

(4)对主要目标细菌耐药率超过75％的抗菌药物，暂停临床应用，根据追踪细菌耐药监测结果，再决定是否恢复临床应用。

4.抗菌药物管理工作组按照要求向全国抗菌药物临床应用监测网报送抗菌药物临床应用相关数据信息，向全国细菌耐药监测网报送耐药菌分布和耐药情况等相关信息。

5.药事管理委员会应根据本院微生物培养、药敏情况，定期进行抗菌药物淘汰或筛选，定期对抗菌药物目录进行调整。

红河州第四人民医院药事管理委员会、药剂科

2011年7月1日

第三篇：临床微生物检测的基因同源性分析

临床微生物检测的基因同源性分析

医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。

目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。细菌DNA 同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA 探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。

一、质粒分型(Plasmid profile assay)：

1、原理：

质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。

2、实验过程：a.质粒抽提；b.0.8%琼脂糖电泳；c.EB染色、凝胶成像。

3、实验方法的评价：

优势：

a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。

b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）分离出来的菌株非常有效。

缺点：

a.实验结果的重复性不好。

b.分辨力不高。

二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析(Restriction Endonuclease Assay REA)

1、原理：

限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在0.5-50Kb范围内的DNA片段。恒定的电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同分离菌株的DNA序列的变异可造成限制性位点数目和分布的变化，所以可以导致其REA图谱出现差异。

2、实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是Hind III）；c.0.7%琼脂糖电泳；d.EB 染色、凝胶成像。

3、实验方法的评价：

优势：

a.实验流程简单。

b.所有的菌株都可以这个方法来分型。

缺点：

a.REA图谱包括成百上千条带，一些条带可能不能检测到，一些条带可能会重叠。

b.REA图谱分析复杂。

c.分辨力不高。

三、染色体DNA的脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Field Gel Eelectrophoresis PFGE)

1、原理：

用识别位点相对多的酶进行REA的一个重要的局限性，是分析那些大量的、重叠的、分辨力较差的限制性酶切片段构成的图谱相当困难。如果用限制性位点相对少的酶消化细菌的基因组，那么就可以得到数量相当少但更大的限制性片段，这样在电泳中，穿过琼脂糖的电场作周期性的改变，就可以产生一个有5-20条清晰的分辨较好的图谱。

2、实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是XbaI）；c.凝胶电泳(脉冲场；d.EB染色、凝胶成像；e.软件分析。

3、实验方法的评价：

优势：

a.PFGE方法的分辨力和可重复性都很高，b.PFGE方法是肠球菌, 肠杆菌和葡萄球菌基因分型的金标准。

缺点：

a.必须使所有的酶和缓冲液都能浸透凝胶块，准备合适的DNA样品需要延长培育时间。近来也有报道葡萄球菌和肠球菌可以用相当短的时间来进行PFGE分析。

b.需要昂贵的专业设备。

四、核糖体分型（Ribotyping）

1、原理：

核糖体操纵子包括编码16SrRNA和25SrRNA以及一种或多种RNA的核苷酸序列。核糖体序列高度保守，针对

大肠杆菌rRNA 制备的探针，或者是克隆的核糖体操纵子，可与许多细菌的染色体核糖体操纵子杂交，细菌的基因 组中通常有多个核糖体基因，分别存在于不同长度的酶切片段中，因此核糖体分型可以得到类似指纹的结果，因此 是可以分型的。

2、实验流程：a.碱性磷酸酶脱去E.coli rRNA末端磷酸；b.[γ-32P]ATP末端标记上述E.coli rRNA；c.抽提DN A,限制性内切酶消化DNA（主要是Hind III）；d.凝胶电泳、转膜；e.用标好的rRNA探针进行souther 印记、放 射性自显影。

3、实验方法的评价：

优势：

a.核糖体序列高度保守, 用大肠杆菌rRNA 制备的探针能对所有的细菌进行分型。

缺点：

a.分辨力中等。

b.流行病学上无关的菌株，有可能有相同的核糖体型图谱。

c.需要用到放射性同位素，成本很高。

d.实验步骤繁琐。

五、限制性内切核酸酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP）的核酸杂交分析

1、原理：

DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新 产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP 的产生。

