第一篇：抽水实验定渗透率方法总结
用抽水试验确定渗透系数
1.抽水试验资料整理
试验期间，对原始资料和表格应及时进行整理。试验结束后，应进行资料分析、整理，提交抽水试验报告。
单孔抽水试验应提交抽水试验综合成果表，其内容包括：水位和流量过程曲线、水位和流量关系曲线、水位和时间(单对数及双对数)关系曲线、恢复水位与时间关系曲线、抽水成果、水质化验成果、水文地质计算成果、施工技术柱状图、钻孔平面位置图等。并利用单孔抽水试验资料编绘导水系数分区图。
多孔抽水试验尚应提交抽水试验地下水水位下降漏斗平面图、剖面图。
群孔干扰抽水试验和试验性开采抽水试验还应提交抽水孔和观测孔平面位置图(以水文地质图为底图)、勘察区初始水位等水位线图、水位下降漏斗发展趋势图(编制等水位线图系列)、水位下降漏斗剖面图、水位恢复后的等水位线图、观测孔的S－t、S－lg t曲线[注]、各抽水孔单孔流量和孔组总流量过程曲线等。
注意：（1）要消除区域水位下降值；（2）在基岩地区要消除固体潮的影响；3）傍河抽水要消除河水位变化对抽水孔水位变化的影响。
多孔抽水试验、群孔干扰抽水试验和试验性开采抽水试验均应编写试验小结，其内容包括：试验目的、要求、方法、获得的主要成果及其质量评述和结论。
2.稳定流抽水试验求参方法
求参方法可以采用Dupuit 公式法和Thiem公式法。(1)只有抽水孔观测资料时的Dupuit 公式
承压完整井：
潜水完整井：
式中 K——含水层渗透系数(m/d);Q—— 抽水井流量(m3/d);sw—— 抽水井中水位降深(m);M——承压含水层厚度(m);R—— 影响半径(m);
H——潜水含水层厚度(m);
h——潜水含水层抽水后的厚度(m);rw——抽水井半径(m)。
(2)当有抽水井和观测孔的观测资料时的Dupuit 或Thiem公式 式中hw ——抽水井中水柱高度(m);
h1、h2——与抽水井距离为r1和r2处观测孔（井）中水柱高度(m)，分别等于初始水位H0与井中水位降深s之差，h1= H0 –s1；h2= H0 –s2。
其余符号意义同前。
当前水井中的降深较大时，可采用修正降深。修正降深s’与实际降深s之间的关系为：s'=s-s2/2H。3.非稳定流抽水试验求参方法
3.1承压水非稳定流抽水试验求参方法
(1)Theis 配线法
在两张相同刻度的双对数坐标纸上，分别绘制Theis 标准曲线W(u)-1/u 和抽水试验数据曲线s-t，保持坐标轴平行，使两条曲线配合，得到配合点M的水位降深[s]、时间[t]、Theis井函数[w(u)]及[1/u]的数值，按下列公式计算参数（r为抽水井半径或观测孔至抽水井的距离）：
以上为降深——时间法（s-t）。也可以采用降深---时间距离法（s-t/r2）、降深---距离法（s-r）进行参数计算。
(2)Jacob 直线图解法
当抽水试验时间较长，u= r2/(4at)<0.01时，在半对数坐标纸上抽水试验数据曲线s-t为一直线（延长后交时间轴于t0，此时s=0.00m），在直线段上任取两点t1、s1、t2、s2，则有
（3）Hantush 拐点半对数法
对半承压完整井的非稳定流抽水试验（存在越流量，K’/b’为越流系数），当抽水试验时间较长，u= r2/(4at)<0.1时，在半对数坐标纸上抽水试验数据曲线s-t，外推确定最大水位降深Smax，在s-lgt线上确定拐点Si = Smax/2，拐点处的斜率mi 及时间ti，则有(4)水位恢复法
当抽水试验水位恢复时间较长，u= r2/(4at)<0.01时，在半对数坐标纸上绘制停抽后水位恢复数据曲线s-t，在直线段上任取两点t1，s1，t2，s2，则有
(5)水位恢复的直线斜率法
当抽水试验水位恢复时间较长，u= r2/(4at)<0.1时，在半对数坐标纸上绘制停抽后水位恢复数据曲线s-t，直线段的斜率为B，则有
3.2 潜水非稳定流抽水试验求参方法
潜水参数计算可采用仿泰斯公式法、Boulton法和Numan法。(1)仿泰斯公式法
式中H0、hw——-初始水头及抽水后井中水头；
W(u)——泰斯井函数；
Q——抽水井的流量(m3/d)；
r——到抽水井的距离(m)； t——自抽水开始起算的时间(d)；
T——含水层的导水系数(m2/d)；T=Khm； hm ——-潜水含水层的平均厚度(m)； K——含水层的渗透系数(m/d)；
A——_含水层的导压系数(1/d)；
m——潜水含水层的给水度。
具体计算时可采用配线法、直线图解法、水位恢复法等。
（2）潜水完整井考虑迟后疏干的Boulton公式
可根据抽水早期、中期、晚期的观测资料，采用相应的方法计算参数。（3）Numan法
对于潜水含水层完整井非稳定流抽水试验，也可以采用Numan模型求参，具体求参过程可参阅《地下水动力学》等教科书。4.参数计算新技术新方法的应用
采用AQUIFERYTEST软件（图1）、数值模拟法（可采用GMS、MODFLOW、FEFLOW等软件）以及肖长来教授提出的全称曲线拟合法（图2）等一些新的软件、方法确定水文地质参数，效果非常好。
Conductivity:9.38E-2 m/d
图1 AQUIFERYTEST软件求参图示
图2 全称曲线拟合法求参图示
5.参数计算结果的验证
