副猪嗜血杆菌的现状与研究进展

第一篇：副猪嗜血杆菌的现状与研究进展

副猪嗜血杆菌的现状与研究进展

副猪嗜血杆菌(haemphilus parasuis, HPS)HPS为革兰氏阴性、具多种不同形态的细菌,从单个球杆状到长的、细长的以至丝状菌体,常可见荚膜。该菌生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子),不需要X因子(血红素和其它卟啉类物质)(Mollen等,1990)。其在巧克力培养基上培养24~48 h生长较差,为光滑型、灰白色透明、直径大约0.5 mm菌落。如与金黄色葡萄球菌共同培养时,HPS在葡萄球菌条状菌苔附近呈卫星生长,生长良好,菌落直径可达1~2 mm。HPS在血液琼脂上呈小而透明的不溶血菌落,在加NAD、马血清的M96支原体培养基或加NAD、马血清和酵母浸出物的PPLO培养基上生长良好。生化反应:尿酶试验阴性、氧化酶阴性、接触酶试验阳性,可发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麦芽糖等。

一、现状

HPS引起病称也称猪革拉泽氏病,近年来，随着养猪业的不断发展，猪场规模化、集约化程度的不断提高，猪群高密度饲养越来越多，呼吸道疾病逐渐成为继繁殖障碍性传染病、胃肠道传染病之后危害养猪业的三大症候群之一。特别是近些年来，猪“高热性”呼吸道疾病的全面蔓延和迁延不愈，尤其是以副猪嗜血杆菌引起的以猪多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的传染性疾病给养猪业带来巨大的经济损失。

在我国，2001年5月开始在华东地区大面积流行，造成了严重的经济损失，个别猪场由于本病的发生不能及时控制，出现严重亏损，甚至倒闭。在这次流行过程中，新发病猪群的发病率几乎达到100%，哺乳仔猪死亡率高达100%，保育猪死亡率高达80%以上，育肥猪死亡率不高，但猪群整体健康水平较差。发病较久的猪群，哺乳期间发病率较低，40日龄之前发病率较低，45日龄后的保育猪几乎100%发病，而且死亡率高达85%以上。当时在广东省，据我们对省内部分地区猪场的调查，革拉瑟氏病的危害也比较严重，占断乳猪死亡率的30%以上，严重猪群高达80%～100%。近几年，对广东省的四会市、顺德、开平、新会、江门、佛山、云浮、韶关、乐昌、龙川、广州萝岗、汕尾，江西省的南昌市、东乡、樟树、定南、潘阳地区，湖南省的衡阳，福建南平，上海等地猪场，进行病原菌的分离鉴定与疾病调查。被调查猪场普遍存在副猪嗜血杆菌感染，而且相当严重，剖检保育阶段的病死猪，90%以上都有典型的副猪嗜血杆菌感染所引起的病变。本病是断乳后保育猪死亡的主要原因。在近几年出现的所谓“高热病”发生猪群，均存在着副猪嗜血杆菌的混合感染。

本病的临床症状出现的往往很突然，先在一头猪或几头猪发病，几天后，才大批出现症状。病程分为过急性型或急性型，常常是体重最重的仔猪受感染。临床症状取决于病变发生的部位。发病初期体温增高至40.5℃～42℃，沉郁，食欲不振，最终食欲废绝。外周循环障碍，皮肤发绀。有时见到眼睑和耳部皮下水肿，结膜潮红。呼吸也可能正常，也可能出现呼吸困难。有的病猪表现出痛苦的叫声，由于跛行而行走缓慢或呈犬坐式。一个或几个关节肿大，腕关节和跗关节多发。有很多病例表现出脑膜脑炎症状，肌肉振颤，行动迟缓，后肢供济失调。有的病猪向一侧倾斜，勉强能站立。国外有报道认为，1～2周龄仔猪感染，易出现败血症。

二、研究进展

2．1流行病学

副猪嗜血杆菌感染呈地方性流行。主要通过直接接触传播。多是因从感染性猪群引进带菌猪而带进致病性菌株。各年龄猪均易感染，都可爆发本病。同样，一旦抗原性不同的新的强毒菌株侵入猪群，也可以引起疫病爆发（Oliveira和Pijoan，2002）。在感染性猪群中，母猪是病菌的储主，无论是致病性还是非致病性菌株，仔猪都是在哺乳期被感染的。但是事实上，母猪的带菌率并不高，因此被感染的仔猪也只是一小部分。被感染的小猪可因感染而产生免疫力，但以后也可能成为亚临床带菌猪。未被致病性菌株感染的仔猪，可从母源抗体获得保护。到5~6周龄断奶时，母源抗体水平下降，可因断奶因素的影响而致使亚临床带菌

猪数量增加，那些在哺乳期没有接触过致病性菌株的猪只开始发病。因此，本病的临床症状通常在5~6周龄时即断奶之后出现。

2．2副猪嗜血杆菌的血清型研究进展

副猪嗜血杆菌的血清型复杂多样，按琼脂扩散血清分型方法Kieletein-Rapp-Gabiedson(KRG)，可将副猪嗜血杆菌分为15 个血清型（国际公认的血清分型标准菌株）。在全世界范围内，各国流行的血清型不尽相同，我国分离株主要是血清4、5、12、13型，在日本和澳大利亚广泛流行的血清型为5型，而危害美国猪场的HPS血清型为4型。在鉴定的15个血清型中毒力存在明显的差别，血清型1、5、10、12、13、14型毒力最强，患猪在4内归于死亡或处于濒死状态；血清2、4、15型为中等毒力，患猪通常不死亡但出现多发性浆膜炎；血清3、6、7、8、9、11型感染猪后没有明显的临床症状，这些菌株归类为无毒力菌株。另有20%以上的分离株血清型不可定。这可能是由于一些分离株不能表达足够多的特异性，或者可能还存在另外的一些血清型。

2．3分子生物学研究

以特异性的PCR方法为基础，建立了限制性内切酶多态性(RFLP)分型方法，先克隆了长为1.9kb的tbpA基因，用TaqI、AvaI和RsaI进行酶切分析，对已知5种血清型的副猪嗜血杆菌菌株进行分析，结果表明RFLP敏感性及分型能力均比琼脂扩散方法强，RFLP方法为100%，而琼脂扩散方法仅为65%。此外，学者们还克隆了副猪嗜血杆菌16srRNA基因、外膜蛋白及脂多糖基因，但具体功能尚不清楚。

2．4发病机理

HPS在呼吸道内早期定居部位现在仍有争议，猪鼻内接种病原菌，病原菌通常在鼻腔和气管分离到，极少从肺和血液中分离到，从未在扁桃体中分离出来。副猪嗜血杆菌在感染期间侵入全身所涉及的因素在很大程度上尚不清楚。Vahle(1997)等研究表明，从鼻腔中部分离到的病原菌与急性关节炎有关，也与鼻－气管黏膜的纤毛缺失及细胞急性肿胀有关。根据试验结果，他们假设这些薄膜特性的改变使得HPS侵入血，黏膜损伤可能会增加细菌入侵的机会，但通过免疫组化及电镜检查等手段都不能在纤毛缺失及细胞降解处检测到HPS，所以认为所观察到的细胞损伤可能由HPS的可溶性毒素所致。其他一些呼吸道性疾病如支原体肺炎、猪流感、猪伪狂犬病和圆环病毒Ⅱ型感染及感染猪呼吸道冠状病毒能降低猪肺泡巨噬细胞的吞噬和杀菌能力,HPS的存在可加剧病情的临床表现。以明尼苏达大学CarlosPijoan博士为首的学者们认为,当前副猪嗜血杆菌病的发生在一定程度上是因为HPS在幼猪体内的定居模式所致。他们认为：只有部分仔猪被母猪排出的细菌所定居,但随着断奶日龄增大，仔猪感染细菌的比率就增加，而提早断奶则可以降低感染的机会。当仔猪体内抗副猪嗜血杆菌的母源抗体水平降低时，不再受母源抗体保护的敏感猪易与致病菌携带猪相接触而发生疾病。临床实践表明，保育舍内暴发猪繁殖和呼吸综合征时，HPS的存在可加剧病情的临床表现，副猪嗜血杆菌会导致死亡率的升高，但其作用机制尚未完全弄清。HPS的感染导致肺泡巨噬细胞损伤，也可引起鼻腔黏膜炎症，导致非特异性呼吸道防卫机制缺陷，使猪发生继发性感染。

