jp-微生物检测实验教学指导

第一篇：jp-微生物检测实验教学指导

《食品微生物检验技术》实验指导 《食品微生物检验技术》实验指导

一、课程性质和任务

《食品微生物检验学》是以微生物学的理论为基础，对食品的微生物污染及控制措施、以微生物为主的因素引起的食品腐败变质、食品检验样品的采集及处理作了扼要介绍；着重介绍了食品微生物检验的指标，食物中毒性微生物、常见病原微生物的生物学特性、致病性及检验方法；系统阐述了肉、蛋、乳、水产品及其制品、罐头食品的微生物学检验方法。通过本课程的学习，使学生掌握食品微生物检验的基本原理与方法，注重培养学生的实际操作能力。

二、教学的目标及要求

通过该课程的学习，要求学生掌握食品微生物检验的基本原理与方法，提高微生物检验的实际操作能力。为达到上述目标，要求学生一定要自己亲自动手独立实验，实事求是的完成每一次实验报告，并做好每次实验前的预习。

三、教学方式及课程考核办法

所有实验在教学实验室里由教师指导完成。课程结束后分笔试和操作考试，操作考试采取一个教师对一个学生的方式进行。考试内容由学生自己抽签选择其中一项在规定时间内完成，超过规定时间扣分。笔试成绩和操作成绩各占考试成绩的60％与40％。

实验一 食品样品的采集及处理

一．实验目的和要求

学习采集样品，稀释样品的方法与步骤。二．实验原理

样品是指从某一总体中抽出的一部分，食品采样是指从较大批量食品中抽取能较好地代表其总体样品的方法。食品卫生监督部门或食品企业自身为了解和判断食品的营养与卫生质量，或查明食品在生产过程中的卫生状况，可使用采样检验的方法。根据抽样检验的结果，结合感官检查，可对食品的营养价值和卫生质量作出评价，或协助企业找出某些生产环节中存在的主要卫生问题。食品采样是 2 食品检测结果准确与否的关键，也是营养食品卫生专业人员必须掌握的一项基本技能。

三．需用的仪器或试剂等

培养基、试管、三角瓶、酒精灯、恒温恒湿培养箱。四．采样方法步骤

（1）液体、半液体均匀食品： 采样以一池、一缸、一桶为一个采样单位，搅拌均匀后采集一份样品；若采样单位容量过大，可按高度等距离分上、中、下三层，在四角和中央的不同部位每层各取等量样品，混合后再采样；流动液体可定时定量从输出的管口取样，混合后再采样；大包装食品，如用铝桶、铁桶、塑料桶包装的液体、半液体食品，采样前需用采样管插人容器底部，将液体吸出放入透明的玻璃容器内作现场感官检查，然后将液体充分搅拌均匀，用长柄勺或采样管取样。

（2）固体散装食品：大量的散装固体食品，如粮食、油料种子、豆类、花生等，可采用几何法、分区分层法采样。几何法即把一堆物品视为一种几何立体（如立方体、圆锥体、圆柱体等），取样时首先把整堆物品设定或想象为若干体积相等的部分，从这些部分中各取出体积相等的样品混合为初级样品。对在粮堆、库房、船舱、车厢里堆积的食品进行采样，可采用分层采样法，即分上、中、下三层或等距离多层，在每层中心及四角分别采取等量小样，混合为初级样品；对数量较多的颗粒或粉末状固体食品，需用“四分法”采样。

（3）不均匀食品： 蔬菜、鱼、肉、蛋类等食品应根据检验目的和要求，从同一部位采集小样，或从具有代表性的各个部位采取小样，然后经过充分混合得到初级样品。肉类应从整体各部位取样（不包括骨及毛发）；鱼类，大鱼从头、体、尾各部位取样，小鱼可取2～3条；蔬菜，如葱、菠菜等可取整棵，莲白、青莱等可从中心剖开成二或四个对称部分，取其中一个或两个对称部分；蛋类，可按一定个数取样，也可根据检验目的将蛋黄、蛋清分开取样。五．样品处理

稀释样品。称取1g样品，在火焰旁加到有9mL无菌水和少许玻璃珠的三角瓶 3 内，振荡10min，使样品和水样充分混合，将菌分散，样品中的菌样被稀释了100倍，样品悬液的稀释度为10-2。在火焰处打开无菌吸管的纸套，用无菌吸管吸取样品悬液1ml，加到一个盛有9ml无菌水的试管内，稀释1000倍制成稀释度为10-3的检样悬液，将此吸管在试管内反复吹洗3次，然后取出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹洗3次，然后取出1ml菌液，加到另一支9 ml无菌水中，制成稀释度为10-4的样品悬液备培养基平板

同法按每级稀释10倍的次序得到10-

5、10-6的样品稀释液，稀释完后，用最后一支吸管，由最小的稀释液（10-6）开始吸取0.2ml加到编号为10-6的培养皿，再依次分别从10-

5、10-4试管中各吸取0.2ml稀释液，加到相应编号的培养皿内，每次吸取时，吸管都要在稀释液中反复吹洗几次。

实验二 细菌的革兰氏染色

1．本次实验的目的和要求

进一步掌握正确规范使用显微镜的方法和技能。理解简单染色和革兰氏染色的原理。掌握革兰氏染色的方法与规范操作。巩固显微镜的使用方法和无菌操作技术。

2．实验内容或原理

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的 4 脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

3．需用的仪器或试剂等

显微镜，擦镜纸，香柏油，二甲苯，接种环，酒精灯，石炭酸复红染色液，草酸胺结晶紫染色液，95%乙醇，蕃红染色液，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。4．实验步骤(1)制片

取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。(2)初染

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。(3)媒染

用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。(4)脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。水洗时，不要直接 冲涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜急、过大，以免涂片薄膜脱落。

注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是格兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。(5)复染

用番红染液复染约2min，水洗。

5(6)镜检

干燥后，用油镜观察。

菌体被染成蓝紫色是革兰氏性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

实验三 微生物培养基的制备 实验目的与要求：

(1)学习微生物培养基的制备，了解培养基配方中各成分的作用、制备流程及各环节的操作技术与应用。

(2)学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、操作关键技术和灭菌技术。2 实验原理

(1)培养基的制备原理

培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。它含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。

固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃～37℃)不会融化而保持固体状态。（2）高压蒸气灭菌原理

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达 6 到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。3 实验器材

琼脂、10％HCL、10% NaOH、牛肉膏、蛋白胨、试管、量筒、小烧杯、玻璃棒、骨匙、pH试纸、纱布、棉花、报纸、麻绳、标签、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、电炉等。4 实验步骤

