猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展

第一篇：猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展

猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展

猪圆环病毒病是公认的免疫抑制病之一，造成猪场损失惨重，疫苗免疫成了救命的稻草。从2011年猪圆环疫苗上市至今，已有17家圆环产品先后上市，目前，出现严重供大于求的现象，同时，养殖场也面临着幸福的烦恼，大量产品的上市，产品价格可能下降，但是，面对玲琅满目的产品，如何选择疫苗成了养殖场一个重要的课题，针对这些烦恼，本文希望能够为养殖场选择疫苗带来帮助，避免走弯路，为养殖场服务。

1.PCV-2国内外最新流行动态

由PCV-2引发的疾病已成全球流行之势，在加拿大首次报道该病原引起PMWS后[1]，学者通过调查本国包括SPF猪、部分散养猪以及育肥猪发现，猪群中PCV-2血清中抗体普遍存在，但目前该病在加拿大仍然只是散发。在英国和北爱尔兰，猪群血清中PCV-2抗体阳性率分别为86％和92％。美国、法国、丹麦、意大利、西班牙、荷兰、新西兰、日本、韩国、墨西哥等国家也相继报道猪群中存在PMWS。在我国猪群中PCV-2感染情况也不容乐观。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22个猪群采集了559份血清，用ELISA方法检测PCV-2抗体，其阳性率高达5l％，表明我国猪群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法对我国北京、山东、河北、深圳、山西、天津、广东等省(市)的12个规模化猪场发病猪群进行猪圆环病毒2型感染的流行病学调查，结果表明猪圆环病毒2型感染情况在我国猪群中相当严重。李超等[4]在2010年对安徽省PCV-2流行病学调查，结果表明安徽省14个市(县)的PCV-2抗体阳性率平均为74.36％，表明安徽省猪群中普遍存在着PCV-2的感染。从上述报道表明PCV-2在我国猪群中广泛存在。根据流行病学调查显示，虽然猪群中PCV-2抗体阳性率较高，但很大比例的抗体阳性猪群并不表现出临床症状。PCV-2与其他多种病原混合感染较为严重，调查发现沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性病原与PCV-2混合感染率达到了20％[5]。陕西省PCV-2与PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陈义祥等对广西地区197份组织病料检测发现，PCV-2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占总病料数量的57.73％。2003年王文军等[7]对黑龙江地区PCV-2阳性猪群的病料调查发现，蓝耳病和猪瘟的阳性率也较高。

哈尔滨兽医研究所刘长明[8]在2007年采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA）对来自与黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地的健康猪群480份血清和发病猪群424份血清，抗体阳性率分别为79.2%和91.7%，表明PCV-2在猪群中感染率非常高。山东农科院畜牧兽医研究所吴家强博士检测结果也证实PCV-2防控比较糟糕，PCV-2，2010年检出率为34.66%（124/357），2011年检出率为25.59%(174/588)；2012年检出率为2

1.38%(147/683)，圆环病毒病依然严重，但有下降趋势，这个和使用圆环疫苗免疫有关系。

第二篇：猪圆环病毒疫苗应用现状

猪圆环病毒疫苗应用现状

摘要

目前在国外只有梅里亚动物保健公司生产全病毒灭活疫苗，使用于母猪免疫。

已经注册的国产圆环病毒疫苗均为全病毒灭活疫苗。分别由哈尔滨兽医研究所用LG、南京农业大学用SH株研制而成。①哈尔滨维科生物技术开发公司；②上海海利生物药品有限公司；③洛阳普莱柯生物工程有限公司；④江苏南农高科技股份有限公司4家公司生产。国产疫苗亟待提高纯化工艺。水性佐剂要比矿物油佐剂疫苗对机体的刺激性小，副反应小。疫苗免疫保护期为3—4月，贮存有效期为12—18月。