2．5副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的研究

副猪嗜血杆菌病灭活疫苗基础菌种的研究 按照《中国兽用生物制品质量标准》要求建立用于副猪嗜血杆菌病灭活疫苗制备与检验用菌株的基础种子，对基础菌种的形态、培养特性、生化特征、血清型、毒力、免疫原性、毒力稳定性和免疫原性稳定性等进行研究。结果表明基础菌种在方面均符合副猪嗜血杆菌的特征，MD0322株为血清4型，SH0165株为血清5型，基础菌种纯粹检验无杂菌生长，两株菌种连代25代以后的毒力和免疫原性均保持稳定不变，在各方面完全符合基础菌种的要求。

副猪嗜血杆菌病灭活疫苗安全性试验 在实验室试制五批副猪嗜血杆菌病灭活疫苗，批

号依次为0301、0302、0303、0304、0305。通过对最小使用日龄靶动物接种、对靶动物各种接种途径一次单剂量接种，对靶动物单剂量重复接种，对靶动物一次超剂量接种以及对怀孕动物(妊娠母猪)接种后观察其精神状态，体温和食欲等指标对疫苗的安全性进行了评价，结果表明该疫苗用于猪的免疫是安全的，无副作用。

四种副猪嗜血杆菌病灭活疫苗对仔猪免疫效力的比较 用副猪嗜血杆菌MD0322株和0165株两株菌种分别制备副猪嗜血杆菌病单价灭活疫苗。将两种单价灭活疫苗与本室试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(双价)，以及国外生产的两种副猪嗜血杆菌病灭活疫苗相比较，每种灭活疫苗分别免疫28～35日龄仔猪10头，21日后二免，同时设立10头未免疫对照。二免后14日，分别用血清4型和5型标准菌株经腹腔内攻毒，结果两种单价疫苗的保护率均为4／5，本室试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗总的保护率为9／10，两种进口疫苗的总保护率分别为8／10(疫苗含血清4型和5型菌)和5／10(疫苗含血清2型和6型菌)。

副猪嗜血杆菌病灭活疫苗效力试验 通过动物试验对试制的五批副猪嗜血杆菌病灭活疫苗进行效力检验。每批选择28～35日龄断奶仔猪20头，每批疫苗免疫10头猪，另外10头作为对照。在二免后14日分别用MD0322株和SH0165株通过腹腔内攻毒，结果免疫猪保护率均在4/5以上，对照组发病率均在3/5以上，表明试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗具有良好的免疫效果。

2.6综合防治的新进展

饲养管理：加强和改善饲养管理可降低副猪嗜血杆菌的发病率。彻底清理猪舍卫生，用消毒药喷雾消毒，每天1次，连续喷雾消毒5 d；用具用2％氢氧化钠溶液洗刷，然后再用清水冲洗。对全群猪用多维饮水6 d，以增强机体抵抗力，减少应激反应。同时给予病猪青菜、萝卜、野菜等青绿多汁饲料，为避免相互传染，将病猪和未表现症状的猪全部分开，隔离饲养。7日龄的仔猪中能检测到副猪嗜血杆菌,早期断奶不能完全控制副猪嗜血杆菌的感染,最关键的措施是减少猪群转运和应激反应,如合理的饲养密度,防止产房和保育室的贼风,加强保温和通风,防止饲料霉菌毒素的感染;隔离引进种猪,种猪入群和小猪合群前用疫苗免疫或用药物净浙江畜牧兽医。2005年第5期化体内细菌性病原体;及时隔离出现临床症状的病猪,进行抗菌素治疗等。

免疫接种：商品苗和自家苗可以防制副猪嗜血杆菌传染病。然而,多种血清型和一定量非分型菌株的存在,影响了有效交叉保护疫苗的发展。Miniats等(1991)用免疫印迹技术分析免疫猪的体液反应与抗原、保护作用之间的关系,结果发现只有针对外膜蛋白(OMP)的抗体与攻毒试验的保护作用有关,完全获得免疫保护的动物无针对脂多糖(LPS)和荚膜多聚糖的抗体。

药物防治：药敏试验显示大多数副猪嗜血杆菌对氟苯尼考、氨苄青霉素、氟喹诺酮类、头孢菌素、氟甲砜霉素及增效磺胺类药物敏感,对四环素、红霉素、氨基糖甙类和林可霉素有抵抗力

三、结束语

目前，副猪嗜血杆菌病在我国猪群普遍存在，已经是引起猪场保育猪死亡的主要细菌性疾病，控制本病的方法是用疫苗免疫接种和药物保健预防，随着副猪嗜血杆菌的诊断，流行病学等方面已取得了重大成就，研究者可以快速，准确的掌握特定猪场中病原的流行病学等相关信息，今后，在确定毒力因子、阐述其致病机理以及获得保护性免疫的机制、以及研制广谱的疫苗等方面都还需要研究工作者进行深入研究。

第二篇：如何正确认识副猪嗜血杆菌

如何正确认识副猪嗜血杆菌

贾诚信

近两个月来，邯郸地区陆续发生了以呼吸道为主要症状的烈性传染病，给当地养殖户带来了不可估计的经济损失。为了进一步控制疫情，公司技术团队亲自下基层为广大养殖户开展技术咨询活动，讲解当前容易发生的几种疾病和控制方案，并提供大量的技术通讯资料，为养殖户进一步控制当前疫情起到了积极的作用。

在基层防控疫情的过程中，我们发现了此次疫情有个共同的临床症状，据我们技术专家团队的一致认为，这次疫情主要引起死亡的疾病是副猪嗜血杆菌，应引起广大养殖企业（户）的广泛关注。为此，我们把副猪嗜血杆菌的一些基本常识与大家交流一下。

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（HPS）引起的一种严重的接触性传染病和全身性疾病。临床上以发烧、咳嗽、严重呼吸困难、发绀、疼痛、被毛粗乱、进行性消瘦，部分猪出现关节肿胀、跛行和中枢神经症状，以及极高的死亡率为特征。在猪场流行的“猪高热综合症” 中，副猪嗜血杆菌病是引起猪大量死亡的主要原因之一，这一结论在某些核心杂志上已经多次报告。

副猪嗜血杆菌为嗜血杆菌属的副猪嗜血杆菌。在显微镜下多呈现不同的形态，有短小杆菌，也有球形、棒状、丝状的，无鞭毛、不形成芽孢、多数无荚膜，但新分离出来的强毒株带有荚膜。该菌具有明显的地方性特征，按血清分型方法，可将副猪嗜血杆菌分为15 种血清型，各血清型之间的致病力存在极大的差异，其中血清1、5、10、12、13、14 型毒力最强，患猪归于死亡或处于濒死状态；血清2、4、8、15 型为中等毒力，患猪死亡率低，但出现败血症状，生长迟滞；血清3、6、7、9、11 型感染猪后没有明显临床症状。目前，从猪场分离出来的多是血清4型和5型。

副猪嗜血杆菌病的主要传播途径是呼吸道，通过空气、猪与猪之间的接触或通过污染排泄物进行传播。在引进种猪时，副猪嗜血杆菌感染是个严重的问题。未免疫的猪场容易受到侵袭，首次感染该菌的猪，症状比较严重。在猪繁殖与呼吸综合症（俗称蓝耳病，PRRS）、圆环病毒病（PCV）等免疫抑制性疾病存在的猪场，本病更容易趁机暴发，发病快，死亡率大幅度上升，损失惨重。如果再与肺炎支原体（MHP）、胸膜肺炎放线杆菌（APP）、多杀性巴氏杆菌（Pm）、猪链球菌（SS）等混合感染，便会发生呼吸道病综合症（PRDC），给猪场造成毁灭性的打击。研究表明，猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒等能降低猪肺泡巨噬细胞的吞噬和杀菌能力，从而增加了HPS 的感染机率。