上述参数计算结果的精度如何，取决于试验场地水文地质条件的概化，也取决于观测数据的精度。对于所求得的参数，应将其代入相应的公式，通过对比计算降深与实测降深的差值，分析所求参数的精度及其可靠性和代表性，最终确定抽水试验场地的有代表性意义的参数值。
方法
（二）单孔稳定流抽水试验，当利用抽水孔的水位下降资料计算渗透系数时，可采用下列公式：
当Q～s（或Δh
2）关系曲线呈直线时，1）承压水完整孔：
(8.2.1-1)
2）承压水非完整孔： 当M>150r，l/M>0.1时：
(8.2.1-2)
或当过滤器位于含水层的顶部或底部时：
3）潜水完整孔：
（8.2.1-3）（8.2.1-4）
4）潜水非完整孔： 当>150r，l＞0.1时：
（8.2.1-5）
或当过滤器位于含水层的顶部或底部时：
（8.2.1-6）
式中 K——渗透系数（m/d）；
Q——出水量（m/d）；
3s——水位下降值（m）；
M——承压水含水层的厚度（m）；
H——自然情况下潜水含水层的厚度（m）；
h——潜水含水层在自然情况下和抽水试验时的厚度的平均值（m）；
h——潜水含水层在抽水试验时的厚度（m）； l——过滤器的长度（m）；
r——抽水孔过滤器的半径（m）；
R——影响半径（m）。当Q～s（或Δh）关系曲线呈曲线时，可采用插值法得出Q～s 代数多项式，即： 2 s＝a1Q+a2Q2+……anQn（8.2.1-7）
式中 a1、a2……an——待定系数。
注：a1宜按均差表求得后，可相应地将公式（8.2.1-1）、（8.2.1-2）、（8.2.1-3）中的Q/s和公式（8.2.1-4）、（8.2.1-5）、（8.2.1-6）中的 进行计算。当s/Q（或Δh2/Q）～Q关系曲线呈直线时，可采用作图截距法求出a1后，按本条第二款代换，并计算。
单孔稳定流抽水试验，当利用观测孔中的水位下降资料计算渗透系数时，若观测孔中的值s（或Δh2）在s（或Δh2）～lgr关系曲线上能连成直线，可采用下列公式：
1承压水完整孔：
以1/a1代换，分别（8.2.2-1）潜水完整孔：
(8.2.2-2)
式中 s1、s2——在s～lgr关系曲线的直线段上任意两点的纵坐标值（m）；
——在Δh～lgr关系曲线的直线段上任意两点的纵坐标值（m）；
22r1、r2———在s（或Δh）～lgr关系曲线上纵坐标为s1、s2（或）的两点至抽水孔的距
2离（m）。
单孔非稳定流抽水试验，在没有补给的条件下，利用抽水孔或观测孔的水位下降资料计算渗透系数时，可采用下列公式： 1 配线法：
1)承压水完整孔：
2）潜水完整孔：
式中 W（ｕ）——井函数；
S——承压水含水层的释水系数；
μ——潜水含水层的给水度。
2直线法：
当
1)承压水完整孔：
<0.01时，可采用公式（8.2.2-1）、（8.2.2-2）或下列公式：
（8.2.3-5）水完整孔：
（8.2.3-6）
式中 s1、s2——观测孔或抽水孔在s～lgt关系曲线的直线段上任意两点的纵坐标值（m）；
——观测孔或抽水孔在 Δh2～lgt关系曲线的直线段上任意两点的纵坐标值（m）；
t1、t2——在s（或Δh）～lgt关系曲线上纵坐标为s1、s2（或）两点
22的相应时间（min）。8.2.4单孔非稳定流抽水试验，在有越流补给（不考虑弱透水层水的释放）的条件下，利用s～lgt关系曲线上拐点处的斜率计算渗透系数时，可采用下式：
（8.2.4）
式中 r——观测孔至抽水孔的距离（m）；
B——越流参数；
mi——s～lgt关系曲线上拐点处的斜率。
注：1 拐点处的斜率，应根据抽水孔或观测孔中的稳定最大下降值的1/2确定曲线的拐点位置及拐点处的水位下降值，再通过拐点作切线计算得出。
越流参数，应根据确定越流参数B。，从函数表中查出相应的r/B，然后8.2.5 稳定流抽水试验或非稳定流抽水试验，当利用水位恢复资料计算渗透系数时，可采用下列公式： 停止抽水前，若动水位已稳定，可采用公式（8.2.4）计算，式中的mi值应采用恢复水位的曲线上拐点的斜率。停止抽水前，若动水位没有稳定，仍呈直线下降时，可采用下列公式：
1）承压水完整孔：（8.2.5-1）
2）潜水完整孔：
（8.2.5-2）
式中 tk——抽水开始到停止的时间（min）；
tT——抽水停止时算起的恢复时间（min）；
s——水位恢复时的剩余下降值（m）；
h——水位恢复时的潜水含水层厚度（m）。
注：1 当利用观测孔资料时，应符合 当
<0.01时的要求。
如恢复水位曲线直线段的延长线不通过原点时，应分析其原因，必要时应进行修正。
利用同位素示踪测井资料计算渗透系数时，可采用下列公式：
（8.2.6-1）
（8.2.6-2）
式中 Vf——测点的渗透速度（m/d）；
I——测试孔附近的地下水水力坡度； r——测试孔滤水管内半径（m）；
r0——探头半径（m）；
t——示踪剂浓度从 N0变化到Nt所需的时间（d）；
N0——同位素在孔中的初始计数率； Nt——同位素t时的计数率； Nb——放射性本底计数率； a——流场畸变校正系数。
方法
