免疫细胞的分离和保存技术

第一篇：免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术

用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。

一、白细胞的分离

（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。

本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。

（二）聚合物加速沉淀法

本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。

二、外周血单个核细胞的分离

外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。

（一）Ficoll分层液法

主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076～1.090之间。而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（图20-1）。

红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。

（二）Percoll分层液法

这是一种连续密度梯度离心分离法。Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。用Percoll原液(密度1.135)与约等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合，高速离心后，使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上，低速离心后，便得四个细胞层。表层为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单个核细胞(75％)，下层富含淋巴细胞(98％)(图-2)。该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各较好的方法，但操作流程较长，手续较多。

图-2 连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图

三、淋巴细胞及其亚群的分离

为研究免疫细胞的功能，常需高纯度的淋巴细胞或其亚群，分离方法介绍如下。

（一）、纯淋巴细胞群的采集

通常利用单核细胞在37℃和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞群。

（1）粘附贴壁法

将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。

（2）吸附柱过滤法

将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。

（3）磁铁吸引法

利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。

（二）、淋巴细胞亚群的分离

分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术。其原则是根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法；而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞是为阴性选择。常用以下几种方法：

（1）E花环沉降法

本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。

（2）尼龙毛分离法

本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1～2h。用预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞纯度可达80％。

（3）亲和板结合分离法

利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取（图-3）。同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。如要分离CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。用抗Ig抗体则可分离B细胞。同样，用活化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞。

图-3 亲和分离法图解

（4）荧光激活细胞分离仪分离法

荧光激活细胞分离仪（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）主要由4部分组成：①细胞流动系统及气压流速控制系统，②激光系统，③检测与讯号处理系统，④细胞分选系统。其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个/s），每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管（图-4）。用FACS分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行，但仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段。

图-4 荧光激活细胞分离仪简图

四、吞噬细胞的分离和收集

人外周血中单核－巨噬细胞可通过Pecoll密度梯度分离法获取，但数量较少，用血量多。用斑蝥敷贴法可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞，不需作进一步体外分离，细胞量损失较少。该法是用滤纸蘸取10％中药斑蝥酒精浸出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4～5h后皮肤局部充血，48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，内含巨噬细胞。但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染，应慎用。

欲获取小鼠、大鼠、豚鼠等小动物的巨噬细胞，可经腹腔内注入少许石蜡油，3～4天后冲洗出腹腔渗出液，所得细胞悬液中70％～80％为巨噬细胞。

五、淋巴细胞的保存和活力测定

（一）、分离细胞的保存

在某些情况下，分离所得细胞需要加以保存，否则活力迅速下降，甚至死亡。

（1）短期保存技术

将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。所用培养液要求等渗，具缓冲作用，并对细胞无毒性。通常置4℃保存较好，可减低细胞代谢活动。要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。

（2）长期冷冻保存技术

利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞，是当前世界上通用的细胞长期保存技术。其原理在于深低温环境可中断细胞的代谢，但在降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变均可导致细胞的损伤和部分死亡，所以在冷冻过程中一定要加用冷冻保护剂，常用的保护剂为二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。条件合适时，冻存细胞一旦复苏，恢复37℃培养，其形态和代谢活动均可恢复正常。操作的原则是先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含10％二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内，速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细胞的损伤。继而进行降温冷冻，目前常用两步降温法，即迅速降温至一选择好的临界温作为过渡站，如－80℃低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空间放置片刻，然后再放入液氮中。如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的活力，要求在20s以内完全融化。将冻存管自液氮中取出，立即放入40℃温水中，融化后即从水中取出，吸出细胞悬液，加入10倍的培养液中混匀，继而低速离心，尽快洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力，然后置37℃培养箱内培养。

（二）、细胞活力测定

细胞活力常用百分比表示，活力的大小对试验结果有很大影响。细胞活力的测定有许多方法，最简便常用的方法是台盼蓝（trypanblue）染色法。台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。免疫检测试剂中常用的防腐剂有硫柳汞、叠氮钠、抗生素等。

1.叠氮钠是HRP的抑制剂，凡是和HRP接触的试剂，一定不能用；

2.硫柳汞在ELISA试剂中可普遍使用，但因其有毒，较少使用；

3.市面许多试剂盒产品，用抗生素做防腐剂较多，如庆大。

4.如果试剂仅在实验室短期使用，其实并不需加防腐剂，常规试剂放4度冰箱，抗体、酶等加甘油分装冻存即可。

5.梅里埃生产的HIV诊断试剂中提到：对照血清的防腐用0.1g/L硫酸庆大霉素和0.2ml/L肉桂醛。

6.防污染可添加0.02%的叠氮钠，或0.01%的硫柳汞。叠氮钠在多数情况下有用且有效，但在有些实验中却不合适，因为它能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒医学 教育网 搜 集整理性，因此不能用于活体实验；因为含有氨基而能干扰许多标记方法；不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体。而硫柳汞不含氨基，不影响基质的稳定性。如果将抗体应用于生物活性检测、体内实验，一般不使用任何防腐剂，这些实验用的抗体应少量分装冷存，切忌反复冻融。

7.吐温-20是作为稳定剂，可减少非特异性黏合。甘油是防止冻融过程中的固-液相变而引起蛋白变性，能有效地增强蛋白质的稳定性，-20度冻存时甘油的浓度可以在20~30%。