FLEX系列茵格发猪圆环病毒疫苗，是具有纯化蛋白抗原的水性佐剂的亚单位灭活疫苗。形成形态、大小与活病毒相同的、具有高度免疫原性的纯化抗原。该产品是目前所有猪圆环病毒疫苗中唯一的单针疫苗，具有抗原缓解效果，应用时不必加强免疫。

在应用圆环病毒疫苗后满意度调查中，进口圆环病毒疫苗满意度最高。如何选择疫苗、制定适合猪场实际的免疫程序、确定免疫时机适时免疫显得尤为重要。

疫苗免疫哪些猪群？何时免疫？应对猪场流行病学、临床症状、剖检变化、生产成绩、病原和抗体的实验室监测进行评估后作出决定。猪场是否应用疫苗，应充分考虑本场发病情况、饲养管理状况、生物安全、主要相关疫病免疫与控制状况、药物预防效果等因素基础上综合判断。母猪是否需要免疫？倘若母猪群因PCV2感染而流产、产死胎、弱仔的比例超出正常，或仔猪因PCV2感染在断奶后1—2周发病，选择母猪免疫就是正确的。进口的疫苗可普免2—3次/年，在国产疫苗应用安全的情况下可免疫3—4次/年。研究表明免疫母猪所产仔猪和非免疫母猪所产仔猪接种疫苗后，其免疫效应均未受到母猪免疫的负面影响，尽管这一结果令人鼓舞，但还需进行更多研究。

仔猪免疫的时间可据下游猪发病日龄确定。疫苗起效时间为2周，感染潜伏期约2周。当母源抗体在3—8周下降到较低水平而环境中野毒感染压力较大时，对于保育猪特别是10周龄后肥育猪是否获得足够保护？一般12周龄开始感染。应在猪群出现临床症状至少4周前施行免疫注射。商品猪群只注射1次即可；1针免疫4个月后再进行第2次免疫。在第1次免疫2周后加强免疫一次；在加强免疫的3—4个月后再免疫。

新生仔猪3—4周龄首免，第一次免疫后间隔3周加强免疫一次。

在制定免疫程序时，还应注意与其它免疫的相互干扰作用。至少7d的间隔；若PRRS弱毒疫苗免疫在前，最好有10d以上的间隔再免PCV2疫苗。

圆环病毒疫苗免疫效果通过常规的抗体检测目前难以给出正确评价，可通过临床症状、生产成绩予以评估，免疫后对猪的健康状况和增重改善明显。圆环病毒疫苗应用于PCV2急性感染，仔猪群呼吸困难、消瘦、皮炎，母猪群流产、产弱仔等，可减少母猪流产，产死胎、弱仔的数量，可明显降低保育及生长育肥猪发病率、死淘率；明显提高日增重、猪群整齐度，降低料肉比，减少皮炎发病率，缩短出生至出栏时间；还有助于猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗、伪狂犬病疫苗免疫效果的正常发挥，降低机体对饲料霉菌毒素的敏感度。

第三篇：猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展

猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展

摘要：猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科，该病毒有2个血清型：PCV1和PCV2。PCV1广泛存在于猪体内，无致病性；PCV2能直接或间接导致一系列猪的综合性疾病。如猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)，断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和成年猪皮炎肾病综合征(PDNS)等，对养猪业危害严重。为了深入了解PCV2致病因素，建立快速鉴别诊断技术，综述了PCV2的猪圆环病毒病及其相关致病因素和目前应用诊断技术研究情况。为研究探讨PCV2的发生和诊断提供借鉴。关键词：猪圆环病Ⅱ型；诊断技术；致病基因

猪圆环病毒(PCV)是兽医学上已知动物病毒中最小的病毒，根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，将其分为PCV1和PCV2两个型，其中PCV1无致病性[1]，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系。PCV2则具有致病性，在临床上主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征。PCV对酸性环境(pH3)、氯仿或者高温(56℃和70℃)有抵抗作用。PCV在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞上不生长，可在PK-15细胞中生长，但不引起细胞病变，且需将PCV盲传多代才能使病毒有效增殖。在接种PCV的PK-15细胞培养物中加入d-氨基葡萄糖，可促进PCV复制，使得感染PCV的细胞数量提高30％。感染PCV的细胞内含有许多胞浆内包涵体，少数感染细胞内含有核内包涵体。

