PCR扩增过程中污染的预防与对策

第一篇：PCR扩增过程中污染的预防与对策

pcr技术是聚合酶链反应，该技术可将极微量的靶dna特异的扩增上百万倍，从而大大提高对dna分子的分析和检测能力。pcr反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，操作复杂，所以在其操作过程中常有污染发生，即使极少量的污染也会造成假阳性，稍有差错就会出现假阴性。

本文讨论pcr扩增过程中污染的预防与对策。操作者必须熟练掌握技术，严格按操作规程操作，防止假阳性、假阴性结果的产生。

污染的原因调查

标本间的污染；采集标本的容器被污染；提取过程中加样枪污染；试剂的污染；提取过程中气溶胶的污染等。

防止污染的预防与对策

实验人员要熟练掌握pcr操作技术，严格规范操作程序，操作过程中加样枪的使用，手套、枪头、离心管应一次性使用。严格按试剂生产厂家提供的程序进行操作。

严把质量关，在操作当中总结，马上到期的试剂或刚过期试剂对pcr结果影响很大。

设立阴性质控和阳性质控：阴性质控以监测试剂是否污染，阳性质控以监测pcr反应是否成功，产物大小是否合本理论要求。

实验室设置及设备的规范化

实验室划分为4区：试剂准备区、，标本准备区、pcr循环扩增区、检测区。扩增仪的设置要符合要求，取样器刻度准确，减少pcr循环次数，只要pcr产物过剩检测水。

近年来pcr技术已普及到各基层医院，广泛地用于感染性病原体，如hbv hcv的临床检测，由于缺乏对核酸扩增检验技术完整的了解以及缺乏质量保证措施，导致部分实验室结果出现假阳性、假阴性的出现，所以操作者必须熟练掌握技术，严格按操作规程操作，防止假阳性，假阴性结果的产生。

第二篇：临床基因扩增(PCR)诊断实验室工作规范(试行)

附件

2临床基因扩增（PCR）诊断实验室工作规范（试行）

为使基因扩增诊断技术规范有效的用于临床，保证检测质量，更好地为临床疾病的诊疗服务，特制定本规范。

1．临床基因扩增实验室的设置：和仪器设备

临床PCR实验室应分为四个隔开的工作区域，每一区域都应有专用的仪器设备。即1）试剂贮存和准备区；2）标本制备区；3）扩增反应混合物配制和扩增区和的扩增产物分析区。如使用扩增和产物检测同时完成的荧光定量PCR方法或全自动分析仪如Cobas－T（Anplicor）等，则3）和4）两个区可合并。

与上述特定实验区有关的各个房间必须有明确的标记，以避免不同工作区内的设备物品如加样器、试剂等的移出或不同的工作区间发生混淆。进入各个工作区必须遵循一严格的）顺序，只能按单一方向进行，即从试剂贮存和准备区～标本制备区～扩增反应混合物配制和扩增区～扩增产物分析区。不同的工作区必须使用不同的工作服，可以不同的颜色来区别。此外，当工作人员离开各工作区时，不得将各区特定的工作服带出。

1．l．试剂贮存和准备区

本区用于贮存溶液的制条、溶液的分装和主反应混合液的制各。本区仪器设备配置：（l）4 冰箱和一20 冰柜；（2）混匀器；（3）微量加样器若干支（覆盖1～1000pl）；（5）专用工作服和工作鞋；（6）专用办公用品；（7）消耗品： 一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离。心管和加样器吸头（带滤心）；（8）可移动紫外灯（近工作台面）。

1．2．标本制备区

标本贮存、核酸提取及贮存均在本区内进行。RNA测定时的单键。cDNA合成也在本区进行。本区仪器设备自己置：（l）4冰箱、－20 或-70 冰柜三（2）高达台式冷冻离心机；（3）混匀器；（4）水浴箱或加热模块；（5）微量如排器若干支（覆盖l～1000μl）；（6）专用工作服和工作鞋；（7）专用办公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）；（9）可移动紫外灯（近工作台面）；（10）超净工作台；（11）超声波水浴（处理大分子DNA适用）。