（三）在单孔抽水试验中,由于没有观测孔,只能根据抽水试验未稳定前的水位,做出降深-半对数时间图,以图解法来求渗透系数或根据水位恢复数据,以图解法来求岩石渗透系数.像这种联解方程,想用数学推导法来求解,是非常困难的.涉及幂函数和指数涵数.如一矿山的抽水试验,涌水量为Q=1053吨/天,含水层厚度为m=241.3米,降深s=9.40米,抽水管径r=0.084米.经过化简和代入后为: k-0.085lgk=1.41113
可以用逼进法,在excel里计算.如k=1时,左边的式子,其得数是小于1的,显然不符合方程.如k=3时,左边的式子,其得数是大于2的,显然也是不符合方程.如k=2时,左边的式子,其得数是介于1--2之间的,这样就界定了k值的大致范围
然后再分别计算
k=1.1 左边的式子k-0.085lgk=1.0965 k=1.2,k-0.085lgk=1.19327
k=1.3,k-0.085lgk=1.2903
k=1.4,k-0.085lgk=1.38758
k=1.5,k-0.085lgk=1.4850 显然k值小于1.5,大于1.4.然后再这个区间继续计算k-0.085k的值,使之趋近于1.41113.在excel里,这种计算非常快捷.很快就可以得出k=1.4244 R=112.12
水文地质参数确定方法
确定水文地质参数的方法一般分为经验数据法、经验公式法、室内试验法和野外试验法四种。供水水文地质勘察中主要采用野外试验法，因为野外试验法求得的参数精确度较高。
经验数据法 根据长期的经验积累的数据，列成表格供需要时选用。渗透系数、压力传导系数、释水系数、越流系数、弥散系数、降水入渗系数、给水度和影响半径等都有经验数据表可查。在评估地下水资源时，水文地质参数常采用经验数据。
经验公式法 考虑到某些基本规律列出的公式，并加上经验的修正。渗透系数、给水度等都可按经验公式计算，其值比选用经验数据的精确度要高。
室内试验法 在野外采取试件，利用试验室的仪器和设备求取参数。渗透系数、给水度、降水入渗系数等水文地质参数，可通过室内试验法求得。
野外试验法 利用野外抽水试验取得有关数据，再代入公式计算水文地质参数。其计算公式分稳定流公式和非稳定流公式。计算时根据含水层的状态(潜水或承压水)、井的完整性(完整井或非完整井)、边界条件(傍河或其他边界)、抽水孔状态(单孔抽水或带观测孔抽水)等条件选择。渗透系数、导水系数、压力传导系数、释水系数、越流系数、给水度和影响半径等，都可用野外抽水试验法求得较精确的数据。野外确定降水入渗系数还可采用地下水均衡试验场的实测数据，一般精度较高。
第二篇：学科德育渗透实验总结
学科教学德育渗透实验总结
郭春波
本学期我在学科教学活动中，充分发挥教材优势，进行德育渗透的课题研究，让德育与知识、技能有机地结合在一起，使学生在获取知识的同时，也得到思想品德熏陶，促使青少年学生在学习中，不断提高自身素质。
一、在教学中，坚持文道结合的原则，让学生获得思想品德教育能更具体、形象。
各个学科的知识都在一定程度上反映了人们的思想观点，思想形成了学科知识的内在属性，它们互相融合，互相渗透，脱离了教材，谈品德，德育是空洞的说教；反之，没有德育的教学，智育也是苍白的。因此在具体的教学活动中，为了更好地实施教学，落实教学目标，德育智育结合，文道结合是必要的，对于具有丰富而生动德育教材学科的各学科而言，这一点更是关键。
在教学中，通过说服教育等方式，让学生理解良好品格的养成需要坚持持久，在掌握一定学习技巧的同时，能更具体形象地获得思想教育教学效果。从而树立远大的抱负，以饱满的生命力投身到学习知识的大潮中去，将来回报祖国。青少年要勇敢的面对困难，而不是躲避困难。如果坚持下去，最终赢得胜利，就会有一种自豪感。这样，学生在学习中，不单掌握一定的学习技能，而且在潜移默化中，逐渐确立正确的世界观、人生观。
二、在教学中，注意激发，培养学生真挚情感，使之成为学生积极向上的动力。
在德育过程中，动之以情，既是晓之以理的继续，更是持之以恒导之以行的基础，因而使受教育者获得真挚情感，仍是教育成功的关键，是提高德育渗透效果的保证。各学科那些文质兼美的语言文字，就是一块块的情感天地，通过富有情感的教学，巧妙的教学手段，激发培养学生真挚情感，积极对学生进行情感教育，激发培养学生爱祖国、爱自然、爱生活的真挚情感，使学生在学习中不单掌握一定的知识技能，而且得到思想品德熏陶，不断提高自己的道德情操。
总之，激发学生心底的真挚情感，才会使学生逐渐脱离低级趣味，而产生高尚的情感，形成高尚的道德情操，自觉追求真、善、美，树立远大的目标，并为之而奋斗。
三、深挖教材中的德育因素，加强对学生品德熏陶
教材中德育的内容，不可能像学科知识那样处处明显，它往往是内在的、深层的，个别隐蔽的，思想教育是渗透在学科知识的方方面面，与学科知识融二为一，这就要求我们在教学中进行德育渗透，不能仅停留在那些表面的内容上，而应当是深入挖掘教材内在的德育因素，各学科的德育，材料虽然丰富，同样需要我们多方面深入挖掘，以提高德育渗透的成效，总而言之，只有深挖，才能加强德育渗透的力度，使青少年不断增强自身素质，提高自身的道德情操。
四、把德育渗透到各种形式的实践活动中去。
开展形式多样的实践活动，是对学习课堂教学的补充，是学生增强素质的另一途径。课余时间组织活动丰富学生学科知识、技能，提高学生的素质，也使学生在潜移默化中得到思想熏陶，激发他们积极向上的情感,从而激发他们的爱国情感。
第三篇：高中生物实验方法总结