PCV2属圆环病毒科(Circoviridae)，是最小的无囊膜单链环状DNA病毒，其单链环状DNA染色质由1759个碱基组成，有11个开放阅读框架，编码11种蛋白质，猪圆环病毒的抵抗力较强，不易被灭活，在外界环境中可长时间存活。由猪圆环病毒(PCV2)引起的猪圆环病，临床表现为体质下降、消瘦、皮肤发白、腹泻、呼吸困难和黄疸。

PCV2与大多数典型的猪病原传播不同，PCV2既可水平传播，也可垂直传播。Shibata等在近期研究中随机的发现，临床健康的猪体内含有PCV2[2]，说明PCV2可潜伏于健康猪群中，更出乎意料的是，科研工作者在怀孕母猪和哺乳期母猪的乳汁中检测出PCV2[3] 1 猪圆环病毒病及其相关性致病因素

1.1 相关的致病因子

PCV2的致病因子主要与免疫刺激、宿主的敏感性和PCV2分离株有关[4]。研究表明，免疫刺激可以激发PCV2从感染向疾病方向发展而出现PMWS的机能障碍特征，这可能是由PRRSV或猪细小病毒(PPV)激活了巨噬细胞，从而促进了PCV2的增殖。

在宿主敏感性研究中发现，长白猪较杜洛克和大白猪更容易出现与PCV2相关的疾病爆发，而皮特兰仔猪对与PCV2相关的疾病敏感性较低，且公猪的遗传品系对PCV2相关疾病发病情况有显著的影响。最新的证据则表明[5]，PCV2分离株在毒力上有一定的差异，但这种微小的分歧可能与病毒的地域来源有关，而与分离株的病毒毒力无关。

1.2 PCV2的协同感染疾病

PCV2的主要协同感染疾病在最初研究中倾向于猪肺炎支原体、PPV、PRRSV，可是随着研究的深入，发现了如猪皮炎与肾炎综合征、繁殖障碍、母猪流产和死亡综合征和PMWS等很多疾病可能都会协同PCV2感染。

充分的证据表明，由于PCV2和PPV在猪体内具有类似的靶细胞，而PPV提高免疫系统的功能导致了更严重的疾病，PCV2和PPV的双重感染会引发比单个感染PCV2更严重的临床症状和病变，在发生PCV2相关疾病PMWA的猪群中，PRRSV居最常见的协同感染因子名单之首，其检出率高达52％[6]。猪呼吸道综合征(PRDC)、增生和坏死性肺炎(PNP)、猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)是发生在断奶、育成猪及成年猪群中的疾病，被认为是由多种病因共同感染所致，由于PCV2在这些共同感染疾病中普遍存在，其在这些疾病的共同感染中扮演了何种角色已普遍引起了人们的关注[7-8]，但PCV2与PRRS和PMWS直接相关的证据[9-10]，愈来愈明显。致病基因

PCV的基因组为单股、负链、环状DNA，病毒基因组以滚环模式(rolling circle model)进行复制。PCV2的复制起始区位于一个324 bp的片段上，其包含1个茎-环结构、保守的九核苷酸基序(AAGTATTAC)、3个六核苷酸重复序列(CGGCAG)和2个五核苷酸重复序列，Rep和Rep’的共表达是起始PCV2的复制所必须的，对PCV2的保守九核苷酸基序进行突变，从而影响病毒的复制过程，Rep和Rep’蛋白协同定位于同一个细胞的细胞核内，二者既可以形成同源复合物，也可以形成异源复合物。

据研究报道认为，猪圆环病的致病基因可能与ORFl-6这6个编码框编码的蛋白有关，其中ORFl为Rep基因，编码2种蛋白，负责PCV2的复制；ORF2为Cap基因，编码Cap蛋白，是PCV2病毒的唯一结构蛋白，可诱导产生中和抗体；ORF3编码的一种蛋白可以诱导宿主细胞凋亡[11-12]。