(1)称量：按照培养基配方，准确称取各成份放于烧杯中。

(2)熔化：向上述烧杯中加入所需水量，搅匀，然后加热使其熔解。如是配制固体培养基，在琼脂熔化的过程中，需不断搅拌并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全熔解后，补充所失水分。如果配方中含有淀粉，则需要将淀粉用少量冷水调成糊状并在火焰上加热搅拌后加足水份及其他药品，待完全熔解后，补充水份。

(3)调PH值：初制备好的培养基往往不能符合所要求的PH值，故需用PH试纸或酸度计校正，用1M HCl调PH至所需范围。

(4)过滤：用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求的情况下这一步可以省去。(5)分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。

注意：装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。

7(6)高压灭菌

手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：

a 首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

b 放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

c 加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

d 同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制电源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌。

e 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

f 将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

实验四 微生物菌种的分离纯化 实验目的和要求

学习采集样品，分离纯化微生物菌种的方法步骤 2 实验内容或原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种微生物的过程称为微生物的分离纯化。欲从含有多种微生物的样品中直接辩认出，并且取得某种所需微生物的个体，进行纯培养，那是困难的。由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成，菌落又是可以识别和加以鉴定的。因此将样品中不同微生物 8 个体在特定的培养基上培养出不同单一菌落，再从选定的某一菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯化的目的。这也就是常用纯种分离法的原理。需用的仪器或试剂等

培养基、试管、培养皿、三角瓶、接种环、酒精灯、恒温恒湿培养箱。4 实验步骤(1)采样，样品稀释

稀释土样。称取1g样品，在火焰旁加到有99mL无菌水和少许玻璃珠的三角瓶内，振荡10min，使土壤和水样充分混合，将菌分散，土样中的菌样被稀释了100倍，土壤悬液的稀释度为10-2。在火焰处打开无菌吸管的纸套，用无菌吸管吸取土壤悬液1ml，加到一个盛有9ml无菌水的试管内，稀释1000倍制成稀释度为10-3的土壤悬液，将此吸管在试管内反复吹洗3次，然后取出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹洗3次，然后取出1ml菌液，加到另一支9 ml无菌水中，制成稀释度为10-4的土壤悬液备培养基平板

同法按每级稀释10倍的次序得到10-

5、10-6的土壤稀释液，稀释完后，用最后一支吸管，由最小的稀释液（10-6）开始吸取0.2ml加到编号为10-6的培养皿，再依次分别从10-

5、10-4试管中各吸取0.2ml稀释液，加到相应编号的培养皿内，每次吸取时，吸管都要在稀释液中反复吹洗几次。(2)制备培养基平板(3)平板画线法分离培养

a平板的制作及培养。将已灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基水浴融化后冷却至45℃～50℃（温度过高，培养皿盖上凝结水太多，菌易被冲掉或烫死；温度过低，培养基凝固不易倒出）。

倾倒培养基应在酒精灯火焰附近操作，右手持盛培养基的三角瓶（或试管），左手拿培养皿，并松动三角瓶的棉塞。培养基一次不能用完时，棉塞应用左手小指夹持，不可放在桌面上，拔出棉塞后，三角瓶口在火焰上灭菌，然后少许打开 9 培养皿盖，迅速倾入培养基，迅速将皿盖盖妥，平放桌上，轻轻旋转，使培养基与悬液混合均匀，待凝固后，即成平板。将培养皿倒置于37℃恒温箱中培养24h，细菌即在所固定的位置长成肉眼可见的菌落。

放线菌的稀释分离法同前，只不过在制土壤悬液时，于99ml无菌水的三角瓶内加入10%的苯酚溶液10滴，以抑制细菌生长，28℃恒温箱中培养7 d～10d。

b平板划线分离法

将融化的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制成平板，待冷凝后，左手持平板，右手持接种针，用接种环在火焰上灭菌后沾取一环适宜稀释度的悬液，在火焰附近用左手拇指、食指掀开皿盖，使接种环轻触培养基，迅速划线（注意勿将培养基划破），划线时，接种环与培养基表面的夹角为20～30°。

常用的划线方式有两种,一种是将平板分成三个区域，先在第一个区域内划3～4条平行线，转动培养皿，在火焰上烧掉接种环上的残余物后，通过第一次划线部分，在第二个区域内划线；第二个区域中的线和第一个区域中的线应有部分交叉，依法在第三个区域中划线。另一种是先以沾有细菌悬液的接种环在平板的一端抹一下，使该处沾上一些细菌，然后烧掉环上剩下的细菌，再用烧过冷却的接种环，通过刚才涂抹的部分，左右划线，不能互相接触。

划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法。分离纯化工作可反复进行，直至获得满意的单菌落纯培养为止。（4）观察、镜检、纯培养

实验五 食品中菌落总数的测定 实验目的和要求

掌握菌落计数的方法，掌握食品细菌菌落总数的测定报告方式。2 实验内容或原理

菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态过程，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数也并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。3 实验材料与仪器

食品检样、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、无菌生理盐水、无菌培养皿、无菌移液管、无菌不锈钢勺。4 实验步骤

（1）取样、稀释和培养

a 以无菌操作取检样25g（或ml），放于225ml灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠），经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。

b 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。

c 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。

d 根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

e 稀释液移入平皿后，将凉至45℃～50℃牛肉膏蛋白胨琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。

f 待培养基凝固后，翻转平板，置37℃温箱内培养48h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。(2)菌落计数方法

作平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0℃～4℃，但不要超过24h。(3)菌落计数报告方法

a平皿菌落数的选择

选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。

b 稀释度的选择

① 应选取平均菌落数在30～300之间的稀释度报告

细菌菌落总数是指检样在培养基上37℃24小时培养所长出的菌落数。菌落总数的多少可以说明污染的程度。

② 若有二个稀释度均在30～300之间时，应以二者比值决定，比值 ≤2取平均数，比值>2则其较小数字。

③ 若所有稀释度均>300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数。④ 若所有稀释度均<30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数。⑤ 若所有稀释度均不在30～300之间，有的>300，有的又<30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。

c 菌落计数报告方法

菌落数在1～100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。

实验六 食品中大肠菌群的测定

1．实验目的和要求

学习食品中大肠菌群检测程序方法，掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。

2．实验内容或原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数是以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。本实验学习多管发酵法检测食品中的大肠菌群。

a 初发酵试验

用于初步发酵试验的液体培养基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。许多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群可发酵乳糖产酸（有机酸），产气（CO2+H2）。乳糖起选择性碳源的作用。溴甲酚紫是pH指示剂（碱性条件：紫兰色；酸性条件：黄色，变色点pH=6.7），当大肠菌群的细菌利用乳糖产酸后，使原来的pH由中性下降成酸性，培养基从紫色变为黄色。另外，溴甲酚紫还具有抑制其他细菌生长的作用。