第二篇：细胞免疫疗法最新调研

细胞免疫疗法最新调研

一、以下为调研查到的确定开展细胞免疫疗法的医院（1）对细胞免疫疗法极力推荐的三甲医院：

1、广州复大肿瘤医院

 国内首批开展生物治疗卫生机构  国内率先开展联合免疫疗法治疗方案医院  同时开展T-plus肿瘤免疫治疗的研究与治疗  作术后及放化疗后的配合使用细胞免疫治疗

 多应用于：胰腺癌，肝癌，肺癌，食管癌，胃癌，乳腺癌

2、广州医学院附属肿瘤医院  国内首批开展生物治疗的卫生机构  研究：DC-CIK疗法  多应用于：肝癌、胃癌  应用病例已达几千余例（保留）

3、北京武警总队第二医院

 中华医学会肿瘤生物治疗课题定点医院  国内首家多细胞免疫治疗医院

 研究：CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞  多应用于：食道癌、肺癌、乳腺癌

 应用超过3000例

4、解放军458医院（广州） 细胞治疗作为放化疗的支持治疗  多应用于：肺癌、乳腺癌、肝癌  研究：DC细胞、CIK细胞、CAPRI细胞

5、天津医科大学附属肿瘤医院

 到2008年9月，应用CIK细胞对肿瘤患者实施免疫治疗，已进行300余例肺癌患者的治疗。

6、解放军第123医院（安徽） 安徽领先的肿瘤治疗医院  研究：DC-CIK疗法

 多应用：肝癌、食道癌、肺癌

7、漳州市医院（福建）

 生物免疫治疗中心：一天接待不超过5名患者

8、解放军第454医院（南京） 研究：DC-CIK疗法  多应用：食道癌、胆癌

9、吉林省人民医院

 吉林省生物免疫治疗最高可报90%  肺癌、胃癌

10、天津市人民医院

 多应用：黑色素瘤、食道癌

 研究：DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞、γδT细胞

11、辽宁省人民医院

 多应用：直肠癌、宫颈癌、乳腺癌  研究：CIK细胞

12、上海仁济医院

 应用：乳腺癌、肺癌

13、遵义医学院附属医院  多应用：鼻咽癌、乳腺癌

14、海口市人民医院

 海南生物诊疗报销比例可达90%  研究：DC-CIK疗法

 应用：胃癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌

15、洛阳市中心医院

 研究：NK细胞、T细胞（CLS生物疗法）

16、哈尔滨医科大学附属第四医院

 应用：肝癌、胃癌

 生物治疗中心每日限制最多6人就诊

17、解放军漳州175医院

18、武警山东省总队医院

 应用：肺癌、胃癌、肾癌、黑色素瘤

19、重庆市肿瘤医院

 研究：DC-CIK疗法

 应用：肺癌，曾应用于左腮腺米库林氏病

20、山西医科大学第二医院

（2）简单提及有开展细胞免疫治疗的医院

1、中山大学附属第一医院：简单提及

2、广州市第一人民医院：生物免疫治疗，“近期开展”。

3、广东省第二人民医院：免疫细胞治疗，肿瘤二科。

4、广州市红十字会医院：详细提及，肿瘤生物治疗。

5、广州军区总医院：生物治疗

6、中山大学肿瘤医院：简单提及。

7、南方医院：有生物治疗中心

8、广东药学院附属第一医院：自体细胞免疫治疗技术取得实质性进展

9、粤北人民医院：提及生物治疗。

10、深圳市人民医院：拥有生物治疗室。

11、佛山市第一人民医院：晚期肺癌和晚期胃肠癌的细胞免疫治疗。

12、中国医科院肿瘤医院（北京）

13、第二军医大学东方肝胆外科医院（上海）

（3）全国肿瘤排名较前并开展了细胞免疫治疗的医院：

1、中山大学肿瘤医院（排名第一）

2、中国医学科学院肿瘤医院（排名第二）

3、天津市肿瘤医院（排名第三）

4、第二军医大学东方肝胆外科医院（排名第五）

5、南方医院（排名第八）

——相信还有很多已开展了细胞免疫疗法，而未在官网或其他渠道宣传的三甲医院。

二、估算：

1、细胞免疫治疗现行应用较多的肿瘤类型为：肺癌、胃癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、乳腺癌。相关规定，三甲医院才能资格开展细胞免疫疗法。

2、开展生物细胞免疫治疗的三甲医院的比例：以广东65家三甲医院（2011年），可查的在官方网站记载有生物免疫疗法的，共有13家，比例达到20%，若按照这个比例，全国共有超过1000家三甲医院，则大约有200家三甲在开展生物细胞免疫治疗肿瘤。

3、治疗费用：综合几家明确给出价格参考的医院为依据，有治疗胃癌在2.5至5万一个疗程，肝癌在3万/疗程，另有2.6万/疗程。我们保守估计以2.5万/疗程作为参考值。

4、疗程的时间：可查的细胞免疫治疗过程为：采血、培养、回输三大块，送GMP实验室进行体外诱导6-7天，然后分5-6天，每天2次回输，约2周一个疗程。

5、市场容量的估算：以现时细胞免疫疗法的普及程度，按保守每家医院5例/月，广东省13家三甲1年约780例：2.5万/疗程* 780例=1950万左右；全国约12000例，市场容量在2.7亿到3亿间。

第三篇：人体免疫细胞阅读答案

阅读短文，完成7～8题。（共4分）

人体免疫细胞能发现并杀死被感染的细胞而不伤害健康的细胞，其机理一直困惑着人们。科学家最近初步揭开了其中的奥秘，原来被感染的细胞能发出信号向免疫细胞求救。

美国马里兰大学的一个科研小组最近在英国《自然》杂志上发表论文指出，人体细胞中大都含有肽，它是细胞健康状态的标志物。细菌或病毒侵入细胞后会破坏该细胞，同时自己也分解繁殖。这时肽分子就会与细菌或病毒碎片结合。这样，附近的免疫细胞就得到该细胞受感染的信号，然后通知其他免疫细胞一同将受感染的细胞及其中的感染物杀死。