1．3．扩增反应混合物配制和扩增区

模板材料（来自标本制备区）和主反应混合液（来自试剂贮存和准备区）的加入以及扩增反应等专门在本二．作区内近行。本区仪器设备自己置：（l）核酸扩增仅三（2）微量加样器（覆盖1～1000 μl）；（3）专用工作服和工作鞋；（4）专用办公用品；（5）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、高压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）；（6）可移动紫外灯（近工作台面）。

1．4.扩增产物分析区

本区面积应为6～8m。扩增严物的分析在本区进行。本区仪器设备配置：视检测方法不同而定，如为PCR�ELISA，则需（l）微量加样器若干支（覆盖l～2s（2）酶标权、洗报机和恒温箱;（3）专用工作服和工作鞋；（4）专用办么，用品；（5）消耗品：～次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）；（6）可移动紫外灯（近工作台面）。

2．临床基因扩增诊断实验室质量保证

临床基因扩增诊断实验室质量保证涉及到整个基因扩增检测的所有阶段，即测定分析前的标本来集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。

2．1．标本的采集

常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或拘檬酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆．痰、脑普液、尿及分泌物等。采样容器最好是密闭的一次性的，如真空系血管。一次性塑料容器使用时无需进一步预处理。当使用非密闹采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采禅，必须注意防止来自来样者的皮屑或分泌物的污染。采样者采样时起码要谈．一次性手套。可重复使用的玻璃器〔应高压处理，因为玻璃器（常含有不易失活的ANA酶。RNA酶的主要来源是实验人员的手。最好是热灭菌，250 烘烤 4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。通常EDTA和拘檬酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除肝素。临床用于RNA（如HCV RNA）测定的血标本最好进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则物血后，必须在1小时内分离血清。

2．2．标本的稳定化处

DNA分析，标本采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送到实验室。由于RNA易于降解，因此用于RNA测定的标本的稳定化处理有时是必不可少的，Chaotropic物质[特别是异硫氨酸抓盐（Guanidine thiocyanate，GITC）]可使DNAse和RNAse立即失活。在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆加入含有GITC的试剂管中进行稳定化处理。GITC可使RNAse不可逆失活的适合浓度为5mol/L。如果GITC浓度小于 4mol／L；RNA会很快降解。在适当的稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。如果温度低于室温，GITC即会结晶，所以在加入标本前应使之完全溶解。如标本不能及时送到实验室，最好选用 GITC处理方法以稳定标本。

2．3标本的运送

标本来集后应尽快送至实验室，经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于 DNA提取的含 EDTA的全血标本及用于 RNA提取的经 GITC 稳定化处理的标本。是否冷藏取决于标本的用途，较长时间在室温贮存会导致灵敏度大大降低。通常应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果在未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。

2．4．标本的贮存

临床体液标本如血清／血浆等可于-70 下长时间贮存。用于DNA测定的核酸样本应在 10mmol／L Tris，lmmol／L EDTA缓冲液（pH 7．5－8．0）中 4 保存。用于RNA测定的核酸样本应在缓冲液中一80 C或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在一20OC即可。用 GIT（：稳定化处理的 RNA标本在室温可保存 7天，如贮存时间较长，则RNA测定敏感性略有下降。

2．5．标本的处理（核酸提取）

核酸提取是决定扩增检测成败的关键性步骤。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致。抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中确．留的有机溶剂（如酚、氯份等），这些物质对其后的酶反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。如在 HBVDNA PCR测定中。采用对血清杯水煮沸裂解以释放DNA的方法时，肉眼观察不明显的溶血也会对扩增测定有很强的抑制作用，应使用正规的核酸提取方法（如经典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等）。当标本为疾时，则必须先进行液化处理。再提取核酸。需注意的是；液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为 RNA时，降解是一个主要问题。RT－PCR测定失败的常见原因是标本在运送前来经充分的稳定化处理．及核酸提取试剂的RNase的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果没．现RNA降解的证据。实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议常规使用高质量的商品核酸提取试剂。