副猪嗜血杆菌病只感染猪，可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5-8周龄的猪。近年来，该病的发病日龄越来越早，发病率一般在10％-15％，严重时死亡率可达50％。患猪和带菌猪是本病的主要传染源，细菌寄生在鼻腔等上呼吸道内，主要通过空气、直接接触来感染其他猪，通过其他的传播途径如消化道也可感染。副猪嗜血杆菌作为猪上呼吸道的常在菌，是一种条件性致病菌。试验证明，支气管败血波氏杆菌是造成副猪嗜血杆菌在上呼吸道定植的诱因，其机理与猪萎缩性鼻炎中多杀性巴氏杆菌的作用相似。副猪嗜血杆菌可引起化脓性鼻炎，病灶处纤毛丢失以及鼻粘膜和支气管粘膜的细胞急性膨胀，粘膜损伤还会增加细菌和病毒入侵机会；也可损伤纤毛上皮，使呼吸道粘膜表面纤毛的活动显著降低。近年来该病的发病率不断上升与很多因素有关：（1）猪群发生猪瘟、蓝耳病、圆环病毒等感染后，猪群的抵抗力下降，副猪嗜血杆菌就会乘虚而入，引起发病；（2）在猪发生气喘病、猪流感等一些呼吸道疾病时，副猪嗜血杆菌的存在可加剧它们的病情，使病情复杂化；（3）随着规模化养殖的发展，饲养管理技术调整不当，猪群密度大、过分拥挤、环境卫生差、猪舍空气混浊、氨气过浓等，导致该病多发；（4）断奶、转群、长途运输等应激因素也可引起该病发生；（5）此外，饲料中霉菌毒素的存在，导致猪群出现免疫抑制，机体抵抗力弱，也容易引起发病。

繁殖母猪一般不表现明显症状，2-8 周龄仔猪感染发病可呈典型症状，同其他呼吸道疾病类似，主要表现为急性型和慢性型两种症状，但一般猪场以慢性型为主。急性型病猪体温高达40-41℃，精神沉郁，食欲减退，气喘，咳嗽，反应迟缓，呼吸困难，鼻孔有黏液性及浆液性分泌物，关节肿胀、跛行、步态僵硬，同时出现身体颤抖，共济失调，可视黏膜发绀，3天左右死亡。急性感染病例存活后会留下后遗症，即母猪流产、公猪跛行、仔猪和育肥猪遗留呼吸道症状和神经症状。慢性型通常由急性型转化而来，病猪 消瘦虚弱，被毛粗乱无光，皮肤发白，咳嗽，呈腹式呼吸，关节肿大，严重时皮肤发红，不能站立，耳朵发绀，少数病例突然死亡。特征性病理变化为胸腔、腹腔浆膜及肺部发炎，胸腔内有大量的淡红色液体及纤维素性渗出物凝块。肺表面覆盖有大量的纤维素性渗出物并与胸壁粘连，多数为间质性肺炎，部分有对称性肉变。单个或多个浆膜面损伤，有浆液性和化脓性纤维蛋白渗出，包括心包膜、腹膜、胸膜、脑膜和关节膜(主要是腕关节和跗关节)等，通常以不同的组合存在，较少单独发生。

剖检可见体表淋巴结，如颌下淋巴结、肩前淋巴结和腹股沟淋巴结等肿大，呈灰白色；内脏淋巴结，如支气管淋巴结、肝门淋巴结、肠系膜淋巴结肿大，出血，呈暗红色，切面呈大理石样花纹。急性病猪胸腔内积有大量淡黄色液体，含少量呈网状的纤维蛋白；心包液增多，心包腔内有少量纤维蛋白连于心包膜与心外膜上。慢性病猪的胸膜腔内常蓄积有大量污黄色、腐尸味的液体，肋胸膜和肺胸膜附着有大量纤维蛋白渗出物，使肺脏与肋胸膜发生粘连，肺脏有大片红色肝变区；心包腔内蓄积有大量灰白色液体，心包膜的内、外表面和心外膜表面附着有大量绒毛状纤维蛋白渗出物，使心包膜与肺脏、心脏发生严重粘连。打开心包膜，心脏表面呈绒毛状外观，病理学上将其称为“绒毛心”。通常在肺的横隔膜叶较易出现病灶，全身淋巴结肿大，暗红色，切面呈大理石花纹。急性病猪的腹腔内腹水显著增多，腹水内含有少量纤维蛋白渗出物，肝脏和脾脏轻度肿大，表面散在附着有纤维蛋白渗出物，胃、小肠和大肠无肉眼可见变化。慢性病猪腹腔内有大量混浊的黄褐色渗出液，腹膜出血、肿胀；肝脏和脾脏肿大，质地较硬，色泽较暗，表面附着有大量纤维蛋白渗出物；肝脏各叶之间，肝脏与腹膜之间发生粘连；小肠和大肠肠壁肿胀、变厚、出血，表面附着有大量纤维蛋白渗出物，相邻肠管之间、肠管与腹膜之间粘连在一起。

防控方案：

实行”全进全出”的饲养制度，做到严格分群饲养 对规模化猪场来讲，分娩舍一定要采用小单元的饲养模式，实行”全进全出”的饲喂体系，严格禁止不同批次的猪只混养，舍内保持合理的饲养密度，确保适宜的温度和舍内优良的空气质量，对栏舍单元进出猪只前后要彻底的冲洗、消毒，并空置净化一周后再投入使用，以减少猪群的发病几率。

消除减少各类应激因素 由于HPS为条件性致病性疾病，故应减少、消除各类应激因素，千方百计地把断奶、转群换料、免疫注射等应激因素减少到最小范围，在保育阶段尽量减少注射疫苗，特别是口蹄疫苗，如果母源抗体处于高免疫状态下，可安排到60～70日龄免疫。

关注霉菌毒素污染的问题 由于霉菌毒素对猪群的免疫系统造成损害，导致猪体的抵抗力下降，鉴于目前饲料普遍存在霉菌毒素的实际情况，建议饲料中添加优质的脱霉制剂，以减轻霉菌毒素的危害。

药物控制 经常发生仔猪多发性浆膜炎和关节炎的猪场应提前使用有效药物进行预防。猪副嗜血杆菌，可能是当前猪场所有致病菌中耐药性产生速度最快的一种细菌。所以一方面推荐使用药物组合，使药物产生协同作用而减少组合中各组分的用药量而不影响疗效，这样可以阻止或延缓耐药性的产生；另一方面推荐多种药物组合轮换使用，同样可以阻止或延缓耐药性的产生。

（1）母猪

混饲：在母猪饲养的任何阶段饲料中长期添加“利霉净（特殊工艺脱霉剂，高效吸毒但不吸收营养物质、高效脱毒、高效解毒、高效排毒）”1-2 kg / 吨 + 妊娠84天以后饲料中添加“围产动力（纯中药产品，增强母猪分娩期动力，防止母猪便秘和具有较好的保胎、安胎作用，连用7-10天）”4 kg / 吨。

产前、产后保健：“头孢经典（5%头孢噻呋钠、18%牛初乳免疫球蛋白）”— 母猪产前48小时一次量肌肉注射本品10-15ml，可阻断母猪将病原体垂直传播给仔猪、防止母猪产前不食和预防母猪产后感染；母猪产后4-6小时内一次量肌肉注射本品15-20ml，可预防母猪产后三联症和防止母猪产后不食。

驱虫：“清净100（具有安全、高效的作用，可用于孕畜；科学配方，疗效神奇，中西医结合；高效驱内、外寄生虫，显著提高饲料报酬）”一次量，0.3ml /kg。

（2）哺乳仔猪

三针保健

“头孢经典（5%头孢噻呋钠、18%牛初乳免疫球蛋白）”分别于1日龄0.5ml/头、7日龄0.5ml/头、21日龄1.0ml/头，用于预防仔猪细菌性腹泻和呼吸道疾病。

（3）保育仔猪

“保育安（20%强力霉素、20%氟苯尼考、5%阿奇霉素、20%金丝桃素、18%松果菊，中西医配方，标本兼治，疗效可靠，是综合防控保育仔猪断奶后多系统衰竭综合征的首选药物，可有效防止病毒引起的各 种继发性感染）”混饲，用本品500g拌料1000kg，连用7-10天，用于预防；治疗按上述剂量加倍。

“嗜血动车（45%阿莫西林、20%头孢噻呋、15%头孢拉啶、8%抗菌增效剂，是预防/治疗当前副猪嗜血杆菌病的首选药物，效果明显，深受广大养殖户的青睐）”混饲，用本品500g拌料1000kg，连用7-10天，用于预防；治疗按上述剂量加倍。本品也可以用于混饮。