b平板分离

为进一步证明大肠菌群的存在，需进行平板分离，所用培养基为伊红美蓝琼脂。伊红美蓝琼脂培养基中含有伊红与美蓝两种苯胺类染料，可以抑制G+菌和一些难培养的G-菌，而且在低酸度时，两种染料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。大肠菌群因其强烈发酵乳糖而产生大量混合酸，使菌体表面带上正电荷，可染上伊红染液，伊红与美蓝结合，菌体被着上深紫色，形成带核心、具金属光泽的特征性菌落。

c 复发酵试验

阳性菌落经涂片染色鉴别为G-，无芽孢者，再经过乳糖发酵管液体培养进行复发酵试验，经24h培养产酸产气者，可确认为大肠菌群阳性结果。3 实验材料与仪器

食品检样、乳糖蛋白胨发酵管、伊红美蓝琼脂平板、EC 肉汤、磷酸盐缓冲稀释液、蛋白胨稀释液、无菌生理盐水、革兰氏染色液、恒温箱、冰箱、恒温水浴、天平、显微镜、直径为90mm的平皿、试管、吸管、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、载玻片、酒精灯、试管架。4 实验操作步骤（1）检样处理

液态检样可用振摇的方式，使充分均匀混合后，取50ml加入 450ml已灭菌的稀释液中，即为10倍稀释检液。

凝态及浓稠液态检体如布丁、炼乳等,经适当搅拌均匀后，取50g加入450ml灭菌之稀释液中，用搅拌均质器搅拌(搅拌方法同前)，即为10倍稀释检液。（2）检样稀释

以无菌操作将上述处理样25ml放于有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇后，制成1:10的均匀稀释液。

用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，制成1:100的稀释液。

另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌吸管。

根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种3管。（3）初发酵试验

将已选择的稀释检液及原液(液体检样)充分振摇、混合均匀后,分别吸取1ml接种于已装有9ml乳糖胆盐发酵管内（内倒置小管）。接种量在1ml以上者，用双倍乳糖胆盐发酵管（内倒置小管），1ml及1ml以下者，用单倍乳糖胆盐发酵管（内倒置小管）。每一稀释度接种3管，置37℃ 温箱内，培养24h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

（4）分离培养

经24h培养后，将产气（倒管顶部有空气）的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置37℃ 温箱内，培养24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。（5）复发酵试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置 37℃温箱内培养24h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

第二篇：表面微生物检测方法

空气、食品接触面微生物检验方法、检验标准 目的：

检测生产车间空气、操作人员手部、与食品有直接接触面的机械设备的微生物指标，生产区域环境当中病原微生物的监控，达到规定标准，以控制食品成品的质量。参照标准：

中华人民共和国国家标准《一次性使用卫生用品卫生标准》GB15979－1995、《HACCP原理与实施》、中华人民共和国国家标准《公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定》GB/T 18204.1－2000、中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、出入境检验检疫局二000四年《出入食品微生物检验培训教材》中《出入食品生产厂卫生细菌检验方法》、日本东京冷冻食品检验方法。采样与检测方法：

3.1空气的采样与测试方法 3.1.1样品采集：(1)取样频率：

a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行采样，以便了解车间卫生清扫消毒情况。b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行采样。

c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间进行采样，如有检验不合格点，整改后再进行采样检验。

d)实验性新产品，按客户规定频率采样检验。e)正常生产状态的采样，每周一次。（2）采样方法

在动态下进行，室内面积不超过30 m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1 m；室内面积超过30 m2，设东、西、南、北、中五点，周围4点距墙1 m。采样时，将含平板计数琼脂培养基的平板(直径9 cm)置采样点(约桌面高度)，并避开空调、门窗等空气流通处，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6h，若样品保存于0～4℃条件时，送检时间不得超过24h。3.1.2菌落培养：

（1）在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置37℃±1℃培养24 h，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。（2）将已采集样品的培养基在6 h内送实验室，细菌总数于37℃±1℃培养48h观察结果，计数平板上细菌菌落数。（3）菌落计算：

a)记录平均菌落数，用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，不可遗漏。

b)若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2 个或2个以上菌落计数。3.2工作台（机械器具）表面与工人手表面采样与测试方法： 3.2.1样品采集：(1)取样频率：

a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行擦拭检验，以便了解车间卫生清扫消毒情况。

b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行全面擦拭检验。

c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间可疑处进行擦拭，如有检验不合格点，整改后再进行擦拭检验。

d)实验新产品，按客户规定擦拭频率擦拭检验。e)对工作表面消毒产生怀疑时，进行擦拭检验。f)正常生产状态的擦拭，每周一次。（2）采样方法：

a)工作台（机械器具）：用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面（取与食品直接接触或有一定影响的表面）取25cm2 的面积，在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。

b)工人手：被检人五指并拢，用浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。（3）采样注意事项： 擦拭时棉签要随时转动，保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具体位置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间 3.2.2 细菌·大肠菌群的检测培养: 样液稀释：将放有棉棒的试管充分振摇。此液为1：10稀释液。如污染严重，可十倍递增稀释，吸取1ml 1：10样液加9ml无菌生理盐水中，混匀，此液为1：100稀释液。3.2.2.1 细菌总数：

（1）以无菌操作，选择1～2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样），将已融化冷至45℃左右的平板计数琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。

（2）待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36℃±1℃培养48 h后计数。（3）结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数 3.2.2.2大肠菌群：（1）平板法: a)以无菌操作，选择1～2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样），将已融化冷至45℃左右的去氧胆酸盐琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。待琼脂凝固后,再覆盖一层培养基，约3-5 ml。

b)待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36℃±1℃培养24h后计数。c)结果计算：以平板上出现紫红色菌落的个数乘以稀释倍数得出。d)结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数（2）试管法: a)以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到BGLB肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。

b)置BGLB肉汤管于36℃±1℃培养48±2h。记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

c)结果报告：按BGLB肉汤管产气管数，查MPN表报告每25cm2食品接触面中或每只手的大肠菌群值。

3.2.3 金黄色葡萄球菌检测（1）定性检测

a)取1ml 稀释液注入灭菌的平皿内，倾注15-20ml的B-P培养基，（或是吸取0.1稀释液，用L棒涂布于表面干燥的B-P琼脂平板），放进36±1℃的恒温箱内培养48±2小时。b)从每个平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌的菌落作血浆凝固酶实验。

c)结果报告：B-P琼脂平板的可疑菌落作血浆凝固酶实验为阳性，即报告手（工器具）上有金黄色葡萄球菌存在。（2）定量检测 a)以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到含10﹪氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。