2．6靶核酸的逆转录和扩增

2．6.l靶RNA的逆转录

cDNA合成为RT-PCR中的第一个酶反应步骤，所产生的 cDNA为靶RNA的反向互补链。为后面扩增的模板。下述因素通常影响cDNA合成的效率：

l）RT活性的降低或完全缺乏。必须排除由于酶质量不高、试剂降解或加样错误而引起的 cDNA合成不充分。

2）RT或热稳定聚合酶的抑制物（如酚、血红素）。当RNA明显为完整而没有扩增时，应怀疑有此类抑制物。

3）RNA的降解。

2．6．2影响扩增的因素

有多种因素可引起PCR的假阳性或假阴性结果，如抑制剂或酶活性丧失（见上）、迟大温度不对、晚十十浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。反应孔中热传导的均一性极为重要，循环仪的温度控制和加热块中热传导的一致性必须有常规的检查以避免假阴性结果。

2．7污染

在实际工作中，常见有以下几种污染类型：PCR片段的污染（产物污染）三天然基因组DNA的污染；试剂污染（贮存液或工作液）：以及交及污染（如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本）。对于所有的扩增技术，由于围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐，所以防止污染重在预防。一旦发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源为止。如果没有例外，实验结果必须作废，即使平行的污染质控中仅有一管显示出有PCR片段污染。

2．7．l．测定分析前的污染源。

测定分析前实验材料的污染主要来自非病人标本来源的核酸。

2．7．2．测定分析阶段的污染源。

通常，测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及到的实验设备的任何部位都是可能的污染源。如受污染的试剂（例如今血清白蛋白，明腋成矿物油）；商品酶制剂；消耗品（如反应管，吸头）和实验设备（如加样器、离心机）。污染的来源之一是许多样本在同时制备时的交及污染，但最主要的污染来源为以前扩增产生的特异产物DNA片段。在前面三个工作区中，不当的实验操作

会引起所使用的试剂、消耗品或实验设备的污染。而在产物分析区，当吸取PCR产物用于检测时，非常容易引起污染，因此必须制定并严格执行标准操作程序。

2．7．3．污染的避免。

要避免污染，首先应是预防而不是排除污染，前面所述工作区的严格划分的目的正是为了预防污染。为避免以前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如在扩增反应中用dUTP取代部分dTTP：从而产生的特异扩增片段含有尿嘧啶，这样扩增前在反应混合液中加入尿嘧啶糖激酶（UNG），可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避免其对将要进行的扩增测定的污染。另外一种方法是持续的长波紫外灯照射，通过异补骨脂素光化；单产生DNA加合物，由于DNA加合物对扩增没有反应但又不妨碍PCR后杂交过程，所以这些方法也能防止污染。由于上面提到的方法会给人一种假的安全感，所以不能以其来替代严格的实验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩增的天然 DNA的污染。

2．7．4．去除污染的措施。

工作完后必须定期采取有效的去污染措施，结合各种不同的方法可达到最佳效果。去污染措施包括但不仅限下面几种：用100ml／L次氨酸钠清洁表面；试验了后长时间的紫外照射实验操作台和其他表面；实验设备如加样器的高压消毒。

2．8．扩增产物的分析

扩增产物的测定有各种方法。如电泳、限制性酶切、斑点印迹、杂交、测序、分光光度法定量等。但临床PCR测定项目基本上都使用探针杂交方法。

2．8．l．与杂交检测有关的干扰。

杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或洗涤方法不合适。最常使用的基因探针有：DNA片段、合成的尊核普酸和体外的转录本（反义 RNA探针）。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光景和同位素等。在扩增后的杂交检测中，应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性。还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提高润度和／或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密控制温度和试剂是避免假阳性和假阴性结果的先决条件，要注意的是，温度和离子强度不能同时改变。