该科研小组是利用X射线晶体分析法发现这一奥秘的。他们选用了能诱发某些白血病的HTLV病毒作为研究对象，并在免疫细胞T细胞中发现了这一病毒的受体。当肽分子与该病毒残片结合后，就会激发附近的T细胞上该病毒的受体，从而使T细胞发挥作用。科学家说，T细胞上含有上百万个不同的受体，利用它可发现大量细菌或病毒并将受其感染的细包杀死。

7．第二段中,它（肽）是细胞健康状态的标志物的意思是（▲）（2分）

A．人体细胞在健康状态下，其中才会有肽分子存在。

B.肽在细菌或病毒入侵后能发生求救信号，维护人体健康。

C．人体在健康的状态下，细胞内含有的肽相对较多。

D．肽分子能将入侵的细菌或病毒分解并与其碎片结合。

8．下列说法不符合原文意思的一项是（▲）（2分）

A．向免疫细胞发生求救信号的是人体细胞中的肽分子。

B．肽分子与细菌或病毒的碎片结合后，会激发T细胞内肽的受体。

C．最终杀死细菌或病毒的是T细胞中的细菌或病毒的受体。

D．T细胞中的受体，不仅杀死了细菌或病毒，还杀死了受感染的细胞。

参考答案：

7、B [解题思路］

它（肽）是细胞健康状态的标志物的意思是肽在细菌或病毒入侵后能发出求救信号，维护人体健康。

A项把因果关系倒转了。是肽维护人体健康，而不是在健康状态下才会有肽分子存在。

C项也是犯了同样的错误，应是有肽在，人体才会健康，而不是相反。

D项是从肽分子的功能方面说的，不是对题目中那句话的直接的解释。

8、B项肽分子与细菌或病毒的碎片结合后，激发的是T细胞内病毒的受体，而非肽的受体。

第四篇：食品分离技术

食品分离技术的现状及研究进展 分离操作在食品工业中的作用

随着食品工业的发展，化工单元操作不断向食品工业渗透并在食品加工领域内实践和提高，形成了适应食品加工特殊要求的新的单元操作。由于食品加工所用的动植物性原料几乎都为固态和液态，为了使固体和液体原料成为多种美味可口、营养丰富的食品，首先必须提取其精华，扬弃其糟粕，分离出不同成分并组合成不同种类的制品。同时为了做到有益无毒，风味别致，又必须反复提纯和精制。因此分离操作已在食品工业中占有相当重要的地位，研究分离技术在食品加工中的应用，对食品加工的科学化具有重要意义[1]。

食品分离技术在食品工业中具有相当重要的地位。其重要性表为以下几个方面:(1)食品分离技术是食品工业的基础[2]。绝大多数食品工业都分离不开食品分离技术，其中不少行业都是以分离工程为主要生产工序的。例如植物油的提取，淀粉的分离，糖制品的分离以及精练提纯等等。(2)食品分离技术能提高食品原料的综合利用程度。在食品加工工程中运用分离技术可以有效的利用食品原料中的各种成分，提高原料的综合利用程度，就提高了食品原料的利用价值。例如采用有效的分离方法可以从茶叶下脚料中分离出茶多酚、茶碱等，从柑橙中分离甘橙油、果胶等，使原料利用率大为增值。制糖行业中色谱分离技术的应用使得产糖率大大提高。(3)食品分离技术能保持和改进食品的营养和风味。采用现代分离技术可以将一些需在高温下完成的工艺改为在常温下进行，这样就可以大大地改善食品的色、香、味及营养。如用膜分离技术代替常规的蒸发浓缩和真空浓缩咖啡、果汁、茶汁等[3-4]。

(4)食品分离技术使产品符合食品卫生要求。食品分离技术包括提取原料中的有益组分和去除其中的有害成分。如花生、玉米等油制品易受黄曲霉污染而产生黄曲霉素，所以在加工过程中必须用适当的方法将其去除。（5）现代食品分离技术能改变食品行业的生产面貌。现代分离技术在食品工业中的应用，往往可以使行业的生产面貌大为改观。例如过去利用太阳能将海水浓缩后结晶制食盐，如今利用食品分离技术制食盐，使得整个行业生产面貌大大改观。2 食品工业中的分离操作方法

分离技术在工农业生产中具有重要作用，并且与我们的日常生活息息相关，同时分离机技术也在不断促进其它学科的发展[5]。由于采用了有效的分离技术，能够分离和提纯较纯的物质，大大的推进了化学学科的发展。又由于各种层析技术、超离心技术和电泳技术的发展和应用，使生物化学等生命科学得到了迅猛的发展。

分离操作包括机械分离和传质分离两大类，机械分离是指被分离的混合物由多于一相的物料所组成，分离设备只是简单地将混合物进行相分离，它属于非均相物系的分离，如沉降，过滤等。另一种分离操作是指依靠组分的扩散和传质来完成的分离过程，故又称扩散分离或传质分离[6]。如蒸馏，吸收，萃取或膜分离等，适用于多组分均相混合物的分离以及非均相混合物的分离[7]。3 传统的机械分离技术

在食品工业中，经常会遇到需要将悬浮液或乳浊液中的两相加以分离。即全部或部分地将这种非均相系的分散介质和分散质相分开。如奶油的制取，葡萄糖品体食品的获得，以及澄清果蔬汁的制取都是两相分离结果。3.1过滤