（4）具体处理措施如下：

饮水：嗜血动车 + VC粉 + 葡萄糖

拌料：保育安：按1000g拌料1000kg治疗，连用7-10天，效果显著。也可用嗜血动车拌料，效果同样良好。

对于严重病例，如不食，可肌肉注射“通用”+ 复合维生素B/VB1，效果显著。

如不食，病猪跛行，可肌肉注射“通用”+“头孢经典”，效果明显。

如不食，有呼吸道症状，可注射“通用”+“头孢经典”或“通用”+“多普达”，分点肌注。

如不食，有呼吸道症状，并伴有身体发红，可注射“通用”+“维生素C注射液”+“头

孢经典”/“多普达”，分点肌注，可起到良好的治疗效果。

四、对于恢复期的病猪，可在饲料中添加“全效”，能显著提高采食量，帮助病猪尽快恢复体质。

专家提醒：

1、由于本病菌极易产生耐药性，在治疗本病时，应该轮换使用药物，可用“保育安”或“嗜血动车”轮换应用，且“嗜血动车”也可以用于饮水。

2、对于不采食的病猪可进行肌肉注射或饮水用药，以免耽误病猪最佳治疗时机。

3、本病的治疗以综合防控为主，管理为佳，提高管理水平，对该病的治疗可以起到积极的效果。

第三篇：猪场副猪嗜血杆菌病高发原因是什么

猪场副猪嗜血杆菌病高发原因是什么？

副猪嗜血杆菌病在猪场的发生越来越普遍，该病之所以高发的原因是什么？广东省农业科学院兽医研究所 王贵平研究员

1.副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道（鼻腔、扁桃体和气管前段等）的常在菌，此病过去一直被认为是仔猪的一种散发性，应激性疾病。

各种应激因素可诱发和促进本病的发生与流行，如气温突变、空气污染严重、通风不良、寒冷潮湿，不同日龄的猪只混群饲养，密度过大，管理不当，饲料质量差，长途运输等，可导致本病的发生。

2.就本人对副猪嗜血杆菌的分离来看，该病更多的被看作继发性病原菌。有研究结果表明，猪群中存在蓝耳病毒感染或一些免疫抑制性病毒病存在，本病更容易继发。

3.血清型和毒力，以及毒力因子这一方面到现在都不是很清楚，血清分布又有地域性，疫苗免疫在不同的血清型之间所引起的交叉保护率很低等等，由于没有很好的预防应对措施，所以该病爆发越来越严重。

广东大华农动物保健品股份有限公司 罗满林

多种免疫抑制病的存在，尤其是圆环病毒，猪繁殖和呼吸道综合征等存在，猪群集约化饲养，养殖环境恶化。

山东菏泽宏兴远种猪繁育有限公司 牛月波

因为该病菌是一种条件性致病菌，主要寄生在猪上呼吸道黏膜，临床上常以继发感染形式出现，由于近年来很多猪场流行免疫抑制性疾病（如蓝耳病、圆环病毒Ⅱ型、猪瘟等），再加上肺炎支原体、流感病毒、呼吸道冠状病毒感染严重，副猪嗜血杆菌乘虚而入，给养猪业带来巨大损失，如去年南方多个省份发生高热病，副猪嗜血杆菌就起了推波助澜的作用。

保定冀中药业有限公司技术部总监 蔡少阁

主要是猪群免疫力低下所造成的。

导致猪群免疫力低下的原因有：免疫抑制病的存在，如蓝耳病、圆环病毒病等；饲料中霉菌毒素的普遍存在；某些促生长添加剂的滥用，如高铜、高胂和高锌等；某些抗生素的长期添加，如氨基苷类抗生素和氯霉素族抗生素等；长期的应激等。四川恒通动物制药有限公司技术部 张瑞杰

1.在实际中，副猪嗜血杆菌已经成为猪体内一种常宿菌，只要猪体抵抗力降低了就有可能爆发副猪嗜血杆菌，只要猪感染某种疾病就有可能继发副猪嗜血杆菌病。

2.另外副猪嗜血杆菌血清型（现有15个血清型）较多，还是有大量的分离株不能被分型，实验室检测存在很多困难，另外不同的血清型对药物的敏感度不同，并且耐药性极强，更为实验室诊断及其药敏试验添加了新的挑战。

3.发病猪场常年带菌，治愈或耐过猪常年带菌，带菌猪和慢性感染猪为本病的传染源。

福建威耳动科药业有限公司 曾佑全

高发的原因：

（1）副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道中的一种共栖菌，常可在鼻腔、扁桃体和气管前段分离到，而不见任何临床症状。

（2）当环境发生变化时或引起免疫抑制的因素（如转群、断奶、混群、饲料的突然改变或通风不良、免疫抑制性疾病）存在时，会导致该病发生。

（3）最近几年整个猪养殖业中呼吸道疾病的复杂化，病毒性疾病的不断复发是导致副猪嗜血杆菌病不断高法的原因之一。

第四篇：猪流感的最新研究进展

猪流感及其研究新进展

李海燕（预防兽医学博士

副研究员）

关键词：猪流感

研究

进展

猪流感（Swine Influenza, SI）是由正粘病毒科猪流感病毒（SIV）引起的一种急性、高度接触传染性的猪呼吸道疾病，临床以突发、咳嗽、呼吸困难、发热、衰竭、迅速康复或死亡为特征。该病呈地方性流行，世界性分布，可发生于各年龄和各品种猪，发病率高达100%。SI是主要的猪免疫抑制病之一，在规模化养猪场中普遍存在，难以根除。SI能直接引起患猪的死亡，并使患猪生产性能下降，肉料比降低，直接影响猪群健康状态和质量，对养猪业危害很大；更值得重视的是，SIV对呼吸道上皮细胞具有高度特异亲嗜性，SIV的感染，致使猪体与外界的天然屏障被破坏，导致胸膜肺炎放线杆菌、嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪2型链球菌、猪呼吸道冠状病毒、猪呼吸-繁殖障碍综合征病毒等的继发或混合感染（Van Reeth et al，2000；Thacker et al，2001），使疫情变为复杂，病情加重，造成饲料、人工的巨大浪费及药物的无谓消耗，死亡率增高，由此引起的经济损失更无法估量。

猪流感和人流感、禽流感一样，是一种最常见的反复发作的病毒性传染病，广泛流行于猪群中的主要有古典型猪H1N1、类禽型H1N1和类人型H3N2病毒引起的SI。H1N1亚型引起的猪流感已有近百年的历史，1918年美国首次报道，当时，人群中正流行20世纪最具灾难性的大流感，全球约20亿人染病，2100万人死亡，而猪群所表现的临床症状和病理变化与当时人群中流行的流感有许多相似之处，所以倍受人们关注。古典型H1N1SIV以地方流行性存在于美国和欧洲，并于20世纪70年代传到了中国台湾、香港和日本等地，在亚洲大范围扩展开来；1979年，禽源H1N1SIV开始了其欧洲之旅，在欧洲猪群中广为传播；之后逐渐蔓延到亚洲，中国也未能幸免。H3N2亚型引起的猪流感是继1968年“香港流感”流行之后，1969年在台湾首次报道，1970年在香港的猪群中也分到了H3N2 SIV。大量的血清学调查结果表明，68年香港流感H3N2毒株及其变异株迅速传到了欧、美的猪群中，并且在世界范围包括中国在内的猪群中存在了数年之久。除H1N1和H3N2亚型引起的猪流感外，由H1N2、H1N7、H3N6、H4N6等其它亚型病毒引起的猪流感也时有发生。

世人对猪流感的高度重视，除了其显而易见的兽医传染病学意义，更在于其深远的公共卫生意义以及在流感病毒流行病学、种间传播中不可替代的特殊地位和作用。SIV具有最大限度感染人的能力，直接影响到畜产品安全，对人类健康有潜在的威胁，在人体器官移植研究中，作为人体器官移植供体的猪必须排除SI的感染。回顾人类流感史，20世纪人流感的3次大流行都和SI密切相关，而1976年1月，美国新泽西洲佛迪狄克斯5名新兵因感染猪源H1N1病毒、1人死于肺炎的事件，则是SI人畜共患病史上的里程碑；此后，至少有12人因感染SIV而死亡。大量研究表明，猪在“禽-猪-人”的种间传播链中，充当禽、人、猪流感病毒重组和复制的“混合器”，扮演着流感病毒中间宿主及多重宿主的作用，SI在人和动物流感的病原学、生态学及流行病学中占有举足轻重的地位。