1．显微观察法：如“观察细胞有丝分裂”“观察叶绿体和细胞质流动”“用显微镜观察多种多样的细胞”等。
2．观色法：如“生物组织中还原糖、脂肪和蛋白质的鉴定”“观察动物毛色和植物花色的遗传”“DNA和RNA的分布”等。
3．同位素标记法（元素示踪法）：如“噬菌体浸染细菌的实验”“恩格尔曼实验”等。
4．补充法：如用饲喂法研究甲状腺激素，用注射法研究动物胰岛素和生长激素，用移植法研究性激素等。
5．摘除法：如用“阉割法、摘除法研究性激素、甲状腺激素或生长激素的作用”“雌蕊受粉后除去正在发育着的种子”等。
6．杂交法：如植物的杂交、测交实验等。
7．化学分析法：如“番茄对Ca和Si的选择吸收”“叶绿体中色素的提取和分离”等。
8．理论分析法：如“大、小两种草履虫的竞争实验”“植物向性动物的研究”等。
9．模拟实验法：如“渗透作用的实验装置”“分离定律的模拟实验”等。
10．引流法：临时装片中液体的更换，用吸水纸在一侧吸引，于另一侧滴加换进的液体。
11．实验条件的控制方法
⑴增加水中O2：泵入空气或吹气或放入绿色植物；
⑵减少水中O2：容器密封或油膜覆盖或用凉开水；
⑶除去容器中CO2：NaOH溶液、Na2CO3溶液；
⑷除去叶中原有淀粉：置于黑暗环境（饥饿）；
⑸除去叶中叶绿素：酒精水浴加热（酒精脱色）；
⑹除去植物光合作用对呼吸作用的干扰：给植株遮光；
⑺单色光的获得：棱镜色散或透明薄膜滤光；
⑻血液抗疑：加入柠檬酸钠（去掉血液中的Ca2+）；
⑼线粒体提取：细胞匀浆离心；
⑽骨无机盐的除去：HCl溶液；
⑾消除叶片中脱落酸的影响：去除成熟的叶片；
⑿消除植株本身的生长素：去掉生长旺盛的器官或组织（芽、生长点）；
⒀补充植物激素的方法：涂抹、喷洒、用含植物激素的羊毛脂膏或琼脂作载体；
⒁补充动物激素的方法：口服（饲喂）、注射；
⒂阻断植物激素传递：插云母片法。
12．实验结果的显示方法——实验现象的观测指标
⑴光合作用：O2释放量或CO2吸收量或有机物生成量。例：水生植物可依气泡的产生量或产生速率；离体叶片若事先沉入水底可依单位时间内上浮的叶片数目；植物体上的叶片可依指示剂（如碘液）处理后叶片颜色深浅。
⑵呼吸作用：O2吸收量或CO2释放量或有机物消耗量
⑶原子或分子转移途径：同位素标记法或元素示踪法
⑷细胞液浓度大小或植物细胞活性：质壁分离与复原
⑸溶液浓度的大小：U型管+半透膜
⑹甲状腺激素作用：动物耗氧量、发育速度等
⑺生长激素作用：生长速度(体重、体长变化)
⑻胰岛素作用：动物活动状态（是否出现低血糖症状——昏迷）
⑼胰高血糖素作用：尿糖的检测（在尿液中加班氏试剂进行沸水浴，看是否出现砖红色沉淀）
⑽菌量的多少：菌落数、亚甲基蓝褪色程度
⑾生长素作用及浓度高低的显示：可通过去除胚芽鞘后补充生长素后的胚芽生长情况来判断（弯曲、高度）
⑿淀粉：碘液（变蓝色）
⒀还原性糖：斐林试剂/班氏试剂（沸水浴后生成砖红色沉淀）
⒁CO2：Ca(OH)2溶液（澄清石灰水变浑浊)
⒂乳酸：pH试纸
⒃O2：余烬复燃
⒄蛋白质：双缩脲试剂（紫色）
⒅脂肪：苏丹Ⅲ染液(橘黄色）；苏丹Ⅳ染液(红色）
⒆DNA：二苯胺（沸水浴，蓝色）、甲基绿（染色后，呈绿色）
⒇RNA：吡罗红（呈红色）、苔黑酚乙醇溶液
第四篇：消化实验方法总结
《豆粕粉碎粒度与蛋白质体外消化率的关系研究》
采用胃蛋白酶-胰酶两步法，通过体外模拟鸡体消化道内环境来比较不同粉碎力度豆粕的蛋白消化率，从而确定适合肉仔鸡生长的较适宜豆粕粉碎力度。
平均粒径采用GB 6971-86 方法，体外试验采用Boisen和Fernandez等体外模拟消化方法。胃蛋白酶最适浓度的选择
1g豆皮→100ml三角瓶+25ml磷酸缓冲液（pH=6.0 0.01M）+10ml盐酸（0.2M）→温和搅拌+1ml(15mg/ml,30mg/ml,45mg/ml,60mg/ml,75mg/ml,90mg/ml)的新鲜胃蛋白酶溶液（由0.01M HCl 配制），pH=2.0 +0.5ml抑菌剂（青霉素+链霉素）→39℃恒温水浴中震荡6h,消化后+20%黄基水杨酸5ml→室温静置30min→抽滤→干燥后残渣凯式定氮法测蛋白质含量→计算蛋白质和干物质消化率。确定最适胃蛋白酶浓度为75mg/ml.胰酶最适浓度选择
在最适（75mg/m）胃蛋白酶液消化后的产物中加入10ml磷酸缓冲液（0.2M pH=6.8）+5mlNaoH(0.6M)+1ml(70mg/ml,90mg/ml,110mg/ml,130mg/ml,150mg/ml)的胰酶溶液（由磷酸二氢钾缓冲液配制）pH=6.8→39℃恒温水浴中震荡18h→消化后+20%磺基水杨酸5ml→室温静置30min→抽滤，干燥后残渣按照凯式定氮法测其蛋白质含量，计算粗蛋白和干物质消化率，确定最适胰酶浓度为110mg/ml。胃蛋白酶一胰酶两步法测定过程[1]
分别称取原样和过筛豆粕于三角瓶中，4个重复，使用最适浓度测定不同粒度豆粕蛋白和干物质含量，并通过氨基酸自动分析仪测其氨基酸含量，计算粗蛋白、干物质和氨基酸消化率。《燕麦粉添加量对面包营养组分含量和淀粉体外消化性的影响》 淀粉体外水解动力学测定