2．9．质量控制

如上所述，应该开展各种质控来评价测定分析当中各步骤的质量，如RNA的完整性、对扩增是否合适和敏感。

2．9．1．室内质量控制

必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控制，以避免假阳性和假阴性，保证测定结果的准确性。由于PCR测定的高敏感性，所以试剂的生产、实验材料的准备、PCR本身和实验中的每一步都要求有质控。扩增反应前后的酶反应各步也应有质控，只不过在质控细节上稍有不同。

2．9．1．1．与实验材料的准备有关的质控。

对DNA提取试剂的效果最常用球脂糖凝胶电冰来检测。可知所提取的DNA是否发生降解。用常规的手工提取方法制备的DNA的平均长度一般为～100kb，用适合PCR的DNA

提取试剂盒制备的DNA的长度平均范围为30�40kb。然而；明显出现降解的DNA（在1和10kb的低分子量范围内）在经琼脂糖凝胶电冰分离和用溴化乙锭染色后也可见有强的荧光信号。用对甲基化不敏感的限制性内切酶（如EcoRI）消化DNA，然后电泳分离，能够对酶活性的抑制剂进行质控（在抑制剂存在的情况下，高分子量的片段不被酶切）。潜在的抑制剂的存在通常用260nm和280nm的分光光度测定来估计，好的 DNA提取物，A260/A280 比值应该在 1． 75--2．0之间；否则，污染（残留的蛋白或酚）可能会很高。仅用光度计比色方法不能对DNA的完整性下结论。

最快的对总RNA提取质量控制的方法是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电冰，这一点跟DNA分离相同，然而，如果对结果产生怀疑，就应该在变性的条件下作琼脂糖凝胶电泳以检测RNA的完整性。在理想情况下，三种主要的核糖体RNA(28S、18s和 5S）在凝胶上出现的带相对较窄。如发生RNA的降解。则带被拖向低分子量或出现带的缺失。测定核糖体RNA带的密度指数可作为对RNA制备的质量评价的实验室内的标准；对向低分子量拖尾的、不对称性的峰的评估也是RNA完整性的合适的指标。另外，琼脂糖凝胶电泳能显示出在RNA的制备中被DNA污染的程度。由于这些原因，单独的光电比色不能对RNA的完整性下结论。

2．9．1．2．对cDNA合成和扩增的质控。

本部分包括阳性质控和阴性质控。

2．．9．l．2．l．cDNA的合成。

对CDNA合成的效率进行监控的关键性的质控是使用一个内反应质控。cDNA的合成可以从存在子每一个RNA提取物中的cRNA 转录本开始(即普遍表达的mRNA，如核糖体蛋白转录本这一类的所谓的管家基因），也可从在制备时加入样本中的作为内标准的 RNA开始。cDNA合成的内质控是能够产生确定产物的阳性质控；如果扩增不成功，质控就显示出有RNA的降解、cDNA合成的过程中错误启动或酶活性丧失。

加入确定量的扩增质控物可以检测RT�PCR的灵敏度。对于RT－PCR方法 所必须的污染质控为无逆转录靶RNA的阴性质控。

2．9．1．2．2．PCR反应。

内反应质控是阳性质控。可使用对有机体存活所必须的靶基因作质按，这些基因至少以丰台子状态存在，因为如果基因组缺失这些基因，将使有机体致死（所谓的致死因子），一个比较好的例子就是维生素D血浆结合蛋白的基因；在世界范围内的许多种族已发现其广泛的多态性，并且还没有发现基因活性的同源性丢失，因此，通过PCR共同扩增这种基因的一个片段，在所有患者中均可获得成功，并且也会证明扩增反应是成功的。

在测定血清／血浆病原体核酸如HBV DNA、HCV RNA等时，应使用已知的弱阳性血清／血浆作为质控样本，与持测临床标本等同处理提取核酸及扩增，以判断扩增检测的有效性。

使用这些外加弱阳性质控不但可检测扩增反应液的质量，还可获得有关PCR检测下限和特异性的信息。这些质控必须使用与诊断实验（即患者的标本）所使用的相同的主反应混合液。如果怀疑方法的检测下限不足以检测出产物时，则每一个反应管都必须加扩增质控。

