微生物菌种纯度检测技术规程

第一篇：微生物菌种纯度检测技术规程

微生物菌种纯度检测技术规程范围

本规程规定了古菌、细菌、真菌、病毒（种）纯度检测的程序和方法。

本规程适用于从事微生物菌种资源保藏及研究的机构、大学、企业、个人等。术语、定义

下列术语和定义适用于本规程

2.1

纯度检测 purity check

指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。

2.2

纯培养pure culture

由单个细胞的后代组成的培养物，即单细胞培养物或无性繁殖系。通常是由挑取单个菌落或利用单胞分离技术，移种繁殖获得。菌种的纯度检测

3.1 古菌和细菌的纯度检测

3.1.1 菌落形态

在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

3.1.2 细胞形态

对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜等特征应相似

3.1.3 芽孢大小、位置、形状

宜检测样品是否形成芽孢，对形成芽孢的菌种，其芽孢大小、位置、形状应相似。

3.2 放线菌菌种纯度检测

3.2.1 菌落形态

在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线,挑取单菌落，适宜培养后，在同一平板上单菌落形状、大小、表面状况、质地、光泽、颜色等应相似。如怀疑为细菌污染，则30℃液体培养24小时，培养液不应浑浊，如浑浊则视为细菌污染。

3.2.2 培养特征

分别接种三种以上培养基，在三种以上培养基上的培养特征应想同，包括气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素的颜色等。

3.2.3 孢子丝及孢囊

在特定的培养基、培养温度及培养时间等条件下，孢子着生方式、孢子丝形态及其颜色或孢囊着生位置（气丝或基丝）、孢囊的形状，大小应呈现出一致性。

3.3 酵母菌种纯度检测

3.3.1 菌落形态

应对菌落形态相似性进行检测。在特定的培养基上，通过对待检测菌株进行稀释或划线涂布平板获取单菌落，一定的培养条件下，比较同一平板内，菌落的大小、形状、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽等应一致。

3.3.2 个体形态

应对检测样品的个体形态进行检测。在指定的培养基及培养条件下，细胞形状、大小及细胞的增殖方式应一致。

3.3.3 繁殖方式

酵母繁殖的方式应一致，如是芽殖，出芽的方位、数量应一致。

3.4 丝状真菌菌种纯度检测

3.4.1 菌落特征

菌落的形态等表观特征应一致。

3.4.2 菌丝特征

在特定的培养基和培养条件下，菌丝分隔、菌丝形态等应一致。

3.4.3 其他主要显微特征应一致

3.4.4 检测是否有细菌污染

3.4.5 对于外观上不能确定菌种纯度的，利用单胞分离技术获得纯培养物进行对比，其菌丝、孢子等特征应与原始菌株的描述一致。

3.5 病毒的纯度检测

3.5.1 纯粹检查

应将待检病毒液直接接种含硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪蛋白胨琼脂培养基（G.A）、葡萄糖蛋白胨汤。通过一定温度时间培养后，检查结果应无细菌生长为纯粹。

3.5.2 支原体检查

检测由禽胚组织或其细胞所培养的病毒应用改良Frey氏培养基。检测其它培养方法所得病毒应用支原体培养基。任何一次琼脂平板上出现支原体菌落，判为阳性。阳性对照中至少有一个平板长菌落，而阴性对照中无菌落生长，则检验有效。

3.5.3 外源病毒检查

病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞基质培养，因此，有可能造成外源因子（特别是外源病毒因子）的污染。为了保证制品质量，需要对毒种和细胞进行外源因子检测。

3.5.3.1 病毒种子批外源因子检查

对病毒主种子批或工作种子批，应抽取足够检测试验需要量的供试品进行病毒外源因子检测。在试验前应用特异性抗体（血清）中和本病毒（或单克隆抗体），所用的抗体免疫源应采用与生产疫苗（或制品）不同种而且无外源因子污染的细胞（或动物）制品。如果病毒曾在禽类组织或细胞中繁殖过，则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚，应来自SPF鸡群。以下方法可以选择一种或多种进行。

3.5.3.1.1 动物试验法

3.5.3.1.1.1 小鼠试验法

取15－20g小鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，每只脑内接种0.03ml，同时腹腔接种0.5ml。至少观察21天。在观察期内至少有80％最初接种的小鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。解剖所用在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接观察期病理改变，并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和颅腔接种另外至少5只15－20g小鼠，并观察21天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。