b)置肉汤管于36±1℃的恒温箱内培养48小时。划线接种于表面干燥的B-P琼脂平板，置36℃±1℃培养45～48小时。

c)从B-P琼脂平板上，挑取典型或可疑金黄色葡萄球菌菌落接种肉汤培养基，36℃±1℃培养20～24小时。

d)取肉汤培养物做血浆凝固酶试验，记录试验结果。

e)报告结果：根据凝固酶试验结果，查MPN表报告每25 cm2食品接触面中或每只手的金黄色葡萄球菌值。

3.3工厂环境中病原体的检测计划与方法

检测计划：为了保证食品安全，工厂应该对生产环境中的病原微生物进行检测和评估，检测项目包括李斯特菌，沙门氏菌等病原体微生物，化验室应该按照一定的计划对生产场所环境中的病原体进行检测，其中包括地面、下水道、排水沟、墙壁、天花板、设备框架、运输的支架，冷藏装置、速冻机、传送带、设备的螺丝、维修工具等部位。当某个点检测到病员微生物时，应该对环境中的相似点加大检测频率；在把所有的预定点检测完后，应该对环境中的病原微生物的存在状况进行全面评估，在下一次环境检测循环过程中加强检测容易出现病原体的环境点，达到持续改进的目的。

检测频率: 每月两次,每次每个区域至少选取5个检测点,分别进行检测。

3.3.1 环境李斯特菌的检测方法（3MTM PetrifilmTM 环境李斯特菌的测试片）3.3.1.1 用涂抹棒，海绵或者其他采样设备收集环境样本。

3.3.1.2 将收集的样本添加10毫升灭菌的缓冲蛋白胨水，将样本与缓冲蛋白胨混合1分钟，将样品置于室温（20-30℃）1小时，最久不超过1.5小时，以修复损伤的李斯特菌。3.3.1.3 将测试片放在平坦处，掀起上层膜。

3.3.1.4 用移液器垂直滴加3毫升样品到下层膜中央，将上层膜缓慢盖下，以免产生气泡。3.3.1.5 轻轻将塑料压板放在位于接种区上层膜上，不要压，扭转或者滑动压板。提起压板等至少十分钟，以使胶体凝固。

3.3.1.6 将测试片透明面朝上，可叠放至十片，在37℃±1℃培养26-30小时，可以用标准菌落记数器或者其他光学放大器判读，不要记数圆形轮廓上的菌落，因为他们不受选择性培养基的影响。

3.3.1.7 对于定性检测，根据紫红色菌落是否存在，结果记为检出或者未检出。3.3.2 环境中沙门氏菌的检测方法

3.3.2.1采样地点: 选取采样点时因尽量选取微生物容易滋生的地方 冷冻车间

FD车间

东区初加工

传递窗口表面、排水沟、排水沟出口、墙壁、地面

卸料间 墙壁、墙角、地面、天花板、物料车表面

东区精加工

地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板

暂存间

墙壁、地面、天花板、墙角、墙缝

西区初加工

传递窗口表面、地面、墙壁、排水沟、排水沟出口

挑选间

墙壁、地面、天花板、墙角、垫板

西区精加工

地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板

包装室

墙壁、地面、天花板、金探传送带表面、落地料存放处

3.3.2.2 操作步骤

3.3.2.2.1采样应在生产开始后进行，用已浸润过的棉拭在选定的被测表面旋转涂抹约100cm2的面积，然后将棉拭放回涂抹试管并盖紧。3.3.2.2.2将样品带回实验室，每5个点混合成一个样品, 登记编号,按照SN0170-92标准及时检测，若有阳性结果出现，应逐步对所混合的每个点分别检测。

物体表面涂抹菌落总数计算方式：物体表面细菌总数（cfu/c㎡）=平皿上菌落的平均数*采样液稀释倍数/采样面积（cm2）

根椐GB15979－2002《一次性卫生用品卫生标准》的标准,生产环境卫生指标 1 装配与包装车间空气中细菌菌落总数应≤2 500 cfu/m3。2 工作台表面细菌菌落总数应≤20 cfu/cm2。

3.工人手表面细菌菌落总数应≤300 cfu/只手，并不得检出致病菌。人员和环境卫生检测方法

一、空气采样及检验方法

1培养基：普通营养琼脂平板，按GB4789.28中3.7条配制 2采样（空气沉降法）

2.1布点：面积小于30平方米的车间，设一对角线，在线上取3点，即中心一点，两端在距墙1米处各取一点；面积大于30平方米的车间，设东、西、南、北、中5个点，其中东、西、南、北点均距墙1米。

2.2采样高度：与地面垂直高度80-150厘米。

2.3采样方法；用直径为9厘米的普通营养琼脂平板在采样点上暴露20分钟盖上送检培养。3培养：于37℃培养24小时。4检测频率：每周 空气质量标准：

生车间、熟车间、成品车间：低于100个 半成品库、成品库：低于10个

二、设备的采样与检验方法

根据生产过程所要求的重点卫生部位，实验室对其进行涂抹采样，进行细菌总数检验。1采样方法

1.1涂抹法（适用于表面平坦的设备和工器具产品接触面）

取经过灭菌的铝片框（框内面积为50平方厘米）放在需检查的部位上，用无菌棉球蘸上无菌生理盐水擦拭铝片中间方框部分，擦完后立即将棉球投入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。

1.2贴纸法（适用于表面不平坦的设备和工器具接处面）

将无菌规格纸（5×5厘米，纸质要薄而软）用无菌生理盐水泡湿后，于需测部分分别贴上两张，两张纸面积共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。2检验方法

2.1细菌总数的检验

将上述样液充分振摇，根据卫生情况，相应地做10倍递增稀释，选择其中2-3个合适的稀释度作平皿倾注培养，培养基用普通营养琼脂，每个稀释度作2个平皿，每个平皿注入1毫升样液，于37℃培养24小时后计菌落数。结果计算

表面细菌总数（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数/30×2 2.2致病菌的检验

沙门氏菌，参照GB4789.4进行 金黄色葡球菌，参照GB7918.5进行

4.检验合格标准：细菌总数10－100个∕cm2，5.关键点：细菌总数≤10个∕cm2 一般区域：细菌总数≤100个∕cm2

三、人员手表面细菌污染情况的检验

1.采样方法：用一支蘸有无菌生理盐水的棉拭子涂擦被检对象手的全部，反复两次，涂擦的时候棉拭子要相应地转动，擦完后，将手接触部分剪去，将棉拭子放入装有10毫升无菌生理盐水的试管内送检培养。