过滤过程是指分散介质相对于分散质的迁移过程。过滤操作的基本原理是利用一种能将悬浮固体微粒截留而使液体自由通过的多孔介质，达到悬浮液中固体与液体分离的目的。此多孔介质称为过滤介质。因此过滤只适用于悬浮液。

过滤设备在食品工业上的应用非常广泛:(1)作为一般固一液系的分离手段:如蔗掂榨汁中会有许多固形杂质，除用澄清法外还须过滤精制。在食用油的浸取与精炼上，用板框压滤机，箱式压滤机和加压叶滤机等设备可除去种子碎片和组织细胞，还可用于油类脱色后滤去漂白土等[8];(2)作为澄清设备:如对啤酒，葡萄酒，果汁，搪浆等用陶质管滤机进行过滤澄清。如制品含有极细固体微粒或呈胶泥状，则过滤时一般以预授形式应用助滤剂或将助滤剂加人浆液中混合后再送人过滤机进行过滤;(3)用过滤法除去微生物:管滤机常用于葡萄酒、啤酒和果汁的过滤以降低微生物的数目。3.2沉降

沉降过程是分散质相对于分散介质的相对迁移过程。在重力场中:使混合物中密度不同的两相获得分离的操作，称重力沉降。根据分散质集态的不同，可分为悬浮液沉降和乳浊液沉降。

实现重力沉降分离的设备称为沉降器，按操作方式可分为间歇式，半连续式和连续式，无论是何种方式的沉降器，其生产能力Q都取决于沉降面积和沉降速度的乘积，而与沉降器的高度无关。故现代化的沉降器的结构特点都是截面大，高度低[9]。

沉降在食品工业中的应用主要有三个方面：(1)以澄清为目的。如果汁、酒类等制品的澄清处理以除去悬浮液中的混浊杂质。(2)以增稠为目的。如淀粉制造，首先利用沉降达到悬浮液的沉淀增浓。(3)以分级或分离为目的利用同一物质的粒径或不同物质粒子的密度不同而使它们得到分离故沉降也是食品加工的常见手段。4 新型的分离技术

科学技术的不断发展导致了对分离技术的要求越来越高，分离的难度也越来越大[10]。特别是随着各种天然资源的不断开采使用，含有用物质的资源逐步减少，迫使人们从含量较少的资源中去分离、提取有用物质。所有这些，促进了分离技术的不断发展，旧的分离方法不断改进完善，新的分离方法不断发现，如近几十年来发展起来的一些新型传质分离技术，如膜分离技术，超临界萃取技术及泡沫吸附分离技术等已引起了食品工业界的重视并已崭露头角[11]。4.1 膜分离技术

反渗透、超滤、微滤、电渗析这四大过程在技术上已经相当成熟，已有大规模的工业应用，形成了相当规模的产业，有许多商品化的产品可供不同用途使用[12]。（1）反渗透是利用反渗透膜(一般为均质膜或表面致密的复合膜)选择地透过溶剂的性质，对溶液施加压力，克服溶剂的渗透压，使溶剂通过膜而从溶质中分离出来的过程，这种技术可用于海水淡化、果蔬汁的浓缩、茶叶抽提液的浓缩等[13]。

（2）超滤应用孔径为10一ZOOA的超滤膜来过滤含有大分子或微细粒子的溶液，使之从溶液中分离的过程。与反渗透不同的是小分子溶质与溶剂一起通过超滤膜[14]。这种分离过程可用于果蔬汁的浓缩和澄清、天然色素和食品添加剂的分离和浓缩、奶的分离和浓缩、酒和醋的澄清与提纯等。

（3）微滤以孔径小于10四的多孔膜过滤含有微粒的溶液将微粒从溶液中除去。可用于食糖的精制、澄清、过滤及啤酒的冷过滤除菌等。

（4）实质上，电渗析可以说是一种除盐技术，因为各种不同的水（包括天然水、自来水、工业废水）中都有一定量的盐分，而组成这些盐的阴、阳离子在直流电场的作用下会分别向相反方向的电极移动[15]。如果在一个电渗析器中插入阴、阳离子交换膜各一个，由于离子交换膜具有选择透过性，即阳离子交换膜只允许阳离子自由通过，阴离子交换膜只允许阴离子以通过，这样在两个膜的中间隔室中，盐的浓度就会因为离子的定向迁移而降低，而靠近电极的两个隔室则分别为阴、阳离子的浓缩室，最后在中间的淡化室内达到脱盐的目的。

膜分离共同的优点是：①节约能源；②在常温下进行，特别适用于热敏性物质的处理，能够防止食品品质的恶化和营养成分及香味物质的损失；③ 食品的色泽变化小，能保持食品的自然状态；④设备体积小且构造简单，费用较低，效率较高；⑤适用范围广，有机物和无机物都可浓缩，可用于分离、浓缩、纯化、澄清等工艺。

膜分离的缺点是：①产品被浓缩的程度有限；②有时其适用范围受到限制，因加工温度、食品成分、pH、膜的耐药性、膜的耐溶剂性等的不同，有时不能使用分离膜；③ 规模经济的优势较低，一般需与其他工艺相结合[16]。

由于膜分离过程不需要加热，可防止热敏物质失活、杂茵污染，无相变，集分离、浓缩、提纯、杀菌为一体，分离效果高，操作简单、费用低，特别适合食品工业的应用[17]。4.2 超临界萃取技术