2、实验流程：a.裂解细菌，抽提基因组DNA、pvuII酶消化；b.凝胶电泳、转膜；c.过氧化物酶标记过的IS110探

针杂交、X-ray 胶片显影；d.软件分析。

3、实验方法的评价：

优势：

a.能对所有携带与探针同源基因的菌株进行分型。

b.实验的重复性很高。

缺点：

a.样品用量大、纯度要求高。

b.探针设计的难度大。

c.RFLP分析技术步骤繁琐，工作量大，成本较高。

六、随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA

RAPD-PCR)

1、原理：

由于整个基因组存在众多反向重复序列，单一引物与反向重复序列结合。使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或臵换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。

2、实验流程：a.抽提DNA； b.合成引物，c1.普通PCR，d1.琼脂糖电泳，e1.凝胶成像；c2.PCR with [α-35 S]dATP，d2.尿素多聚丙烯酰胺凝胶电泳，e2.干胶 X-ray显影。

3、实验方法的评价：

优势：

a.分辨力高。

缺点：

a.可重复性差。

b.图谱很难解释。

c.实验步骤繁琐，过程中需要用到同位素。

七、扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism

AFLP-PCR）

1、原理：

由于不同物种的基因组DNA 大小不同，基因组DNA 经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA 片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA 进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA 指纹的

有无来检出多态性。

2、实验流程：a.裂解细菌，抽提基因组DNA；b.限制性内切酶消化；c.PCR扩增；d.毛细管电泳；e.用ABI-310 Genetic Analyzer分析电泳结果。

3、实验方法的评价：

优势：

a.分辨力高。

缺点：

a.引物需要同位素标记。

b.对样品DNA质量要求严格。

c.实验中需要用到毛细管电泳，一般实验室不具备此仪器。

八、重复片段PCR（repetitive extragenic palindromic rep-PCR）

1、原理：

rep-PCR所使用的引物是以短的基因外重复序列为基础的。肠杆菌科成员、一些革兰氏阳性菌和真菌中，都有这些序列，一般说来，这种序列在细菌染色体上有许多位点。当两个序列的距离足够近时，那么位点之间的DNA片段将被有效的复制。因为重复序列的数目和位点变化很大，所以不同菌株扩增产生重复片段的大小和数目也就相应的不同。

2、实验流程：a.抽提基因组DNA； b.合成rep引物、PCR；c.1.5%琼脂糖电泳；d.软件分析结果。

3、实验方法的评价：

优势：

a.有较好的重复性。

b.实验步骤比较简单。

缺点：

a.中等的分辨力。

b.该方法的结果分析是基于Dendron software(Solltech, Inc.,Oakdale, Calif.)软件分析，一般实验室很少有此 软件。

九、核苷酸序列分析（Nucleotide sequence determination）

1、原理：

在细菌界中，核糖体的某些学列高度保守，人们可以设计几乎从任何细菌都可以扩增到核糖体序列的引物。通过测定扩增产物以及分析核糖体操纵子相对变化的区域，就可以确定感染性微生物的类型。

2、实验流程：a.细菌基因组DNA抽提；b.PCR扩增；c.PCR产物测序；d.测序结果与GeneBank 序列比对，得出鉴 定结果。

3、实验方法的评价：

优势：

a.实验步骤比较简单，结果容易分析。

b.对一些难于分型的菌株也能得到很好的结果。

缺点：

a.代测菌株必须有足够的差异序列以保证切实有效。

b.目前还不清楚单一位点的测序能否提供可靠的鉴定结果。随着越来越多的分子技术应用到医院感染的病原菌研究中，为流行病学调查和患者的治疗提供了快捷准确的支持。然而，医院感染病原菌存在广泛而迅速的变异，这些变异使得菌株的基因同源性分析资料的解释变得错综复杂。在任何一种分析系统中，一个单一遗传事件(如单个代谢酶的变化或者一条电泳条带的变化)组成的改变，不足以得出两个菌株代表不同菌株的结论，也就是说它们不一定在流行病学上无关。因此，多种分子分析技术的联用，已成为分子流行病学调查和临床微生物诊断的趋势。

脉冲场凝胶电泳

1984年，Schwartz和Centor发明了交变脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)技术，与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。

一、PFGE的基本原理

脉冲电泳分离DNA大分子的介质是琼脂糖，大于20kb的线性DNA双链片段，在琼脂糖凝胶的网孔中的泳动，就像蛇行似的寻找弯曲蜿蜒的孔隙。普通的单方向恒定电场给DNA分子的泳动动力方向确定且不发生变化，所以严重影响凝胶电泳分离大分子量DNA片段的效果。

PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的，最大分辨率为5000kb大小的线性DNA分子。在交变脉冲电场中，大分子量线性DNA改变泳动方向所需时间比小分子线性DNA要长，因为前者变形能力低于后者。当某一线性DNA在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需的时间大于脉冲场脉冲维持时间时，该DNA的迁移速度将减为最低。线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差异作为分离不同DNA分子的依据。当DNA分子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与DNA分子量成反比。根据被分离DNA分子的范围选择适当的脉冲时间，经过较长时间不断变形转向泳动，不同大小的DNA就被分离。DNA分子的净迁移方向与普通电泳一样，垂直于样品孔。

影响PFGE分辨率的因素包括几方面：两个脉冲场的均一性；两个脉冲场的脉冲时间以及它们之间的比率；两个脉冲场的强度和方向。为了增强PFGE对大小差异较大的DNA样品的分辨率，可采用交变脉冲梯度电场，即在电泳过程中，先用较短的交变脉冲时间使较小的DNA分子分离，然后用较长的交变脉冲时间分离较大的DNA分子。

二、PFGE分类

(一)正交交变电场凝胶电泳

正交交变电场凝胶电泳(orthogonal fieldalternatinggelelectrophoresis，OFAGE)，两交变电场的电流方向相互垂直。

(二)反转电场凝胶电泳

反转电场凝胶电泳(field inversion gelelectrophoresis，FIGE)，交变电场均一并且是180’反向的。

三、PFGE的电泳条件

凝胶中琼脂糖的浓度一般为o．8％～1．5％，常用1％。电泳缓冲液为0．5XTBE，也可用TAE缓冲液。在OFAGE中对于20cm×20cm的凝胶，选择330V以上的电压，在0．5XTBE中的电流为100—200mA，以达到IOV／cm的电压。在FIGE中，一般选择140V的电压，0．5XTBE中的电流为50～60mA，电压一般为7V／cm。通常情况下，电泳宜在5～15℃的低温条件下进行；电泳缓冲液应在两极槽之间循环；而且低电压能产生较整齐的条带；交变电场的交叉角度越大分离效果越好。

电泳后DNA样品染色，采用0．5ug／mlEB浸泡30～45min，紫外灯下观察拍照。

四、PFGE技术的应用(一)分离原核生物的染色体。

(二)人类染色体内切酶物理图谱分析，并将大片段DNA分子直接克隆，是人类基因组序列测定工程中有效的方法之一。

(三)探测细胞染色体上百万碱基对以上的基因组DNA的缺失。

(四)适于单向电场电泳难以分辨的DNA物理图谱的制作。

第四篇：临床微生物实习小结

临床微生物实习小结

1、临床微生物实习小结

不知不觉我都在微生物呆了一个多月了，从真菌结核到手工鉴定，再到血培，血清，培养基，最后一周就是前台。说一下我的感受，也希望后面来实习的同学能从我这提前得到点信息

最有挑战性的：手工鉴定

1.老师一大早会开始看头天孵的平板，看长得如何，长得不好的，接着孵一天;没有分出单个菌落的，不能上机的就要交给我们来转个平板，转平板的注意事项就是要挑菌，这个需要技术，小心不要挑到杂菌。

2.像比较典型的菌落，老师直接根据其特征就能判断出是革兰阴性还是阳性来决定上机，有疑问的交给我们，我们来染色，染色也要注意挑菌。

3.需要手工生化鉴定的，像什么血浆凝固酶实验，卫星现象，普平，6.5%的氯化钠这些，我们都会接触到，同志们在进手工鉴定之前可以提起复习一下老师原来给的鉴定流程和实验书上的操作步骤。

4.还有手工药敏实验，革兰阴性杆菌营养要求低点，一般用MH，阳性球菌一般用血平板，补药敏的话，手工鉴定那有手册，要按着手册进行。

5.一般最后的工作就是留菌，就是保存菌种

下午如果有时间的话，可以自己看一些一天前上机的平板，做一下染色，触酶，凝固酶等简单的实验，而且一般报告都已经出了，可以查看是什么菌。

写的很短，要实习的很多，真的发现时间过得很快，实践出真知，让我们慢慢积累吧。

2、临床微生物实习小结

在这次见习中，我和其他三位同学被一起分到了微生物科。在微生物科负责我们见习工作的是一位韩老师，他为人很随和，给我们布置的见习任务就是每个人跟踪一种类型的临床标本。他要求跟踪从标本被送到微生物科开始一直到得出最终的报告为止并把从中的所见所得记录下来，通过这样一个过程让我们能够对微生物科有尽可能多的了解。除此之外，韩老师还让我们了解一下里面的一些大型自动化仪器的用途及操作方法，为我们以后能更快的适应实习做准备。