1g样品+50ml磷酸缓冲液（pH=6.9）→37℃水浴消化5min→取0.2ml消化上清液→1min后加入1mlα-淀粉酶溶液（40mg/ml 用DNS溶液配制）→37℃水浴继续消化→每隔15min分别取消化液0.2ml于25ml试管中+0.8ml蒸馏水+1mlDNS→沸水浴中煮沸10min→取出后+15ml蒸馏水，摇匀→空白管调零，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的含量。采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/m L的葡萄糖溶液绘制标准曲表2，根据还原糖释放量的变化比较淀粉的体外消化性。《苦荞芽粉馒头品质及体外模拟消化研究》 甲醇提取液的制备
参照Bojana(2011)提取样品的方法并稍作修改。准确称取5g待提取的苦荞馒头样品浸没于50ml甲醇/水（80/20，v/v）溶液中，用均质机搅拌使样品破碎均质。样品液超声波提取15min，将悬浮液转移至离心管中。原样品再加入50ml甲醇/水（80/20，v/v），重复一次，合并提取液。2500r/min离心，取上清液于45℃水浴下蒸发至干，用甲醇重新溶解并定容到100ml，备用。酚含量测定
采用Folin–Ciocalteu法（FILIPCEV 2011）测定试样的总酚含量，并稍作修改。取500μL蒸馏水，加入125μL的标准溶液或提取液后，再加入125Μl Folin–Ciocalteu试剂，充分混匀后加入1.25ml 7%碳酸钠溶液，漩涡混匀后避光放置90min后于760nm处测定混合液的吸光值。以没食子含量为纵坐标（μg/ml），吸光度为横坐标，得回归方程为y=0.014X+0.041（R2=0.995）。按照测定没食子酸标准液吸光度的步骤测定待测液吸光度。黄酮含量测定
采用NaNo2-Al(NO)3方法测定。取一定浓度的样品水溶液0.1ml与0.2ml 5%NaNO2溶液，漩涡混匀后室温下放置6min，加入0.2ml 10%的ALCL3，振荡后静止6min，然后加入2ml 1M NaOH溶液，最后加水定容至5ml，放置15min后于波长510nm处测定混合液吸光值。以芦丁含量为纵坐标（μg/ml），吸光度为横坐标得回归方程为y=0.007x+0.030（R2=0.991）。按照测定芦丁标准液吸光度的步骤测定待测液吸光度。体外模拟消化过程
体外模拟消化过程参考Gawlik等人的方法，略作修改。
模拟唾液：2.38gNa2HPO4，0.19gKH2PO4，8gNacl和0.91gα-淀粉酶（220U/ml）溶于1升水中形成模拟唾液，用磷酸盐缓冲液调节溶液为pH=6.75。
模拟胃液：0.32%胃蛋白酶溶于0.3mol/L的Nacl，用HCL调节溶液pH=1.2。模拟肠液：0.05g胰蛋白酶和0.3g胆汁溶于35ml的NaHCO3（0.1mol/l）。
体外提取过程（S0）：准确称取6.0g荞麦馒头样品浸没于100ml甲醇水（80/20，v/v）溶液中，静置6h，悬浮液转移至离心管中，2500r/min离心10min，取上清液于45℃水浴下旋转蒸发至干，用甲醇重新溶解并定容到10ml，-20℃保存，备用。
口腔消化过程（S1）：准确称取6g样品置于100ml的烧杯中并加入30ml模拟唾液，用均质机搅拌使样品充分破碎均质后放入水浴摇床中，37℃振荡10min。
胃肠消化过程（S2）：取出水浴摇床中的样品，用3mol/l的盐酸调节溶液体系至pH=1.5后加入30ml模拟胃液，置于40℃水浴摇床中振摇60min。反应结束后取5ml的样液，于70℃的水浴锅中加热灭酶，经过模拟胃部消化的消化液用0.1mol/l的NaHCO3调节使溶液体系的pH=6，加入30ml胆汁胰酶的复合液，再分别加入5ml 1mol/l的Nacl和1mol/l KCl，置于37℃水浴震荡120min模拟肠道消化，于70℃的水浴锅中加热灭酶，-20℃保存备用。每个样品重复三次。
肠道吸收过程（S3）：将20ml剩余消化液转移到透析袋中，并将透析袋置于装有50ml PBS缓冲液的烧杯中，37℃水浴震荡4h。将PBS缓冲液转移到离心管中，-20℃保存备用，每个样品重复三次。
《羊奶婴儿配方奶粉中蛋白质体外模拟消化研究》 外模拟胃消化
体外模拟胃消化参照Johns[8]的方法并对其加以改进。将奶粉样品用蒸馏水配制成蛋白质质量分数为1%的乳液，于37℃水浴中预热10min，用1mol/L的HCl调乳液p H3。在每100m L乳样中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为3×106U)，于
37℃恒温摇床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH调节乳液p H值至7灭酶，测定其中蛋白质的胃消化率。体外模拟肠消化
体外模拟肠消化参照Johns[8]的方法并对其加以改进。将奶粉样品用蒸馏水配制成蛋白质质量分数为1%的乳液，于37℃水浴中预热10min，用1mol/L的Na OH调乳液p H7。在每100m L乳样中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为1.25×105U)，于37℃恒温摇床上消化水解2h，然后沸水浴5min灭活，测定其中蛋白质的肠消化率。体外模拟总消化