3.5.3.1.1.2 乳鼠试验法

取出生后24小时内的乳鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，脑内接种0.01ml，同时腹腔接种至少0.1ml。每天观察，至少14天。在观察内至少有80％最初接种的乳鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的乳鼠，直接肉眼观察其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只出生后24小时内乳鼠，并每天观察至接种第14天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。

3.5.3.1.2 细胞培养法

3.5.3.1.2.1 非血吸附检查

用经抗血清中和后的病毒悬液，接种于生产用的同种的细胞。细胞至少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25％。于36±1℃培养，观察14天，必要时可更换细胞培养液，未见细胞病变（CPE）为阴性，符合要求。

3.5.3.1.2.2 血吸附病毒检查

上述接种病毒的各个细胞于第6－8天后和第14天，取出2瓶进行血吸附病毒检查。用0.2％－0.5%鸡和豚鼠红细胞混合菌悬液覆盖于细胞表面，分别置于2－8℃，20－25℃，30分钟后显微镜下观察，未见血球吸附现象为阴性，符合要求。

3.5.3.1.3 鸡胚检查法

在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选用9－11日和5－7日龄两组SPF鸡胚，每组至少5只，分别于尿囊腔和卵黄囊接种经抗体血清中和后的病毒悬液，每胚0.5ml。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和鸡血细胞混合悬液做血球凝集试验应为阴性。被接种的鸡胚至少80％存活7天，试验有效。

3.5.3.2 生产用细胞外源因子检查

3.5.3.2.1 细胞直接观察

每批生产用细胞应留取5％（或不少于500ml）,细胞悬液不接种病毒，作为对照细胞加入与疫苗生产相同的细胞维持液，置于与疫苗生产相同的条件下培养，观察14天，在显微镜下观察是否有细胞病变（CPE）出现，无细胞病变（CPE）出现者为阴性，符合要求。在观察期末至少有80％的对照细胞培养物存活，试验有效。

3.5.3.2.2 血清吸附病毒检查

对生产用细胞外源因子检查的（1）项细胞培养物在观察期末取至少25％的细胞培养瓶进行血吸附病毒检查。（方法同病毒种子批外源因子检查的血吸附病毒检查）

参考文献

[1] 刘志恒，姜成林主编.放线菌现代生物学与生物技术.北京：科学出版社,Pp1-353.2004

[2] 杨苏声主编.细菌分类学.北京：中国农业大学出版社,Pp1-145.1997

[3] 沈萍，彭珍荣主译.《微生物学》，第五版，中文版,高等教育出版社，2004

[4] 中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》编写组.常见与常用真菌.北京：科学出版社,P1-317，1978

[5] 中国科学院微生物研究所《菌种保藏手册》编著组.菌种保藏手册.北京：科学出版社,P1-839，1980

[6] David R.Boone et al.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.Second Edition.Volume One.Springer.2001

[7] Kirk P.M., P.F.Cannon, J.C.David and J.A.Stalpers(ed).Dictionary of the Fungi.9th edition.CABI Publishing.2001

第二篇：氢氧化钠检测 氢氧化钠纯度检测

氢氧化钠检测 氢氧化钠纯度检测

一：氢氧化钠检测概述（003）

科标无机检测中心提供氢氧化钠检测、氢氧化钠纯度检测、氢氧化钠成分检测、氢氧化钠含量检测等相关分析、检测服务。氢氧化钠，俗称烧碱、火碱、片碱、苛性钠（香港亦称“哥士的”），为一种具有高腐蚀性的强碱，一般为片状或颗粒形态，易溶于水并形成碱性溶液，另有潮解性，易吸取空气中的水蒸气。用途很广，如制造肥皂、纸浆、人造丝，整理棉织品，精炼石油，提炼煤焦油产物等。制法有电解法和化学法两种。

二：氢氧化钠的主要用途

氢氧化钠用途极广。用于制祁虽溶液、造纸浆、肥皂、染料、人造丝、制铝、石油精制、棉织品整理、煤焦油产物的提纯，以及食品加工、木材加工及机械工业等方面。

使用氢氧化钠最多的部门是化学药品的制造，其次是造纸、炼铝、炼钨、人造丝、人造棉和肥皂制造业。另外，在生产染料、塑料、药剂及有机中间体，旧橡胶的再生，制金属钠、水的电解以及无机盐生产中，制取硼砂、铬盐、锰酸盐、磷酸盐等，也要使用大量的烧碱。三：主要检测产品