SI是一种世界性分布的群发性传染病，对SI的研究已有80多年的历史。近年，SI出现了新的疫情，特别是在中国，不仅H1和H3亚型SI有抬头和蔓延的趋势，而且在某些省份和地区猪群中出现了H5和H9亚型流感病毒的感染，但我国对SI的研究相对滞后。20世纪末，李海燕等率先在全国大范围进行SI疫病的血清学和病毒学调查研究，对SI的诊断、疫苗、分子生物学及分子流行病学等方面进行了全面研究，进展喜人。本文着重将中国SI研究进展情况简要概述如下。1.猪流感的世界流行近况 SI一直是猪群中难以根除的呼吸道疾病之一。近年，猪群中除了常见的经典型H1N1、类禽型H1N1和类人型H3N2流感病毒引起的SI外，由重组病毒H1N2、H1N7、H3N6引起的SI也时有报道。1998年，美国卡罗莱纳洲、明尼苏达洲、爱荷华洲和德克萨斯洲接种了H1N1SI疫苗的四个猪场暴发了严重的SI，研究表明，其病原为H3N2人-猪双重组病毒株和人-猪-禽三重组病毒株，母猪发病严重，有3%-4%的母猪出现流产，产仔率降低5%-10%，断奶前仔猪死亡率高达4%-5%；23个洲的4382份血清样品中抗三重组病毒株抗体阳性率为20.5%，抗经典H1N1SIV抗体阳性率为28.3%；到1999年，从俄克拉荷马洲、伊利诺斯洲、科罗拉多洲、威斯康星洲及北卡罗莱纳洲又分离出三重组H3N2 SIV，血清学调查结果表明，该病毒引起的SI几乎遍及整个美国，由此说明，该病毒对猪有很好的适应性并很快在猪群中传播开。1999年，普遍流行于水鸟中的H4N6 禽流感病毒（AIV），首次从北美中东部安大略湖自然感染的猪体中分离到，1999年香港报道从猪群中分离到4株H9N2亚型流感病毒。

2000至2003 年间，我们从中国东北、西北、华中、华东、华南及西南地区20个省、市及自治区猪群中分离到116株不同亚型SIV，其中，45株为H3N2，25株为H1N1，2株为H1N2，8株为H9N2，2株为H5N1。值得人们关注的是，H5N1亚型流感病毒已传入我国猪群中，李海燕等从2001年东部沿海暴发SI的某猪群的病毒分离物中鉴定了1株病毒为H5N1亚型，该猪群同时伴有H1N1和H3N2亚型SI的协同发生和流行。当时该猪群表现出严重的呼吸道症状、高热、咳嗽、打喷嚏，怀孕母猪流产率高达10％以上，母猪、仔猪、育肥猪相继发生，病死率在5％以上，紧急免疫自家疫苗后有所缓解，但病情易反复。2003年4月，从该地区进行的SI血清学和病原学调查结果表明，该地区猪群中存在抗H5N1亚型流感病毒抗体，阳性率为9.5%；其抗体水平相差较大，该猪群曾在1.5年前注射自家苗，说明并非是疫苗免疫产生的抗体。另外，从该猪群采集的鼻棉拭子中再次分离到了1株H5N1亚型流感病毒。2.中国猪流感研究概况 2.1 SI的诊断及诊断技术

猪流感的诊断，可根据流行病学、临床症状和病理变化作出初步诊断。本病的特点为各种年龄、性别和品种猪都可感染，大多在深秋、早春和气候骤变时发生流行；常在几天内全群感染，病程短，发病率高而死亡率低，临床可见支气管肺炎症状和病变；同期若有人流感的流行则更有参考价值。猪流感的确诊，必须通过病原学诊断（病毒分离鉴定）和血清学诊断（特异性抗原或抗体检测）。

已建立的特异性抗原或抗体的检测方法有血凝抑制试验（HI）、琼脂扩散试验（AGP）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）等。同时，应注意与猪喘气病、猪传染性萎缩性鼻炎、猪传染性胸膜肺炎、猪繁殖-呼吸障碍综合征等其它病的鉴别诊断。2.1.1血清学诊断

快捷有效的诊断方法是疫病防制的关键，血清学诊断技术是SI定性诊断、常规亚型鉴定最实用、确实的方法。哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室从国外引进猪流感病毒（H1、H3亚型）标准毒株，建立了既可检测抗原亦可检测抗体的SI琼脂免疫扩散（AGP）诊断方法，同时建立了红细胞凝集（HA）试验、红细胞凝集抑制（HI）试验、神经氨酸酶抑制（NI）试验等常规血清学诊断及亚型鉴定方法，为全面开展我国SI疫情的调查研究打下基础。在此基础上，以全病毒抗原和重组核蛋白抗原为基础，开展了SI间接ELISA、抗原捕捉ELISA和PCR-ELISA诊断技术的研究，以满足生产实践及科学研究等对SI诊断的不同需求。2.1.2 病原学诊断 由于SI的临床症状和剖检变化差别较大且随其并发或继发感染情况、感染病毒株致病力高低、病程长短、应激及管理情况不同表现也不尽相同，而且无一为特征性症状和剖检变化，所以SI的确诊最确实的应依据病毒的分离鉴定。哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室在多年禽流感研究的工作实践基础上，建立了SIV的分离鉴定技术体系，制备了SIV血凝素（H1、H3、H9亚型）和神经氨酸酶（N1、N2亚型）的分型试剂，从我国东北、西北、华中、华东、华南及西南地区收集、分离、鉴定了116株SIV，建立了SIV中国分离株种毒库。值得一提的是，在病毒的分离鉴定工作中，对初步鉴定为SIV的分离物必须进行纯化后方可进行进一步的亚型鉴定，流感病毒可用鸡胚进行有限稀释克隆进行纯化。

2.1.3分子诊断

SI最确实、最经典的诊断方法是病毒的分离鉴定及其生物学特性测定，耗时费力并要求较高的实验条件，不能满足急性传染病紧急疫情防制工作的需要，为解决SI防制实践中疫病的直接早期快速诊断及鉴别诊断的技术难题，哈兽研开展了猪流感分子诊断及分子鉴别诊断技术的研究。在H1和H3亚型HA基因克隆和序列分析研究的基础上，建立了直接从猪鼻棉拭子或病料样品中检测H1和H3亚型SIV的多重套式RT-PCR诊断法，无需进行病毒分离鉴定（常需时10多天）即可达到监测或鉴别诊断H1和H3亚型SIV感染的目的。以基因工程表达抗原和单抗为基础的SI亚型特异性分子诊断研究已获突破性进展，已获得表达有H1和H3亚型特异性基因（HA、NA）的真核分泌型重组表达载体或/和重组病毒，并实现了在昆虫细胞中的高效表达。2.2 血清学调查及毒株监测

哈兽研SI研究组率先在全国范围内开展SI的血清学和病原学调查研究，2000～2003年，对黑龙江、吉林、辽宁、山东、内蒙、河南、河北、江苏、安徽、浙江、湖北、福建、广东、广西、海南、成都、重庆、上海等19个省、市、自治区1985份猪鼻棉拭子样品和死亡猪肺、气管样品以及4214份血清样品进行研究，基本掌握了我国不同地区SI的疫情、流行和分布情况。从SI的血清学研究发现，我国东北、华北、华中、华南、西南、西北等地区的猪群均不同程度地受到SIV的感染。总体上看，我国猪群中H1N1和H3N2亚型流感相当普遍，感染猪场波及我国东北、西北、华中、华东、华南及西南地区，感染阳性率最高可达100％；呈全国性分布，并经常协同发生和流行；从2000到2003年，猪群中的抗H1流感病毒抗体呈逐年递增的趋势，阳性率分别为3.4%、9.5%、10.5%和12.0%，说明H1亚型 SIV自20世纪70年代传入中国台湾、香港猪群后，近几年在中国大陆猪群呈现蔓延趋势。抗H3亚型流感病毒抗体从2000至2002年呈逐年递增，阳性率分别为19.4%、25.1%和68.4%，但2003年有所下降，为24.0%，采集血清的猪场在1年内都未注射SI疫苗或自家苗。我们知道，H3N2亚型SIV是继1968年“香港流感”流行之后，1969年在台湾猪群中首次分离到的，此后便长期存在于中国各地的猪群中；由于猪群中抗H3亚型流感病毒抗体的普遍存在，使H3亚型SI的流行和传播趋向于自限性，抗体检测结果也体现了这种趋势。