体外模拟总消化参照Johns[8]的方法并对其加以改进。将奶粉样品用蒸馏水配制成蛋白质质量分数为1%的乳液，于37℃水浴中预热10min，用1mol/L的HCl调乳液p H3。在每100m L乳样中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为3×106U)，于37℃恒温摇床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH调节乳液p H值至7。再向每100m L乳样中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为1.25×105U)，于37℃恒温摇床上消化水解2h，然后沸水浴5min灭活，测定其中蛋白质的总消化率。燕麦全粉中蛋白质体外消化的测定
燕麦蛋白质的体外消化实验采用Wang[15]报道的体外消化模型进行,略有改动。具体操作如下:准确称取一定质量的样品分散于0.1 mol/L HCl中形成50 g/L的溶液,置于37℃水浴中预热5 min,以酶∶底物为1∶ 100加入胃蛋白酶,在37℃恒温振荡器上反应,分别在不同的消化时间(0、10、30、60、120 min)取样,用1 mol/L的NaOH调节pH7.0终止消化反应,120min所得的消化液调节pH7.0后,以酶∶底物为1∶ 100加入胰蛋白酶,在消化10、30、60、90、120min之后取样分析。
第五篇：RT-PCR实验方法总结
RT-PCR实验方法总结大全
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：
1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须
在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov问题：
在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！解答：
1.RT-PCR有两种做法：
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。3.RACE 我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无
RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。有关内参：
RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。
问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？ 答： it should determined the amount of RNA.but it not for the quantitity of the PCR.it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR)and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much.but the amount just using “accurate piptte” is wrong.it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。
关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。
有关内参的建议：
一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。
2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这 图我在 *** 帖过。关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。
引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。
我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？
18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。
正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。
有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？
原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制
请问： 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？ PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？ 3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？