见习的第一天，我们看的是标本的接种，我们看过那里的老师熟练的接种过程后深感自己平时做实验室的速度是如此之慢，如果以我们这种速度去完成每天要接种上百个标本的临床工作是根本不可能的。此外我们还看了临床上的革兰染色，发现它与我们做实验时有一些不同，主要区别是在染料上，临床上为了提高染色速度都用了快速染料。总之，这一天的见习让我们了解到的就是效率在临床上是十分重要的。

见习的第二、第三天，我们看的是临床标本的鉴定，对某些细菌，临床上有经验的老师只要通过观察菌落特征、气味及其他一些简单物理性状就可以初步判断出是何种细菌，让我们大感吃惊。科室里还有一位很热心的老师在她空闲的时候向我们详细的讲解了一番在临床上一些常见微生物的鉴定方法，听过之后让我们受益匪浅。见习的第四天，我们看的是临床标本的药敏反应。在这一天里，我们详细的了解了临床上是如何做药敏反应的，以及不同的微生物需要做哪些药敏反应，这些都是我们在课堂上所无法学到的宝贵知识。

最后一天，我们看的是微生物科是如何做质控的。通过这一天的见习，使我们深刻了解到质控对于检验科的重要性。之前，我们只是从书本上了解到其对于检验这一学科是很重要的，但是无法有深切的体会，这次见习给了我们一次很好的机会能让我们在实践中认识到它。除了这些以外，我们每天还在科室里老师有空的时候让他们给我们讲解了一番微生物科中各种孵育箱的作用、ATB仪器的操作方法及其他一些仪器的用途和操作方法，让我们对微生物科有了更全面的了解。

五天的时间眨眼就过去了，我的见习也在不知不觉中圆满结束了，能学到的东西却比我们在学校一个月学到的还多。回想这段时间的生活，我觉得自己过的很充实，也很快乐，更重要的是我学到了不少东西。我相信，这段时间的收获将是我人生中的一笔宝贵的财富。我也相信，通过这次见习的锻炼，将帮助我能更快的融入到即将到来的实习生活中以及以后的工作中。

3、临床微生物实习小结

岁月如梭，光阴似箭，不知不觉在微生物室实习的时间已接近尾声了。

回想这两个月在微生物室实习的这三个月时间里在指导老师的带领下自己真的学会了不少。通过自己的勤奋在积极协助老师完成细菌学方面检验项目的同时，我发现自己的操作能力不说有了很大程度的提高但也有了更大的进步了，相比在学校的时候操作起来更熟练了比如在利用显微镜看细菌形态的时候，以前调显微镜亮度、找视野等就要弄好几分钟，现在通过在医院检验科微生物室三个月的实习，这些小问题都不存在了，而且通过染色在显微镜下能辨认的细菌也比较多了，像球菌科的葡萄球菌感染、链球菌、淋球菌以及杆菌科的肠杆菌，真菌孢子在显微镜下也能一眼辨认。

总之在微生物三个月的实习日子里感觉自己受教颇多，通过亲身实践操作把自己在学校学到的理论知识同实践很好的结合了起来，从而更进一步加深了自己的细菌学知识底蕴，在带教老师的悉心指导下已熟悉掌握了各类标本的接种、细菌培养以及细菌的初步鉴定、细菌的药敏试验等。

在此做次总结为自己更好的回顾在医院检验科微生物室所学。

4、临床微生物实习小结

微生物室是我此次临床药师进修的第一站，也是非常重要的第一步，经过这一个月的学习，我对于一张张药物敏感性报告后的各个步骤有了更直观的认识，学习从临床检验的角度看待抗生素的合理使用，在这一个月的学习中，我了解了微生物室常用的细菌学检验方法，熟悉抗菌药物敏感试验方法和特殊耐药机制的筛选方法，并跟随带教老师参与了简单的临床检验操作及药敏报告的解读。同时，熟悉了微生物的基本分类，本地区常见的病原菌及耐药情况，以及临床常见感染性疾病的常见病原菌及耐药情况。在老师的耐心教导下，我对于MRSA、、VRE、PRSP、产ESBLs菌等几种特殊病原菌的耐药情况及药物选择有了更加全面系统的学习。这一个月的学习让我受益匪浅。