2002年，东北、华北、华南及西南的猪群中抗禽源H9N2亚型流感病毒抗体的阳性率分别为5.6%、4.5%、6.8%及1.9%，但2003年采集的猪血清中均未出现。2003年采集的血清样品中出现抗禽源H5N1亚型流感病毒抗体，华南、华东地区猪血清抗体阳性率分别为3.9%和9.5%。从研究结果看，H5和H9亚型SI的出现和流行与我国同亚型禽流感（AI）的流行呈现一定的平行发展关系。20世纪末21世纪初，H9N2亚型AI在我国广泛流行，曾一度给我国养禽业造成巨大经济损失，近年由于疫苗的使用和禽群中抵抗力的出现，H9亚型AI逐渐趋于稳定。而且，H5N1亚型AIV引起的'97香港“禽流感事件”曾导致人的感染发病和死亡。H5亚型AI在我国开始扩散蔓延，其严重程度已不容忽视。我国南部沿 海地区由于特有的生态条件和生活习惯使流感病毒得以在人、猪和禽（鸡、鸭等）之间交叉循环感染，给病毒提供了特有而复杂的演化环境和孵育温床。猪作为禽、猪、人流感病毒基因重组的混合器，任何新亚型的A型流感病毒从该地区猪群中分离到都不足为奇。在此背景下，从我国猪群中检测到抗H5亚型流感病毒抗体并分离到H5N1亚型SIV，尽管可以理解但却足以使世人震惊和关注，同时也给我们敲响了警钟。我们知道，20世纪每次人流感的大流行都和SI密切相关。引起1918年“西班牙流感”的H1N1毒株的HA基因是SIV和人流感病毒的基因内重组，该病毒在1918年以前已在猪等哺乳动物体内存在多年并获得感染人的能力，由猪传染给人，从而引起这次瘟疫性流感大流行；引起1957年“亚洲流感”和1968年“香港流感”的H2N2和H3N2毒株也都经过猪体的基因重配和适应过程。因此，对SI的监测作为预测和防止流感大暴发的最重要手段在欧美国家早已引起关注并达成共识。那么，这些从中国南部沿海地区猪群中分离到的H5N1流感病毒和'97香港“禽流感事件”中H5N1流感病毒的遗传演化关系如何？是否有进一步的进化关系？这些演化能否导致病毒致病力和宿主范围的改变以及其潜在的公共卫生意义如何？这些都将是引起世界关注的重要课题。2.3 SIV分离株的抗原特性

哈兽研农业部动物流感重点开放实验室SI研究课题组用有限稀释克隆法对获得的SIV分离株进行纯化并对其生物学特性及抗原特性进行研究，所有SIV分离株对鸡都不表现为高致病性，经鸡胚分离传代后SIV分离株均能凝集0.7% 人“O”型血、绵羊、兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠及鸡的红细胞，大部分H3亚型SIV分离株表现为亲和相，为类TKUK63毒株，表现出一定的地域类群；部分分离株经鸡胚传代后，出现了相别的变异[9]。这种相别和相变在流感流行病学、流感监测和诊断中均有重要意义。2.4 生态学和流行病学

哈兽研SI研究课题组对所采病料或所收集到的SIV初步分离物及血清学调查阳性的原发病猪场进行SI的流行病学背景及生态学研究，包括猪群历史或发病情况、猪场环境、管理及防疫措施等，掌握了SI第一手临床流行病学和生态学材料。调查发现，目前在中国的猪群几乎都未注射SI疫苗，因此，猪群中抗流感病毒抗体可以客观地反应猪群受SI感染的情况，高密度、多应激的集约化养猪和恶劣的养殖环境以及不完善的防疫及管理制度是致使许多老病久防不止，病情反复，新的疫病又不断出现和蔓延的根本原因，SI的大范围感染已严重威胁养猪业的健康稳定发展及畜产品的安全。2.5 免疫防制

世界SI防制经验表明，疫苗免疫是预防和控制SI暴发的有效措施和主动性战略，在欧美国家，SI免疫已成为养猪场的一项常规免疫，有些SI疫苗已商品化，如MaxiVac-Flu（H1N1亚型猪流感灭活疫苗）、PRV/Marker Gold--MaxiVac-Flu（猪伪狂犬病四基因缺失疫苗-H1N1亚型猪流感灭活疫苗）、MaxiVac-M+（H1N1亚型猪流感-猪肺炎霉形体灭活疫苗）、MaxiVac Excell（H1N1亚型H3N2亚型猪流感二价联苗），我国至今没有商品化的SI疫苗。

血清学调查和毒株监测研究发现，1999－2003年间我国东北、西北、华中、华东、华南及西南地区等20个省、市猪群大范围存在H1和H3亚型SI感染，同时证实H9N2亚型病毒在我国猪群中的存在，并首次发现我国猪群已感染H5N1亚型流感病毒，为人类流感及动物流感的防制敲响了警钟。从2000－2003年收集和送检的样品中分离鉴定了45株H3N2亚型、25株H1N1亚型、2株H1N2亚型、8株H9N2亚型和2株H5N1亚型SIV。我国的SI已呈现抬头蔓延之势，疫情复杂而不容乐观，已经严重威胁到我国养猪业的健康稳定发展，不做好SI的防制工作，将直接影响人民的身体健康和社会的稳定。

中国农科院哈尔滨兽医研究所科研人员在近年我国SI血清学调查和毒株监测基础上，对分离自中国 不同地区、不同亚型SIV流行株的生物学特性进行研究，综合分析SI毒株监测及其生物学特性分析结果，筛选出免疫原性好、与全国范围流行的H1N1和H3N2亚型各抗原群均有很好抗原反应性、对鸡胚高滴度适应、在鸡胚中生长性状良好的流行株作为种毒，在SI灭活疫苗研究方面已取得突破性进展。首先，完成了毒种的分离鉴定、毒种含量测定、血清学特性测定、毒种致病力测定、毒种的免疫原性和抗原性测定、毒种的纯粹性检验和保存期试验等毒种各项研究工作。其次，研制了SI H1N1亚型和H3N2亚型单价灭活疫苗及H1N1－H3N2亚型双价灭活疫苗，其生产工艺（包括病毒繁殖与灭活试验、佐剂比较试验、疫苗佐剂的配制和乳化工艺试验等）、终产品配制及检验、安全性试验、免疫效力试验、免疫攻毒效力与抗体水平的平行关系试验、免疫期试验、保存期试验等实验室试验基本完成，结果理想。田间实验结果表明，疫苗免疫后无任何不良反应，可有效预防H1和/或H3亚型SIV引起的SI，保护率高，免疫期持续时间长，可有效降低高热、咳嗽、呼吸困难等临床症状，增加平均日增重，显著改善饲料转化率，安全、有效，对仔猪、育肥猪、母猪均具有免疫保护。SI诊断试剂和灭活疫苗现正进行中间试制和区域试验。该研究中各项内容均已达到国际同类研究先进水平，填补了我国SI诊断与防制研究的空白。2.6 SIV的分子生物学研究

为建立SIV中国分离株分子流行病学、遗传变异与演化等相关信息数据库，探讨不同亚型SIV中国分离株的基因来源、进化及其在流感病毒种间传播中的作用，哈兽研SI研究组在现有不同亚型SIV分离株中，选择有时间或地域代表性、不同抗原亚群、具有不同生物学特征的毒株进行全基因克隆和序列测定。已完成15株H1N1亚型SIV 120个基因的克隆和序列测定，初步建立了H1N1亚型SIV分离株HA、NA、NP、M、NS、PA、PB1及PB2基因的分子流行病学、分子变异与遗传演化基因信息数据库。完成了21株H3N2亚型 HA基因、25株NA基因、21株NP基因、25株M基因、25株NS基因的克隆和序列测定，对核苷酸序列和相应的氨基酸序列信息进行了分析和比较性研究，积累了丰富的H3N2亚型SIV一级结构数据，储备了雄厚的相关技术及数据。也完成了6株H9N2亚型SIV 42个基因的克隆和序列测定以及2株H5N1亚型SIV 16个基因的克隆和序列测定工作，建立了H5和H9亚型SIV分离株HA、NA、NP、M、NS、PA、PB1及PB2基因的分子流行病学、分子变异与遗传演化基因信息数据库。

研究发现: 中国华北、华中、华东及华南地区猪群中至少存在H1N1、H1N2、H3N2 3种亚型SIV的共同进化。福建、广东、内蒙等省病毒株与H9N2 AIV A/Duck/Hong Kong/Y280/97 NA基因的氨基酸同源率在96.7％－98.4％之间；H5N1 亚型AIV A/Chicken/HongKong/YU822.2/01与我国南部沿海地区H1N1亚型SIV NA基因的氨基酸同源率在98％以上，与福建、内蒙、黑龙江省部分毒株NP基因的氨基酸同源率分别在98.2％－98.7％、97.3％－97.8％、95.1％－96.0％之间，其M基因的氨基酸同源率均在95％左右；浙江、山东、河南分离株与A/Chicken/HongKong/258/97(H5N1)M基因的氨基酸同源率在96.8％－98.1％之间；A/Goose/GuangDong/3/97(H5N1)NP基因与内蒙2个毒株的氨基酸同源率分别为98.2％和98.7％，与福建分离株为99.1％。H5N1亚型SIV 2001年分离株对鸡呈高致病性，而2003年分离株能感染猪，但对鸡没有致病性，但其HA序列裂解基元却呈现高致病性AIV的特征，其HA和NA序列与H5N1亚型高致病性AIV A/Duck/Zhejiang/52/2000的核苷酸同源率高达99.3％和99.2％，而这2株病毒的宿主特异性和对鸡的致病性却完全不同。这些研究结果意味着, 在中国猪群中存在与H5N1和H9N2亚型AIV高度同源、遗传背景近似的毒株。说明在中国猪群中存在与H5N1亚型AIV高度同源、遗传背景近似的毒株。他们究竟在何处演化、如何演化、这些演化能否导致病毒致病力和宿主范围的改变以及其潜在的公共卫生意义如何？这将成为世界关注的最具挑战性的课题！