超临界萃取是利用超临界流体这种在临界点附近具有特殊性能的物质作为溶剂进行萃取的一种分离方法。超临界流体是指超过临界温度与临界压力的气体[18]。如果某种气体处于临界温度以上，无论压力多高，也不能液化，仍然是气体，这时称此气体是超临界流体。超临界流体具有这样的物理性质:其密度与液体较接近，粘度和自扩散能力却接近于气体。因此超临界流体对液体、固体物质的溶解度与液体溶剂相接近，且在临界点附近，压力和温度的微小变化会引起其溶解能力的极大变化[19]。利用超临界流体的这些特性，通过改变温度或压力可在近临界点附近实现萃取剂与待分离物质的分离。

(1)由于在临界点附近，流体温度或压力的微小变化会引起溶解能力的极大变化，这种极强的选择性对分离溶解度相接近的两种成分非常有利，且萃取后溶剂与溶质的分离很容易。

(2)由于超临界流体具有与液体相接近的溶解能力，同时它又保持了气体所具有的传递性，这种具有液体与气体双重性能的流体能使传质很快地达到平衡，有利于高效分离的实现。

(3)超临界流体如CO2(Tc=31.1℃，Pc=7.38Mp)适合于食品工业中一些热敏性物质的萃取。

当然，超临界萃取的缺点是设备和操作都要求在高压下进行，设备投资费用高。在食品工业方面，利用超临界萃取技术可从咖啡豆和茶叶中脱除咖啡因，还可用于提取啤酒花中的有用成分及从烟草中脱除尼古丁等。超临界流体萃取技术作为一种新的分离技术，正越来越受到人们的重视，将在各个领域中得到广泛的应用[20]。4.3 泡沫吸附分离技术

泡沫分离是根据表面吸附的原理，借助鼓泡使溶液中的表面活性物质聚集在气-液界面，随气泡上浮至溶液主体上方，形成泡沫层，将泡沫和液相主体分开，从而达到浓缩表面活性物质（在泡沫层），净化液相主体的目的。从液相主体中浓缩分离的既可以是表面活性物质，也可以是能与表面活性物质相互亲和的任何溶质，比如金属阳离子、蛋白质、酶、染料等等。另外，一些固体粒子（沉淀微粒或矿石小颗粒），也可以被表面活性物质吸附，从溶液中分离出来。

泡沫吸附分离技术是近几十年发展比较快的的新兴分离技术，通常把凡是利用气体在溶液中鼓泡，以达到分离或浓缩的这类方法，总称为泡沫分离技术[21]。泡沫分离必须具备两个基本条件，首先，所需分离的溶质应该是表面活性物质，或者是可以和某些活性物质相络合的物质，它们都可以吸附在气-液界面上；其次，富集质在分离过程中借助气泡与液相主体分离，并在塔顶富集。因此，它的传质过程在鼓泡区中是在液相主体和气泡表面之间进行，在泡沫区中是在气泡表面和间隙液之间进行。所以，表面化学和泡沫本身的结构和特征是泡沫分离的基础[22]。

随着人们对环境污染的日益重视，要求治理污染的呼声越来越高，政府对企业污染的控制也越来越严格，泡沫分离技术作为一种新兴的分离技术，越来越受到人们广泛的关注，它的优点就在于适合低浓度的分离回收，能在很低浓度下十分有效地除去表面活性物质；设备简单，投资少、能耗小，并且操作方便。5 分离技术的展望

目前，各种新型分离技术比传统分离法已有了突破性进展，这对于进一步提纯功能性食品成分，开发功能性产品，更大限度地发挥银杏资源优势具有推动作用。随着高精度、高灵敏度分析技术的应用，天然产物活性成分的提取纯化和结构鉴定尤其是在产品的应用领域显示了更为广阔的前景，同时这也促进了植物有效物质的结构、药理、药效等方面的深入研究。银杏叶加工集成优化工艺的探究，微量天然产物成分的高效快速高纯分离和鉴定的集成系统技术的建立，都将提高银杏叶及其特色药用资源的利用率，有利于实现资源优势向技术优势的转化，从而产生更大的经济效益、社会效益和环境效益[23]。分离操作在食品加工中占有非常重要的地位。分离技术的发展方兴未艾，研究掌握各种分离技术的原理和技术，尤其是一些新叮的传质分离技术可以提高现有的分离技术冰平，是一项非常重要的工作，对食品加工的科学化具有重要的意义。

参考文献

[1] 高等教育学.教育部高等教育司.高等教育出版社

[2] 吴格明.创新能力培养.中国教育学刊, 2002.6

[3] 远辉.影响课程教学效果的几种心里因素.云南教育,2002: 增刊

[4] 温恒福.论教学方式的改变.中国教育学刊, 2002.6 [5] 徐世明, 张志鹏, 王继峰, 等.银杏叶活性成分的提取制备及质量标准、测定方法的研究进展[J ].药品分析与鉴定, 2001, 3(6): 33-36.[6] 敏涛.水果蔬菜的保健价值与食用禁忌[M].南昌:江西科学技术出版社, 1992.[7] 孙伟,丁宝莲.半加工切割蔬菜的生理和品质保持研究[ J ](Ⅰ, Ⅱ).上海农业学报, 1999, 32(3): 72-77.[8] 张维一,毕阳.果蔬采后病害与控制[ M].北京:中国农业出版社, 1996.[9] 毕阳.果蔬贮运学[ M].兰州:甘肃农业大学出版社,1992.[10] 薛卫东.果蔬贮藏与保鲜[ M].成都:电子科技出版社, 1995.[11] 陆耀军 ,王军 ,张庆珍.重力式油水分离设备入口构件的模拟实验选优[J ].石油学报 ,1995 ,19(3): 1112.115.[12] 郑远扬.一种高效的油水分离器[J ].油气田环境保护 ,2000 ,10