2.检验方法：同工器具表面细菌总数检验方法。

3.结果计算：每只手表面的细菌总数（cfu/只手）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数

四、消毒液药效的微生物学鉴定法

1采样对象：正常使用的消毒液，和已知配制好备用的消毒液 2采样及检验方法

在无菌条件下，用无菌吸管吸取1毫升样液，加入9毫升稀释液中混匀，对于醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通营养肉汤即可；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂，需在肉汤中加入0.1%硫代硫酸钠，对洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在肉汤中加入3%（W/V）土温80和0.3%卵磷脂；对醛类消毒剂，需在肉汤中加入0.3%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种复方消毒剂，需在肉汤中加入（W/V）土温80，以中和被检样液中的残效作用，将注入了样液的稀释液充分摇匀，取1毫升注入平皿，随之倒入普通营养琼脂，待琼脂凝固后，翻转平皿，将平皿于37℃条件下培养24小时后计平板上生长的菌落数。3结果分析

平板上有菌生长，表明被检样液中有残存活菌，若每个平板菌落数在10个以下，仍可用于消毒，若每个平板菌落数超过10个，说明每毫升被检样液含菌量已超过100个，即不宜在用于消毒。

该公式是一个经验公式.它的理论模式依据是:100CM2的面积上10MIN降落的菌落数, 等于1升空气中所含的细菌总数.系数50000基于上述假说和单位换算而来.细菌总数(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT

5/10T:实际放置了5MIN;

100/A:A单一培养皿面积;

1000:1M3=1000L啊,换算成m3

1、空气细菌落菌数单位既然是cfu/m3，那采样时应该还要记录放置平皿的高度。

2、食品安全管理体系中罐头行业有个标准如下：

落下菌数

空气污染程度

评价

30以下

清洁

安全

30～50

中等清洁

50～70

低等清洁

应加注意

70～100

高度污染

对空气要进行消毒

100以上

严重污染

禁止加工

3、是否可根据企业相应的加工产品微生物指标进行自行制定？

第三篇：微生物检测课后习题

绪论：

1.食品的卫生标准内容包括那些？感官指标、理化指标、微生物指标

2.对食品进行微生物检验具有何意义？是衡量食品卫生质量的终于指标，也是判断被检食品是否能食用的科学依据；可以判断食品加工环境及食品卫生的情况，为卫生管理工作提供科学依据；可以有效地防止人畜共患病的发生；保证产品质量，避免不必要的损失

3.食品微生物检验的范围包括那些？生产环境的检验；原辅料的检验；食品加工、储藏、销售等环节的检验；食品的检验

4.食品卫生标准中的微生物指标有那些？菌落总数；大肠菌群；致病菌；霉菌及其毒素；其他指标 菌落总数概念和测定意义

1.什么是菌落总数？是指食品检验经过处理，在一定条件下培养后，所得1mL（g）或1cm2面积检样中所含菌落的总数

2.测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？（1）判定食品被细菌污染的程度及卫生质量（2）预测食品存用的期限长短（3）了解细菌在食品中的繁殖动态

3.画出平板倾注法测定菌落总数的示意图：步骤:检样—稀释处理—选择3个适宜稀释度—倒平板—培养—菌落计数—报告结果

4.在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？(1)选取菌落数在30-300之间的平板,若有两个稀释度均在30-300之间时,比值小于或等于2取平均数,比值大于2则取稀释度较低平板菌落数(2)如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告(3)如均小于30,则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告(4)如菌落数有的大于300,有的又小于30,不再30-300之间,以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告(5)如所有稀释度均无菌落生长,则应按小于1乘以最低稀释倍数报告

5.在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？(1)对照平板出现几个菌落时,要追加对照平板(2)吸管进出瓶子或试管时,吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分（3）吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm，调整时要使管尖与容器内壁紧贴（4）进行稀释时，吸管口不得与稀释液接触（5）检验从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min（6）稀释倍数越高菌落数越少，如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。

6.在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？普通食品37℃48h倒放平板；清凉饮料、调味品、糕点、酒类：37℃24h；水产品：30℃48h 大肠菌群测定

1.什么是大肠菌群？大肠菌群由那些微生物组成？指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖，产酸产气的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌；组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属、阴沟肠杆菌

2.测定食品、饮料等产品的大肠菌群数有什么意义？（1）判断食品是否受到粪便的污染（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况

3.大肠菌群具有那些生物学特性？形态与染色：革兰氏阴性，无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气；培养特性：在EMB琼脂平板上的典型菌落：呈深紫黑色或中心深紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽

4.在大肠菌群数的检验中，要注意哪些事项？（1）抑菌剂（2）菌落特征（3）产气量（4）MPN检索表

5.在水的大肠菌群数检验中，如何进行水样的采集？自来水（未含氟）：龙头火烧灭菌，畅流5-10秒后取样；地面水源水，江湖河，水库，水池等浸入水下20cm下取样，水井50cm下取样；漂白粉处理的水样：自来水，游泳池水，应在瓶内加入0.03g硫代硫酸钠/500,或2ml1.5%硫代硫酸钠液/500ml,除氯;运送:2小时内送检.6-10℃<6h立即检验;检验前将水样震荡5-10min 病原性球菌检测

1.金黄色葡萄球菌可产生哪些毒素和酶?溶血毒素；杀白细胞素；血浆凝固酶；脱氧核糖核酸酶；肠毒素；溶纤维蛋白酶；透明质酸酶

2.金黄色葡萄球菌在B-P平板上的菌落特征如何?说明其原理？特征：圆形，光滑凸起，湿润，成灰色至黑色，边缘色淡周围为浑浊带，在其外层有一透明带；原理：氯化锂、甘氨酸：抑制非致病性葡萄球菌的生长；丙酮酸钠：促进葡萄球菌生长；亚碲酸钾：抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色。

3.金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征如何?菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有透明溶血圈（β型）

4.确认葡萄球菌为金黄色葡萄球菌的依据至少应该包括那几个试验? 5.金黄色葡萄球菌的形态与染色、培养特征如何？形态与染色：革兰氏阳性球形菌，排列呈葡萄状。无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气；培养特征：需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃、PH7.4；对营养要求不高，在普通培养基中生长良好，加少量葡萄糖或血液生长更旺盛；耐盐性强，在含NaCL7.5-15%培养基中能生长；在肉汤中是浑浊生长，时间过长，有少量沉淀；在普通培养基上生长，可形成圆形凸起，表面光滑，边缘整齐，不透明，直径1—2mm的菌落能产生黄色色素；血琼脂平板：菌落大、产生完全溶血圈；BP平板：灰色到黑色边缘淡，菌落周围有一浑浊带，在其外有一透明带