第五篇：表面微生物检测方法

空气、食品接触面微生物检验方法、检验标准 目的：

检测生产车间空气、操作人员手部、与食品有直接接触面的机械设备的微生物指标，生产区域环境当中病原微生物的监控，达到规定标准，以控制食品成品的质量。参照标准：

中华人民共和国国家标准《一次性使用卫生用品卫生标准》GB15979－1995、《HACCP原理与实施》、中华人民共和国国家标准《公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定》GB/T 18204.1－2000、中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、出入境检验检疫局二000四年《出入食品微生物检验培训教材》中《出入食品生产厂卫生细菌检验方法》、日本东京冷冻食品检验方法。采样与检测方法：

3.1空气的采样与测试方法 3.1.1样品采集：(1)取样频率：

a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行采样，以便了解车间卫生清扫消毒情况。b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行采样。

c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间进行采样，如有检验不合格点，整改后再进行采样检验。

d)实验性新产品，按客户规定频率采样检验。e)正常生产状态的采样，每周一次。（2）采样方法

在动态下进行，室内面积不超过30 m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1 m；室内面积超过30 m2，设东、西、南、北、中五点，周围4点距墙1 m。采样时，将含平板计数琼脂培养基的平板(直径9 cm)置采样点(约桌面高度)，并避开空调、门窗等空气流通处，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6h，若样品保存于0～4℃条件时，送检时间不得超过24h。3.1.2菌落培养：

（1）在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置37℃±1℃培养24 h，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。（2）将已采集样品的培养基在6 h内送实验室，细菌总数于37℃±1℃培养48h观察结果，计数平板上细菌菌落数。（3）菌落计算：

a)记录平均菌落数，用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，不可遗漏。

b)若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2 个或2个以上菌落计数。3.2工作台（机械器具）表面与工人手表面采样与测试方法： 3.2.1样品采集：(1)取样频率：

a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行擦拭检验，以便了解车间卫生清扫消毒情况。

b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行全面擦拭检验。

c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间可疑处进行擦拭，如有检验不合格点，整改后再进行擦拭检验。

d)实验新产品，按客户规定擦拭频率擦拭检验。e)对工作表面消毒产生怀疑时，进行擦拭检验。f)正常生产状态的擦拭，每周一次。（2）采样方法：

a)工作台（机械器具）：用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面（取与食品直接接触或有一定影响的表面）取25cm2 的面积，在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。

b)工人手：被检人五指并拢，用浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。（3）采样注意事项： 擦拭时棉签要随时转动，保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具体位置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间 3.2.2 细菌·大肠菌群的检测培养: 样液稀释：将放有棉棒的试管充分振摇。此液为1：10稀释液。如污染严重，可十倍递增稀释，吸取1ml 1：10样液加9ml无菌生理盐水中，混匀，此液为1：100稀释液。3.2.2.1 细菌总数：

（1）以无菌操作，选择1～2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样），将已融化冷至45℃左右的平板计数琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。

（2）待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36℃±1℃培养48 h后计数。（3）结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数 3.2.2.2大肠菌群：（1）平板法: a)以无菌操作，选择1～2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样），将已融化冷至45℃左右的去氧胆酸盐琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。待琼脂凝固后,再覆盖一层培养基，约3-5 ml。

b)待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36℃±1℃培养24h后计数。c)结果计算：以平板上出现紫红色菌落的个数乘以稀释倍数得出。d)结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数（2）试管法: a)以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到BGLB肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。

b)置BGLB肉汤管于36℃±1℃培养48±2h。记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

c)结果报告：按BGLB肉汤管产气管数，查MPN表报告每25cm2食品接触面中或每只手的大肠菌群值。

3.2.3 金黄色葡萄球菌检测（1）定性检测

a)取1ml 稀释液注入灭菌的平皿内，倾注15-20ml的B-P培养基，（或是吸取0.1稀释液，用L棒涂布于表面干燥的B-P琼脂平板），放进36±1℃的恒温箱内培养48±2小时。b)从每个平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌的菌落作血浆凝固酶实验。