(1):29230.[13] 杨芳圃.XSL —Ⅰ 型三相分离器[J ].油气田地面工程 ,1997 ,16

(1):52253.[14] 《化学工程手册》编辑委员会液固分离北京化学工业出版社1989 [15] 吴俊生等分离工程上海华东化工学院出版社1992 [16] 无锡轻院等食品工程原理北京中国轻工出版社1993 [17] 王平褚等膜技术在食品工业中的新进展食品与机械1993·5 [18] 蒋维均新型传质分离技术北京化学工业出版社1992 [19] 高以恒等膜分离技术基础北京科学出版社1989 Wakeman,Progress in Filtration and Saperation 1986 [20] 陈树章非均相物系分离北京化学工业出版社1993 [21] 常志东，刘会洲，陈家镛.泡沫分离法的应用与发展[J].化工进展，1999,5:18 [22] 邓修，吴俊生.化工分离进展[M].北京：科学出版社

[23 ] 孙莉英.含油废水处理技术进展[J ].华中科技大学报 ,2002 ,19(2):87290.

第五篇：分子分离技术

目录

摘要................................................1 关键词..............................................1 1 前言..............................................1 2 传统分离方法......................................2 3 现代分离方法......................................3 3.1 色谱方法.......................................................................................3 3.2 电泳技术及其它...........................................................................6 展望..............................................8 参考文献............................................9

生物大分子分离技术的发展现状

姓名：陈绍勇

学号：20124016016

专业：动物学 摘要: 生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸(DNA 和RNA)以及多糖等。生物大分子分离技术是生命科学研究中的关键技术之一。当前, 各学科之间的交叉渗透为生物大分子分离技术的发展提供了更多的契机。对以沉淀、透析、超滤和溶剂萃取为代表的传统分离技术, 以及色谱, 电泳等现代分离技术的发展概况、原理、特点及应用进行了综述。并结合生命科学的发展现状, 展望了生物大分子分离技术的发展前景。

关键词: 生物大分子,传统分离方法,现代分离方法 1 前言

生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸(DNA和RNA)以及多糖等。生命科学的发展给生物大分子分离技术提出了新的要求。各种生化、分子研究都要求得到纯的, 以及结构和活性完整的生物大分子样品, 这就使得其分离技术在各项研究中起着举足轻重的作用。对生物大分子分离技术的研究和开发也就应运而生。而且随着各学科之间的交叉渗透, 材料化学、自动化技术等学科的发展也为生物大分子分离技术的发展提供了更多的契机。生物大分子的制备具有如下主要特点: 生物材料的组成极其复杂;许多生物大分子在生物材料中的含量极微, 分离纯化的步骤繁多, 流程长;许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境就极易失活(因此分离过程中如何防止其失活, 就是生物大分子提取制备最困难之处);生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的, 温度、pH 值、离子 强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响, 很难准确估计和判断[1]。这些都要求生物大分子的分离技术以此为依据, 突破这些难点, 优化分离程序, 以获得符合要求的生物大分子样品。传统分离方法

常用的传统生物大分子分离方法有沉淀、透析、超滤和溶剂萃取等。它们都是一些较早就建立起来的分离方法, 至今仍然被广泛应用。如在蛋白质领域, 应用盐析法使蛋白质沉淀出来已有80 多年的历史。其突出的优点是成本低, 不需要特别昂贵的设备;操作简单、安全;对许多生物活性物质具有稳定作用[2]。该法虽然分辨能力不高,但在粗级分离中仍然被经常采用。有机溶剂沉淀法也是较早使用的沉淀方法之一。有机溶剂对于许多蛋白质、核酸、多糖和小分子生化物质都能产生沉淀作用。其引起沉淀的主要原因在于改变介质的介电常数, 以及类似盐析的争夺水化水现象[2]。等电点沉淀法利用具有不同等电点的两性电解质, 在达到电中性时溶解度最低, 易发生沉淀, 从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质, 可以利用此法进行初步的沉淀分离, 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白[3], 而不用于沉淀目的物。非离子型多聚物是20 世纪60 年代发展起来的一类重要的沉淀剂, 它们具有很强的亲水性和较大的溶解度, 在溶液中可通过空间位置排斥作用使生物大分子、病毒和细菌等聚集沉淀。该法温和的操作条件和较高的沉淀效能, 使得其经常被用于细菌、病毒、核酸和蛋白质的分离, 其中应用最多的多聚物是聚乙二醇[4,5]。

自Thomas Graham 1861 年发明透析方法至今已有140 多年, 透析已 成为生物化学实验中最简便最常用的分离纯化技术之一, 在生物大分子的制备过程中, 除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术, 同时半透膜的材料也更加多样化、透析方式也更加丰富。超滤是一种加压膜分离技术, 自20 世纪20 年代问世后, 直至60 年代以来其发展迅速, 很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术[6]。超滤作为一种高效分离技术, 广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子的脱盐、浓缩和分级分离。溶剂萃取法(是用一种溶剂将产物自另一种溶剂(如水)中提取出来, 以达到浓缩和提纯的目的)是20世纪40 年代兴起的一项化工分离技术, 并很快应用到了生物分子的提取和分离上。最初是用于抗生素、有机酸、维生素等生物小分子的提取。最近几十年来随着与其它技术的结合而产生了一系列新的分离技术, 如逆胶束萃取、超临界萃取、液膜萃取等, 可以用于生物大分子如核酸、蛋白质、多肽等的提取和精制。现代分离方法 3.1 色谱方法