食品中溶血性链球菌的检验

1.链球菌的溶血现象有那几个类型，各类型的溶血特征如何？甲型α-溶血性链球菌（菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血，这类链球菌多为条件致病菌。）、乙型β-溶血性链球菌（菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血，该菌的致病力强，常引起人类和动物的多种疾病，与人类疾病有关的血清型90%属于A族链球菌）、丙型γ-链球菌（不产生溶血素，菌落周围无溶血环，也称为丙型或不溶血性链球菌，该菌无致病性，常存在于乳类和粪便中，偶尔也引起感染。）

2.溶血性链球菌在血平板和葡萄糖肉汤中生长有何特征？在血平板上形成灰白色，半透明、表面光滑、有乳光圆形突起的细小菌落，直径0.5-0.75mm，针尖大小，菌落周围出现溶血环；在葡萄糖肉汤中：

3.溶血性链球菌能产生什么毒素和酶？溶血毒素、致热外毒素、透明质酸酶、链激酶、链道酶、杀白细胞素

4.写出链球菌的检验程序，并说明链激酶的反应原理。检验程序：固体检验—样品处理—增菌培养—分离培养—纯化培养—生化鉴定—报告；原理： 肠道致病菌

1.肠道致病菌具有那些生物性特性？均为革兰氏阴性杆菌，中等大小，无芽孢，多数具有周鞭毛能运动；需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑，液体培养基浑浊生长；肠道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳糖、葡萄糖产酸或产酸产气；可还原硝酸盐为亚硝酸盐

2.肠道致病菌具有那些抗原？又称为什么？有什么特点？O抗原：也称菌体抗原，细胞壁脂多糖，耐热100℃不被破坏

H抗原：也称鞭毛抗原，鞭毛蛋白，不耐热，60℃30’可破坏

K抗原:也称表面抗原(荚膜抗原),多糖,具有阻抑O抗原发生凝集的现象,加热60℃30’可消除抑阻作用 菌毛抗原: 3.写出肠道致病菌检验的基本程序？检样—处理—增菌培养—分离培养—生化实验—血清学鉴定—报告 沙门氏菌

1．典型沙门氏菌的五项生化试验结果如何？

2.沙门氏菌的形态特征，培养特性是什么？形态特征：革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽孢，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌；培养特性：需氧或兼性厌氧，最适温37，PH7.2-7.4；对营养要求不高，在普通培养基上生长良好，37，24h能形成菌落中等大小，直径2-3mm，圆形或卵圆形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落；在液体培养基中，呈均匀浑浊性生长，无菌膜。3.沙门氏菌检验时为什么要进行前增菌和增菌？

4.沙门氏菌有哪些抗原？各有何特点？O、H抗原如何表示，A-F群沙门氏菌中，代表每群O特异性抗原的独特因子是什么？O抗原（主要抗原OA~OZ，O51~63，O65~67）、H抗原、表面抗原（K抗原）、菌毛抗原。

5.沙门氏菌哪几个菌型具有Vi抗原，Vi抗原对O抗原血清连实验有何影响，对含Vi抗原菌，如何做O抗原血清学实验？含有Vi 抗原的沙门氏菌：伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌。Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍O抗原的血清学凝集试验。破坏Vi抗原：60℃30秒，100℃5秒，石炭酸处理或人工培养后消失。

6.沙门氏菌在SS平板，TSI培养基上生长的现象如何，说明其原理

7.分离纯化后怎样选用最少的生化试验方法初步鉴定检验菌是否是沙门氏菌属的细菌

8.如何进行沙门氏菌的血清学试验 志贺氏菌 1.志贺氏菌分几个群各称为什么？抗原结构如何？K抗原对O抗原试验有何影响？A群痢疾志贺氏菌、B群福氏志贺氏菌、C群鲍氏志贺氏菌、D群宋内氏志贺氏菌；抗原结构：ABCD均是O抗原；A群、C群具有K抗原；影响：K抗原可阻碍O抗原的血清学凝集实验，煮沸处理即可。

2.写出志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌在SS、EMB平板上生长的菌落特征？志贺氏菌：无色透明，不发酵乳糖，中等大小，光滑圆形菌落；沙门氏菌：SS圆形或卵圆形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落；大肠杆菌：EMB呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽

3.志贺氏菌在三糖铁培养基上生长结果如何？斜面产碱仍为红色或粉红色；底层产酸不产气，变黄色；不产硫化氢，不出现黑色。

4.在志贺氏菌中，接种三糖尿病铁培养基和葡萄糖半固体培养基后，那些培养物可认为不属于本菌生长现象的范围而可弃去？在TSI表面上呈现蔓延生长的培养物；在18h-24h发酵乳糖、蔗糖的培养物；不分解葡萄糖，只在半固体培养基表面生长的培养物；产气的培养物；有动力的培养物；产硫化氢的培养物。5.如何用生化反应来区分志贺氏菌各群？用4中志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则用A1，A2、B群多价和D群血清分别试验；如是B群，则哟个群和型因子血清分别检查；4中志贺氏菌多价血清不凝集的菌株用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1-15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3-12型多价血清及各型因子血清检查。

6.写出沙门氏菌、志贺氏菌的检验程序及其所用培养基。沙门氏菌：检验—增菌（前增菌）--分离培养—生化实验初步鉴定—血清学反映最后鉴定—报告；培养基：BS琼脂平板和XLD琼脂平板；志贺氏菌：检验—样品处理—增菌培养—SS、EMB平板分离培养—初步生化鉴定—最后血清学鉴定—报告。培养基：强选择性（SS或HE）、弱选择性（EMB或麦康凯）副溶血性弧菌

1.副溶血性弧菌的形态与染色有和特点？革兰氏阴性无芽孢多形态杆菌，单端鞭毛、两端浓染。杆状、棒状、甚至球状、丝状等；需氧或兼性厌氧，生长最好；在2~3%NaCL培养基中生长最好,无盐或食盐>10%不能生长;最适温度36℃,PH7.5-7.8;在专用选择性平板上,菌落呈圆形凸起,浑浊不透明,表面光滑,较湿润,边缘不整齐;血平板:可见溶血环

2.副溶血性弧菌的生化特性中最有特点的是那个项目，如何利用这个项目，诊断某细菌是否是副溶血性弧菌？

3.副溶血性弧菌在TSI，Nacl蔗糖，嗜盐选择性平板上培养特征如何？Nacl蔗糖平板：圆形，半透明或不透明，无粘性，绿蓝色；嗜盐性平板：圆整或不齐，隆起混浊，无粘性，无色，湿润。镜检：两端浓染 蜡样芽孢杆菌