研究结果同时表明，H3亚型SIV中国分离株属欧亚猪谱系，其HA基因来源于水禽流感病毒，NS基因同时存在2大基因群系，广东大部分毒株和人流感病毒分离株属北美基因群系，内蒙、河南、山东、福建、黑龙江及广东部分SIV分离株属欧亚基因群系；通过对HA1、NA糖蛋白二级结构的预测发现，SIV中国不同地区分离株与参考毒株相比，其二级结构已发生明显的改变，主要体现在α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的数目及位置的不同，可见HA和NA基因的点突变、碱基的缺失或插入会导致其蛋白功能的改变。H1亚型SIV分离株大部分属经典美洲猪谱系。进一步证实在中国内陆存在“禽-猪-人” 的流感病毒种间传播；并提出在中国存在“（水）禽-猪-（水）禽”及“人-猪-人”的种间传播机制。3 结 语

猪的呼吸道上皮细胞表面同时存在流感病毒的2种受体，并且SIV HA序列上受体结合位点具有与人流感病毒受体(唾液酸（SA）α-2,6半乳糖苷（Gal）)和禽流感病毒受体（SAα2,3-Gal）相同的结合特异性，因此，猪自然成为禽、猪、人流感病毒共同的易感宿主，成为流感病毒基因重组、新亚型流行株产生的活载体，同时决定了SIV也具有感染人和禽的能力，奠定了SIV在流感病毒流行株演化和种间传播中不可替代的地位和作用。我国南部沿海地区正处于全球候鸟迁徙路线上，同时该区水网密布，四季放养或混养着鸡、鸭、鹅、猪等，而且人与之接触频繁，这种特有的生态条件和生活习惯使流感病毒得以在人、猪和禽（鸡、鸭等）之间交叉循环感染，给病毒提供了特有而复杂的演化环境和孵育温床，各种新亚型的A型流感病毒都可能在该地区重组或突变产生。因此，中国（特别是中国南部）一直是世界流感研究地域上的重中之重。我们的研究已表明，H1N2、H5N1和H9N2亚型SIV已出现在中国猪群，究竟其遗传演化规律如何以及在AIV突破“禽－人”种间屏障中起何作用，将成为世界SI研究的新热点，中国SI研究的新进展将是对世界流感研究的重要新贡献。

附：猪流感的防制对策

SI是一种群发性的呼吸系统疾病，其病程、病情及严重程度随病毒毒株、猪的年龄和免疫状态、环境因素以及并发或继发感染的差异而表现不同。因此，对SI的防制，应从群体出发，以计划免疫为核心，实行综合防制措施。

强化“预防为主、养防结合、防重于治”的理念，以灭活疫苗为“免疫硬件”，以首免和加免为主线，以母源、补白、调整、应急免疫为辅线，以多联和群体免疫为方向，以免疫质量评价技术为标准，建立严格的卫生管理制度，努力改善猪群日常管理及环境以减低猪的应激因素，可有效地预防和控制SI的发生和流行。

严格检疫制度，不从疫区引种，从外地引进种猪，必须了解产地的疫情和饲养管理状况并进行严格检疫；从国外引种时，必须经过国家海关对相关疾病的严格检疫，合格时方可引入。

养猪场应加强猪病的日常监测（包括病原监测和抗体监测），以提高动物群体“有效免疫”的整体保护水平，一旦发现血清学阳性的猪群，应及时进一步确诊，采取可行的措施，密切注视流行动向，防止疫源扩散。

加强饲养管理，实行“全进全出”制度。一批猪出栏后，猪舍经清洗、消毒后空置1~2周方可引进下一批猪。

严格控制参观养猪场，必要时经场长或主管兽医许可方可进入参观。参观人员必须遵守场内防疫制度，经洗澡、更换场区工作服及鞋帽方可进入，并按指定路线参观。

生产人员进入生产区，应穿工作服和工作鞋帽。工作服和工作鞋帽应经常清洗、消毒。工作人员严禁相互串栋。

猪场工作人员不许在场外或自己家中饲养和从事与养猪有关的业务，养猪场工作人员所需的猪肉产品必须经检疫，最好由本场提供。定期对猪舍及猪群进行喷雾消毒；应保持料槽的清洁，定期清洗消毒；及时清理垫料和粪便，保持清洁卫生；场内消毒池要经常换消毒液，以保持有效浓度。

猪舍应封闭，防止活体媒介物与猪群接触。搞好环境卫生，消灭蚊、蝇、老鼠及其它昆虫进入场内。对于易带来外界疫源的媒介物（包括工作人员、推销员、销售商、运送工人、来访客等），都应严加管理和监督。所有的一切用具和运输工具都须经严格消毒后，才能进入猪场。场内兽医人员不能对外诊病。

养猪场水源应来源于自场的井水或自来水，禁止直接饮用河流、池塘和湖泊水。以上措施是通过猪群的整体保健措施的全面实施来达到防治和减少SI的发生和流行。以下措施可在生产实践中作为参考：

预防：猪流感更易并发或继发其它疾病而导致严重经济损失，因此最好通过生物安全措施和免疫接种预防其发生。在欧美国家，免疫接种已成为预防SI的重要手段。加快猪流感疫苗的研制和开发也将成为必要，及时进行免疫接种能够提供很好的保护力，但必须明确所发生流感的亚型，有时需接种不同亚型的双价苗。以全灭活猪流感病毒或其免疫蛋白(血凝素抗原和神经氨酸酶抗原)制成的SI疫苗，主要依靠产生血液抗体而提供保护。

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所用中国流行株研制出油包水型H1、H3亚型单价及H1-H3双价灭活疫苗，安全、有效，对仔猪、育肥猪、母猪均具有免疫保护，有效降低临床症状：高热、咳嗽、呼吸困难等，增加平均日增重，显著改善饲料转化率，有效预防和控制H1、H3亚型SI的扩散和蔓延。现实验室的所有试验已完成，正进入中间试制和区域试验阶段。

免疫途径：肌肉注射或皮内接种 免疫程序：

小猪每头份2ml，两次免疫间隔2-3周

种猪配种前或配种时或分娩前免疫，每头份4ml，首免后间隔2-3周加强免疫，以后每年免疫2次 优点：对抗原性相似的同亚型毒株有75-100%的抗感染保护作用。局限性：⑴ 对不同血清亚型保护性差；⑵ 灭活免疫产生的免疫力较慢。

治疗：对猪流感目前没有特异的治疗方法，必须采取果断的综合性措施来降低其死亡率，盐酸金刚烷胺和盐酸金刚乙胺有一定的抗流感病毒作用，金刚烷胺对猪流感的防治效果随用药时间的不同而表现出差异，在感染的同时或在感染后1~3天用药，猪群的发病率和病死率会有不同程度的降低。但在用药猪群中会有散毒现象，并有抗药性病毒株的出现。

以下措施对猪流感有一定的治疗和缓解作用，是减少损失的有效途径：（1）用百毒杀、强力消毒灵、碘力杀等消毒剂进行消毒，并将病猪隔离；（2）试用复方吗啉胍片或复方金刚烷胺片和板蓝根冲剂，抑制病毒繁殖，减少病毒传播和排毒，用量根据猪的体重及药品含量确定。（3）抗感染、抗应激：应用抗生素可防止或减轻细菌性并发或继发感染；重症病猪应服用抗生素或磺胺类药品，同时给予止咳祛痰药。如泰磺安每50克配10公斤料每天饲喂2次，或土霉素碱＋磺胺二甲嘧啶混合拌料均有一定效果。用维生素C（500克/吨，拌料或饮水）可抗应激。（5）选用疫苗进行紧急免疫接种，缩短病程，减少病毒的传播。（6）补充体液，如人工输液或饮水中添加电解多维和葡萄糖等。（7）中草药：苏叶100克、薄荷100克、藿香100克、荆芥100克、苍术100克、防风100克、双花120克、黄芪100克、甘草30克。该配方为100头仔猪一天用量，连服2天。