1903 年俄国植物学家Tswett, 在一填有碳酸钙的玻璃柱中注入用石油醚萃取的植物色素, 在室温下展层, 得到不同的色素区带, 后来称之为色谱[7]。色谱分离又称层析。最初, 层析技术并未得到关注。20 世纪50 年代, 气液层析得到发展, 并在石油、化工、制药等领域得到应用。到60 年代, 由于开发出适用于生物物质分离纯化的层析固定相, 层析技术才被用于生物物质的分离纯化并得到迅速发展[7]。至今, 已有丰富的色谱技术被用于生物大分子的分离。液相色谱法是分析化学中发展最快, 应用最广的分析方法, 它在许多领域成为必不可少的手段,其中高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)更是以其独特的优点占据突出地位。HPLC 用于生物化学样品分析始于20 世纪70年代中期, 80 年代针对生命科学领域分离和制备而设计的生物色谱填料为HPLC 在生命科学研究领域的地位奠定了坚实的基础;90 年代, 随着生物医药研究与开发的迅速发展, 各种类型的高通量及手性色谱柱纷纷出现[8]。HPLC 是目前最通用、最有力和最多能的层析形式, 在生物大分子的分离分析中,HPLC 分离模式主要有反相色谱（RPC), 空间排阻色谱(SEC), 离子交换色谱(IEC), 疏水作用色谱(HIC), 亲和色谱(AC)等。反相液相色谱柱效高、分离能力强、重复性好、操作简便、保留机理清楚, 是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种。它与多数其它形式的层析不同之处在于固定相基本上是惰性的, 固定相与被分离物之间只可能有疏水作用。它吸引人的地方在于流动相的小小变化, 例如加入盐, 改变pH 或有机溶剂的量就能成功地影响分离特性。它在20 世纪50 年代就已用于许多有机小分子的分离和分析,80 年代后逐步应用于生物大分子如蛋白质、多肽、核酸的鉴定,并用于制备规模的分离[8]。半个世纪前, 随着交联聚苯乙烯的出现和发展, 离子交换色谱成为一种重要的分离工具。离子交换色谱的填料及含盐的缓冲流动相系统类似于蛋白质稳定存在的生理条件, 有利于保持生物分子的活性和构象。因此, 它在解决生物学中许多难于分离的问题上起到了重大作用。随着HPLC 的飞速发展, 以及各种新型离子交换材料的出现, 离子交换色谱在氨基酸、蛋白质、核酸、有机酸、糖类及药物等方面的应用越来越广。空间排阻色谱所用 的固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质凝胶, 是按溶质分子大小进行分离的色谱技术, 又称尺寸排阻色谱或凝胶色谱。按流动相类型不同分为凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱。十多年来该法在凝胶制备, 仪器技术性能, 数据处理和理论研究上取得的进展, 促进了该技术在许多领域的应用。亲和层析是60 年代发展起来的一种高效、快速的分离纯化技术。它是一种利用生物大分子能够通过范德华力、疏水力、空间和静电相互作用,与配体特异、可逆地结合在一起的生物学特性, 从复杂的生物样品中分离得到目标产物的液相色谱技术。亲和层析容量大, 选择性强, 分离效率高, 且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用, 最先被用于酶的纯化, 现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整细胞的纯化[3]。科学的发展使得分离分析的对象越来越复杂,从而提高了对分离分析技术的要求, 促进了各种新技术的发展。二维液相分离方法, 二维液相分离/ 质谱分析方法等多种自动化二维系统均得到了开发利用, 如Lundell 和Markides采用离子交换和反相色谱二维液相模式分离了复杂生物样品中的肽;Bushey 和Jorgenson设计了用阳离子交换和体积排除分离模式的自动化二维系统等。HPLC 与光谱或波谱技术的在线联用也成为了解决复杂样品体系的有力手段。目前最常用最有效的是高效液相色谱-质谱(mass spectroscopy, MS)联用技术, 高效液相色谱-核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)等也在研究开发中。与此同时,快速分离技术也得到了迅猛发展, 在20 世纪70 和80 年代需要1h 分离的样品现在可能只要几分钟甚至几秒钟即可完成, 有关快速HPLC 及其应用也多有报道, 如Unger 等最早 采用缓冲溶液盐浓度梯度, 以4mL/min 流速在2.5min 内分离了8 种蛋白质。近年来, 随着生物技术和医药工业的发展, 传统的分离手段已经不能满足对大量样品高纯度分离的要求, 液相制备色谱的发展研究为解决实际应用中出现的问题带来希望。20 世纪70 年代初开发出的模拟移动床色谱具备分离能力强,设备体积小,投资成本低, 便于实现自动控制并特别有利于分离热敏性及难以分离的物系等优点, 在制备色谱技术中最适含用于进行连续性大规模工业化生产, 其应用范围也不断扩大, 已出现采用该技术分离氨基酸、单克隆抗体和蛋白质的研究[17]。超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,(SFC)是以超临界流体(supercritical fluid, SF)作为流动相的一种新颖的色谱技术, 具有分析速度快、选择性好、分离效率高、分析条件温和等优点,可分析气相色谱不宜分析的高沸点、高分子量、低挥发性和热不稳定试样, 又比高效液相色谱有更快的分析速度和更高的柱效。自60 年代起逐渐出现一些有关该技术的研究报道。超临界流体色谱应用领域十分广泛, 可用于分离分析热敏性物质、非挥发性高分子、生物大分子、极性物质和手性对映体等。目前, SFC 与MS、FT-IR(fourier transform infraredspectrometer, 傅里叶变换红外光谱仪)、NMR等联用技术也逐渐得到开发。