1.引起蜡样芽孢杆菌事物中毒的常见食物有那些？什么条件下可引起蜡样芽孢杆菌食中毒？乳类、肉类、米饭、淀粉类、甜点心、凉拌蔬菜，水果，色拉 2.蜡样芽孢杆菌的形态与染色特性如何？革兰氏阳性大杆菌，芽孢不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，周身鞭毛，有动力

3.蜡样芽孢杆菌在普通营养琼脂和甘露醇卵黄多粘菌琼脂平板上生长的菌落特征如何？普通：菌落灰白色，不透明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状；甘露醇卵黄多粘菌素平板：菌落呈粉红色，具有白色浑浊环。血平板：菌落呈浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有溶血环。4.写出蜡样芽孢杆菌检验的基本程序？检验—稀释处理—平板分离—证实实验—培养特性观察—生化实验—报告结果 霉菌、酵母菌数测定

列表说明霉菌、酵母菌数的测定与菌落总数的测定有什么不同的地方和相同的地方？

检验程序：检验—处理—稀释—平板分离培养—菌落计数—报告 罐头类

1.罐头食品的商业无菌检验中，保温的目的是什么？目的：观察是否胖听或泄漏 2.在罐头食品的商业无菌检验中，开罐前要做好那些准备工作？用75%酒精稀球擦试无代号端，并点燃灭菌（胖听不能烧），然后开罐，但不能伤及卷边结构。3.如何判断罐头为商业无菌？该批罐头食品经审查生产记录，属于正常，抽取样品经保温试验未见胖听或泄漏，保温后开罐，经感官检查PH测定，涂片镜检，或接种培养，确证无M增殖现象。

第四篇：微生物检测技术复习资料

名词解释

1病原微生物：感染人、动植物，导致疾病发生的有害微生物。

2无菌操作：用于防止微生物进入人体组织或其它无菌范围的操作技术称为无菌操作 3灭菌：用物理和化学方法杀灭或清除传播媒介上一切微生物的方法

4菌落总数：指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。

5大肠菌群：寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，随大便排出体外。食品中大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。微生物：一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。包括病毒、细菌、真菌、原生动物和某些藻类。

7微生物检测：基于微生物学的基本理论，利用微生物实验技术，根据各类产品卫生标准的要求，研究产品中微生物的种类、性质、活动规律等，用以判断环境、产品等卫生质量的一门应用技术。菌落：将细菌接种在固体培养基上经18∽24小时培养，长出肉眼可见的来源于一个细胞的细菌集团。荚膜：在某些细菌细胞外壁外存在着一层松散透明、厚度不定的胶状物质叫荚膜。10消毒：杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的FF。

填空简答

1饮用水的微生物检测

大肠菌群是指示水质受粪便污染的指示菌，细菌总数指示水体受污染物污染的情况。我国GB5749-85《中华人民共和国国家标准 生活饮用水卫生标准》中规定生活饮用水细菌总数每毫升不得超过100个，大肠菌群每升不得超过3个。培养基的分类（按物理性质）：液体、固体、半固体、脱水培养基

3病毒的组成：核酸和蛋白质革兰氏染色：阴红阳紫 5 细菌特殊结构的功能：

鞭毛：是细菌的运动器官，鞭毛菌在液体环境下可自由移动，速度迅速，抗原性 1化学趋向性运动，有助于细菌向营养物质处前进，而逃离有害物质.2.与细菌致病性相关

3.可用以细菌的鉴定和分类

菌毛：菌毛是在某些细菌表面存在着一种比鞭毛更细、更短而直硬的丝状物，须用电镜观察。特点是：细、短、直、硬、多，菌毛与细菌运动无关，根据形态、结构和功能，可分为普通菌毛和性菌毛两类。前者与细菌吸附和侵染宿主有关，后者为中空管子，与传递遗传物质有关。

芽孢：芽孢是细菌的休眠体，对不良环境有较强的抵抗能力。耐热性、抗逆性强（抗热、抗辐射、抗化学物质和抗静水压等能力）

荚膜：①抗吞噬作用②黏附作用③抗有害物质的损伤作用④抗干燥作用⑤当缺乏营养时，荚膜可被利用作碳源和能源，有的荚膜还可作氮源。肺炎双球菌：光滑型(简称S型)产生荚膜，有毒；粗糙型(简称R型)不产生荚膜，无毒。7 芽孢：抗逆性强

8疯牛病

牛海绵状脑病（Bovine spongiform encephalopathy, BSE），又称疯牛病，是一种侵犯牛中枢神经系统的慢性的致命性疾病，由一种非常规的病毒——朊病毒（Prion）引起的一种亚

急性海绵状脑病，这类病还包括绵羊的搔痒病、人的克-雅氏病（Creutzfeldt-Jakob Syndrome , CJD）（又称早老痴呆症）、库鲁病以及最近发现的致死性家庭性失眠症等等。

朊病毒是一类非正常的病毒，它不含有通常病毒所含有的核酸，而是一种不含核酸仅有蛋白质的蛋白感染因子。

朊病毒属于亚病毒，亚病毒包括：类、拟、朊病毒三类。人类三大流行病原：线虫（原生、无脊椎动物动物）分类：包括自由生活线虫（海洋、淡水和土壤中）和危害植物的病原线虫人类病原真菌的分类：

1）浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，顽固性，但影响身体较小；

2）深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。

3）此外，有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起中毒性真菌病。12原核微生物常见类群

1）真细菌：细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体

2）古生菌 13真菌类群

鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门、半知菌亚门细菌的基本形态

细菌的种类虽然很多，但其基本形态只有三种：球菌（葡萄球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌）、杆菌、螺旋菌（弧菌和螺菌）。15 病毒的分类