碳酸钙、无水高氯酸锂、工业过硫酸盐产品、工业氯化钙、工业用高纯氢氧化钠、化纤用氢氧化钠、工业硼化物、工业硼酸、工业用氢氧化钠、工业碳酸钠、工业用合成盐酸、工业硝酸 浓硝酸、工业硫酸、工业氢氧化镁、工业氢氧化钙、副产盐酸、工业碳酸氢钠、工业高锰酸钾、工业氯化钙等。碳酸钙、无水高氯酸锂、工业过硫酸盐产品、工业氯化钙、工业用高纯氢氧化钠、化纤用氢氧化钠、工业硼化物、工业硼酸、工业用氢氧化钠、工业碳酸钠、工业用合成盐酸、工业硝酸 浓硝酸、工业硫酸、工业氢氧化镁、工业氢氧化钙、副产盐酸、工业碳酸氢钠、工业高锰酸钾、工业氯化钙等。

四：主要检测项目

化合物含量、单质含量、水分、氯化物、重金属含量、灼烧残渣、PH值、不溶物含量、水溶物含量、密度、白度、吸油量、活化度测定、酸碱度、筛余物含量、粒度、堆积密度、松散度、105℃挥发物等。

第三篇：NY_T 528-2002_食用菌菌种生产技术规程

NY/T 528-2002 食用菌菌种生产技术规程

基本信息

【英文名称】Technical inspection of pure culture making of edible fungi 【标准状态】被代替 【全文语种】中文简体 【发布日期】2002/8/27 【实施日期】2002/12/1 【修订日期】2002/8/27 【中国标准分类号】暂无 【国际标准分类号】暂无

关联标准

【代替标准】暂无 【被代替标准】暂无

【引用标准】GB 4789.28-1994,GB 9687-1988,GB 9688-1988

适用范围&文摘

暂无

第四篇：微生物实验菌种保藏方案

一、石蜡油低温保藏法

本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4～4℃下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121℃高压蒸汽灭菌1～2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm为宜。

二、甘油管冷冻保藏法

1．试验方法介绍本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(108～1010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。-20℃保存时间较短。或采用体积比为8：2的甘油－生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。

2．效果该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。

三、真空冷冻干燥法

1．试验原理

真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。

2．试验步骤

1）安瓿管准备选取规格约直径为8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。

2）保护剂的选择及制备冷冻干燥保藏法使用的保护剂种类很多，效果不尽相同，通常采用高分子化合物与低分子化合物混合使用效果更好。在配制时注意比例、浓度、pH和灭菌方法。一些对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种可以用脱脂乳糖等要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种可以用脱乳为保护剂。

3）菌种准备及分装菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到108～1010cfu/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，装量可依据冷冻干燥机效能而定。

4）预冻分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-30～-40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水乙醇冻5～10min。

5）冷冻干燥经预冻的安瓿放入干燥箱中开始抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下，并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加速水分升华，但升温不宜过快，以

免引起样品融化。干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而定，以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空载时最高真空；样品温度与管外温度接近。

干燥完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频真空检测真空度。

6）保藏及冻干管的启用密封好的冻干管在4℃或-18℃下保藏。当需用冻干菌种时，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂轮在无菌条件下打开，或将安瓿顶部在酒精灯火焰上灼烧，迅速滴上冷的无菌水，使管破裂，然后用镊子等轻轻敲碎管口，加入0.3～0.5ml液体培养基溶解冻干菌块成为悬液，用无菌滴管或接种环移至斜面或液体培养基进行培养。

7）影响菌株生长因素

①菌的质量：保藏的菌种应培养在营养丰富的最适条件下，使之进入稳定期，稍老一些的菌体对环境抵抗力强。另处，作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高不同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液细胞浓度不高，就会使以后传种造成困难，保存期也会受到影响。

②保护剂：不同种类的保护剂对不同微生物的作用是不同的，如个别菌种在脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时死亡率大大减少。一般情况下，那些容易保存的菌种对保护剂的要求不很严格，而不易保存的菌种对保护剂的要求却很苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干燥保存菌种的关键因素。