研究表明，ORF3诱导TNF-α达到较高水平可能与并发PPV和PMWS直接相关，ORF5诱导的IL-6可能与PDNS有关(PDNS也是IL-6明显增强)[13]，OFFR2基因表达的IL-10可能是感染猪逐渐发展成更严重的PMWS，而ORFl表达的Thl(IFN-γ)和Th2(IL-13)PMWS和PDNS有某种联系[14]。鉴别诊断技术

3.1 PCR方法

复合PCR技术具有单联PCR技术同样的优点，又能一次反应同时方便快捷的检测鉴别多种不同病原体。夏平安教授[15]等针对可引起猪免疫抑制病的重要病原PRRSV和PCV2建立了一种复合PCR检测方法，根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株部分开放阅读框保守序列和PCV2基因保守序列，设计合成了2对特异引物，最终建立了可同时检测PRRSV和PCV2的复合PCR诊断方法。

冯志新等研究设计合成了一套引物和TaqMan探针，特异性扩增PCV2-ORF2基因，通过反应条件的优化，建立了快速定量检测PCV2的实时PCR方法。该方法具有较好的特异性和重复性，对PCV2 DNA检测的下限为1拷贝／uL，敏感性比常规PCR高106倍[16]。

Chae等报道了一种半槽式多重PCR，成功进行PCV1、PCV2和PPV的鉴别诊断，在98个精液样品中发现，有20个阳性的PCV和42个阳性PPV，与半槽式PCR诊断结果相同。当PCV或PPV在人为污染的精液样本中存在时，运用该技术分析发现：PCV和PPVDNA主要存在精

液和一小部分无精子中。实验数据表明，该方法具有较高的敏感性和特异性，可以很好地区别PCV或PPV在猪上的感染。

Kathleen运用实时PCR检测Rep基因(ORF1)在自然感染的猪群和实验室人工感染的猪群的肺、淋巴结等组织，可以检测到2.2×103～2．2×1010／mLPCV2拷贝数。同时，他们检测到在所有被PMWS感染的猪群中都存在Rep基因，即证明了存在PCV2的混合感染的可能性。

3.2 ELISA和ELISA试剂盒

林彦星等应用原核表达的PCV2衣壳(Cap)蛋白作为诊断抗原，初步建立了一种检测PCV2抗体的间接ELISA方法[17]。实验表明该方法具有较高的敏感性和特异性，适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。秦承学等将PCV2 ORF1和ORF2基因分别插入杆状病毒和大肠杆菌表达系统，用亲和层析方法提纯获得重组衣壳(Cap)与复制(Rep)蛋白，用细胞融合技术获得2株Cap和Rep蛋白单克隆抗体，以重组Cap和Rep蛋白作为抗原，通过反应重要条件的优化，建立了间接ELISA方法，有较好的特异性和重复性，可用于PCV2抗体检测和疫苗免疫抗体鉴别诊断[18]。

研究人员研究对3种抗免疫球蛋白G的ELISA试剂盒检测抗PCV2a和PCV2b抗体，同时也检测了抗PCV2和PCV1抗体，55头3周龄的小猪随机分成7组，其中7头为阴性对照，8头接种PCV2a，8头接种PCV2b，8头接种PCV1，其余的24头接种不同厂家的3种疫苗，收集1周的血液样本，分别用3种试剂盒进行检测，反应数值都大于0.94，检测发现PCV2a和b抗体没有根本区别，没有检测出PCV1抗体，但1种试剂盒可鉴别出经疫苗B接种的猪体内的PCV2a或PCV2b抗体[19]。

3.3 竞争性酶联免疫吸附试验(C-ELISA)

Walker以分离的PCV2细胞培养物作为抗原，以PCV2特异性单克隆抗体作为竞争性反应物，C-ELISA敏感性和特异性达到99.58％和97.14％。McNelilly等建立了PCV特异性抗原捕获ELISA，其与定量病毒分离，可以区别PCV的临床和亚临床感染。