外加阴性质控（污染质控）在每一个PCR实验中都必须设有，应该包括几种阴性质控。通常，这些质控是民来指明PCR过程中污染出现的阶段。包括在样品制备的整个过程中所带的空白反应管、含有样品制备时所用的所有反应液但不含可扩增的模板（所谓的模拟制备）的反应管等。模拟质援可以评估PCR实验的综合质量。

此外，为对吸样过程进行质控，可以水质控样本来代替核酸样本加入至反应管，反应管中含所有的反应成分。实际工作中仅通过水样本来检测污染是否存在的方法是不可取的，因为它不能发现样本处理过程中的污染源，水仅可作为扩增试剂的质控。

在扩增靶RNA的PCR实验中，应做省略逆转录的污染质控，通过这种方法，可发现以前扩增的DNA片段所引起的污染。

2．9．l．3．对测定结果评价的质控．

2．9．1．3．1．板上来交和膜上斑点印迹杂交的质控。

在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中使用了不同杂交条件而造成的对结果的错误解释。

2． 9． 2．室间质量评价能力验证，proficiency testing）

所有开展临床基因扩增检测的实验室都应参加由卫生部临床控验中心组织的全国临床基因扩增项目的空间质量评价，并作为开展临床基因扩增诊断的依据之一。

本工作规范自公布之日起实施。

卫生部医政司

第三篇：16sRNA PCR 扩增及凝胶电泳分析实验报告

16sRNA PCR 扩增及凝胶电泳分析

微生物学20092474王紫枫

一、实验目的1．熟悉细菌活化及培养过程

2．掌握PCR扩增技术及方法

3．掌握凝胶电泳分析技术

二、实验原理

rRNA进化缓慢，具有高度保守性。不同微生物的rRNA的基因序列在某些位点以不同的几率发生突变。同时，小核糖体亚基16sRNA分子量大，携带信息量大，可作为属种鉴定的基础。

通过筛选的细菌，做活化培养后，细菌在缓冲液酶解，通过细胞破壁、裂解、离心得到RNA相关序列，在经过设定PCR相关条件。温度、循环次数，将裂解液加入到体系中进行扩增。在完成循环后进行凝胶电泳、拍照、序列分析。

三、实验用品

供试菌种53种、编号试管每株两个LB固体和液体培养基、Mg2+、无菌水、EB Buffer、TE离心管、移液枪

四、实验步骤

1．将供试菌株编号，没人分得3个菌株。

2．将菌株接入固体培养基进行活化，培养24小时。

3．将活化后的菌株挑一环，接入5ml液体培养基内振荡培养16小时得到菌悬液。

4．取1.5ml菌悬液于离心管，10000转5分钟弃上清。

5．用无菌水洗涤一次，沉淀悬浮于150ul TE Bufler。

6．将上述悬液在沸水上煮10分钟，水浴10分钟，10000转5分钟离心后，上清液于-20℃保存。

7．取上述上清液1ul于PCR中。

8．3小时PCR扩增。

9．将扩增后的序列取1ul于EB，并注入电泳槽中。

10． 经过电泳后的凝胶，取出于紫外荧光灯中显色，拍照并分析。

五、实验结果

经过拍照，仅有2、3、6、9、22、38、39、40号扩增出了新的序列显色明显。其他没有扩增出来的原因可能是提取过程中丢失。另外第三块胶板没有明显变化的主要原因可能是电泳时入缓冲液使用了旧的缓冲液，并未出现预期的结果。

六、注意事项

1．预制固体培养基琼脂要加够量，否则很难凝固。

2．在转接时，挑取的一环尽量多一些，肉眼可看见的状态为宜，生长期长一些。

3．缓冲液先用现配。

第四篇：实验四 PCR扩增基因特异片段

实验四

PCR扩增基因特异片段

一、实验目的

1、学会PCR仪的使用方法。

2、掌握PCR反应的实验技术。

二、实验原理

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

GLBI蛋白是玉米胚中含量最丰富的蛋白质之一，其编码基因glb1位于第一染色体长臂，基因表达仅限于种子组织。该蛋白对于幼苗生长与存活并非必需。本实验扩增glb1基因部分序列，全长1200bp左右。