c)结果报告：B-P琼脂平板的可疑菌落作血浆凝固酶实验为阳性，即报告手（工器具）上有金黄色葡萄球菌存在。（2）定量检测 a)以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到含10﹪氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。

b)置肉汤管于36±1℃的恒温箱内培养48小时。划线接种于表面干燥的B-P琼脂平板，置36℃±1℃培养45～48小时。

c)从B-P琼脂平板上，挑取典型或可疑金黄色葡萄球菌菌落接种肉汤培养基，36℃±1℃培养20～24小时。

d)取肉汤培养物做血浆凝固酶试验，记录试验结果。

e)报告结果：根据凝固酶试验结果，查MPN表报告每25 cm2食品接触面中或每只手的金黄色葡萄球菌值。

3.3工厂环境中病原体的检测计划与方法

检测计划：为了保证食品安全，工厂应该对生产环境中的病原微生物进行检测和评估，检测项目包括李斯特菌，沙门氏菌等病原体微生物，化验室应该按照一定的计划对生产场所环境中的病原体进行检测，其中包括地面、下水道、排水沟、墙壁、天花板、设备框架、运输的支架，冷藏装置、速冻机、传送带、设备的螺丝、维修工具等部位。当某个点检测到病员微生物时，应该对环境中的相似点加大检测频率；在把所有的预定点检测完后，应该对环境中的病原微生物的存在状况进行全面评估，在下一次环境检测循环过程中加强检测容易出现病原体的环境点，达到持续改进的目的。

检测频率: 每月两次,每次每个区域至少选取5个检测点,分别进行检测。

3.3.1 环境李斯特菌的检测方法（3MTM PetrifilmTM 环境李斯特菌的测试片）3.3.1.1 用涂抹棒，海绵或者其他采样设备收集环境样本。

3.3.1.2 将收集的样本添加10毫升灭菌的缓冲蛋白胨水，将样本与缓冲蛋白胨混合1分钟，将样品置于室温（20-30℃）1小时，最久不超过1.5小时，以修复损伤的李斯特菌。3.3.1.3 将测试片放在平坦处，掀起上层膜。

3.3.1.4 用移液器垂直滴加3毫升样品到下层膜中央，将上层膜缓慢盖下，以免产生气泡。3.3.1.5 轻轻将塑料压板放在位于接种区上层膜上，不要压，扭转或者滑动压板。提起压板等至少十分钟，以使胶体凝固。

3.3.1.6 将测试片透明面朝上，可叠放至十片，在37℃±1℃培养26-30小时，可以用标准菌落记数器或者其他光学放大器判读，不要记数圆形轮廓上的菌落，因为他们不受选择性培养基的影响。

3.3.1.7 对于定性检测，根据紫红色菌落是否存在，结果记为检出或者未检出。3.3.2 环境中沙门氏菌的检测方法

3.3.2.1采样地点: 选取采样点时因尽量选取微生物容易滋生的地方 冷冻车间

FD车间

东区初加工

传递窗口表面、排水沟、排水沟出口、墙壁、地面

卸料间 墙壁、墙角、地面、天花板、物料车表面

东区精加工

地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板

暂存间

墙壁、地面、天花板、墙角、墙缝

西区初加工

传递窗口表面、地面、墙壁、排水沟、排水沟出口

挑选间

墙壁、地面、天花板、墙角、垫板

西区精加工

地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板

包装室

墙壁、地面、天花板、金探传送带表面、落地料存放处

3.3.2.2 操作步骤

3.3.2.2.1采样应在生产开始后进行，用已浸润过的棉拭在选定的被测表面旋转涂抹约100cm2的面积，然后将棉拭放回涂抹试管并盖紧。3.3.2.2.2将样品带回实验室，每5个点混合成一个样品, 登记编号,按照SN0170-92标准及时检测，若有阳性结果出现，应逐步对所混合的每个点分别检测。

物体表面涂抹菌落总数计算方式：物体表面细菌总数（cfu/c㎡）=平皿上菌落的平均数*采样液稀释倍数/采样面积（cm2）

根椐GB15979－2002《一次性卫生用品卫生标准》的标准,生产环境卫生指标 1 装配与包装车间空气中细菌菌落总数应≤2 500 cfu/m3。2 工作台表面细菌菌落总数应≤20 cfu/cm2。