3.4 间接免疫荧光试验

间接免疫荧光技术常用于猪圆环病毒感染的血清学普查，其特点是快速、特异、敏感，是目前诊断PCV2常用的血清学方法。在用于抗体检测时，可将PCV2按种于96孔细胞培养板的PK-15细胞上，培养一段时间后，经丙酮固定干燥后即可。此方法不仅可以用于检测抗体，而且可以用已知PCV特异性抗体检测抗原，主要用于PCV的分离鉴定及猪源细胞PCV污染情况的普查，为疾病诊断和净化猪源细胞提供了有效手段。

3.5 免疫金标检测

浙江大学发明公开了一种猪圆环病毒2型(PCV2)抗原或抗体检测试纸条。检测试纸条既可以猪圆环病毒2型抗原也可以检测血清中的PCV抗体，检测试剂条操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

3.6 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的具有明显优势的扩增技术，能够在63℃～65℃等温条件下扩增特异的DNA序列，在30～60min可以得到肉眼可见的结果，该技术在禽流感的快速诊断中已成功运用。据研究数据统计分析表明，此技术的敏感性高于PCR，同时，在检测PCV1，PPV，PRV时无交叉反应，特异性较高，能够完成对PCV2的快速检测和定性分析，为PCV2的诊断提供了一种快速敏感的检测方法。

3.7 基因芯片技术

基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的，工作原理是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片是在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析成千上万的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。基因芯片技术已经成功地应用于禽流感和口蹄疫等重大疾病的快速诊断及分型和定型，但在PCV2混合感染的相关疾病的快速诊断和鉴定上还没见报道。可以预见，在不久的未来可能会出现基因芯片技术在PCV2引起的相关疾病上的应用。

3.8 原位杂交(ISH)技术

ISH具有高度敏感性，在国内外已经建立了多种方法。应用ISH既可以对PCV1和PCV2进行分型，又可以检测PCV与其他病毒的混合感染。刘方娜等根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列，在ORF2内设计l对特异性引物，利用PCR反应扩增出371 bp的核酸片段，回收并纯化PCR产物，用地高辛标记，建立了地高辛标记核酸探针诊断PCV2的方法[20]。该探针与8个PCV2重组菌的核酸抽提物均能发生特异性杂交，而与对照组猪圆环病毒I型(PCVI)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸杂交均为阴性；对PCV2 DNA的最低检测量为lOpg。结论与讨论

PCV2与一系列猪的综合感染相关，这些疾病包括PMWS，PNP，PDNS，PRDC。很显然，这些疾病的发生与发展，至少与PCV2损毁猪的免疫系统有关，比如，PMWS发展是由于免疫系统异常和免疫抑制有关。显微镜观察发现，PCV2在淋巴组织的淋巴细胞、组织细胞和巨细胞广泛存在，导致体液免疫和细胞免疫失败。同时，由于PCV2分离株在毒力和地理分布上相差较大，这就意味着它的病原学意义有相当高的研究价值。

有文献报道，PCV2可以感染牛，接种PCV2完全可以致死8周龄的小鼠，这是否意味感染别的动物还需要进行很多的调查研究。目前，PCV2的研究倾向与动物解剖，然后进行分型和鉴定，这明显不利于动物安全生产、疾病的控制和人类自生安全。PCR技术有存在假阳性的问题，ELISA虽然特异性和敏感性较高，但它所用时间较长，在快速诊断方面显然不足，LAMP技术花费时间较少，敏感性和特异性也较高，但他是一个相对较新的技术，还需要更多的临床验证，基因芯片技术已经成功地应用于禽流感、口蹄疫和人类重大疾病的快速诊断及分型和定型，但在PCV2诊断和鉴定上还没见报道。如何与PCV2相关疾病的混合感染中进行快速的分型和定型鉴定，如何加强传统诊断技术的完善，以及加大对PCV2分子致病特性的研究力度，是科学工作者努力探索的问题；从而建立快速、敏感、准确的分子诊断技术和诊断方法，定期检测和预测即将流行的毒株，不断提高传统技术敏感度和特异性，同时不断推广和完善新方法、新技术，为早期、快速、特异、敏感地鉴别诊断此病毒，为有效地防控PCV2暴发与蔓延具有重大的理论意义和现实意义，控制PCV2对全世界养殖业及公共卫生构成的巨大威胁。