真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4 种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。其中18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守,适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析, 其间的间隔区为内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)，本实验扩增榨菜黑斑病ITS序列，序列全长500kb左右。

三、实验仪器及药品耗材

1、主要仪器：移液器、振荡器、PCR仪、电子天平、量筒、微波炉、电泳仪、水平电泳槽和凝胶成像系统等。

2、主要药品及耗材：一次性手套、PCR板、移液器吸头、无菌水、2×PCR 混合酶（Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs及PCR稳定剂和增强剂组成的混合液）、液体石蜡、琼脂糖、0.5×TBE缓冲液、Goldview染料、DNA Marker 2000和溴酚蓝等。

四、实验步骤

（一）PCR扩增玉米目的基因glb1

1、在PCR管中配制25ul反应体系 双蒸水 8.5ul 2×PCR 混合酶

12.5ul 正向引物ul 反向引物 1 ul DNA 2 ul 液体石蜡 20 ul

2、按一下程序进行扩增 94℃预变性5 min，1个循环；

94℃变性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸2 min，共设35个循环； 72℃延伸10 min； 4℃保存

(二)琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果

配制1%琼脂糖凝胶，在25ul PCR扩增产物加1ul溴酚蓝，200伏，200毫安，电泳并观察结果。

五、作业

绘画出PCR扩增电泳图，标明DNA Marker 位置及检测PCR产物位置，并根据DNA Marker位置及亮度估算PCR扩增产物的大小及浓度。

第五篇：临床中PCR扩增的实验室设计

临床基因扩增（PCR）实验室设计

★

介绍了什么叫做基因扩增实验室以及基因扩增实验室是如何保证实验结果的安全性和可靠性的。并从平面布置、通风空调系统设计、污染的预防与控制几个方面探讨了基因扩增实验室设计的主要特点和应注意的问题。

★概述

临床基因扩增实验又称PCR实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点，因此被临床医生广为认可，已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的禽疫病诊断。但是，这种实验需要有能保证绝对安全、配置合理的实验室和非常规范的操作为前提。近年来对临床基因扩增检验实验室的建设越来越得到重视，因为它对检测结果的可靠性、准确性和安全性起到至关重要的作用。本文主要从临床基因扩增检验实验室的平面布局，空调通风系统设计、气流控制和污染的防制几个方面对实验室设计中的主要特点进行了阐述。临床基因扩增检验实验室设计的核心问题是如何避免污染。因此，实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是围绕这个核心问题进行的。下面就对这几个方面分别进说明。

PCR实验室平面布局

临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。

实验室通风空调系统设计及压力控制

PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。1.试剂贮存和准备区

该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。2.标本制备区

该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。

3.扩增反应混合物配制和扩增区

该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。4.扩增产物分析区

该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。

本区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。

污染的预防与控制

PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中，常见的有以下几种污染类型：扩增产物的污染；天然基因组DNA的污染；试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。1.工作区域的严格划分

（1）各个实验区域设置合理；

（2）各个实验区域要有明显的标记（如，醒目的门牌或不同的地面颜色等），以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。2.合理的系统设置

（1）合理的空调通风系统设置，尽量采用全送全排的空调系统；（2）严格的气流压力控制，保证不同的实验区内不同的压力要求。3.规范的操作（1）临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训，经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作；

（2）在实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施；

（3）清洁工作及时、正确。实验工作结束后，必须立即对本区进行清洁。除常规的消毒液体对表面进行擦拭消毒或紫外线灯的照射消毒外，对一些实验设备还应进行高压消毒处理。4.严格的管理

（1）严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室，有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门；

（2）在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服（如，不同颜色），当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域；

（3）尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。（4）扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源，废液不能在实验室中倾倒，必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理，如焚烧等；

（5）扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。

5.完备的实验室配套设施

完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器，如，超净工作台、离心机、加样器等。