一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.如果内参照有,目的没有,至少证明不是“美丽惹”的祸.原因书里应该都说了.在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施
1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分离与纯化
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA
一、试剂准备
1．3M醋酸钠（pH 5.2）2．0.1M NaOH 3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。
4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS 5．无水乙醇、70%乙醇 6．DEPC
二、操作步骤
1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。
5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。
8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。
10.用适量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事项
1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点： 1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。
2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。
3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。
4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。
一、试剂准备
1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。
2.杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。3.RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4)20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml)8μl、RNase T1(250U/μl)1μl，加DEPC H2O至2ml
二、操作步骤 1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。（1）设计含T7启动子的PCR引物
由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:
T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：
上游引物
下游引物Ⅱ T7 启动子序列
下游引物Ⅰ
（2）PCR
先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。
（3）探针合成标记与纯化
在0.5ml 离心管中加入下列试剂：
RNasin（40U/μl）0.5μl
GACU POOL GAC
（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM）2μl
[α-32P]UTP(10μCi/μl)2.5μl
DTT(二硫苏糖醇，0.1M)1μl
5×转录 buffer 2μl
模板（50ng/μl）1μl
T7 RNA 聚合酶(15U)1μl
混合后，短暂离心，37OC保温1hr。
加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。
加入：饱和酚 50μl 氯仿 50μl
酵母tRNA（2μg/μl）4μl
DEPC H2O 100μl
室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。
2．杂交
（1）RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。
（2）取8μl RNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。
（2）80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。
3.消化
(1)杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。
(2)加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 OC保温10min。
(3)加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。
(4)转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g×10min。
(5)弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
4、电泳与放射自显影
（1）配制凝胶：(50ml)
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1）6.25ml
5×TBE 10ml 尿素 24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。
（2）预电泳
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。
（3）加样
将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。
（3）电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。
三、注意事项
1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。
2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。
3、同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。
4、RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。
可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞
说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了
如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了 第二次的引物设计要求可以低一点 以50μl体系为例 引物各1μl 第一次PCR产物5μl
二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物的量
我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.luoyu10 wrote: 各位大哥：
我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？
最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。
问：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想请教引物如何设计？
好的引物所具有的令人满意的特点：
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* 选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
* 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
* 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。* 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
【经验】如何确认RNA的质量 各位都知道，提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！
以下两种方法，相信大家都知道的： 1）检测RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比值为2.0。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。2）RNA的电泳图谱
一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。
电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的（见下图）。
以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。
下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。3）保温试验
方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了！
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