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第四篇：猪圆环病毒病 概述

猪圆环病毒病 概述： 本病由猪圆环病毒(PCV)引起。病原-----PCV

1、分类：1995 年列为圆环病毒科（Circoviridae)。在本科里还有其 他的病毒，如鸡传染性贫 血病毒（CAV）、鹦鹉喙羽病病毒（BFDV）。PCV、BFDV 列为圆环病毒属，CAV 列为环形 病毒属。2.核酸类型：DNA。其单链环状 DNA 染 色质有 1759 个碱基组成。且已克 隆测定了序列。11 个开放阅读框架，有 编码 11 种蛋白质。引起 PMWS 的 PCV 和引起 PK-15 污染的 PCV，同属于圆环病毒属，且高度的同源，但抗原性及 DNA 序列方面有一定的差异。为了区别，日前将 PCV－PK15 称为 PCV-1，而将 PMWS 称为 PCV-2。

3、形态大小： 为无囊膜二十面体，大小约 4～26.5nm。

4、PCV 可在猪源细胞上复制，但 CPE 不明 显。

5、存在：淋巴结，骨髓，血液。流行病学

1、PCV 易引起猪发病，一 般不与 CAV 和 BFDV 发生交叉感染，但用 ELISA 证实人血清有 30%、小鼠血清 12%~69%、牛血清 35%抗体阳性。

2、血清学调查表明：猪的阳性为 20%~80%，且分布极其广，几乎世界各处都有。

3、周龄的猪多发，PRRS 阳性猪群中更易继发本病。6~8 在

4、发病率高，病死率有高有低，但即使不死，亦诱发其它疾病的发生。症状 ①仔猪 断奶后多系统衰弱综合症； ②猪皮炎肾病综合症； ③相关性繁殖障碍综合症； ④相关性肺炎； ⑤相关性肠炎； ⑥相关性神经系统病。体重减轻，渐进性消瘦，虚弱。呼吸困难，过速，偶有咳嗽。皮肤苍白，结膜黄染。下痢、腹泻。中枢神经紊乱。病 变： 全身淋巴结肿大，尤以腹股沟淋巴结为最，肿大达 3~4 倍，切面充血、出血。肺 弥漫性病变，比重增加，坚实成橡皮样，表面呈花斑状。肝花斑状，萎缩。脾肿 大，切面呈肉状。肾被膜有白色病灶，肿大。回肠有花斑状。诊断：