1）按感染的对象分

动物病毒、植物病毒、细菌病毒、昆虫病毒及真菌病毒，另外尚有亚病毒——类病毒(Viroids)拟病毒(Virusoid)和朊病毒(Prion)。

2）按遗传物质分类分

DNA病毒和RNA病毒两大类

（噬菌体寄生于细菌中病毒的总称。）高压蒸汽灭菌指标： 0.10MPa，121℃，20min左右纯种分离的技术方法

1）固体培养基纯种分离技术:① 稀释倒平板法；② 涂布平板法 ③平板划线分离法；④稀释摇管法——厌氧微生物的分离

2）液体培养基纯种分离技术——稀释法（不可靠）

3）单细胞（孢子）分离——显微分离

4）选择培养: ① 选择平板培养② 富集培养

问答题

1、微生物有益方面

1）微生物与粮食增产

固氮、解磷、解钾、生长激素、分解大分子碳源等促生产功能，抗病虫害。

2）微生物与能源供应

产乙醇、产甲烷、分解长链烃或脂肪酸为短链燃料，微生物电池、微生物采油。

3）微生物与资源开发

发酵产乙醇、丙酮、水杨酸等化工产品。

4）微生物与环境保护

微生物修复:重金属、降解塑胶废品、净化污水、监测环境污染等。

5）微生物与人类健康

生物制品：菌苗、疫苗、类毒素等；

代谢产物：胰岛素、白细胞介素、干扰素、链激酶及青霉素等抗生素。

2、微生物有害方面

1）人类疾病

1347年，鼠疫造成欧洲约2500万人死亡。

2）动植物疾病，降低食物产量及品质

1843-1847年，欧洲马铃薯晚疫病，饿死100万人，164万逃往北美。

3）污染水源、加工食品、医药

完达山刺五加致死事件、太湖蓝藻污染等。

4）破坏人类生活用品

家具、化妆品等损害、污染

3样品采集的原则

1）根据检验目的、样品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。

2）采样、保存、运输、接收过程应遵循无菌操作程序，采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品中原有微生物的种类、数量变化(避免采样引入新的污染或者对微生物的杀灭因子)。

3)采样要讲究方法、有代表性，不同的样品有不同的要求，特别是某些特殊样品。

4)注意采样时间和种类：一般原则是根据不同疾病的特点和临床表现，确定采样时间和标本种类。

5)注意生物安全：采样中避免造成人员感染、标本和环境的污染。采用防护装备，注意安全操作和安全包装样品。

6)样品的包装、密封标志要明确，以备查询。（用于卫生质量评价的样品，应标明样品名称、编号、采样时间、采样量、采样者、检测项目等。）

利用某一特定微生物特有的基因序列，设计特异性引物进行PCR扩增。若有条带，则说明待测样品中含有目的菌，且目的菌的含量与条带的亮度呈正相关；若无条带，则说明待测样品中无目的菌。微生物检验的任务

1）研究各类产品的样品采集、运送、保存以及预处理方法，提高检出率。

2）根据各类产品的卫生标准要求，选择适合不同产品、针对不同检测目标的最佳检测方法，探讨影响产品卫生质量的有关微生物的检测、鉴定程序以及相关质量控制措施；利用微生物检验技术，正确进行各类样品的检验。

3）正确进行影响产品卫生质量的有关微生物的快速检测方法、自动化仪器的使用，并认真进行检验结果的分析和试验方法的评价。

4）及时对检验结果进行统计、分析、处理，并及时准确地进行结果报告。

5）对影响产品卫生质量及人类健康的相关环境的微生物进行调查、分析与质量控制。微生物的特点：个体小、比表面大；分布广、种类多；代谢强、繁殖快；易变异、抗性强 7 科赫法则:①分离、纯化单菌落;②分别接种寄主;③从致病寄主分离出相应菌株 8 微生物检测的意义

1）衡量动植物性产品卫生质量的重要指标，也是判定被检产品能否食用的科学依据。

2）可以判断产品加工环境卫生状况，对产品被微生物污染的程度作出正确的评价，为各项

卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。

3）“预防为主”：可以有效地防止或者减少食物中毒、人畜共患病的发生，保障人民的身

体健康。

4）对提高产品质量、避免经济损失、保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。*微生物检测与植物检疫

植物检疫目的：发现、检出和鉴定有害微生物、昆虫、杂草等，作为出证或检疫处理的依据。外来有害生物爆发的因素：天敌、环境、寄主、潜在危害的认识（人为因素）。

关系：植物检疫的一部分，主要负责检测引起植物病害的微生物，防治病原物的进入或流出，保证农林园艺业安全。

设计题

病原微生物采集、分离、鉴定方案

第五篇：微生物实验室检测规范

一、实验室管理制度

1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理，使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。

2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。

3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。

4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。

5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。

6．科、室负责人督促本制度严格执行，根据情况给于奖惩，出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。

二、仪器配备、管理使用制度

1．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱，电位 pH计、高速离心机。

2．实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。

3．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员，经科室负责人同意填报修理申请、送仪器维修部门。

4．各种仪器（冰箱、温箱除外），使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后，方可离去。

5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借，使用后按登记本的内容进行登记。

6．仪器设备应保持清洁，一般应有仪器套罩。

7．使用仪器时，应严格按操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏，要追究当事者责任。

三、药品管理、使用制度

1．依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格，出厂日期等，领回后建立帐目，专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。

2．药品试剂陈列整齐，放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。

3．领用药品试剂，需填写请领单、由使用人和室负责人签字，任何人无权私自出借或馈送药品试剂，本单位科、室间或外单位互借时需经科室负责人签字。

4．称取药品试剂应按操作规范进行，用后盖好，必要时可封口或黑纸包裹，不使用过期或变质药品。

四、玻璃器皿管理、使用制度

1．根据测试项目的要求，申报玻璃仪器的采购计划、详细注明规格、产地、数量、要求，硬质中性玻璃仪器应经计量验证合格。

2．大型器皿建立帐目，每年清查一次，一般低值易耗器皿损坏后随时填写损耗登记清单。

3．玻璃器皿使用前应除去污垢，并用清洁液或2%稀盐酸溶液浸泡24 h后，用清水冲洗干净备用。

4．器皿使用后随时清洗，染菌后应严格高压灭菌，不得乱弃乱扔。

五、安全制度

1．进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。

2．在进行高压、干烤、消毒等工作时，工作人员不得擅自离现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行，试验过程中如产生毒气时应在避毒柜内操作。

3．严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液，病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方有离开现场。

4．工作完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用新洁尔灭、过氧乙酸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。

5．实验完毕，即时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理。

6．每日下班，尤其节假日前后认真检查水、暖气、电和正在使用的仪器设备，关好门窗，方可离去。

六、环境条件要求

1.实验室内要经常保持清洁卫生，每天上下班应进行清扫整理，桌柜等表面应每天用消毒液擦拭，保持无尘，杜绝污染。

2.实验室应井然有序，不得存放实验室外及个人物品、仪器等，实验室用品要摆放合理，并有固定位置。

3.随时保持实验室卫生，不得乱扔纸屑等杂物，测试用过的废弃物要倒在固定的箱筒内，并及时处理。

4.实验室应具有优良的采光条件和照明设备。

5.实验室工作台面应保持水平和无渗漏，墙壁和地面应当光滑和容易清洗。

6.实验室布局要合理，一般实验室应有准备间和无菌室，无菌室应有良好的通风条件，如安装空调设备及过滤设备，无菌室内空气测试应基本达到无菌。

7.严禁利用实验室作会议室及其他文娱活动和学习场所。