③干燥速度：实验表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率为67.3%，而3h为59%。

④空气的影响：冷冻干燥后空气对细菌细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死亡，故在冻干后应立即在真空下融封，才有利于长期保存。

⑤温度的影响在干燥和真空状况下温度的影响远没有上述几项因素重要，因此可以在室温下保存，但许多微生物在4℃保存的存活率要比在室温下高1倍。⑥含水量的影响：水分含量过高对菌存活不利，完全脱水也不利于保存，一般把干燥后的细胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。⑦复苏培养：打开安瓿管后加入无菌水使 冻干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。

菌种能否适宜于冻干保存，需经过实验来证明，一般是在保存1个月进行复苏培养，如果菌的成活率高于10%，即认为可用冻干保存法保存，以后6个月、2年、5年、10年再进行检查存活情况，以确定保存期的上限。

冻干保藏的效果因微生物种类而异，一般是细菌＞放线菌＞真菌＞藻类，而菌丝体不宜用此法保存。

3．试验效果冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。

4．试验仪器及试剂冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个部分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱可控制温度范围为-40～40℃。

四、液氮超低温保存

1．试验原理本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。大多数微生物如病毒、噬菌体，立克氏体，各种细菌、放细菌、支原体，各种丝状菌、酵母、藻类和原虫，特别是一些无法用冻干保存的微生物，都可用此法长期保存。工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130℃以下温度时，它的新陈代谢作用停止，化学反应也消失，而液氮温度可达-196℃，在这种情况下可以长期保存。

2．试验步骤

1)安瓿管准备一般要求用95%料或GG17的玻管制作，以能承受巨大的温差变化而不破损，大小根据需要而定。用印同在管壁上书写菌号，160℃烘干，加棉塞灭菌备用。

2)菌种准备在最适培养基斜面上培养得到健壮菌种，制成悬浮液，如为不产孢子的真菌，则采用斜面或液体振荡培养，制成菌丝片段。将菌悬淮分装至灭菌安瓿管中，每管0.2～0.5ml，然后用火焰将安瓿熔封。

3)冻结将熔封后的安瓿管入大慢速冻结器上，以每分钟下降1℃的速度冷冻，当安瓿管温度下降至-35℃时，即可把安瓿管移入液氮内作长期保藏。

4)菌种的复苏培养直至全部溶化为止，当溶化后即开启安瓿移至培养基内培养，扣作时应特别注意安全，防止爆炸或冻伤，不宜戴线手套，要戴皮手套操作

3．试验仪器及试剂

1）保护剂与冷冻干燥保存一样，液氮保存菌种也需要有保护物质，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌对甘油敏感，效果不佳，可选用其他保护剂，常用的有5%～10%(V/V)二甲基亚砜；20%二甲亚砜加1%蛋白陈；吐温80及0.4mmol聚乙烯氮戊环等，糖类也可作为一种保护剂，但浓度适当加以控制。

2）液氮罐

第五篇：微生物菌种、毒株的管理规定2013版

微生物菌种、毒株的管理规定

为加强可感染人类的高致病性病原微生物菌种、毒株的管理，保障人体健康和公共卫生安全特制定本规定。

一、菌种、毒株的保藏和管理严格按《中华人民共和国传染病防治法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《可感染人类的高致病性病原微生物菌种、毒株管理规定》等法律、行政法规的规定执行。

二、设立《微生物实验室菌种登记表》，其内容包括：菌种编号、菌种名称、菌种来源、保存日期、数量、保存条件、存放位置、保管人。

三、严格的登记制度、建立详细的总账及分类账。

四、根据菌种的特性选择适宜的保存方式。采用双人管理。

五、根据菌种情况，定期检测菌种品质，发现菌种变异或退化时应及时报告，并查明原因。

六、菌种的发放需要双保管人员同时在场的情况下才能进行。每次使用标准菌株都应做好使用记录，包括标准品的名称、编号、使用时间等。

七、购买的标准菌株初次复苏使用时，应批量保存在菌种管中，-20℃以下保存。

八、新的标准菌株复苏后，传代最多不超过3次，如超过3次将不再作为标准菌株使用。

九、标准菌株保存管一经解冻使用后，不得再次冻存。

十、菌种必须装在密封的专用容器内高压灭菌销毁，并做好销毁记录。

十一、菌种、毒株失窃要及时报告处理，并有相应的应急预案。

微生物实验室菌种、毒株管理者：