第五篇：生物制品学实验报告----三价副猪嗜血杆菌油乳剂灭活疫苗的制备及检验（小编推荐）

三价副猪嗜血杆菌油乳剂灭活疫苗的制备及检验

副猪嗜血杆菌是猪格拉泽氏病(Glasser’s disease)的病原菌，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD 依赖型、革兰氏阴性细小杆菌。对营养要求比较苛刻，培养时必须供给含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鲜血液才能生长。此菌有多种血清型，其中强毒力的有1、5、10、12、13、14型，常可致死动物；中等毒力的有2、4、8、15型，多表现为多发性浆膜炎，不致死；低毒力的有3、6、7、9、11型，常无临床表现和病变。在中国，4型和5型是主要分离株，而澳大利亚和丹麦的主要血清型为5型和13型。在研究2、4、5、12、13和14型间的交叉保护性时发现，除了血清12型制备的单菌和血清2、12型制备的二价苗外，其他型都能对同源菌株产生保护；用血清4型制备的菌苗，可以保护血清5型的攻击；用血清4、5型制备的二价菌苗，可以抵抗血清13、14型的攻击（仔猪病变的严重性和病死率明显降低）。三价灭活疫苗主要用于预防猪副嗜血杆菌病。该苗针对性强，安全可靠，能有效降低发病率和死亡率。一、实验目的 了解副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗制作的流程。2 掌握副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗制作的操作技术。

二、乳化的原理

乳化剂能降低分散物的表面张力，在微滴（粒）表面形成薄膜或双片层，以阻止微滴（粒）的相互凝结。

三、材料，试剂，培养基

（1）器材：不锈钢锅（或瓷锅）、电炉、乳化器、量筒、玻璃棒、离心机、吸管等。

（2）试剂：、甲醛（灭活剂）、白油（抗原油相）、Span-80（油相乳化剂）、Tween-80（抗原水相乳化剂）、硬脂酸铝（稳定剂）、4、5、13型分离菌株（抗原）。（3）培养基的制备：

1、配制0.2%的V因子

准确称0.2g的NAD（辅酶I）加入100mlddH2O，用0.22um的细菌过滤器过滤除菌，4°C保存备用。

2、制备TSA培养基

称16gTSA加入348ml双蒸水，121°C高压灭菌20min，当温度到50°C左右时（放入50°C水浴锅）加入0.2%的V因子，使V因子浓度达100ug/ml，然后加入32ml的灭活新生牛血清

100ml----4g TSA-----5ml V因子-------8ml血清

3、TSB培养基

称3gTSB于87 ml双蒸水中溶解。121°C高压灭菌15min，冷却至50°C左右，加入已配制的0.2%的V因子5ml，再加入灭活的新生小牛血清8ml，使血清浓度达0.8% 100ml-------3g TSB----5ml V因子----8ml血清

四、实验内容

（1）菌株菌液制备及培养繁殖 将副猪嗜血杆菌三株菌种按分别划线接种于TSA固体培养基平板上，37°C恒温培养18-24h，挑取单个菌落接种于TSB液体培养基中，37°C振荡培养12-16 h后，再将此菌液按l%的比例加入新配制的TSB液体培养基，37℃振荡培养12-16h后，按平板菌落计数法计数。培养24h后，收集菌液，用分光光度计法测定细菌总菌含量。经检验合格者作为制苗抗原。（2）制苗抗原的浓缩和细菌的灭活

将纯检合格的制苗抗原培养物以超滤器浓缩，作为制苗用浓缩抗原。然后按TSB液体培养基总体积加入终浓度为0.2%的甲醛（先10倍稀释），充分摇匀后，37°C温箱中灭活14h或分别在4、8、12、16、20h和24h取灭活菌液于TSA固体培养基划线培养，置普通恒温箱中37℃培养48h，观察细菌灭活效果。37°C灭活14h可达到较好的效果。（3）制苗用水相的制备

根据培养24h后的分光光度计法或麦氏比浊管测定的总菌数结果，参照培养12-16h的平板菌落计数法计数结果。取灭活的三种血清型按照一定的比例（等量）混合抗原液96份，然后过滤, 除去沉渣及杂物, 加入4份即终浓度为4%灭菌的Tween-80(96∶4)充分混匀, 边加边搅拌，使其充分融化（可加热助溶，温度低于37℃）, 作为制苗用水相，水相要摇匀，让吐温-80充分溶解。（4）制苗用油相的制备

取10号白油93份（先加一部分，后补足）置于不锈钢锅中缓慢加热后，加入硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到透明为止，再缓慢加入6份Span-80(司本-80)，充分混匀，121℃高压蒸汽灭菌3Omin，冷却至室温备用。或者按比例将工业白油94份置于不锈钢锅（或瓷锅）中加热后，缓慢加入6份 Span-80，混合后按总量加入2%硬脂酸铝，溶化后，继续升温至160℃，维持10min，待冷却后即可制苗。切勿用少量的白油与硬脂酸铝混合后边煮边搅拌，那样很容易烧焦冒烟。（5）疫苗的制备（乳化工艺）

按油相与水相2：1（v/v）混合乳化。即1份水相配2份油相在高速搅拌器中搅拌。先将处理好的油相2份置于高速搅拌器中，低速搅动油相，同时缓慢加入水相l份(油∶水= 2∶1)，乳化时胶体磨转速由慢变快，最后以8，000一10，OO0r/mln高速乳化2一5min，使水油充分乳化。乳剂混匀，分装于灭菌疫苗瓶中。在乳化过程中亦可根据乳剂黏稠度适当调整油、水相比。制成乳白色的W/O型油乳佐剂疫苗。

（6）油乳剂检验：油乳剂检验项目包括乳剂类型检查、黏度测定、稳定性测定、粒度大小及分布检测等，生产实际中以黏度测定与稳定性测定为主。在每批苗分装过程的前、中、后各抽样2瓶供物理性状检验及安全检验。无菌检验： 将制备好的灭活油乳苗分别接种于普通肉汤培养基和血琼脂培养基中 , 于37 ℃温箱中培养10 d, 观察有无细菌生长。均应无菌生长方合格。物理性状检验 : 观察疫苗颜色：眼观应为均匀一致的乳白色黏稠乳剂。稳定性检测 ：1）离心加速法，将疫苗置于 10m l 离心管内, 3 000 r/min离心15min水油不分层，可保存1年以上不破乳。2）加速老化法，疫苗于37℃储存10-30d不破乳，说明其稳定性良好。黏度检验：最简易的方法是在室温条件下用吸管吸取1ml乳剂, 然后垂直放出, 记录放出0.4ml所需时间。垂直放出0.4ml所需要的时间作为黏度单位，以0.4ml 2-6s为合格，说明黏度适中, 适合于注射应用，不得多余10-15s。

5剂型检测：将疫苗数滴滴于冷水表面, 观察油滴扩散情况，即观察疫苗滴于水中是否呈油滴状且不分散。滴于水中油滴呈规则的圆形, 未见扩散现象, 说明疫苗为油包水剂型。

6安全检验：对最小使用日龄靶动物一次单剂量接种的安全性灭活疫苗接种途径只有一种，就是肌肉注射。每批三价灭活苗随机取样3瓶,等量混合后接种兔2只,每只肌肉注射2mL；接种14日龄哺乳仔猪，每组5头，每头猪接种2ml，另设5头猪作为阴性对照，于耳后肌肉注射5-10 mL, 观察仔猪的临床表现，并每日测定体温，持续2周。

五、小结

（1）副猪嗜血杆菌对营养要求比较苛刻，培养时必须供给含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鲜血液才能生长。且具有非常多的血清型，纯化非常困难。故对菌的纯化及灭活和疫苗的安全性试验是生产灭活苗的关键环节。由于副猪嗜血杆菌，在菌液制备的过程中容易生长杂菌，我们纯化了很多次菌，液体仍然很浑浊，使得实验进展延后。（2）注意事项： 细菌灭活过程中，甲醛浓度越高，碱性溶液中的抗原性损失就越大。故甲醛要注意适量 2 制备油相时，要使Span-80和硬脂酸铝充分溶解。3 制备水相时，抗原与Tween-80充分混匀。乳化时，油相必须冷却后方可与水相混和乳化，以防油温过高使抗原性降低。5 注意先加入油相后再加入水相，充分搅拌。6 疫苗在4℃、暗处保存，切勿冰冻。7 一定要做好安全检验