3.2 电泳技术及其它

电泳现象于1808 年被发现, 在1937 年由瑞典科学家Tiselius A 首次将其作为一种分离技术所应用。随着电泳支持物的改进, 电泳条件的完善,区带电泳、等电聚焦电泳、双向电泳等技术逐渐建立起来。同时, 在 电泳模式上也有了极大的发展, 先后出现了圆盘电泳、垂直板电泳、脉冲电泳等, 电泳分辨率也随之得到提高。1956 年Smithies 和Poulik最早引入双向电泳技术, 他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合起来分离血清蛋白, 随后双向电泳技术得到很快的发展。目前所应用的双向电泳体系由O’Farrell 等于1975 年发明, 第一向为等电聚焦电泳, 第二向为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。这是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。该技术的应用与发展对开展“蛋白质组”的研究具有重要意义。同时,针对双向电泳技术的某些缺陷, 相应的改进技术也得以应用, 如窄范围pH 胶条的使用, 胶上差示电泳(differential in-gel electrophoresis, DIGE)技术。然而, 由于蛋白质二维凝胶分离、染色体转移等环节操作困难, 且十分费时, 已被公认为是蛋白质组研究的技术“瓶颈”。因此, 发展快速、高效、高通量、在线的分离监督方法已成为蛋白质组学研究的重大科学问题之一。谁率先取得突破, 谁将占据蛋白质组学研究的有利地位。毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)是20世纪80 年代初期迅速发展起来的一种新型分离分析技术, 是经典电泳技术和现代微柱分离有机结合的产物。与传统的分离方法相比, CE 具有分离效率高、分析速度快、样品及试剂用量少等特点, 使其成为极为有效的分离技术, 广泛应用于分离蛋白质、糖类、核酸等多种物质。目前, 不同分离模式的毛细管电泳技术已成为最重要的生物样品分离分析手段, 如毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚焦等。近来, 许多有关多维毛细管电泳分离技术的设想已被提出, 有些还得到了初步的尝试, 其分离的优势也 得到人们的关注[9]。毛细管电色谱(CEC)是利用电渗流或电渗流结合压力来推动流动相移动的一种液相色谱分离法。它集CE 和HPLC的优势与一身, 既有CE 水平的高柱效, 同时还具有HPLC 的高选择性。近年来其应用已引起广泛关注。目前, 毛细管电色谱的研究主要侧重于方法本身的完善和发展, 以及与质谱等定性分析技术联用的研究开发。微流控芯片于20 世纪90 年代初由瑞士的Manz 和Widmer 提出, 它是通过微细加工技术将微通道、微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件窗口和连接器等功能元件像集成电路一样, 使它们集成在芯片材料上的微全分析系统。近10 年来,随着微制造技术和电子技术的不断进步, 微流控芯片得到了迅速的发展, 并成为生物样品分离分析的重要手段和研究热点, 先后出现了毛细管电泳芯片、毛细管电色谱芯片、样品制备和分离的集成系统等。展望

生命科学的发展决定了追求高效、快速、高通量、集成化的生物样品分离分析方法必将成为未来的发展方向。分子生物学中一个众所周知的事实是蛋白质生物活性和功能多是在溶液中显现的, 因此液相色谱的强大功能使得其在生命科学及其它领域的重要地位不会动摇, 面对复杂体系的分离任务, 它仍在不断完善发展。芯片系统将不断发展建立更多的实用体系, 开发更广泛的应用价值。多通道毛细管电色谱仪器也将被开发。对超临界流体性质的认识深入, 将推动超临界流体色谱技术的发展和应用。各种分离模式相结合构成的多维分离方法也将得到进一步的研究开发, 以实现将一根色谱柱上未分开的组分在另一根柱上用不同的 分离原理加以完全分离。各种分离设备将与光谱、波谱这类提供结构信息的仪器进行在线连接, 建立起更多的联用方式, 以实现分离, 定性定量分析一体化。

随着生物技术成果的不断积累和生物技术产业化进程的不断推进, 生物制品的分离与纯化技术已成为实现生物高技术产业化的关键, 在理论和技术研究上都得到了长足的发展。发展层析柱和凝胶过滤柱的放大技术, 大规模分离过程的自动控制,下游工程的集成优化技术等成为工业化生产中的关键。液相色谱是工业生产上常用的有效方法,而模拟移动床色谱和径向色谱等将在生物工程领域发挥越来越重要的作用。在研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术的同时, 进行各种分离技术的高效集成化, 可以达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。在这个各学科快速发展, 并相互影响的时代,生物大分子分离技术必将不断的推陈出新, 以更加方便、高效、快捷的方式应用于科研和生产领域。参考文献

[1] 陈毓荃.生物化学试验方法和技术.北京:科学出版社,2002, 46~49.[2] 苏拔贤.生物化学制备技术.北京:科学出版社,1986,51~52.[3] 王镜岩, 朱圣庚, 徐长法.生物化学.北京: 高等教育出版社,2002,307~313.[4] 陈晓东,陶志华,王忠永, 等.临床检验杂志,2002,20(4): 219.[5] 王辉龙,周建武,王中来, 等.福州大学学报,2001,29(5):123~126.[6] 肖恩荣,李定或,丁一刚, 等.武汉化工学院学报,2005,27(1):6~10.[7] 严希康.生化分离技术.上海:华东理工大学出版社,1996,80.[8] 鲍时翔,姚汝华.华南理工大学学报,1996,24(12):98~103.9