3.工人手表面细菌菌落总数应≤300 cfu/只手，并不得检出致病菌。人员和环境卫生检测方法

一、空气采样及检验方法

1培养基：普通营养琼脂平板，按GB4789.28中3.7条配制 2采样（空气沉降法）

2.1布点：面积小于30平方米的车间，设一对角线，在线上取3点，即中心一点，两端在距墙1米处各取一点；面积大于30平方米的车间，设东、西、南、北、中5个点，其中东、西、南、北点均距墙1米。

2.2采样高度：与地面垂直高度80-150厘米。

2.3采样方法；用直径为9厘米的普通营养琼脂平板在采样点上暴露20分钟盖上送检培养。3培养：于37℃培养24小时。4检测频率：每周 空气质量标准：

生车间、熟车间、成品车间：低于100个 半成品库、成品库：低于10个

二、设备的采样与检验方法

根据生产过程所要求的重点卫生部位，实验室对其进行涂抹采样，进行细菌总数检验。1采样方法

1.1涂抹法（适用于表面平坦的设备和工器具产品接触面）

取经过灭菌的铝片框（框内面积为50平方厘米）放在需检查的部位上，用无菌棉球蘸上无菌生理盐水擦拭铝片中间方框部分，擦完后立即将棉球投入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。

1.2贴纸法（适用于表面不平坦的设备和工器具接处面）

将无菌规格纸（5×5厘米，纸质要薄而软）用无菌生理盐水泡湿后，于需测部分分别贴上两张，两张纸面积共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。2检验方法

2.1细菌总数的检验

将上述样液充分振摇，根据卫生情况，相应地做10倍递增稀释，选择其中2-3个合适的稀释度作平皿倾注培养，培养基用普通营养琼脂，每个稀释度作2个平皿，每个平皿注入1毫升样液，于37℃培养24小时后计菌落数。结果计算

表面细菌总数（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数/30×2 2.2致病菌的检验

沙门氏菌，参照GB4789.4进行 金黄色葡球菌，参照GB7918.5进行

4.检验合格标准：细菌总数10－100个∕cm2，5.关键点：细菌总数≤10个∕cm2 一般区域：细菌总数≤100个∕cm2

三、人员手表面细菌污染情况的检验

1.采样方法：用一支蘸有无菌生理盐水的棉拭子涂擦被检对象手的全部，反复两次，涂擦的时候棉拭子要相应地转动，擦完后，将手接触部分剪去，将棉拭子放入装有10毫升无菌生理盐水的试管内送检培养。

2.检验方法：同工器具表面细菌总数检验方法。

3.结果计算：每只手表面的细菌总数（cfu/只手）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数

四、消毒液药效的微生物学鉴定法

1采样对象：正常使用的消毒液，和已知配制好备用的消毒液 2采样及检验方法

在无菌条件下，用无菌吸管吸取1毫升样液，加入9毫升稀释液中混匀，对于醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通营养肉汤即可；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂，需在肉汤中加入0.1%硫代硫酸钠，对洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在肉汤中加入3%（W/V）土温80和0.3%卵磷脂；对醛类消毒剂，需在肉汤中加入0.3%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种复方消毒剂，需在肉汤中加入（W/V）土温80，以中和被检样液中的残效作用，将注入了样液的稀释液充分摇匀，取1毫升注入平皿，随之倒入普通营养琼脂，待琼脂凝固后，翻转平皿，将平皿于37℃条件下培养24小时后计平板上生长的菌落数。3结果分析

平板上有菌生长，表明被检样液中有残存活菌，若每个平板菌落数在10个以下，仍可用于消毒，若每个平板菌落数超过10个，说明每毫升被检样液含菌量已超过100个，即不宜在用于消毒。

该公式是一个经验公式.它的理论模式依据是:100CM2的面积上10MIN降落的菌落数, 等于1升空气中所含的细菌总数.系数50000基于上述假说和单位换算而来.细菌总数(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT

5/10T:实际放置了5MIN;

100/A:A单一培养皿面积;

1000:1M3=1000L啊,换算成m3

1、空气细菌落菌数单位既然是cfu/m3，那采样时应该还要记录放置平皿的高度。

2、食品安全管理体系中罐头行业有个标准如下：

落下菌数

空气污染程度

评价

30以下

清洁

安全

30～50

中等清洁

50～70

低等清洁

应加注意

70～100

高度污染

对空气要进行消毒

100以上

严重污染

禁止加工

3、是否可根据企业相应的加工产品微生物指标进行自行制定？