一、临诊 腹股沟淋巴结肿大，脾、肾肿大，肝萎缩，渐进性消瘦，有诊断价值。

二、实验

1、原代肾细胞或 PK-15 可用作培养 PCV-2，但在细胞培养物上还不能判是否有 病毒存在。需要特异抗体用免疫荧光或直接免疫过氧化物酶染色确认。

2、用 PCR 扩 增病毒。

3、待检材料做组织切片，观察有否包涵体。

4、ELISA 测定抗体。防 治

1、预防：圆环病毒-繁殖障碍与呼吸综合症二联苗。首免：10-15 日龄。二免： 30-35 日龄。

2、发病后的处理： 1）在饲料中添加呋喃妥咽或病毒灵或病毒唑，多维。2）注射圆环·蓝毒康或圆环抗毒杀。3）注射猪用干扰素

第五篇：猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白表达综述

PCV2是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，为单股环状负链无囊膜的DNA病毒, 为已知的最小动物病毒之一，约17~ 20nm, 二十面体对称。根据病毒的抗原性和基因组成不同，可分为2种基因型或称血清型, 即PCV1型和PCV2型。PCV1无致病性。PCV2具有致病性，基因组全长1767bp或1768bp，包括11个读码框，其中ORF2编码病毒的主要结构蛋白)核衣壳蛋白(Cap)，其N端包含一个由41个氨基酸残基组成的的核定位信号(Nuclear location signal，NLS)，与PCV2在细胞核内定位有关。Mahe和Liu等分别在sf 9真核细胞及大肠杆菌中进行了PCV2Cap蛋白的表达, 但Cap蛋白的表达量较低。为了提高Cap蛋白的表达量, 本实验成功构建去除NLS的重组质粒, 并对其进行表达、纯化、鉴定。

1材料和方法

1.1pcv-581重组质粒的构建

1.1.1PCR扩增去除NLS基因的pcv-581

1.1.1.1引物的设计与合成: 根据本实验室保存毒株的测序结果, 用Oligo6.0设计删除核定位信号特异引物(由大连宝生物工程公司合成), 并引入限制性内切酶BamHI、HindIII(加下划线表示)。上游引物: ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC;下游引物: GAAAGCTTT TCATTAAGGGTTAAGT;产物长度581bp。

1.1.1.2PCV2核酸的提取: 取接种PCV2病毒的PK-15细胞悬液500uL, 常规方法提取, 最后加20uL灭菌去离子水溶解,-20度保存。

1.1.1.3PCR扩增: PCR的反应体系总体积25uL: 上、下游引物(10uLmol/L)各1.0uL，10×RCR Buffer2.5uL、dNTP3.0uL(2.5mM each)，提取的DNA2.0LL,Taq酶0.25LL(5U/ LL, TaKaRa), 去离

子水补到25LL。反应参数为: 95e , 5min;94e, 45

s;55.9e, 45s;72e, 45s;30个循环;72e , 7min。

取5LLPCR产物进行电泳分析(见图1)。

1.1.1.4PCR扩增产物的酶切、回收: 醇沉淀PCR

扩增产物、酶切、回收。具体操作方法如下: PCR

产物补到100LL, 加入等体积异丙醇, 置-20e 静

止过夜, 13 000r/ min离心15min弃上清, 加入

600LL75%乙醇, 7000r/min离心5min, 倒掉上清,晾干, 加入10LL灭菌去离子水溶解。将醇沉产物

进行BamHI酶切, 体系为20LL: 10@buffer K2LL,BamHI 1LL(15U/ LL , TaKaRa), 醇沉产物10LL,H2O7LL, 37e 酶切1h。将酶切产物继续醇沉淀

(方法步骤同上)后进行HindIII(15U/ LL, TaKaRa)

单酶切, 酶切体系同上, 回收目的片段。

1.2pQE-pcv581重组质粒的构建和鉴定: 将载

体pQE-32(QIAGEN)质粒用BamHI 和HindIII双

酶切, 做100LL 酶切体系: 10@ buffer K10LL,BamHI2LL, HindIII 2LL, pQE-32质粒70LL, H2O

16LL。37e 酶切2h15min, 用胶回收试剂盒回收

(TIANGEN, 操作按照说明书进行), 目的片段和载

体常规方法连接、转化M15、筛选阳性重组质粒

pQE-pcv581。酶切鉴定(见图2)。

1.3重组蛋白的诱导表达及纯化

从含有氨苄抗性的琼脂平板上挑取单个阳性

菌落接种到5mL氨苄抗性(100Lg/ mL)的LB液体 培养基中, 37e 过夜振荡培养、活化, 取过夜活化 的培养物按照的比例接种到5mL含氨苄抗性的液 体LB培养基, 37e 振荡培养, 培养至OD600nm达 0.4-0.6, 然后加入IPTG(TaKaRa)至终浓度为0.2mmol/ L、0.4mmol/ L、0.6mmol/ L、0.8mmol/ L、1.0mmol/L、1.2mmol/L继续培养, 分别在诱导前、诱 导1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h取样, 取1mL菌液离心